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酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法

阅读:709发布:2021-12-02

专利汇可以提供酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种断奶仔猪营养性腹泻模型,具体涉及高 酪蛋白 日粮诱导的断奶仔猪营养性腹泻模型,属于动物模型构建领域。给21日龄断奶仔猪持续饲喂15天高酪蛋白日粮,高酪蛋白日粮中酪蛋白是唯一的蛋白来源,酪蛋白的添加量为33.72%,日粮中 粗蛋白 含量为30%,试验结束后测定仔猪腹泻指标、血清生化指标、肠道结构形态及肠道 水 通道蛋白标记分子和紧密连接蛋白标记分子表达量。本发明采用了酪蛋白作为唯一蛋白来源,并确定了酪蛋白在日粮中的添加量,建立高酪蛋白日粮诱导的断奶仔猪营养性腹泻模型,为深入探索和 预防 新生动物发生断奶腹泻提供可靠的模型。,下面是酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法专利的具体信息内容。

1.高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一、试验动物及分组:选取21天的断奶仔猪14头,随机分为对照组A和高蛋白组B两组,每组各7头,对照组饲喂粗蛋白平为17%的日粮,高蛋白组饲喂粗蛋白水平为30%的日粮,转入步骤二;
步骤二、试验过程:仔猪在代谢笼持续饲养15天,实验前3天仔猪进行定位预饲期,饲喂常规教槽料,自由饮水,实验第4天开始对照组A仔猪饲喂粗蛋白水平为17%的饲料,高蛋白组B仔猪饲喂粗蛋白水平为30%的饲料,自由采食和饮水;实验结束前一天晚8点对仔猪禁食,实验过程中进行腹泻评分测定,并观察每组仔猪肛周围卫生和健康状况;
步骤三、试验结束后的指标测定
(1)生猪生长性能测定:对每只仔猪进行体重称重并记录;
(2)血液指标测定:采集仔猪前腔静脉血,按40mg/kg代谢体重给仔猪肌肉注射4%戊巴比妥钠溶液,前腔静脉采10ml,在室温中静置30min-2h,待血清析出后,4℃,3000rmp离心
15min,取上清液于-80℃保存,然后对上清液进行生化指标的测定;
(3)内容物测定:收集回肠和结肠内容物以及粪便进行指标测定,结肠内容物测定短链脂肪酸,回肠内容物测定肠道生物、粪便测定含水量
(4)肠道分析:试验结束后,解剖每只仔猪,并取空肠、回肠,将空肠和回肠各分为2份,1份用福尔林固定用于形态结构测定分析,另1份置于液氮速冻后-80℃保持,用于紧密连接蛋白家族、水通道蛋白基因测定。
2.根据权利要求1所述高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法,其特征在于所述对上清液进行生化指标的测定,具体测定指标为总蛋白、白蛋白、尿素、肌酐,钠离子、氯离子、甘油三酯、低密度脂蛋白、免疫球蛋白M。
3.根据权利要求1所述高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法,其特征在于两组日粮中不包含任何其他蛋白来源,酪蛋白为唯一的蛋白来源。
4.根据权利要求1所述高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法,其特征在于所述酪蛋白为食品级产品。

说明书全文

酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法

技术领域

[0001] 本发明属于动物模型构建领域,涉及一种断奶仔猪营养性腹泻模型,具体涉及一种高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法。

