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一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法

阅读：2发布：2020-12-20

专利汇可以提供一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法，属于外泌体富集平台技术领域。包括基底和琼脂糖层，琼脂糖层贴合在基底表面；琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，叉型微通道结构含有斜流通道、汇集通道和分离通道，分离通道用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道富集到汇集通道中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。制备方法为将阳膜的结构复制到琼脂糖上，得到含有所述叉型微通道结构的琼脂糖层；将琼脂糖层贴合在基底上，然后在琼脂糖层上打孔，用作进样口，即得到基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片。本发明可以实现外泌体的快速富集及高效检测，具有操作方便，高效，以及成本低等特点。，下面是一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，其特征在于，包括基底(1)和琼脂糖层(2)，所述琼脂糖层(2)贴合在所述基底(1)表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道(3)、汇集通道(4)和多个并行排列的分离通道(5)，所述多个并行排列的分离通道(5)的末端与斜流通道(3)连接，所述斜流通道(3)的末端与汇集通道(4)连接，所述斜流通道(3)与汇集通道(4)呈Y型分布；所述琼脂糖层(2)上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道(5)中；所述多个并行排列的分离通道(5)用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道(3)富集到汇集通道(4)中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。
2.如权利要求1所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，其特征在于，所述各个分离通道(5)的宽度为1-100μm，高度为1-100μm。
3.如权利要求1所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，其特征在于，所述斜流通道(3)呈对称分布，各个所述斜流通道(3)宽度逐渐增大，与汇集通道(4)连接处的宽度最大。
4.如权利要求1-3任一所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备阳膜，所述阳膜具有并行排列的凹槽和柄端，所述凹槽的末端与斜侧部连接，所述斜侧部与柄端连接；将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液浇筑于所述阳膜上，冷却固化后，将固化后的琼脂糖揭起，得到含有叉型微通道结构的琼脂糖层；所述阳膜上的凹槽之间的部分对应形成叉型微通道结构的各个分离通道，所述阳膜上的柄端对应形成叉型微通道结构的汇集通道，所述斜侧部对应形成叉型微通道结构的斜流通道；
S2：在步骤S1中得到的琼脂糖层上打孔，所述孔用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道中，然后将琼脂糖层贴合在基底上，即得到基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片。
5.如权利要求4所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，通过光刻方法或者3D打印方法制备所述阳膜。
6.如权利要求5所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，通过光刻方法制备所述阳膜的方法具体为：将SU-8胶甩于洗净烘干的硅片上，前烘除去SU-
8胶中的溶剂之后，进行光刻，然后进行后烘，之后经显影液显影后，再进行坚膜，即可得到具有所述叉型微通道结构阳膜。
7.如权利要求4所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述琼脂糖溶液的质量浓度为3％-10％。
8.如权利要求4所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述贴合步骤后，包括抽真空的步骤，用于除去琼脂糖层中叉型微通道结构中的气泡和琼脂糖层与基底之间的气泡。
9.如权利要求4所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述基底为亲水性基底。
10.如权利要求9所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，其特征在于，所述基底为玻璃。

说明书全文

一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于外泌体富集平台技术领域，特别提供了一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法。

