技术领域
[0001] 本
发明属于
生物传感技术领域，具体涉及一种可用于监测谷物霉变产生的玉米赤霉烯酮的光电化学适配体传感器的制备方法。
背景技术
[0002] 玉米赤霉烯酮(ZEN)是广泛存在于
饲料和谷物中的一种
真菌毒素，是由真菌产生的
次级代谢产物，广泛存在于玉米、
高粱、小麦、
大麦等
农作物中，具有很强的污染性和类雌
激素作用。ZEN污染严重影响着农产品
质量和
食品安全，进一步造成巨大的经济损失，过量的玉米赤霉烯酮可引发致畸、致癌、神经毒性和流产等
疾病，严重威胁人体健康。因此，人们对ZEN的研究越来越重视。目前，已建立的ZEN检测方法主要包括高效液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、酶联
免疫吸附法、表面增强
拉曼散射免疫测定法和
荧光偏振免疫分析等。这些方法结果准确，且在实际应用中取得了较好的分析结果，但也存在一定的局限性。例如，质谱法仪器设备价格昂贵，前处理过程复杂、操作繁琐、效率低，因此不适用于大规模样本的筛查和日常的内控检测。酶联免疫吸附法灵敏度相对较高，且能定量检测，但检测时间较长，环境和基质干扰严重。因此，寻找简单灵敏、快速准确且易于推广的分析检测方法是目前的一项重要课题。
[0003] 光电化学方法(PEC)由于其具有成本低、检测速度快、灵敏度高等特点，在真菌毒素检测领域引起了越来越多的关注。对于典型的PEC，具有高光电转换效率的光敏材料对于实现出色的分析性能必不可少。
氧化锌
半导体(ZnO，带隙： )因其对光
腐蚀的
稳定性，高光电和光催化活性而在光催化和光伏
电池中得到了广泛的研究。然而，ZnO的宽带隙会严重导致低的可见光吸收率，这进一步降低了光电响应和检测灵敏度。
[0004] 近年来，氮掺杂
石墨烯
量子点(NGQDs)由于具有良好的
导电性和优异的光化学性能，已被广泛用作PEC传感平台中的电荷传输介质。基于窄带隙半导体和宽带隙半导体之间的
电子相互作用，NGQD可以用作良好的敏化剂，有效地促进光诱导的电子转移，并阻碍PEC反应电子转移过程中的电荷重组。因此，开发一种光电化学适配体传感器实现对玉米赤霉烯酮的灵敏、高选择性监测成为一项重要课题。
发明内容
[0005] 针对
现有技术存在的问题，本发明利用窄带隙半导体和宽带隙半导体之间的电子相互作用，并引入ZEN适配体，构建一种新型的光电化学适配体传感器，用于监测谷物霉变产生的ZEN含量，实现早期诊断。
[0006] 一种监测谷物霉变产生的玉米赤霉烯酮的光电化学适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0007] (1)ZnO-NGQDs
复合材料的制备：
[0008] 首先，将
柠檬酸铵加入到超纯
水中，进行加热反应，反应过程中，溶液的
颜色从无色变为亮黄色，再加入氢氧化钠溶液调节pH值，得到氮掺杂
石墨烯量子点溶液，记为NGQDs溶液；
[0009] 然后将NGQDs溶液和二水合
醋酸锌加入到N，N-二甲基甲酰胺中混合均匀，进行加热反应，反应结束后，在冷却至室温后，得到的产物分别用
乙醇和超纯水洗涤离心三次，
真空干燥，得到的氧化锌氮杂石墨烯量子点复合材料，记为ZnO-NGQDs复合材料，室温避光放置；
[0010] (2)将ITO
电极进行裁剪后依次在氢氧化钠溶液、超纯水和乙醇中超声，超声后晾干；再取绝缘
胶带覆盖电极部分区域，并在绝缘胶带表面开设圆形孔洞；
[0011] (3)将步骤(1)制备得到的ZnO-NGQDs复合材料加入水中，得到ZnO-NGQDs溶液；然后将溶液滴加到经步骤(2)处理后电极表面的圆形孔洞处，晾干，得到的产品标记为ZnO-NGQDs/ITO；
[0012] (4)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲
氨基丙基)-3-乙基
碳二亚胺
盐酸盐(EDC)加入缓冲溶液中，得到含有EDC和NHS的混合溶液，滴加到步骤(3)制备的电极的圆形孔洞处，在室温条件下进行孵育，然后室温下晾干；
[0013] (5)在步骤(4)得到晾干后电极表面的圆形孔洞处修饰氨基功能化的ZEN适配体，在一定
