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一种高载药量的缓释微凝胶药膏及其制备方法与应用

阅读:588发布:2022-10-06

专利汇可以提供一种高载药量的缓释微凝胶药膏及其制备方法与应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开一种高载药量的缓释微凝胶药膏及其制备方法与应用。本发明将季铵盐壳聚糖 水 溶液和透明质酸水溶液混匀,得到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液;将药物与微凝胶水溶液混合后浓缩,加入 增稠剂 混匀,得到高载药量的缓释微凝胶药膏。透明质酸与季铵盐壳聚糖通过静电作用形成微凝胶,安全方便;浓缩使微凝胶外面的药液浓度提高,能提高微凝胶的药物负载量,未被微凝胶负载药物可以在一定程度上抑制已负载药物从微凝胶向外释放,延长缓释时间;增稠剂可以把载药微凝胶悬液制成膏状,有利于在 皮肤 表面涂抹,同时投入的药物能100%利用,降低药物使用成本。该药膏能用于制备 治疗 组胺非依赖性 瘙痒 和 镇痛 药物。,下面是一种高载药量的缓释微凝胶药膏及其制备方法与应用专利的具体信息内容。

1.一种高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)将季铵盐壳聚糖溶液和透明质酸水溶液混合均匀,得到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液;
(2)将药物与步骤(1)得到的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液混合,浓缩;
(3)接着加入增稠剂,搅拌均匀,得到高载药量的缓释微凝胶药膏。
2.根据权利要求1所述的高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的季铵盐壳聚糖和透明质酸按质量比1:1~1:3配比计算;
4 4
步骤(1)中所述的透明质酸的分子量为5.0×10~20.0×10道尔顿;
步骤(1)中所述的季铵盐壳聚糖的分子量为2.0×104~20.0×104道尔顿。
3.根据权利要求1所述的高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的季铵盐壳聚糖水溶液的浓度为0.1~2.0mg/mL;
步骤(1)中所述的透明质酸水溶液的浓度为0.1~2.0mg/mL。
4.根据权利要求1所述的高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的药物和所述的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶按质量比1:1~4:1配比计算;
步骤(3)中所述的增稠剂的用量按增稠剂在高载药量的缓释微凝胶药膏中的质量分数为2~8%计算。
5.根据权利要求4所述的高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的药物为生物和黄类成分中的至少一种;
步骤(2)中所述的浓缩的方式为旋转蒸发浓缩;
步骤(3)中所述的增稠剂为羟丙基甲基纤维素。
6.根据权利要求5所述的高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法,其特征在于:
所述的生物碱为化苦参碱、槐果碱和氧化槐果碱中的至少一种;
所述的黄酮类成分为毛蕊异黄酮和高丽槐素中的至少一种。
7.一种高载药量的缓释微凝胶药膏,其特征在于:通过权利要求1~6任一项所述的制备方法制备得到。
8.一种含有治疗组胺非依赖性瘙痒镇痛作用药物的缓释微凝胶药膏,其特征在于:
通过权利要求1~6任一项所述的制备方法制备得到。
9.权利要求8所述含有治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用药物的缓释微凝胶药膏在制备治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述的治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用的缓释微凝胶药膏包括但不限于其他药物剂型如:外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、糊剂、贴剂、栓剂、膜剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂;微球制剂、微囊制剂、纳米囊制剂、丸剂。

说明书全文

一种高载药量的缓释微凝胶药膏及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及于医用技术领域,特别涉及一种高载药量的缓释微凝胶药膏及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 微凝胶是一种具有三维交联网络结构和微/纳米尺寸的凝胶,除了具有传统水凝胶的弹性、亲水性、不溶不熔等性能外,还可作为药物载体用于药物的控制释放。季铵盐壳聚糖(HTCC)是一种线性阳离子聚电解质,透明质酸(HA)是一种线性阴离子聚电解质,这两种物质均为天然高分子材料,具有良好的生物相容性和生物降解性,对人体无害,在生物医药领域有广泛应用。微凝胶的制备技术有化学交联法和物理交联法。化学交联微凝胶以共价键结合,通常使用化学交联剂和引发剂,但残留的交联剂和引发剂有一定的潜在毒性。物理交联水凝胶常通过静电作用、氢键、配位键、疏水作用、结晶等物理作用形成,不涉及化学交联剂、引发剂及相关化学反应,具有更好的环境友好性,并且制备方法相对简便。微凝胶作为药物载体虽有广泛研究,但目前微凝胶用于载药时存在如下不足之处:(1)制备过程中往往加入交联剂,一定程度上增加不安全性;(2)传统的微凝胶载药法是将微凝胶浸泡于药物溶液中进行负载,待药液在微凝胶里外达到浓度平衡后,将载药微凝胶从药液中分离,导致载药量较低,这会导致活性成分药物的浪费,增加制备成本;(3)由于微凝胶对药物的负载与释放机制主要是受微凝胶里外药物浓度差驱动的物理扩散的影响,传统的微凝胶载药法得到的载药微凝胶载药量低,再加上在使用中,由于微凝胶里外的药物浓度差较大,药物很容易从微凝胶中扩散出去,因而无法实现长时间的缓慢释放。