背景技术

[0002] 外泌体作为细胞外囊泡(EV)的一个重要亚群，其自身及其相关蛋白和核酸已被广泛认为是无创诊断和预后肿瘤生物标志物。外泌体分析目前主要存在两大挑战：一、如何从复杂的细胞基质或体液中分离得到外泌体；二、外泌体直径比细胞小100倍，体积比细胞小1000000倍，且具有高度异质性，如何操控并精准分析。当前，外泌体分离的主流方法是超速离心(差速或密度梯度等)，被认为外泌体分离的“金标准”。但该技术存在明显的缺陷：1、通过高速离心获得的外泌体在形态上容易畸变；2、方法非常耗时，需要20-30小时；3、分离的纯度不高，获得的外泌体夹杂着大量其他微泡。为解决分离问题，最近发展起来的基于外泌体表面特异标志蛋白的免疫亲和方法，如亲和色谱、免疫磁珠或者试剂盒纯化方法，能实现外泌体的快速特异性分离。外泌体分析目前主要还是沿用已有的细胞分析方法。破环性分析，亦即：类似细胞分析一样，将大量外泌体裂解后定性定量分析其组份，需要大量外泌体的样本，但从动物或人的体液中很难获取大量的外泌体，同时此法难以获取原位外泌体完整信息，特别是获取外泌体相关RNA信息。类似细胞分析，成像也是外泌体分析的主要方法，但由于外泌体太小，如何标记并操控、如何提高分辨率等，也是当前面临的全新挑战。研究揭示，当外泌体的癌症筛查指标浓度较低时，单纯外泌体分离后直接检测往往还不能奏效。
外泌体预浓缩后再进行检测将是一个不错的选择。基于微流控芯片外泌体在线浓缩或富集的研究目前还比较少，例如Marczak和同事们借助离子浓差极化初步实现外泌体的在线浓缩(Electrophoresis,Feb 27,2018,39 2029-2038)64，但也仅仅是浓缩并未进一步在线检测。最近，国内孙佳姝课题组则报道了一种热泳适配体集成化芯片，用于特异性外泌体的富集检测，并成功实现了多种癌症血清样品分类和检测，有望实现癌症的早期筛查(Nat Biomed Eng,Mar,2019,3(3):183-193)。此方法虽简单有效，但仍需要复杂外围设备辅助。

[0003] 除了检测外泌体表面特异蛋白，外泌体内蛋白或核酸等，比如microRNAs(miRNAs)也可作为预测和早期诊断癌症转移的替代分子生物标志物。最近的研究表明，miRNA在各种类型的癌细胞(包括乳腺癌细胞)分泌的外泌体中均有表达。有趣的是，大量的实验证据揭示，当miRNA包裹在外泌体中时，比游离RNA更稳定，这为封装在外泌体内的miRNA的检测提供了一种很有前景的方法。最近，Lee等人利用分子信标首次对外泌体多个内部特异核酸进行了原位完整检测，相较于传统的定量PCR破坏性分析，此方法不仅快速方便，同时能保持外泌体的完整性，便于进一步下游分析。但其借助96孔板检测，并无富集步骤，样品消耗量大，且未进行信号放大检测，灵敏度较低。纵观现有方法，由于技术限制，大部分只实现了外泌体的高效分离和裂解释放，并未实现外泌体超敏检测(信号放大)；其二对外泌体的分析大多是破坏性分析，即：将获得的外泌体裂解后进行后续Western Blot(WB)分析蛋白质或定量PCR分析RNA等，并非原位直接检测；其三，外泌体富集并原位双检测(外泌体数量以及内部特异核酸分子的同时检测)仍面临巨大挑战。

[0004] 此外，虽有研究表明病人体液中的外泌体数量比正常人显著增大，其特异标记物水平也比正常人显著升高。但如何区分特异标记物水平升高是由于外泌体数量增大(特异标记物表达水平一致)还是由于特异标记物在外泌体上高特异性富集或高表达(外泌体数量变化不大)造成的，目前也面临巨大挑战。

发明内容

[0005] 本发明解决了现有技术中外泌体富集效率低，检测背景高，以及难以实现外泌体的多种标记物(如特异标记物和非特异标记物)同时检测等技术问题，提供了基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，叉型微通道结构含有斜流通道、汇集通道和多个并行排列的分离通道，多个并行排列的分离通道的末端与斜流通道连接，斜流通道的末端与汇集通道连接，斜流通道与汇集通道呈Y型分布；多个并行排列的分离通道用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道富集到汇集通道中，并用于将样液中的分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。本发明中的芯片，能有效除去游离的探针，有效降低背景，实现了外泌体高效富集。

[0006] 按照本发明的第一方面，提供了一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，包括基底和琼脂糖层，所述琼脂糖层贴合在所述基底表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道、汇集通道和多个并行排列的分离通道，所述多个并行排列的分离通道的末端与斜流通道连接，所述斜流通道的末端与汇集通道连接，所述斜流通道与汇集通道呈Y型分布；所述琼脂糖层上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道中；所述多个并行排列的分离通道用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道富集到汇集通道中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。

