技术领域
[0001] 本
发明属于
生物化工领域，具体涉及一种发酵制备长链二元酸的方法。
背景技术
[0002] 长链二元酸（Long chain dicarboxylic acids）是指
碳链中含有10个以上碳
原子的脂肪族二
羧酸（简称DCn），包括饱和及不饱和二羧酸，是一类有着重要和广泛工业用途的精细化工产品。同时也是化学工业中合成高级香料、高性能尼龙工程塑料、高档尼龙热熔胶、高温
电介质、高级油漆和涂料、高级
润滑油、耐寒性
增塑剂、
树脂、医药和
农药等重要原料。
[0003] 发酵法生产长链二元酸是利用
微生物特有的
氧化能
力和微生物胞内酶的作用，在常温常压下分别通过α、ω-氧化，将长链正烷
烃两端的甲基氧
化成为羧基，生成相应链长的各种长链二元酸。能利用石油烃类的细菌、霉菌和放线菌的种类很多，其中假丝
酵母属（candida）的酵母菌是正烷烃发酵生产二元酸的高产微生物。长链二元酸发酵是典型的气相（氧气）-
水相（发酵液）-油相（烷烃）-固相（菌体）四相体系。烷烃底物作为发酵后期的唯一碳源添加量通常为20%-30%，由于烷烃
水溶性较差，在通气发酵体系中较多的烷烃会受
汽提作用而损失，因此长链二元酸发酵多采用批次发酵，发酵过程中补加烷烃的形式。中国
专利CN102115767A公开了一种微生物同步发酵正十一烷生产十一碳二羧酸方法，通过在60、90、120小时补加正十一烷，使发酵液中正烷烃浓度始终≥5%（V/V）。
[0004] 为了维持四相体系的均一性，提高烷烃在发酵体系中的溶解性，在培养基中添加乳化剂也是一种常规手段。中国专利CN102115768A公开了一种微生物同步发酵正十六烷生产十六碳二元酸的方法，添加
表面活性剂0.1～2 g/L以增强油相的乳化效果。一般情况下乳化剂并非微生物代谢所需成分，因此这种外加乳化剂的方式会对正常的微生物发酵产生不利影响。
[0005] 现阶段为了提高烷烃在水相体系中的溶解效果，在烷烃预处理方面也进行了相关研究。中国专利CN103805643A公开一种生产长链二元酸的方法，在发酵过程中加入乳化烷烃，改善了发酵体系中水相和油相间的相容性，提高了发酵体系中烷烃的转化率和二元酸产品的收率。该方法采用
微波乳化的方式对烷烃预处理，虽然能够提高烷烃的乳化效果，但微波
辐射危害大，实际应用存在困难。
发明内容
[0006] 针对
现有技术的不足，本发明提供了一种发酵制备长链二元酸的方法。本发明通过增加烷烃预处理工序，提高烷烃转化率，并且减少烷烃损失，实现烷烃一次添加，简化工艺过程。
[0007] 本发明提供的发酵制备长链二元酸的方法，包括以下内容：（1）
种子液制备：将长链二元酸发酵菌培养获得种子液；
（2）烷烃预处理：在烷烃中加入
脂肪酸和水，进行超声处理，获得胶团状烷烃；
（3）长链二元酸发酵：将预处理后烷烃、种子液加入发酵培养基中，采用区间调控pH值的方式进行发酵，直至发酵结束。
[0008] 本发明中，所述的长链二元酸发酵菌为具有完整α、ω-氧化途径的微生物，如可以是假丝酵母属、隐球酵母属、内孢霉属、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母属、红酵母属、球拟酵母属或丝孢酵母属等中的至少一种，优选热带假丝酵母菌。
[0009] 本发明中，步骤（1）将活化的发酵菌接种至培养基中，接种体积比为3%～10%，优选5%～10%；培养
温度为25～37℃，优选28～32℃，培养15～24小时。培养基的配方为：
蔗糖30～45g/L、玉米浆1.5～2g/L、酵母膏1.5～1.8g/L、
氯化钠0.8～1.2g/L、
磷酸二氢
钾3.5～
7.5g/L、
硫酸镁1.2～1.8g/L、尿素1.2～4.8g/L，硫酸铵1.5～2g/L、
醋酸钠1.5～1.8g/L。
[0010] 本发明中，步骤（2）所述的烷烃为具有10～16个碳原子的烷烃。烷烃用量为发酵液总体积的15%～30%，优选20%～25%。
[0011] 本发明中，步骤（2）所述脂肪酸为具有10～18个碳原子的脂肪酸，如可以是油酸、亚油酸、
蓖麻油酸、亚麻酸等中的至少一种，优选油酸、亚油酸。脂肪酸的添加量为烷烃重量的0.5%～2%。进一步的，在加入脂肪酸的同时加入一定量磷脂，如可以是磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油等中的至少一种，添加量为脂肪酸
质量的1%～5%，优选2%～5%。
[0012] 本发明中，步骤（2）所述水的添加量为烷烃重量的1～2.5倍。
[0013] 本发明中，步骤（2）超声处理的
频率为25～40kHz，超声功率
密度为10～100W/L，时间为10～30分钟。
[0014] 本发明中，步骤（3）发酵种子液的接种体积比为2%～20%，优选10%～20%。发酵温度为25～37℃，优选28～32℃；搅拌转速为120～500rpm，优选200～400rpm；通气量为0.2～1.0VVM，优选0.5～1.0VVM；发酵时间为138～144小时。