背景技术

[0002] 我国一直是一个生猪产业大国,每年大致出栏6.9亿头。然而,在现当代养猪生产中,断奶给仔猪的生长带来了巨大的压,并伴随着胃肠道生理,生物学和免疫学的显著变化。由于这些变化,断奶后的一段时间内仔猪肠道紊乱,生长性能下降,并极易发生断奶后腹泻。断奶后腹泻带来的生长受阻和肠道疾病是仔猪断奶时期遭受的重大考验,甚至会引起仔猪死亡,给养猪业造成了严重的经济损失,也是养猪业遇到的重大挑战。断奶仔猪的饲养管理在生产中是一个非常重要的环节,也是提高仔猪存活率和生长性能的关键之一。根据引起断奶仔猪腹泻的原因分类,可以将仔猪腹泻分为三大类:病毒性腹泻、细菌性性腹泻和营养性腹泻。其中,由于仔猪断奶后营养摄入不均衡、消化酶系统尚未健全等生理以及环境的影响,使得营养性腹泻成为最常见的腹泻类型,严重影响仔猪的生长性能及存活率。
断奶初期,饲料中没有IgA以及其他的免疫因子,且仔猪消化道的重量和体积都较小,消化系统尚未发育完全,减弱了仔猪的免疫功能,使得断奶仔猪肠道对日粮的需求非常敏感。实际生产中,仔猪断奶后,由于受到饲料的营养成分和环境因素变化等原因,常常导致出现以腹泻拉稀为主要特征的营养性腹泻,严重影响仔猪的生长性能及存活率。然而,断奶仔猪营养性腹泻的发病机制十分复杂,近年来,国内外的大量研究表明,仔猪的腹泻与断奶后的营养存在着密切关系。因而研究建立断奶仔猪营养性腹泻模型来研究营养性腹泻的具体机制可以对我国由于断奶腹泻引起的较高死亡率起到一定的缓解作用,对我国畜牧业发展具有重要的意义。
[0003] 营养性腹泻(post-weaning nutritional diarrhea,PWND)常发生在仔猪断奶期间,表现为食欲下降、消化功能紊乱、体重减轻、腹泻,伴随着养性粪便,严重时可引起仔猪的死亡。一方面断奶后发生营养性腹泻,对仔猪的小肠结构和功能都造成了很大的损伤。大约 95%的肠上皮细胞存在于绒毛和隐窝中,分泌相关消化酶体。长的绒毛和浅的隐窝一起增加小肠消化吸收的表面积,而断奶会造成绒毛和隐窝的损伤,使得绒毛变短,隐窝加深。不同的营养物质引起绒毛和隐窝损伤的机制不同,例如饲料中蛋白质的种类和含量而不是蛋白质的水解影响回肠的绒毛长度和隐窝深度。在仔猪断奶日粮中添加一定水平的大豆蛋白,会使得仔猪肠道绒毛变短,隐窝加深,并引起营养性腹泻增加了断奶后仔猪的死亡率。而使用一定水平的喷雾干燥血浆蛋白粉作为日粮蛋白质来源,则对仔猪的肠道发育有促进作用。并且,断奶后小肠对于饲料的消化吸收能力大大降低,容易造成未吸收的食物残留,过度发酵而产生多种病原菌,引起营养性腹泻。另一方面,有文献证明,大肠功能的改变,跟断奶后腹泻息息相关。断奶后饲料刺激减少了仔猪大肠隐窝的密度并且增加了盲肠的有丝分裂,也短暂的减弱了结肠的吸收能力。断奶后由于饲料的刺激,小肠吸收能力减弱,过剩的水和电解质转移到大肠,而大肠功能受损,无法全部吸收,因此导致严重的腹泻出现。
[0004] 由于大多数动物饲料中所需植物蛋白还有抗营养因子,仔猪断奶时,一般其消化系统尚未发育完全,蛋白酶分泌不足,对于蛋白质的消化能力极低。添加高水平蛋白含量饲料,未消化完全的蛋白质在小肠中积累引发炎症,而后进入大肠继续发酵,产生大量的腐胺等毒性胺类物质。同时加速了肠道的蠕动和分泌,减弱了结肠对水分的吸收,损伤了仔猪的肠道功能,引起腹泻。使得植物蛋白的利用受到了极大的限制,因此建立以酪蛋白为唯一蛋白来源诱导PWND的模型,研究蛋白质水平对于断奶仔猪断奶时期,胃肠道的生理功能和肠道健康的功能,可以创造有助于缓解目前我国蛋白资源的匮乏条件下,最大程度降低PWND,创造更高的经济效益。
[0005] 总之,目前我国生猪养殖业面临的巨大压力之一就是断奶后腹泻的高发病率和高死亡率,而建立高酪蛋白日粮引起的断奶仔猪营养性腹泻模型,为深入探索和预防新生动物发声断奶腹泻提供可靠的模型。