[0007] 优选地，所述各个分离通道的宽度为1-100μm，高度为1-100μm。

[0008] 优选地，所述斜流通道呈对称分布，各个所述斜流通道宽度逐渐增大，与汇集通道连接处的宽度最大。

[0009] 按照本发明的另一方面，提供了任一所述的基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：

[0010] S1：制备阳膜，所述阳膜具有并行排列的凹槽和柄端，所述凹槽的末端与斜侧部连接，所述斜侧部与柄端连接；将琼脂糖粉末加热溶解在水溶液中，然后将琼脂糖溶液浇筑于所述阳膜上，冷却固化后，将固化后的琼脂糖揭起，得到含有叉型微通道结构的琼脂糖层；所述阳膜上的凹槽之间的部分对应形成叉型微通道结构的各个分离通道，所述阳膜上的柄端对应形成叉型微通道结构的汇集通道，所述斜侧部对应形成叉型微通道结构的斜流通道；

[0011] S2：在步骤S1中得到的琼脂糖层上打孔，所述孔用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道中，然后将琼脂糖层贴合在基底上，即得到基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片。

[0012] 优选地，通过光刻方法或者3D打印方法制备所述阳膜。

[0013] 优选地，通过光刻方法制备所述阳膜的方法具体为：将SU-8胶甩于洗净烘干的硅片上，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后，进行光刻，然后进行后烘，之后经显影液显影后，再进行坚膜，即可得到具有所述叉型微通道结构阳膜。

[0014] 优选地，所述琼脂糖溶液的质量浓度为3％-10％。

[0015] 优选地，步骤S2中所述贴合步骤后，包括抽真空的步骤，用于除去琼脂糖层中叉型微通道结构中的气泡和琼脂糖层与基底之间的气泡。

[0016] 优选地，所述基底为亲水性基底。

[0017] 优选地，所述基底为玻璃。

[0018] 总体而言，本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

[0019] (1)本发明提供了一种基于叉型结构及琼脂糖材质被动式毛细力进样方式，无需外设进样设备(比如泵或阀)，简单方便，成本低。

[0020] (2)本发明借助琼脂糖的高亲水性及毛细作用力以及封闭末端设计，实现了外泌体高效富集，最低检测线能达到1000个外泌体。

[0021] (3)由于纳米级外泌体肉眼不可见，通常需要借助探针标记，但常规游离探针去除需借助离线离心或过滤步骤，借助本发明中的琼脂糖芯片，其自身纳米级疏松多孔性，能以在线方式，有效除去游离为标记探针，有效降低背景，进一步提高检测灵敏度。

[0022] (4)相较于微滤膜系统，本发明中琼脂糖材质的纳米级疏松多孔性及毛细力的进样动力，避免了滤膜系统容易阻塞的缺点。

[0023] (5)本发明可以同时实现外泌体多种标记物的同时检测，即利用多种不同荧光性质探针同时标记外泌体，利于实现外泌体的定性定量分析。附图说明

[0024] 图1为本发明芯片结构示意图，其中：1-基底、2-琼脂糖层、3-斜流通道、4-汇集通道、5-分离通道。

[0025] 图2为本发明芯片电镜显微结构图。

[0026] 图3为本发明制备芯片所用阳膜的结构示意图，其中：6-凹槽、7-柄端、8-斜侧部。

[0027] 图4是基于软光刻技术加工芯片示意图。

[0028] 图5是本发明外泌体检测示意图。

[0029] 图6是本发明外泌体检测示意图。

[0030] 图7和图8分别为不同浓度PS微球富集效果图及定量分析图。

[0031] 图9和图10分别为不同体积PS微球富集效果图及定量分析图。

[0032] 图11和图12分别为不同浓度PS微球随时间富集效果图及定量分析图。

[0033] 图13为不同浓度外泌体富集效果图。

[0034] 图14和图15分别为单独荧光染料富集效果的明场和暗场图。

[0035] 图16和图17分别为不同细胞来源外泌体被不同荧光染料分子标记后检测效果的明场和暗场图。

[0036] 图18不同细胞来源外泌体检测定量分析图。

具体实施方式

[0037] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0038] 外泌体琼脂糖芯片包括琼脂糖层，琼脂糖层内通道结构示意图如图1所示，其为叉状微通道结构，有多个入口通道即分离通道5，入口通道汇集与对称设计的两条斜流通道3，两条斜流通道3汇集到末端封闭的出口即汇集通道4，于琼脂糖层入口处打一个贯穿孔作为样品引入口，将打孔的琼脂糖层与玻璃层贴合，并短暂真空处理完成最后芯片。图2显示是微流控芯片电镜显微结构图。

