本発明は、乾燥形態の酵素組成物、及び液体形態の酵素組成物を調製するためのこれらの酵素組成物の使用に関する。

動物を治療するための酵素の使用は周知である。酵素は、動物に利用可能なエネルギー及び/又は栄養素を増加させるなどして、飼料の消化率を改善し栄養価を向上させるために、動物飼料に添加されることが多い。

しかし、酵素が飼料添加物として有する多くの利益にもかかわらず、それらの使用は限られており、多くの欠点を有する。酵素はタンパク質であり、したがって、温度及びpHのような多くの環境パラメータに対して感受性である。

飼料製品の調製において、使用前に一定時間、酵素溶液を保存することがしばしば望ましい。有効性を維持するために酵素を保存するために必要とされる環境条件は、しばしば汚染を引き起こす可能性のある微生物の生育にとって最適な条件となる。

抽出された酵素は、それらの本来の環境、例えば細胞コンパートメント、細胞外液にない場合、しばしば不安定であり得るし、最適な条件が維持されない場合、適切に機能しないか、又は溶解し続けない可能性がある。例えば、タンパク質分解又は凝集の結果として活性が失われる可能性がある。保存寿命は、数日から1年超まで変動し得、酵素の性質及び使用される保存条件に依存する。

一般に、液体酵素は、本質的に、粒状又は乾燥形態の酵素よりも安定性が低い。水性環境はまた、微生物の増殖の重大なリスクをもたらす。異なる酵素を保存のために一緒に混合すると、安定性及びリスクがさらに増大する。

室温での保存は、一般に、例えば、微生物の増殖、加水分解又はタンパク質分解のために、わずか数時間後にタンパク質分解及び/又は酵素不活化を生じる。

低温、例えば約4℃での保存は当該技術分野では保存寿命を延ばすことが知られているが、微生物及びタンパク質分解は依然として一般的であり、しばしば不可避である。さらに、低温で多量の液体酵素を保存することは、設備と冷却エネルギーの両方に比較的高いコストを伴う。

酵素の凍結乾燥(通常は凍結による)も場合によっては使用され、分解を最小限にしてはるかに長い保存寿命を提供する。

タンパク質安定化溶液及び添加剤はまた、保存安定性を増加させ、酵素溶液の保存寿命を延ばすことも知られている。アジ化ナトリウム(NaN₃)のような抗菌剤もまた公知であるが、これらはしばしばまた酵素の構造を損傷させ、従って活性を阻害する。さらに、NaN₃は急性毒性であり、その後の飼料用途には適さない。

CN101617740は、ペレット化動物飼料に噴霧することを意図した液体フィターゼ製剤を開示している。ペレット化プロセスの前に、粉末、顆粒又は丸剤の形態の固形製剤を飼料に添加しなければならなかったので、液体製剤が好ましかったのである。しかしながら、ペレット化プロセスの間、供給物はより高い温度に、特に70℃より高い温度にさらされ、その結果フィターゼ酵素がその活性の少なくとも一部を失う。事実、動物飼料に一般的に使用されているフィターゼ酵素は、60℃の温度からすでに活性を失い始めるのである。

液体フィターゼ製剤の欠点は、乾燥フィターゼ製剤と比較して保存安定性が低いことである。液体製剤の保存安定性を高めるために、CN101617740は、ポリエチレングリコールを添加して酵素分子及び安定剤、特にトレハロースを保護し、溶液の浸透圧を高めて酵素を安定化することを開示する。安息香酸ナトリウムをさらに保存料として添加し、溶液のpHを4.5〜5のpHで緩衝させた。これらの添加剤により、酵素の活性の損失は、室温で6ヶ月間保存した場合、−40%から−10%に低下し、40℃の温度で6週間保存した場合には−40%から−17%に低下した。

CN101617740に開示されている液体製剤の欠点は、非常に多くの添加剤、すなわち例えば1000kgの溶液あたり約30kgのポリエチレングリコール、50kgのトレハロース、0.5kgの安息香酸ナトリウム及び20kgの0.5MHClを使用しなければならないことである。一般に、液体酵素製剤の欠点は、冷却条件下(たとえ低温条件下で保存してもその保存安定性が乾燥製剤よりも低い)で保存しなければならず、乾燥配合物と比較して、はるかに多量の酵素溶液を保存し、取り扱い、輸送する必要がある。これらの欠点にもかかわらず、飼料配合物へのペレット化プロセスの前に乾燥酵素配合物を混合するときの酵素活性の喪失を考慮して、CN101617740において液体配合物が好ましいとされたのである。