发明内容

[0006] 本发明目的是针对现有我国面临仔猪断奶腹泻高发病率和高死亡率的现状,建立高酪蛋白日粮诱导的断奶仔猪营养性腹泻模型,为深入探索和预防新生动物发生断奶腹泻提供可靠的模型。
[0007] 为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下:高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、试验动物及分组:选取21天的断奶仔猪14头,随机分为对照组A和高蛋白组 B两组,每组各7头,对照组饲喂粗蛋白水平为17%的日粮,高蛋白组饲喂粗蛋白水平为 30%的日粮,转入步骤二;
步骤二、试验过程:仔猪在代谢笼持续饲养15天,实验前3天仔猪进行定位预饲期,饲喂常规教槽料,自由饮水,实验第4天开始对照组A仔猪饲喂粗蛋白水平为17%的饲料,高蛋白组B仔猪饲喂粗蛋白水平为30%的饲料,自由采食和饮水;实验结束前一天晚8点对仔猪禁食,实验过程中进行腹泻评分测定,并观察每组仔猪肛周围卫生和健康状况;
步骤三、试验结束后的指标测定
(1)生猪性能测定:对每只仔猪进行体重称重并记录;
(2)血液指标测定:采集仔猪前腔静脉血,按40mg/kg代谢体重给仔猪肌肉注射4%戊巴比妥钠溶液,前腔静脉采10ml,在室温中静置30min-2h,待血清析出后,4℃,3000rmp离心 
15min,取上清液于-80℃保存,然后对上清液进行生化指标的测定;
进一步地测定上清液中的生化指标为总蛋白、白蛋白、尿素、肌酐,钠离子、氯离子、甘油三酯、低密度脂蛋白、免疫球蛋白M;
(2)内容物测定:收集回肠和结肠内容物以及粪便进行指标测定;进一步地结肠内容物测定短链脂肪酸,回肠内容物测定肠道微生物、粪便测定含水量
(3)肠道分析:试验结束后,解剖每只仔猪,并取空肠、回肠,将空肠和回肠各分为2份, 
1份用福尔林固定用于形态结构测定分析,另1份置于液氮速冻后-80℃保持,用于紧密连接蛋白家族、水通道蛋白基因测定。
[0008] 所述常规教槽料为市售常规教槽料;所述A、B两组仔猪日粮配方中不包含任何其他蛋白来源,酪蛋白为唯一的蛋白来源,所述酪蛋白为食品级产品。
[0009] 有益效果本发明提供的高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的构建方法,具有以下优点:
(1)本发明以酪蛋白为唯一的蛋白来源,酪蛋白消化率高,且不含有抗营养因子,实验证明酪蛋白可以作为良好的仔猪断奶时期日粮的蛋白来源。
[0010] (2)本发明确定了酪蛋白作为唯一蛋白来源的添加量。
[0011] (3)本发明利用酪蛋白诱导断奶仔猪产生营养性腹泻后,可明显观测到仔猪肠道水通道蛋白标记分子和紧密连接蛋白标记分子表达显著降低,高蛋白组B仔猪持续性腹泻并排出水养性粪便,腹泻特征明显。本发明的方法具有简便易行、可重复性好等特点,可为动物营养学或医学领域研究水通道蛋白和紧密结合蛋白与腹泻的关系,进而开发功能性调控物质提供良好的实验模型。附图说明
[0012] 图1:仔猪实验体重变化比较(A1、B1分别为对照组A和高蛋白组B仔猪实验初期体重、A2、B2分别为对照组A和高蛋白组B仔猪实验末体重);图2:不同含量的酪蛋白日粮对诱导仔猪肠道结构形态变化;
图3:不同含量的酪蛋白日粮对诱导仔猪肠道紧密连接蛋白家族、水通道蛋白基因变化;
图4:不同含量的酪蛋白日粮对诱导仔猪回肠微生物变化。
具体实施例
[0013] 高酪蛋白日粮诱导断奶仔猪营养性腹泻模型的建立方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、试验动物及分组:选取21天的断奶仔猪14头,体重在7.98±0.14kg,随机分为对照组A和高蛋白组B两组,每组各7头,对照组饲喂粗蛋白水平为17%的日粮,高蛋白组饲喂粗蛋白水平为30%的日粮,转入步骤二;对照组A和高蛋白组B日粮配方见表1,对照组和实验组分组情况见表2。
[0014] 表1实验日粮配方(该配方为半纯合日粮)所述预混料为每kg饲料提供:海泡石,6.043g;猪用维他命,750mg;,150mg;
150mg;锰,80mg;锌,120mg;硒,0.3mg;钴,1mg;碘,0.3mg;VB4,1000 mg。
[0015] 表2实验分组情况步骤二、试验过程:仔猪在代谢笼持续饲养15天,实验前3天仔猪进行定位预饲期,饲喂常规教槽料,自由饮水,实验第4天开始对照组A仔猪饲喂粗蛋白水平为17%的饲料,高蛋白组B仔猪饲喂粗蛋白水平为30%的饲料,自由采食和饮水;实验结束前一天晚8点对仔猪禁食,实验过程中进行腹泻评分测定,并观察每组仔猪肛门周围卫生和健康状况;