发明内容

[0003] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法。
[0004] 本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的高载药量的缓释微凝胶药膏。
[0005] 本发明的再一目的在于提供上述高载药量的缓释微凝胶药膏的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种高载药量的缓释微凝胶药膏的制备方法,包括如下步骤:
[0007] (1)将季铵盐壳聚糖(HTCC)水溶液和透明质酸(HA)水溶液混合均匀,得到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液;
[0008] (2)将药物与步骤(1)得到的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液混合,浓缩;
[0009] (3)接着加入增稠剂,搅拌均匀,得到高载药量的缓释微凝胶药膏。
[0010] 步骤(1)中所述的将季铵盐壳聚糖水溶液和透明质酸水溶液混合均匀的方式优选为:在搅拌作用下,将季铵盐壳聚糖水溶液注入透明质酸水溶液中。
[0011] 所述的季铵盐壳聚糖水溶液注入透明质酸水溶液的速度为1~10mL/h;优选为5~10mL/h。
[0012] 步骤(1)中所述的季铵盐壳聚糖和透明质酸按质量比1:1~1:3配比计算;优选为按质量比1:2配比计算。
[0013] 步骤(1)中所述的季铵盐壳聚糖的分子量优选为2.0×104~20.0×104道尔顿;更优选为10.0×104道尔顿。
[0014] 步骤(1)中所述的透明质酸的分子量优选为5.0×104~20.0×104道尔顿;更优选为10.0×104道尔顿。
[0015] 步骤(1)中所述的季铵盐壳聚糖水溶液的浓度优选为0.1~2.0mg/mL;更优选为1mg/mL。
[0016] 步骤(1)中所述的透明质酸水溶液的浓度优选为0.1~2.0mg/mL;更优选为1mg/mL。
[0017] 步骤(1)中所述的混合均匀的方式优选为搅拌。
[0018] 所述的搅拌的时间为1~6h;优选为3h。
[0019] 步骤(1)中所述的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的粒径为150~350nm、电位为-30~-20mV;优选为200~340nm、电位为-25.4~-20.4mV。
[0020] 步骤(2)中所述的药物优选为生物和黄类成分中的至少一种;更优选为具有治疗组胺非依赖性瘙痒镇痛作用的生物碱和黄酮类成分。
[0021] 所述的生物碱优选为化苦参碱、槐果碱和氧化槐果碱中的至少一种。
[0022] 所述的黄酮类成分优选为毛蕊异黄酮和高丽槐素中的至少一种。
[0023] 所述的药物优选为水溶性药物。
[0024] 步骤(2)中所述的药物和所述的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶按质量比1:1~4:1配比计算;优选为按质量比2:1配比计算。
[0025] 步骤(2)中所述的混合的方式优选为搅拌,更优选为磁搅拌,转速为200~400rpm。
[0026] 所述的搅拌的时间优选为16~24h;更优选为20h。
[0027] 步骤(2)中所述的浓缩的方式优选为旋转蒸发浓缩。
[0028] 步骤(2)中所述的浓缩的条件为真空度15~30kPa、温度40~55℃;优选为真空度15~30kPa、温度40~45℃;更优选为真空度20kPa、温度45℃。
[0029] 所述的浓缩优选为浓缩至1~3mg/mL;更优选为浓缩至2mg/mL。
[0030] 步骤(3)中所述的增稠剂优选为羟丙基甲基纤维素。
[0031] 步骤(3)中所述的增稠剂的用量优选为按增稠剂在高载药量的缓释微凝胶药膏中的质量分数为2~8%计算;更优选为按质量分数为5%计算。
[0032] 一种高载药量的缓释微凝胶药膏,通过上述制备方法制备得到。
[0033] 一种含有治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用药物的缓释微凝胶药膏,通过上述制备方法制备得到。
[0034] 所述的治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用药物优选为氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、毛蕊异黄酮和高丽槐素中的至少一种。
[0035] 上述含有治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用药物的缓释微凝胶药膏在制备治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用制剂中的应用。