国際公開第2014/159185号パンフレットはまた、飼料ペレットに噴霧することができる液体酵素製剤及びペレット化する前に飼料と混合することができる顆粒化酵素製剤を開示している。液体酵素製剤は、フィターゼ、バッファー、安定剤、特にトレハロース、及び抗菌剤、特に安息香酸ナトリウムを含む。粒状化酵素製剤は、とりわけ、担体及びフィターゼを含む。担体は、例えば、小麦粉又はデンプンを含み、したがって水に溶解せず、例えば20℃の低温、すなわち酵素を失活させない温度では特に、水に溶解しない。

したがって、飼料に噴霧することができるが、保存安定性、保存条件、及び保管され、輸送され、処理されることが必要とされる大量の水に関して、既知の液体酵素製剤の欠点を示さない新規で改良された酵素組成物が必要とされている。

本発明によれば、第1の態様から明らかなように、1種以上の水溶性飼料用酵素、安息香酸の塩及び弱酸を含む酵素組成物が提供され、その酵素組成物は乾燥形態であり、これは液体形態で酵素組成物を提供するために水に溶解可能であり、この液体酵素組成物は、水溶性粉末中に存在する弱酸によってpH5以下に緩衝される。

酵素組成物が乾燥形態であるという事実のために、それは既知の安定化溶液よりもずっと優れた良好な保存安定性を有する。さらに、制御されていない保存条件下で、よりコンパクトな空間に保存することができ、より小さな重量及び体積のために、輸送及び取り扱いがより容易になる。酵素組成物は、水に容易に溶解することができ、飼料に噴霧される直前に水に容易に溶解することができる。それは、例えば1週間未満又は1日(24時間)未満のような短時間の間だけ液体形態で保存されればよいので、この保存期間の間、液体がより高い温度、例えば20℃より高い温度で保存される場合でさえも、酵素活性は失われないか、ほとんど失われない。したがって、安定剤を酵素製剤中に提供する必要がなく、特に水溶性乾燥製剤中に提供する必要がない。安定剤は酵素を安定させたまま完全に水溶性の乾燥製剤を製造することをはるかに困難にするのである。

乾燥製剤を水に溶解することによって得られる液体製剤の比較的低いpHのために、ベンゾアート塩(安息香酸塩)は抗微生物活性酸形態に部分的に変換される。液体製剤は、弱酸と安息香酸の塩との反応によって形成された弱酸の共役塩の存在によって規定のpH値に緩衝化される。

いくつかの実施形態において、安息香酸の塩は、安息香酸ナトリウムを含み得る。

いくつかの実施形態では、酵素組成物は、前記ベンゾアートを少なくとも3.0重量%の量、好ましくは少なくとも4.0重量%の量、より好ましくは少なくとも5.0重量%の量で含むことができるが、好ましくは15重量%未満の量で、より好ましくは10重量%未満の量で含むことができる。

いくつかの実施形態において、液体酵素組成物は、水溶性酵素組成物中に存在する弱酸によって4.5以下のpHに緩衝化され得る。液体組成物のpHは、pH4.3〜pH4.5であってもよい。

いくつかの実施形態では、飼料用酵素は、乾燥飼料組成物中に少なくとも75重量%の量、好ましくは少なくとも80重量%の量、より好ましくは少なくとも85重量%の量で存在することができる。

飼料用酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、セルロース、カルボヒドラーゼ、ヘミセルロース、リパーゼ及びキシログルカナーゼからなる群から選択される1種以上の酵素を含むことができる。一実施形態では、酵素はフィターゼ、特に4未満のpHで最適に作用するフィターゼを含む。別の実施形態では、酵素はキシラナーゼ、好ましくはセルロース及び/又はヘミセルロースを含む。