对实验中需要使用到的代谢笼和猪舍进行消毒处理,并确保水源的充足和干净。
[0016] 为更好地评价断奶仔猪腹泻状况,使用沾取了生理盐水的棒逐头擦拭仔猪肛门,观察有无粪便污染及红肿,利用相机拍照,并做好记录,计算每组腹泻率和腹泻指数。并且每天收集仔猪的粪便,采用冻干法计算其含水量的情况,每天2次。标准如下表1所示。
[0017] (1)腹泻指数=每组粪便评分之和/每组头数,指数越高,表示该组腹泻越严重。
[0018] (2)当粪便评分为2分或以上时认为仔猪发生腹泻,试验结束后计算各组的腹泻率。
[0019] 腹泻率(%)=100×[每组仔猪腹泻头次总数/(每组仔猪总头数×试验天数)]。一天一头仔猪发生腹泻记录为1头次。
[0020] 腹泻状况评分标准步骤三、试验结束后的指标测定
(1)生猪性能测定:对每只仔猪进行体重称重并记录;
(2)血液指标测定:采集仔猪前腔静脉血,按40mg/kg代谢体重给仔猪肌肉注射4%戊巴比妥钠溶液,前腔静脉采10ml。在室温中静置1h,待血清析出后,4℃,3000rmp离心15min,取上清液于-80℃保存,然后对上清液进行生化指标的测定,测定上清液中的生化指标为总蛋白、白蛋白、尿素、肌酐,钠离子、氯离子、甘油三酯、低密度脂蛋白、免疫球蛋白M;
(2)内容物测定:收集回肠和结肠内容物以及粪便进行指标测定,结肠内容物测定短链脂肪酸,回肠内容物测定肠道微生物、粪便测定含水量;
(3)肠道分析:试验结束后,解剖每只仔猪,并取空肠、回肠,将空肠和回肠各分为2份, 
1份用福尔马林固定用于形态结构测定分析,另1份置于液氮速冻后-80℃保持,用于紧密连接蛋白家族、水通道蛋白基因测定。
[0021] 所述常规教槽料为市售常规教槽料;所述A、B两组仔猪日粮配方中不包含任何其他蛋白来源,酪蛋白为唯一的蛋白来源,所述酪蛋白为食品级产品。
[0022] 试验结果:(1)断奶仔猪体重变化
试验结果如图1,试验结果表明,对照组A仔猪体重随着实验进行,体重持续增长,具有较为良好的生长性能,而高蛋白组B仔猪体重随着实验周期持续降低,为负增长。
[0023] (2)仔猪排便情况对比试验结果实验第1周,高蛋白组B可观察到明显的腹泻症状,仔猪排便为喷射状,并且粪便为水养性粪便。
[0024] 表3仔猪腹泻评分和粪便含水量(3)仔猪肠道指标采样和测定
第15天,对照组A、高蛋白组B仔猪采血后屠宰。测定下列指标:
肠道形态学:取空肠和回肠组织,中性福尔马林固定,制备石蜡切片,HE染色,观察肠道形态结构的变化,包括绒毛高度、隐窝深度。试验结果如图2所示,试验结果表明,跟对照组A相比,高蛋白组B仔猪回肠和空肠绒毛均显著减短,隐窝均显著加深。
[0025] 分子生物学分析:取空肠和回肠组织,液氮速冻后-80℃保存,使用Western blotting、免疫组化和RT-PCR等技术研究仔猪营养性腹泻对肠道生理功能的影响,探讨各营养性腹泻模型下,紧密连接蛋白家族、水通道蛋白等的合成变化。试验结果如图3所示,试验结果表明,跟对照组A相比,高蛋白组B仔猪回肠水通道蛋白1(AQP1)和水通道蛋白5(AQP5) 以及紧密连接蛋白occludin表达显著降低。
[0026] (4)仔猪血液生化指标测定采集仔猪前腔静脉血,按40mg/kg代谢体重给仔猪肌肉注射4%戊巴比妥钠溶液,前腔静脉采10ml。在室温中静置30min-2h,待血清析出后,4℃,3000rmp离心15min,取上清液于-
80℃,使用cobas c311罗氏全自动生化分析仪选择总蛋白,白蛋白,尿素,肌酐,钠离子,氯离子,甘油三酯,低密度脂蛋白,免疫球蛋白M这些与免疫,渗透压,氮代谢相关指标进行测定,试验结果见表4,试验结束表明,跟对照组A相比,高蛋白组B仔猪肠道内外渗透压差明显增大(钠离子、氯离子),炎症因子表达显著上调(低密度脂蛋白、免疫球蛋白M),肾小球功能受损(肌酐、尿素)。
[0027] 表4不同含量的酪蛋白日粮对诱导仔猪血清生化指标变化(5)猪结肠粪便短链脂肪酸的测定
将采集的A、B两组仔猪结肠粪便进行预处理,使用安捷伦7890A高效液相色谱仪进行短链脂肪酸的测定,试验结果见表5,结果表明,跟对照组A相比,高蛋白组B仔猪体内主要提供能量的短链脂肪酸,丁酸含量显著降低,丙酸含量也明显降低。
[0028] 表5不同含量的酪蛋白日粮对诱导仔猪结肠短链脂肪酸含量的变化(6)肠道内容物的测定
回肠内容物-80度保存,送专业公司进行16s测序,试验结果见图4,试验结果表明:跟对照组A相比,高蛋白组B仔猪回肠内含有大量致腹泻细菌属,弯曲杆菌属。
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