[0036] 所述的治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用药物包括但不限于其他药物剂型如:外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、糊剂、贴剂;栓剂、膜剂;胶囊剂、乳剂、混悬剂;微球制剂、微囊制剂、纳米囊制剂;丸剂等。
[0037] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0038] 1.本发明利用透明质酸与季铵盐壳聚糖之间的静电作用复合形成微凝胶,结合旋蒸浓缩法和增稠剂制备得到高载药量的缓释微凝胶药膏。本发明利用透明质酸与季铵盐壳聚糖之间的静电作用复合形成微凝胶,不使用多余的化学交联剂,对环境更友好,制备工艺更加简便。旋蒸浓缩使微凝胶外面的药液浓度提高,有利于药物向微凝胶内部扩散,从而提高微凝胶的药物负载量,同时未被微凝胶负载药物可以在一定程度上抑制已负载药物从微凝胶向外释放,从而有助于缓释时间的延长。在此基础上,往浓缩的载药微凝胶悬液中加入增稠剂,可以把载药微凝胶悬液制成膏状,有利于在皮肤表面涂抹,方便使用,同时投入的药物可以100%利用,降低药物使用成本。本发明可通过药物投入量进行调节,所投药物大部分在微凝胶里面分布,少部分在微凝胶外面分布,微凝胶里外药物的浓度差使得微凝胶里面的药物缓慢持续释放,降低药物释放浓度过大导致的副作用。与传统的药膏相比,本发明提供的具有治疗组胺非依赖性瘙痒和镇痛作用的氧化苦参碱(结构见图1)缓释微凝胶药膏在使用48h后氧化苦参碱释放率超过90%并可100%充分利用,能够在减少给药次数的同时保持良好药效。
[0039] 2.本发明提供的氧化苦参碱缓释微凝胶药膏具有很好生物安全性,无皮肤刺激,不会对人体产生损害。附图说明
[0040] 图1是氧化苦参碱的结构图。
[0041] 图2是季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶制备工艺图。
[0042] 图3为季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的粒径和电位分布图;其中,图A是粒径分布图,图B是电位分布图。
[0043] 图4是季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的透射电镜图。
[0044] 图5是季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶外观示意图。
[0045] 图6是实施例1制备得到的氧化苦参碱缓释微凝胶药膏和对照样的体外药物释放曲线图。
[0046] 图7是动物实验造模与给药方法示意图。
[0047] 图8是小鼠面颊模型的搔抓、擦拭行为示意图。
[0048] 图9是小鼠面颊模型的录像设备放置示意图。
[0049] 图10是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠搔抓、擦拭面颊行为的影响结果图。
[0050] 图11是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠右侧面颊激发处皮肤折叠厚度的影响结果图;其中,图(A)是各组小鼠给药前后右侧面颊皮肤折叠厚度柱形图,图(B)是各组小鼠面颊皮肤折叠厚度变化柱形图。
[0051] 图12是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠脾脏与胸腺指数的影响结果图;其中,图(A)是脾指数的检测结果图,图(B)是胸腺指数的检测结果图。
[0052] 图13是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠右侧面颊皮肤激发区域及腹部皮肤致敏区域的影响结果图。
[0053] 图14是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠右侧面颊激发处皮肤苏木精-伊红(HE)染色的影响结果图;其中,图(A)是溶剂对照组,图(B)是空白药膏组,图(C)是模型组,图(D)是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组,图(E)是阳性药组,放大倍数为100×。
[0054] 图15是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠右侧面颊皮肤激发处甲苯胺蓝(TB)染色的影响结果图;其中,图(A)是溶剂对照组,图中红色方框放大区域内的蓝紫色斑点即为被甲苯胺蓝染色的肥大细胞,图(B)是空白药膏组,图(C)是模型组,图(D)是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组,图(E)是阳性药组,放大倍数为100×,图(F)各组小鼠面颊皮肤中肥大细胞数目柱形图。