いくつかの実施形態では、酵素組成物は、水溶性粉末の形態であり得る。他の実施形態では、酵素組成物は、水溶性顆粒の形態であり得る。

いくつかの実施形態では、乾燥酵素組成物は、20℃の温度で蒸留水に10g/lの量で完全に可溶性である。

水溶性粉末は好ましくは自由流動性である。これは、固化防止剤、特にシリカを含有してもよい。シリカは乾燥配合物中に1〜3重量%の量、好ましくは約2重量%の量で存在することができる。

いくつかの実施形態において、弱酸は、クエン酸、特にクエン酸一水和物を含み得る。

本発明によれば、第2の態様から明らかなように、本発明の第1の態様による水溶性酵素組成物を水に溶解する液体形態の酵素組成物の調製方法が提供される。

いくつかの実施形態では、液体酵素組成物は、調製後1週間未満以内、好ましくは1日未満以内に動物飼料と混合される。

いくつかの実施形態では、ベンゾアート及び安息香酸は、約0.01重量%〜約1.5重量%の量で液体酵素組成物中に存在し得る。いくつかの実施形態において、ベンゾアート及び安息香酸は、約0.05重量%〜約0.15重量%の量で存在し得る。

本発明によれば、第3の態様から明らかなように、飼料配合物を調製するための方法であって、 本発明による酵素組成物を乾燥形態で提供する工程; 場合により組成物を一定期間保管すること; 乾燥酵素組成物を水に溶解する工程; 溶解した酵素組成物を飼料混合物、特に飼料ペレットにスプレーする工程 を含む方法が提供される。

本発明は、添付の図面を参照してさらに説明される。

図1は、水に溶解後0日目、3日目及び15日目に飼料用酵素フィターゼを含む、本発明による酵素組成物の酵素活性を示すチャートである。

図2は、水への溶解後0日目、3日目及び15日目の、図1の酵素組成物中の微生物数を示すチャートである。

図3は、水に溶解後0日目、3日目及び15日目の、飼料用酵素キシラナーゼを含む、本発明による酵素組成物の酵素活性を示すチャートである。

図4は、水への溶解後0日目、3日目及び15日目の、図3の酵素組成物中の微生物数を示すチャートである。

詳細な説明 定義 用語「酵素」は、特定の化学変化を引き起こす触媒として作用する物質、例えば、タンパク質を指す。例えば、フィターゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、セルロース、カルボヒドラーゼ、ヘミセルロース、リパーゼ。

「飼料用酵素」又は「食品用酵素」という用語は、食物又は飼料の分解又は消化に特異的に適合し得る動物の消化管において典型的に見出される酵素を指す。例えば、酵素フィターゼは、種子及びナッツに一般的に見られるフィチン酸の加水分解を触媒する。これらの酵素は、天然源又は合成源から得ることができ、インビボ又はインビトロで増殖させることができる。

酵素に関連して「活性」という用語は、当業者には容易に理解されるであろう。例えば、酵素活性は、1分間に1マイクロモルの基質の変換を触媒する量を指すことができる。酵素活性は関連する標準、例えば、フィターゼ活性についてはISO30024:2009を用いて測定することができる。代替酵素の活性を測定するための関連する標準的方法は、当技術分野で公知であろう。

酵素活性の変化、例えば酵素活性の低下は、pH、温度、競合的又は非競合的阻害剤、及び固定化剤のような因子によって引き起こされる可能性がある。いくつかの場合における酵素活性の有意な変化は、元の活性の50%未満の酵素活性の低下を意味し得る。いくつかの実施形態によれば、元の活性の50%未満の酵素活性は、酵素活性の有意な変化、例えば減少又は低下をもたらす。酵素活性の有意な変化は、例えば、酵素、保存条件及び酵素組成物の意図された用途に依存して変化することが理解されよう。酵素活性の有意な変化(すなわち、50%未満)は、依然として特定の用途における本発明の組成物の酵素活性の要件を満たすことも理解されよう。

用語「ベンゾアート」は、当業者に知られており、化学式C₇H₅O₂−のアニオンを指す。アニオンは安息香酸(C₆H₅COOH)の塩及びエステル、例えば安息香酸ナトリウムに通常見出される。