[0039] 实施例1

[0040] 图3为本发明制备芯片所用阳膜的结构示意图，图4为该微流控芯片具体的加工过程，其中给出的具体的琼脂糖上层的加工方法如下，芯片高度为10μm。简言之，SU-8阳膜采用标准的光刻技术加工而成。

[0041] 匀胶和前烘：洗净的硅片经氮气吹干后，置于热平板上除湿，150℃加热1小时，此硅片除湿后，将硅片置于等离子体清洗器中进行清洗(时间：2min，电压：800V)。接着将硅片置于匀胶机内，负压吸住后，于硅片中央滴入大约2mL GM1060-SU8胶，匀胶参数为：400rpm×18s、1500rpm×60s，此参数下芯片高度约为10μm。匀胶结束后，至于热平板上前烘，参数为：室温4h，65℃15min，95℃45min。

[0042] 曝光与后烘：前烘结束后，进行曝光操作，曝光时间为45s，曝光结束后可将其立刻置于热平板上进行后烘，后烘参数：65℃15min，95℃40min。

[0043] 显影和坚模：显影的原则是先边缘后中间，能有效避免过显对微通道结构的损害。于直径10cm的玻璃培养皿中倒入约5mL PGMEA溶液，将硅片垂直置于培养皿中，匀速转动硅片使边缘接触显影液，待边缘显净后，将这个硅片有结构的那面朝上的方式整体置于显影液中，微微摇动培养皿，使其充分接触，直至出现流沙状现象，时间约为1-2分钟。此时，将硅片轻轻取出，用二丙酮醇溶液对其进行缓慢冲洗直至结构清晰可见，异丙醇溶液进行定影后氮气吹干，重新置于热平板上坚模，坚模参数为135℃2h，至此阳模制作完成。所述阳膜具有并行排列的凹槽6和柄端7，所述凹槽6的末端与斜侧部8连接，所述斜侧部8与柄端7连接。

[0044] 琼脂糖浇筑、固化以及与玻璃贴合：将琼脂糖粉末与水混合，加热溶解，配置成3％的琼脂糖凝胶，并将其浇注在上述阳膜上，室温或4度冰箱凝固后，利用手术刀片切下琼脂糖片层，得到含有叉型微通道结构的琼脂糖层2；所述阳膜上的凹槽6之间的部分对应形成叉型微通道结构的各个分离通道5，所述阳膜上的柄端7对应形成叉型微通道结构的汇集通道4，所述斜侧部8对应形成叉型微通道结构的斜流通道3；借助体式显微镜和打孔器，在芯片的入口处打出一个直径2mm的贯穿孔，作为试剂及样品的引入口，并与干净的载玻片(76mm×26mm×1.2mm)贴合形成最终的芯片。在滴加样液富集外泌体封装之前，芯片真空处理10秒左右，以除去琼脂糖中通道以及与基底之间存在的残留气泡，利于芯片封装及贴合。

[0045] 实施例2

[0046] 本实施中的阳膜采用3D打印技术完成，芯片高度为5μm。

[0047] 阳膜打印：将设计好的3D模型导入到3D打印中，打印材质为透明树脂，芯片高度为5μm，直接打印即可完成阳膜。

[0048] 琼脂糖浇筑、固化以及与玻璃贴合：将琼脂糖粉末与水混合，加热溶解，配置成5％的琼脂糖凝胶，并将其浇注在上述阳膜上，室温或4度冰箱凝固后，利用手术刀片切下琼脂糖片层。借助体式显微镜和打孔器，在芯片的入口处打出一个直径2mm的贯穿孔，作为试剂及样品的引入口，并与干净的透明树脂薄片贴合形成最终的芯片。在滴加样液富集外泌体封装之前，芯片真空处理10秒左右，以除去琼脂糖中通道以及与基底之间存在的残留气泡，利于芯片封装及贴合。