温度条件下进行孵育，得到光电化学适配体传感器，标记为Apt/ZnO-NGQDs/ITO；
[0014] (6)取多个步骤(5)得到的Apt/ZnO-NGQDs/ITO，分别在表面的圆形孔洞处修饰不同浓度的ZEN标准溶液，其中Apt/ZnO-NGQDs/ITO和浓度一一对应，室温下静置反应一段时间；然后，再经Tris-HCl溶液
对电极进行清洗，得到的产品标记为ZEN/Apt/ZnO-NGQDs/ITO；在三电极体系中，将得到的ZEN/Apt/ZnO-NGQDs/ITO作为
工作电极，Ag/AgCl(饱KCl)电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在PBS(pH＝7.5)缓冲溶液中，施加偏置
电压，检测并记录光
电流信号，建立ZEN溶液浓度和光电流信号的对应关系的标准线性曲线；
[0015] (7)霉变谷物中产生的ZEN含量的监测：将霉变谷物经过处理和提取得到样品溶液，修饰在步骤(5)得到的产品Apt/ZnO-NGQDs/ITO上，进行检测获得的光
电信号，然后代入步骤(6)建立的标准曲线中，得到该溶液中ZEN的浓度，从而推算霉变谷物中产生ZEN的含量，实现对谷物霉变产生的ZEN的监测。
[0016] 优选的，步骤(1)中，所述柠檬酸铵和超纯水的用量比为2g：60mL，加热温度为180～200℃，反应时间为20～40min，氢氧化钠浓度为1mg mL-1，调节pH值为7.0；所述加热反应中需要保持一个密封且常压的环境。
[0017] 优选的，步骤(1)中，所述NGQDs溶液、二水合醋酸锌和N，N-二甲基甲酰胺的用量比为1～20mg：115mg：30mL。
[0018] 优选的，步骤(1)中，所述反应温度为90～100℃；反应时间20～60min。
[0019] 优选的，步骤(2)中，所述裁剪后的ITO电极是长为2cm宽为1cm的长方形氧化铟
锡电极；所述氢氧化钠溶液的浓度为1M；所述圆形孔洞的直径为6～10mm。
[0020] 优选的，步骤(3)中，所述ZnO-NGQDs溶液的浓度为2～6mg mL-1，用量为10～25μL。所述晾干具体为红外烤灯下晾干，时间为10-20min。
[0021] 优选的，步骤(4)中，所述混合溶液中EDC和NHS的终浓度分别为0.005M和0.01M；所述缓冲溶液为pH值为7.4的PBS溶液；所述滴加的用量为5～15μL，室温下孵育的时间为0.5～2小时。
[0022] 优选的，步骤(5)中，所述氨基功能化的ZEN适配体的浓度为0.5～2.5μΜ，所述修饰的用量为5～20μL。
[0023] 优选的，步骤(5)中，所述一定温度孵育为4℃，孵育的时间为2～16小时。
[0024] 优选的，步骤(6)中，所述Tris-HCl的pH为7.4；所述缓冲溶液为PBS溶液，浓度为0.1M，pH为7.5。
[0025] 优选的，步骤(6)中，所述ZEN标准溶液浓度为100fg mL-1～100ng mL-1；所述室温下静置反应一段时间为10～60min；所述测试时施加的偏置电压-0.2～0.3V。
[0026] 优选的，步骤(7)中，对霉变谷物的处理和提取过程如下：称取1g谷物，加入5mL体积比为6:4的甲醇水溶液中，剧烈震荡20min后，将溶液用8000rpm/s离心10～15min，取上清液将其溶解在0.1M、pH为7.5的缓冲溶液中，存放在4℃中以备用。
[0027] 本发明的有益效果为：
[0028] (1)本发明制备了基于宽带隙半导体ZnO和窄带隙半导体NGQDs的复合材料，通过调节NGQDs、二水合醋酸锌和N，N-二甲基甲酰胺的用量比，制备ZnO-NGQDs复合材料，可以显著提高光电流信号，同时大大缩短了反应时间。
[0029] (2)本发明引入特异性识别元件ZEN的适配体，构建了基于ZnO-NGQDs的光电化学适配体传感器，可实现对ZEN的灵敏、选择性分析。
[0030] (3)本发明构建的光电化学适配体传感器用于对谷物霉变产生的ZEN的监测，可以实现对谷物霉变的早期诊断。
附图说明