「バッファー」という用語は、酸性又は塩基性であれ、pHの変化に抵抗し得る1つ又は複数の化合物を指す。バッファーは、一般に、1つ以上の弱酸及びそれらの対応する共役塩基を含む水溶液の形態である。しかし、バッファーは、pHを緩衝する溶液に添加され得る液体(水性)形態又は乾燥形態で提供され得る。適切なバッファーは、例えば、クエン酸塩(シトラート)、アコニット酸塩(アコニタート)、酢酸塩(アセタート)、コハク酸塩(スクシナート)、マレイン酸塩(マレアート)、リン酸塩(ホスファート)、ホウ酸、炭酸塩(カーボナート)などを含む。本発明の1つの実施形態では、バッファーはクエン酸塩(シトラート)である。有利には、クエン酸塩(シトラート)は安全で経済的であり、多くの異なる種類の食品及び飼料添加物の安定した緩衝を提供することができる。

「飼料配合物」という用語は、飼料又は食物の組成物を指す。飼料配合物中の各成分の量は、しばしば定量化され、特定の栄養要求に適した量で選択される。成分は、混合して飼料混合物を形成することができる。

「機能性」という用語は、酵素に関して容易に理解されるであろう。例えば、機能性は、例えば保存後の、酵素に保持されている機能性パーセンテージとして表すことができる。

酵素に関する「保存」、「保存寿命」、「湿度」という用語は、当業者には容易に理解されるであろう。しかし、これらは、本発明の組成物の地理的位置がどこにあるかによって変化し得る。

本発明の酵素組成物に関する「温度」という用語は、例えば、インキュベーション温度、試験温度、保存温度を指してもよい。いくつかの実施形態において、インキュベーション温度は約30℃であり得、試験温度は例えば、酵素活性を試験するために約50℃であり得る。

「微生物増殖」という用語は、微生物の集団の拡大、繁殖、増殖(proliferation)又は増殖(propagation)を指す。細菌、真菌、ウイルス又は藻類である。

微生物増殖の制御に関して「制御する」という用語は、例えば、ISO4833−2:2013によって決定されるような、前記微生物の集団の増加又は増殖又は前記微生物の増殖率の変化、例えば減少又は低減を指す。増殖の制御はまた、微生物の増殖又は死の完全な阻害を意味し得る。

用語「期間」は、任意の長さの時間を意味すると理解される。例えば、酵素組成物の保存に関して、いくつかの実施形態では、酵素組成物は、1時間以上、1日以上、又は1週間以上の期間保存することができる。いくつかの実施形態では、酵素組成物を1日、3日間又は15日間保存する。

本発明によれば、第1の態様から明らかなように、1種以上の水溶性飼料用酵素、安息香酸の塩及び弱酸を含み、液体形態で酵素組成物を提供するために水に溶解可能な乾燥形態の酵素組成物であって、液体酵素組成物が水溶性粉末中に存在する弱酸によってpH5以下に緩衝される酵素組成物が提供される。乾燥酵素組成物を水に溶解する際に得られるpHは、特に乾燥組成物10gを蒸留水1リットルに20℃の温度で溶解することにより測定される。酵素組成物は、蒸留水に20℃の温度で10g/lの量で完全に溶解することが好ましい。

液体製剤中の酵素の必要濃度に依存して、乾燥酵素組成物を水中に異なる量で溶解させることができる。いくつかの実施形態では、乾燥酵素組成物は、水1リットル当たり少なくとも1g、好ましくは少なくとも3g、より好ましくは少なくとも5g、最も好ましくは少なくとも7gの量で溶解される。いくつかの実施形態において、乾燥酵素組成物は、水1リットル当たり100g以下、好ましくは75g以下、より好ましくは50g以下、最も好ましくは25g以下の量で溶解される。

本発明の乾燥酵素組成物は、微生物の増殖を実質的に示さず、室温で1年間保存した場合、酵素活性の有意な変化を示さない。

さらに、本発明の酵素組成物は最適化され、酵素安定性と酵素機能との間のバランスが達成される。

本発明の教示に従って、酵素組成物の活性は、液体の形態で保存中、すなわち水に溶解した後、20℃で、3日以上、5日以上、10日以上、15日以上、20日以上、酵素組成物に対する微生物汚染が実質的に低減されているか又は全くない状態で維持することができる。

本発明の酵素組成物を液体の形態で20℃で3日以上、5日以上、10日以上、15日以上、20日以上保存した場合、酵素組成物に対する微生物汚染が実質的に減少しているか又は全くなしに、80%以上、85%以上、90%以上又は99%以上の酵素活性を維持することができる。