[0015] 本发明中，步骤（3）所述采用区间调控pH值的方式进行发酵，具体为：发酵起始，将发酵体系pH值控制在5～6，24h后将体系pH控制在6.8～8.0。优选地，发酵24h后每间隔20-28小时提高一次pH值，每次提高0.1～0.3，直至发酵结束。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：（1）本发明通过烷烃预处理，即加入脂肪酸、水进行超声处理，有利于发酵微生物通过胞饮作用摄取烷烃，降低发酵微生物的排斥，提高了烷烃转化率和发酵效果，降低了发酵周期内烷烃的使用量，在工艺上实现了烷烃底物一次性添加，从而简化了工艺步骤。
[0017] （2）在发酵过程中，发酵菌会自主分泌增
溶剂和乳化剂，它们产生假增溶作用，使烷烃以胶团形式存在并通过胞饮作用摄取烷烃。本发明通过外源脂肪酸与磷脂组分的协同作用，更易于介导胞饮作用，提高烷烃的利用率。
[0018] （3）现有常规调控方式是在pH梯度调节的同时添加一定量的烷烃，由于烷烃乳化需要一个过程，因此发酵周期内的生产强度受到了抑制。通过采用烷烃预处理，并结合pH梯度调节，烷烃可以迅速被利用，从而提高了生产强度。
[0019] （4）本发明发酵过程有助于改善气相-水相-油相-固相四相体系的均一性，一方面减少了烷烃受汽提作用，随尾气的损失；另一方面能够提高烷烃的传质效果，提高发酵水平。
具体实施方式
[0020] 下面通过
实施例来进一步说明本发明方法和效果。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0021] 以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化
试剂商店购买得到。
[0022] 本发明实施例中选用热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56作为发酵菌株进行长链烷烃发酵生产长链二元酸，该突变株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.0356。
[0023] 本发明实施例中采用区间调控pH值的方式进行发酵，从发酵开始，分别对0～144h范围内pH控制值进行区间调控。
[0024] 烷烃转化率T的计算公式为： 。其中，M1、M2、M3分别为烷烃初始加入质量、发酵液中残余质量、尾气中回收的烷烃质量，g。
[0025] 长链二元酸生产强度K的计算公式为： 。其中，C为发酵液中长链二元酸发酵浓度，g/L；H为发酵总时间，h。
[0026] 实施例1培养基配方为：蔗糖30g/L、玉米浆2g/L、酵母膏1.5g/L、氯化钠1.2g/L、磷酸二氢钾
3.5g/L、
硫酸镁1.8g/L、尿素4g/L、硫酸铵1.5g/L、醋酸钠1.8g/L。
[0027] （1）种子液制备：将发酵菌液50mL接种于含450mL种子培养基的3L摇瓶中，培养温度为32℃，摇床转数为120rpm，培养48小时，制得发酵菌种子液。
[0028] （2）烷烃预处理：取十二碳烷烃750g（体积约1L），加入750g水、15g亚油酸，超声处理10分钟，超声频率为40kHz，功率密度为50W/L。
[0029] （3）长链二元酸发酵：将发酵种子液500mL加入2.75L发酵培养基中，然后添加1.75L经步骤（2）预处理后的十二碳烷烃。发酵参数如下：发酵温度为32℃，搅拌转数为
400rpm，通气设置为0.8vvm。0～24h、24～48h、48～72h、72～96h、96～120h、120～144h的pH值分别控制为5、7、7.2、7.4、7.6、7.8。
[0030] 最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为156.6g/L，十二碳烷烃的转化率为82.1 %，尾气回收烷烃40.2g，生产强度1.08 g/( L·h)。
[0031] 实施例2培养基配方为：蔗糖35g/L、玉米浆1.5g/L、酵母膏1.8g/L、氯化钠0.8g/L、磷酸二氢钾
7.5g/L、硫酸镁1.2/L、尿素4.8g/L、硫酸铵2g/L、醋酸钠1.5g/L。
[0032] （1）种子液制备：将发酵菌液50mL接种于含950mL种子培养基的3L摇瓶中，培养温度为28℃，摇床转数为120rpm，培养48小时，制得发酵菌种子液。
[0033] （2）烷烃预处理：取十三碳烷烃1875g（体积约2.5L），加入3750g水、37.5g油酸，超声处理20分钟，超声频率为30kHz，功率密度为20W/L。
[0034] （3）长链二元酸发酵：将发酵种子液1L加入2.75L发酵培养基中，然后添加6.25L经步骤（2）预处理后的十二碳烷烃。发酵参数如下：发酵温度为28℃，搅拌转数为300rpm，通气设置为0.5vvm；0～24h、24～44h、44～64h、64～84h、84～104h、104～124，124～144h的pH值分别控制为6、7、7.2、7.3、7.4、7.6、7.9。
[0035] 最终发酵体系中十三碳二元酸浓度为144.2g/L，十三碳烷烃的转化率为79.2%，尾气回收烷烃86.5g，生产强度1.01 g/( L·h)。
[0036] 实施例3种子培养基配方为：蔗糖30g/L、玉米浆2g/L、酵母膏1.5g/L、氯化钠1.2g/L、磷酸二氢钾3.5g/L、硫酸镁1.8/L、尿素4g/L。