[0031] 图1为该光电化学适配体传感器的构建过程示意图。
[0032] 图2中A为NGQDs溶液，二水合醋酸锌和N，N-二甲基甲酰胺的不同用量比与光电流的关系图；图B为ZEN适配体浓度与光电流差值的关系图。
[0033] 图3中A为不同浓度ZEN所对应的PEC响应，其中ZEN的浓度由上而下依次为100fg mL-1,500fg mL-1,1pg mL-1,5pg mL-1,20pg mL-1,100pg mL-1,200pg mL-1,500pg mL-1,1ng mL-1,5ng mL-1,10ng mL-1,20ng mL-1和100ng mL-1；图B为ΔIPEC(ΔIPEC＝I0–I，I0和I分别代表不存在和存在ZEN时的PEC响应)与ZEN浓度对数之间的标准线性曲线。
[0034] 图4的A图为该适配体传感器在不存在和存在ZEN时连续扫描410s的稳定性；B图为适配体传感器的选择性；其中干扰物分别为伏
马菌素B1(FB1)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)以及它们三种的混合物(Mixture)。
具体实施方式
[0035] 本发明使用的氨基功能化的ZEN适配体通过生工生物(上海)公司；
[0036] 下面结合具体
实施例和
说明书附图，对本发明做进一步说明。
[0037] 实施例1：
[0038] 本发明光电化学适配体传感器的构建流程如附图1所示，具体步骤如下：
[0039] (1)ZnO-NGQDs复合材料的制备：
[0040] 首先，称量2g柠檬酸铵加入60mL的超纯水中溶解，置于三颈烧瓶中，在200℃油浴回流下反应30min后，溶液颜色由无色变成亮黄色，停止加热，待溶液温度冷却至室温，加入0.1M的氢氧化钠调节pH值到7.0，将制备所得的NGQDs溶液存放在4℃备用；
[0041] 然后，称量115mg二水合醋酸锌和5mg的NGQDs溶液加入到30mL的N，N-二甲基甲酰胺溶液中混合均匀，加入三颈烧瓶中，加热到95℃反应20min，冷却后，分别用乙醇和超纯水洗涤离心三次，最后在55℃烘箱中烘干，得到的白色固体，记为ZnO-NGQDs，避光备用；
[0042] (2)将ITO电极进行裁剪，长为2cm、宽为1cm，然后将其在1M氢氧化钠溶液中煮沸，取出后再置于超纯水和乙醇中依次超声清洗15min，晾干，最后取绝缘胶带覆盖电极部分区域，并在绝缘胶带表面开设圆形孔洞，直径为6mm，所述圆形孔洞用来修饰材料；
[0043] (3)将20μL浓度为4mg mL-1的ZnO-NGQDs复合材料修饰到步骤(2)处理的电极上，即圆形孔洞处，在红外烤灯下晾干，此时得到的产品标记为ZnO-NGQDs/ITO；
[0044] (4)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)加入pH值为7.4的PBS溶液中，得到含有EDC和NHS的混合溶液，混合溶液中EDC和NHS的终浓度分别为0.005M和0.01M；修饰在步骤(3)制备的电极表面，依然滴加在圆形孔洞处，室温下晾干；
[0045] (5)将10μL浓度为1.5μΜ修饰氨基功能化的ZEN适配体修饰在步骤(4)制备的电极表面，滴加在圆形孔洞处，4℃下孵育12h，ZnO-NGQDs复合材料表面富含的羧基官能团与ZEN适配体之间的缩合反应可使得ZEN适配体被固定在电极表面，从而获得的光电化学适配体传感器；此时产品标记为Apt/ZnO-NGQDs/ITO；
[0046] 其中，通过制备不同混合溶液的用量比，改变NGQDs溶液的用量，NGQDs溶液分别取值1mg,2mg,5mg,8mg,10mg,20mg；二水合醋酸锌为115mg，N，N-二甲基甲酰胺为30mL，检测光电流信号。
[0047] 从图2(A)中，可以看出，随着混合溶液比例从1mg：115mg：30mL到5mg：115mg：30mL，光电流信号逐渐增加，在比例为5mg：115mg：30mL时光电流信号达到最大值。因此，选择5mg：115mg：30mL的比例作为混合溶液的最佳反应比例。