いくつかの実施形態において、安息香酸の塩は、安息香酸ナトリウム又は安息香酸カリウムを含む。

一実施形態では、安息香酸の塩は、安息香酸ナトリウムを含む。驚くべきことに、安息香酸ナトリウムの添加は、酵素活性を有意に低下させることなく、溶解した酵素生成物中の微生物の増殖を妨げるか又は実質的に減少させることが見出された。

いくつかの実施形態において、ベンゾアート塩(安息香酸塩)は、約0.01wt%〜約1.5wt%の量で溶解した製剤中に存在する。ベンゾアート塩(安息香酸塩)は、約0.05重量%〜約1.1重量%の量で存在してもよい。一実施形態では、溶解した酵素組成物は、約0.1重量%のベンゾアート塩(安息香酸塩)を含む。ベンゾアート塩(安息香酸塩)は、約0.9重量%〜約1.1重量%の量で存在してもよい。一実施形態では、酵素組成物は約1重量%のベンゾアート塩(安息香酸塩)を含む。

抗菌剤としてのベンゾアートの認識された機能は、本発明に組み込まれる。さらに、ベンゾアートの官能性は、例えばpHのような条件に応じて、変化、例えば低減又は強化され得る。

非解離形態の安息香酸は、活性抗菌剤である。安息香酸は、水に僅かしか溶けないので、乾燥製剤に含まれるのには適していない。安息香酸ナトリウムのようなベンゾアートは、高度に可溶性であり、酸性条件下、例えば、pH<5で、解離していない安息香酸に変換する。したがって、本発明では、酵素組成物をpH≦5に緩衝化する。

いくつかの実施形態では、溶解した組成物のpHは約pH5以下である。溶解した組成物のpHは約pH4〜約pH4.8である。一実施形態では、溶解した組成物のpHは、約pH4.0〜4.5、好ましくは約pH4.3〜4.5である。溶解した酵素溶液中の0.1重量%及び1重量%安息香酸ナトリウムの異なる濃度の有効性を評価すると、4.3〜4.5の範囲の標的pHが酵素及びベンゾアートの最適な作用を確実にすることが判明した。

酸性条件下、特にpH4.5以下では、安息香酸ナトリウムは静菌剤、静真菌剤及び保存剤である。EナンバーE21の食品添加物として使用されることが多い。安息香酸ナトリウムは化学式NaC₇H₅O₂を有し、これは動物の食品添加物又は飼料として許容される。

いくつかの実施形態では、水溶性乾燥酵素組成物は、少なくとも75重量%、好ましくは少なくとも80重量%、より好ましくは少なくとも85重量%の量で前記水溶性飼料用酵素を含む。

いくつかの実施形態では、飼料用酵素は、溶解した組成物の最終体積の少なくとも0.05重量%の量で存在することができる。いくつかの実施形態では、飼料用酵素は、溶解した酵素組成物中に少なくとも0.5重量%の量で存在し得る。

いくつかの実施形態では、酵素は、約0.2重量%〜約10重量%の量で液体組成物中に存在し得る。いくつかのさらなる実施形態では、酵素は、約0.2重量%〜約5重量%の量で存在し得る。他の実施形態では、酵素は、約0.2重量%〜約2重量%の量で存在し得る。酵素はまた、約0.2重量%〜約1重量%の量で存在してもよい。一実施形態では、組成物は約0.7重量%の飼料用酵素を含む。酵素は、約1重量%〜約2重量%の量で存在し得る。一実施形態では、組成物は約1.5重量%の酵素を含むことができる。

別の実施形態では、飼料用酵素は、液体組成物中に、約0.05重量%〜約1重量%の量で、約0.5重量%〜約1重量%の量で、0.6重量%〜約0.8重量%の量で存在し得る。