[0037] 发酵培养基配方为：蔗糖30g/L、玉米浆2g/L、酵母膏1.5g/L、氯化钠1.2g/L、磷酸二氢钾3.5g/L、硫酸镁1.8/L、尿素4g/L、硫酸铵1.5g/L、醋酸钠1.8g/L。
[0038] （1）发酵种子液制备：将发酵菌液50mL接种于含450mL种子培养基的3L摇瓶中，培养温度为30℃，摇床转数为120rpm，培养48小时，制得发酵菌种子液。
[0039] （2）烷烃预处理：取十二碳烷烃750g（体积约1L），加入1500g水、7.5g油酸，超声处理20分钟，超声频率为25kHz，功率密度为50W/L。
[0040] （3）长链二元酸发酵：将发酵种子液500mL加入2L发酵培养基中，然后添加2.5L经步骤（2）预处理后的十二碳烷烃。发酵参数如下：发酵温度为30℃，搅拌转数为400rpm，通气设置为0.8vvm；0～24h、24～48h、48～72h、72～96h、96～120h、120～144h的pH值分别控制为5、7.0、7.3、7.6、7.7、8.0。
[0041] 最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为150.2g/L，十二碳烷烃的转化率为80.1%，尾气回收烷烃41.5g，生产强度1.04g/( L·h)。
[0042] 实施例4同实施例1，不同在于：加入脂肪酸的同时加入0.75g磷脂酰甘油。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为162.6g/L，十二碳烷烃的转化率为85.5%，尾气回收烷烃30.7g，生产强度
1.13 g/( L·h)。
[0043] 实施例5同实施例3，不同在于：加入脂肪酸的同时加入0.75g二磷脂酰甘油。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为156.2g/L，十二碳烷烃的转化率为82.2%，尾气回收烷烃36.9g，生产强度
1.08 g/( L·h)。
[0044] 实施例6同实施例1，不同在于：脂肪酸采用蓖麻油酸。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为
148.2g/L，十二碳烷烃的转化率为79.6%，尾气回收烷烃43.5g，生产强度1.03g/( L·h)。
[0045] 实施例7同实施例1，不同在于：脂肪酸采用亚麻酸。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为
153.2g/L，十二碳烷烃的转化率为81.9 %，尾气回收烷烃42.1g，生产强度1.06g/( L·h)。
[0046] 实施例8同实施例1，不同在于：以十四碳烷烃进行发酵，制备十四碳二元酸。最终发酵体系中十四碳二元酸浓度为101.6g/L，十六碳烷烃的转化率为50.2%，尾气回收烷烃113.2g，生产强度0.71 g/( L·h)。
[0047] 比较例1同实施例1，不同在于：步骤（2）不添加亚油酸，以超声方式进行烷烃预处理。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为122.3g/L，十二碳烷烃的转化率为65.6%，尾气回收烷烃178g，生产强度0.84 g/( L·h)。
[0048] 比较例2同实施例1，不同在于：步骤（2）不添加水，以超声方式进行烷烃预处理。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为120.1g/L，十二碳烷烃的转化率为64.1%，尾气回收烷烃182g，生产强度0.83g/( L·h)。
[0049] 比较例3同实施例1，不同在于：步骤（2）添加亚油酸后单纯通过搅拌混合，不通过超声方式进行烷烃预处理。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为120.9g/L，十二碳烷烃的转化率为
63.9%，尾气回收烷烃186g，生产强度0.83 g/( L·h)。
[0050] 比较例4同实施例1，不同在于：发酵过程不采用区间调控pH值的方式，整个发酵过程pH为7.0。
最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为125.2g/L，十二碳烷烃的转化率为66.7%，尾气回收烷烃175g，生产强度0.87 g/( L·h)。
[0051] 比较例5同实施例1，不同在于：烷烃预处理过程按照中国专利CN103805643A公开的方式进行，并且处理后的烷烃分批次添加。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为136.2g/L，十二碳烷烃的转化率为75.5%，尾气回收烷烃90g，生产强度0.94 g/( L·h)。
[0052] 比较例6同实施例1，不同在于：烷烃预处理过程按照中国专利CN103805643A公开的方式进行，并且处理后的烷烃在发酵初期一次添加。最终发酵体系中十二碳二元酸浓度为123.1g/L，十二碳烷烃的转化率为64.2%，尾气回收烷烃169g，生产强度0.85 g/( L·h)。