[0049] 实施例3

[0050] 一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，包括基底1和琼脂糖层2，所述琼脂糖层2贴合在所述基底1表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道3、汇集通道4和多个并行排列的分离通道5，所述多个并行排列的分离通道5的末端与斜流通道3连接，所述斜流通道3的末端与汇集通道4连接，所述斜流通道3与汇集通道4呈Y型分布；所述琼脂糖层2上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道5中；所述多个并行排列的分离通道5用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道3富集到汇集通道4中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。

[0051] 所述各个分离通道5的宽度为1μm，高度为1μm。

[0052] 实施例4

[0053] 一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，包括基底1和琼脂糖层2，所述琼脂糖层2贴合在所述基底1表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道3、汇集通道4和多个并行排列的分离通道5，所述多个并行排列的分离通道5的末端与斜流通道3连接，所述斜流通道3的末端与汇集通道4连接，所述斜流通道3与汇集通道4呈Y型分布；所述琼脂糖层2上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道5中；所述多个并行排列的分离通道5用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道3富集到汇集通道4中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。

[0054] 所述各个分离通道5的宽度为500μm，高度为500μm。

[0055] 实施例5

[0056] 一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片，包括基底1和琼脂糖层2，所述琼脂糖层2贴合在所述基底1表面；所述琼脂糖层内设置有叉型微通道结构，所述叉型微通道结构含有斜流通道3、汇集通道4和多个并行排列的分离通道5，所述多个并行排列的分离通道5的末端与斜流通道3连接，所述斜流通道3的末端与汇集通道4连接，所述斜流通道3与汇集通道4呈Y型分布；所述琼脂糖层2上表面具有孔洞，所述孔洞用作进样口，用于将含有外泌体的样液流经叉型微通道结构的各个分离通道5中；所述多个并行排列的分离通道5用于将含有外泌体的样液中的外泌体通过斜流通道3富集到汇集通道4中，并用于将样液中的杂质分子从琼脂糖凝胶的孔隙中排出。

[0057] 所述各个分离通道5的宽度为100μm，高度为100μm。

[0058] 所述斜流通道3呈对称分布，各个所述斜流通道3宽度逐渐增大，与汇集通道4连接处的宽度最大。

[0059] 实施例6

[0060] 本实施中介绍如果用所述芯片进行外泌体高效富集及检测，如图5所示，利用非特异性胆固醇-Cy3探针标记全部外泌体，利用PD-L1-适配体-FITC探针标记特异性PD-L1蛋白表达的外泌体。

[0061] 将含有外泌体和对应探针(胆固醇-Cy3和PD-L1-适配体-FITC)共同孵育30分钟后，引入到琼脂糖-玻璃杂合芯片入口，琼脂糖浓度为4％，借助琼脂糖材质的超亲水性、水渗透性以及纳米级多孔性，胆固醇-Cy3和PD-L1-适配体-FITC标记的外泌体可以自动富集在微通道的封闭出口处，而过量的未结合探针可以流过纳米级多孔琼脂糖凝胶，借助双通道成像，从而实现外泌体的快速富集及高效检测，具有操作方便，高效，以及成本低等特点。

[0062] 实施例7

[0063] 如图6所示，利用非特异性DSPE-Cy3(二酰基脂质diacyl lipid，DSPE)探针标记全部外泌体，利用CD63抗体-FITC探针标记特异性CD63蛋白表达的外泌体。

[0064] 将含有外泌体和对应探针(DSPE-Cy3和CD63抗体-FITC)共同孵育30分钟后，引入到琼脂糖-玻璃杂合芯片入口，琼脂糖浓度为4％，借助琼脂糖材质的超亲水性、水渗透性以及纳米级多孔性，DSPE-Cy3和CD63抗体-FITC标记的外泌体可以自动富集在微通道的封闭出口处，而过量的未结合探针可以流过纳米级多孔琼脂糖凝胶，借助双通道成像，从而实现外泌体的快速富集及高效检测，具有操作方便，高效，以及成本低等特点。