別の実施形態では、飼料用酵素は、液体組成物中に、約1重量%〜約2.5重量%の量で、約1重量%〜約2重量%の量で、約1.4重量%〜約1.6重量%の量で存在し得る。

液体組成物中に存在する酵素の量は、その活性及び所望の投与量に依存することが理解されよう。

酵素は、当該分野で公知の任意の適切な飼料用酵素であり得る。酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼ、セルロース、カルボヒドラーゼ、ヘミセルロース、リパーゼ及びキシログルカナーゼからなる群から選択される1種以上の酵素を含み得る。一実施形態では、酵素はフィターゼ及び/又はキシラナーゼである。一実施形態では、酵素は、フィターゼ、キシラナーゼ又はα−ガラクトシダーゼ又はそれらの組み合わせである。一実施形態では、酵素は、4.0未満のpHで最適に作用するフィターゼである。4未満のpHで最適に作用するフィターゼの非限定的な例は、特に市販の3−及び6−フィターゼである。

例えば、本発明の酵素組成物は、水溶性粉末、顆粒、ペレット凍結乾燥、凍結乾燥又は任意の他の適切な乾燥形態の形態であってもよい。

いくつかの実施形態では、酵素組成物を液体形態で提供することができ、例えば、乾燥酵素組成物を水に溶解することによって酵素を溶解状態で提供することができる。

本発明によれば、第2の態様から明らかなように、本発明の第1の態様による水溶性酵素組成物を水に溶解した液体形態の酵素組成物の調製方法が提供される。。いくつかの実施形態では、乾燥酵素組成物は、水1リットル当たり少なくとも1g、好ましくは少なくとも3g、より好ましくは少なくとも5g、最も好ましくは少なくとも7gの量で溶解される。いくつかの実施形態において、乾燥酵素組成物は、水1リットル当たり100g以下、好ましくは75g以下、より好ましくは50g以下、最も好ましくは25g以下の量で溶解される。

いくつかの実施形態において、液体酵素組成物は、調製後1週間未満以内、好ましくは1日未満以内に動物飼料と混合される。したがって、酵素噴霧ステーションにおいて温度が室温よりも高い場合でも、酵素の活性は完全に又はほぼ完全に維持される。

本発明の酵素組成物は、飼料配合物中の成分又は含有物であってもよい。酵素の成分

乾燥組成物を水に溶解することによって調製された液体組成物は、飼料に適用される前に、ある期間保存され得る。この期間は、酵素組成物が使用前に、例えば数分から1日又は数日又は数週間保存される必要がある任意の適切な期間であり得ることが理解されるであろう。好ましくは、本発明の酵素組成物を20℃で3日以上、5日以上、10日以上、15日以上、20日以上保存した場合、酵素組成物への微生物汚染が実質的に減少しているか、又は全くなしに、80%以上、85%以上、90%以上又は99%以上の酵素活性を維持することができる。

飼料配合物は動物飼料の調製に使用することができる。飼料配合物は、使用直前に調製してもよく、又は有意な酵素活性を失うことなく、及び動物飼料と混合する前、特に動物飼料に液体組成物を撒布する前に、短期間、例えば1週間未満又は1時間未満又は数時間未満保存してもよい。

本発明の酵素組成物は、水に溶解した後、3日以上、1週間以上、15日以上、3週間以上の期間保存すると50%以上、60%以上、70%以上、80%以上の機能性を維持することができる(図1及び3参照)。

溶解した酵素組成物は、3日以上、1週間以上、15日以上、3週間以上の期間保存した場合、85%以上の機能性、90%以上の機能性、95%以上の機能性、99%以上の機能性を維持することができる(図1及び図3を参照)。

酵素の機能は、その通常の機能を果たす能力であり、例えば、フィターゼの機能は、フィチン酸の加水分解を触媒することである。酵素の機能性は酵素の活性に大いに関連しており、したがって酵素の機能性の低下はしばしば酵素活性の低下に関連することが理解されるであろう。酵素の機能性、例えば温度、光、湿度の低下を引き起こし得る他の因子が存在し得ることが理解されるであろう。

特に水に溶解された場合、本発明の酵素組成物は、酵素活性に有意に影響を及ぼすことなく、微生物の増殖を有意に減少させるか又は実質的に全く示さない。

微生物の増殖とは、微生物体、例えばウイルス、真菌、細菌又は藻類の増殖を指すことが理解されるであろう。増殖の制御は、微生物の集団の増殖又は繁殖の減少、微生物の増殖の完全な阻害又は死、又はこのスペクトルにおける制御のレベルを意味し得る。