[0048] 从图2(B)中，可以看出，当步骤(5)中ZEN适配体的浓度从0.5μΜ增加到1.5μΜ时，光电流的差值逐渐增大，且在1.5μΜ达到最大值；因此，选择最佳ZEN适配体的浓度为1.5μΜ。
[0049] (6)在步骤(5)得到的适配体传感器上修饰不同浓度的ZEN标准溶液，利用适配体与ZEN的特异性结合，用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗来除去未结合的目标物，此时产品标记为ZEN/Apt/ZnO-NGQDs/ITO；在三电极体系中，将得到的产品作为工作电极，Ag/AgCl(饱KCl)电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在0.1M PBS(pH＝7.5)缓冲溶液中结合型号为PLS-SXM300/300UV的氙灯
光源和型号为660E的电化学工作站来检测和记录光电流信号。建立ZEN溶液浓度和光电流信号的对应关系的标准线性曲线，如附图3所示。
[0050] 从图3的A图中，可以看出，随着ZEN浓度的增加(由上到下的浓度依次为100fg mL-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1,500fg mL ,1pg mL ,5pg mL ,20pg mL ,100pg mL ,200pg mL ,500pg mL ,1ng mL-1,5ng mL-1,10ng mL-1,20ng mL-1和100ng mL-1)，I的值逐渐减小。
[0051] 从图3的B中，可以看出，ΔIPEC(ΔIPEC＝I0–I，I0和I分别代表不存在和存在ZEN时的PEC响应)与ZEN浓度对数之间的标准线性曲线为ΔIPEC＝14.86+1.04log CZEN[g mL-1](R2＝-13 -7 -1 -14 -10.991)，线性范围为1×10 -1×10 g mL ，检出限为3.33×10 g mL 。
[0052] 从图4的A图中，可以看出，不管ZEN存在与否，连续扫描410s后，该光电化学适配体传感器都能保持好的稳定性。
[0053] 从图4的B图中，可以看出，干扰物(伏马菌素B1、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A以及它们的混合物)引起的光电流I的变化几乎可以忽略不计，说明该传感器具有选择性，能够特异性检测ZEN。
[0054] (7)霉变谷物中产生的ZEN含量的监测：首先，分别使用本发明制备的光电化学适配体传感方法和国家标准检测方法(HPLC-MS)对加入标准ZEN溶液的谷物进行检测，通过对比发现本发明光电化学适配体传感器具有好的准确性和可靠性。然后在此
基础上，对霉变谷物中产生的ZEN含量的监测；
[0055] 称取1g霉变谷物，加入5mL体积比为6:4的甲醇水溶液，剧烈震荡20min后，将该溶液用8000rpm/s离心10min，取上清液将其溶解在0.1M、pH＝7.5的PBS缓冲溶液中，然后将处理和提取得到的溶液修饰在步骤(5)得到的产品上，进行检测获得的光电信号，代入步骤(6)建立的标准曲线中，得到该溶液中ZEN的浓度，从而推算霉变谷物中产生ZEN的含量，实现对谷物霉变产生的ZEN的监测，如表格1所示，其中corn flour为玉米粉，rice flour为大米粉，barley flour为大麦粉。
[0056] 表格1.利用该适配体传感器监测三种谷物霉变产生的ZEN的含量的记录。
[0057]
[0058] 可以看出，利用制备的光电化学适配体传感器用于监测霉变谷物产生的ZEN可以发现，虽然在同样环境下，不同谷物都会发生霉变，但霉菌增长速度却大不相同。简而言之，在相同的孵化环境中，玉米粉更容易发霉。因此，利用该光电化学适配体传感器可以及早发现谷物作物是否发霉并确定ZEN浓度，实现早期诊断的效果。
[0059] 说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行
修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的
权利要求范围内。