[0065] 实施例8

[0066] 为了评估本发明的可行性，我们采用荧光聚苯乙烯纳米颗粒(PS)进行各种实验参数评估。所选PS的平均直径为100nm，与外泌体的特征尺寸范围基本一致。随后，通过在芯片样品入口处引入不同梯度浓度的10倍稀释PS悬浮液，测试了其在定量体积(10μL)下不同浓度PS悬液以及定量浓度(1×107颗粒/mL)下不同体积的PS悬液的富集效率。浓缩后，计数通道末端的PS并显微成像获取相应的荧光强度。图7和图8分别为不同浓度PS微球富集效果图及定量分析图，荧光强度随着PS浓度的增加呈指数增加。通过其浓度乘以体积计算颗粒的绝对数量。荧光强度随着PS体积的增加而线性增加，图9和图10分别为不同体积PS微球富集效果图及定量分析图。结果显示，所提芯片具有较高的绝对检测灵敏度，检测限(LOD)约为～103个外泌体，且样品体积极低(低至1μL)。此外，我们还进一步研究了三个初始浓度(1×108个颗粒/mL，5×106个颗粒/mL和PBS，对应0个颗粒/mL)下富集动力学，结果表明荧光强度在10分钟内以稳定的方式增长，图11和图12分别为不同浓度PS微球随时间富集效果图及定量分析图。当施加较高浓度的PS悬液时，荧光强度在达到最高值后轻微下降，可能是由于PS在富集区域中的分散或荧光漂白所致。

[0067] 实施例9

[0068] 为了验证所提芯片技术富集外泌体的效率，将获得的外泌体实施与上述PS相同的实验方案。众所周知，适体或脂质纳米探针，包括单酰基脂质(monoacyl lipid，C18)，二酰基脂质(diacyl lipid，DSPE)和胆固醇(cholesterol，Chol)等作为替代亲和试剂也可用于外泌体检测和分析。为了在富集期间更好地追踪完整的外泌体，在将其引入芯片检测之前，外泌体将与Chol-Cy3非特异性标记预先孵育。如图13所示，由于琼脂糖凝胶毛细管效应和强渗透性，定量体积为10μL的不同浓度的标记外泌体可以在微通道的封闭端自动富集。此外，无需任何复杂的洗脱或洗涤步骤，游离探针可自动流过纳米级多孔琼脂糖凝胶，利于降低背景，提高灵敏度及检测线。

[0069] 实施例10

[0070] 本实施例中，将外泌体非特异标记探针Chol-Cy3，miR-21对应的发夹核酸探针MB共同与外泌体孵育后导入到芯片。单独染料分子可以自由通过琼脂糖凝胶，而不被富集(图14和图15)。如图16和图17所示，MCF-7细胞来源的外泌体中信号A、B均显示出明显荧光强度(信号A来源于Chol-Cy3标记，信号B来源于miR-21导致发夹结构打开，荧光淬灭得以恢复)。
而HUVEC细胞来源的外泌体内信号B的荧光强度明显低于前者。有趣的是，借助非特异性标记策略，来自两种细胞系的同等量的外泌体的信号A荧光强度几乎没有差异。为了使其更加合理和准确，可通过荧光比(B/A)进一步定量计算结果。如图18所示，来自MCF-7细胞的外泌体的荧光比(B/A)远高于来自HUVEC细胞的外泌体，验证了所述芯片可以用于疾病的早期快速检测。

[0071] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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蓄电器件用电极、蓄电器件和蓄电器件用电极的制造方法	2020-05-08	149
由包含铼和/或钌的超合金制成的涡轮部件以及相关制造方法	2020-05-08	860
硅/无定形碳/石墨烯锂离子电池负极材料的制备方法	2020-05-11	72
硅碳负极材料及其制备方法和应用	2020-05-11	897
研磨用组合物	2020-05-08	445
基于表面等离激元的硅基纳米激光器及其制备方法	2020-05-08	921
一种用于蓄电池的散热通风结构	2020-05-08	283
一种硅基纳米级弯曲切趾光栅的制备方法	2020-05-08	927
负极补锂添加剂及其制备方法	2020-05-11	592
有机氢氯硅烷生产工艺	2020-05-08	351

一种基于琼脂糖的外泌体富集微流控芯片及制备方法

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