実験 次に、本発明の酵素組成物の製造方法について説明する。

方法 フィターゼ及びキシラナーゼを含む私有の酵素は、水溶性粉末又は顆粒(それぞれWSP又はWSG)として提供された。これらの酵素を、飼料配合物調合用の調製装置の水槽に、それぞれ7g/L(フィターゼ)及び15g/L(キシラナーゼ)の濃度で溶解した。

酵素溶液中の0.1重量%及び1重量%安息香酸ナトリウムの異なる濃度の有効性を評価した。

私有のフィターゼの水溶性ペレット(WSP)を7g/Lの濃度で水に溶解し、4.3−4.5のpHに緩衝した。0.1重量%及び1重量%の安息香酸ナトリウムをそれぞれ含む2つの試験溶液を調製した。

私有のキシラナーゼの水溶性ペレット(WSP)を15g/Lの濃度で水に溶解し、pHを4.3−4.5に緩衝化した。0.1重量%及び1重量%の安息香酸ナトリウムをそれぞれ含む2つの試験溶液を調製した。

適切な量のクエン酸を用いて、各酵素溶液をpH4.3〜4.5で緩衝化した。4.3〜4.5の範囲の標的pHが酵素及び安息香酸ナトリウムの最適な作用を確実にすることが判明した。

飼料ミル及び飼料工場に見出される標準レベルの微生物汚染を、例えば塵の形成から再現するために、各実験において溶液1リットルあたり0.1グラムの微細飼料を添加した。30℃で酵素組成物を溶解し、インキュベートした後、0日目、3日目及び15日目に、総好気性微生物数及び酵素活性をアッセイした。

フィターゼに関して、酵素活性は、標準ISO30024:2009方法(http://www.iso.org/iso/iso catalogue/catalogue tc/cataiogue detail.htm? csnumber=45787)を用いて測定した。ISO30024:2009は飼料サンプル中のフィターゼ活性の測定を規定しており、もっぱらフィターゼ活性の測定及びもっぱら完全飼料でのみ検証されている。

好気性微生物の増殖は、標準的ISO4833−2:2013方法(http://www.iso.org/iso/catalogue detail.htm?csnumber=59509)を使用して測定した。ISO4833−2:2013は、30℃で好気的にインキュベートした後、固体培地の表面上に増殖してコロニーを形成することができる微生物の列挙のための水平方法を規定している。この方法は、人間の摂取又は動物飼料用の製品、ならびに食品及び飼料生産及び食品処理分野の環境試料に適用することができる。

キシラナーゼ(エンド−1,4−β−D−キシラナーゼ)については、Magazymeからのキシラザイム錠を用いてpH4.7及び50℃で酵素活性を測定した。キシラナーゼ活性はエンドペントサナーゼ単位(EPU)で表現される。EPU単位は、既知の活性を有するエンド−1,4−β−キシラナーゼ酵素及び標準添加法を用いて計算される。1EPUは、pH4.7及び50℃で、オート麦のキシランから毎分0.0083ピコモルの還元糖(キシロース当量)を放出する酵素の量である。

結果 図1は、0日、3日及び15日の期間、30℃での溶解及びインキュベーション後のフィターゼ活性をftu/g(フィターゼ単位/グラム)で示す。0.1%安息香酸ナトリウムを含む酵素組成物は、15日目に最良の活性を保持する。

図2は、図1の酵素組成物の好気性微生物増殖を同じ時間期間で示す。0.1%又は1%の安息香酸ナトリウムを含有する溶液には微生物の増殖は見られなかった。

図3は、0日、3日及び15日の期間、30℃での溶解及びインキュベーション後のepu/g(キシラナーゼ単位/グラム)におけるキシラナーゼ活性を示す。酵素の活性は、ベンゾアートの存在によって3日又は15日で影響されなかった。

図4は、同じ期間における図3の酵素組成物の好気性微生物増殖を示す。0.1重量%又は1重量%の安息香酸ナトリウムを含有する溶液中に微生物の増殖は見られなかった。15日目には、好気性細菌増殖も対照において抑制された。これは、15日目の培養上部で明らかになった真菌の伸長に起因する競合阻害によって引き起こされた可能性が高い。

したがって、酵素組成物は、飼料配合物の調製に適用及び使用される前に、少なくとも15日間水槽に保存され得ることが見出された。