具体实施方式

[0055] 下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施方式和实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0056] 本发明涉及的材料信息如下:
[0057] (1)实验仪器及耗材
[0058] 纯水仪(LINIQUE-R20型,锐思捷科学仪器有限公司)、先行者分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)、涡旋混合器(Vortex-Genie 2/2T型,上海凌初科学仪器有限公司)、磁力搅拌器(HJ-4A型,上海东玺制冷仪器设备有限公司)、数显智能控温磁力搅拌器(SZCL,德国Bruker公司)、中大麦迪注射(广州中大医疗器械有限公司)、激光纳米粒度仪(Zetasizer-nano型,尔文公司)、场发射透射电子显微镜(Tecnai G2F20S-TWIN 200KV,美国FEI公司)、高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)、超滤离心管(15mL,30KD,Millipore)、紫外可见分光光度计(UV759CRT-FS型,上海佑科仪器仪表有限公司)、冷冻干燥仪(FD-1A-50型,上海比郎仪器有限公司)。
[0059] (2)实验药品及试剂
[0060] 透明质酸(HA,分子量5.0~20.0×104,化妆品级,华熙福瑞达生物医药有限公司,实施例和对比例中所用的透明质酸是不同批次购买得到的低分子量透明质酸钠)、季铵盐壳聚糖(HTCC,分子量2.0~20.0×104,取代度90%,上海源叶生物科技有限公司,实施例和对比例中所用的季铵盐壳聚糖是不同批次购买得到的低分子量季铵盐壳聚糖)、氧化苦参碱(纯度97%,览(上海)化工科技有限公司,China,CAS:16837-52-8,Lot:CEBF150009)。
[0061] 实施例1
[0062] (1)季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的配制
[0063] 分别配制浓度为1mg/mL的季铵盐壳聚糖(将购买得到的季铵盐壳聚糖溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分4
子量为10.0×10)水溶液和透明质酸(将购买得到的透明质酸溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为10.0×
104)水溶液,以季铵盐壳聚糖:透明质酸=1:2的质量比制备季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶:在磁力搅拌作用下,利用注射泵将10mL季铵盐壳聚糖溶液以5mL/h的速度缓慢注入到
20mL透明质酸溶液中,搅拌3h(如图2所示),得到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液。利用马尔文激光粒度仪测试季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶粒径为257.9±4.8nm,电位为-
22.3±1.9mV(如图3所示),用场发射透射电子显微镜观察到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶形貌为大小较均匀的圆球形(如图4所示)。季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶在生理盐水中的稳定性好,常温下放置24h的粒径为265.1±4.2nm。
[0064] (2)氧化苦参碱缓释微凝胶药膏的制备
[0065] 以氧化苦参碱:季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶质量比为2:1的投药比,将60mg氧化苦参碱加入到步骤(1)制备得到的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液中,磁力搅拌(200~400rpm)20h后,用旋转蒸发仪在真空度20kPa、45℃温度条件下将溶液浓缩至2.0mg/mL(通过6000rpm的转速离心收集上层药物溶液,用紫外分光光度计(所使用的波长是220nm)测得药物在微凝胶中的分布为80%,在水溶液中的分布为20%)。根据浓缩溶液的质量加入增稠剂羟丙基甲基纤维素,使增稠剂的最终质量分数为5%,搅拌均匀得到氧化苦参碱缓释微凝胶药膏(如图5所示),其载药量为100%,其中20%分布在微凝胶外面,80%分布在微凝胶里面。
[0066] (3)药物释放效果研究
[0067] 分别称量所制得的氧化苦参碱缓释微凝胶药膏和对照样(制备方法同氧化苦参碱缓释微凝胶药膏但不含季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶)各1.0g,转移至透析袋中(MW:8000-14000),然后放入10mL生理盐水溶液中,在37℃下进行透析,分别在1h、2h、4h、8h、
12h、24h、36h、48h、60h用等体积的生理盐水替换全部透析液体。利用紫外分光光度计测量每个时间点的透析液在220nm处的吸光度值,以累计释放百分率对时间作图,得到氧化苦参碱缓释微凝胶药膏和对照样的体外释放曲线(图6)。从图中可看出,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏的药物释放速率明显比对照样要慢,对照样在12h时已经释放80%,而氧化苦参碱缓释微凝胶药膏在48h后才超过80%,说明季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶对药物释放起到了缓释效果。
[0068] 实施例2
[0069] (1)季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的配制
[0070] 分别配制浓度为0.1mg/mL的季铵盐壳聚糖(将购买得到的季铵盐壳聚糖溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为20.0×104)和透明质酸(将购买得到的透明质酸溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为20.0×104)水溶液,以季铵盐壳聚糖:透明质酸=1:1的质量比制备季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶:在磁力搅拌作用下,利用注射泵将10mL季铵盐壳聚糖溶液以10mL/h的速度缓慢注入到10mL透明质酸溶液中,搅拌1h,得到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液。利用马尔文激光粒度仪测试季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶粒径为205.4±3.3nm,电位为-23.7±1.7mV,用场发射透射电镜观察季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶形貌为大小较均匀的圆球形。季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶在生理盐水中的稳定性好,常温下放置24h的粒径为209.3±3.2nm。
[0071] (2)氧化苦参碱缓释微凝胶药膏的制备
[0072] 以氧化苦参碱:季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶质量比为1:1的投药比,将2mg氧化苦参碱加入到步骤(1)制备得到的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液中,磁力搅拌(200~400rpm)20h后,用旋转蒸发仪在真空度15kPa、温度40℃条件下将溶液浓缩至1.0mg/mL(通过6000rpm离心收集上层药物溶液,用紫外分光光度计测得药物在微凝胶中的分布为60%,在水溶液中的分布为40%)。根据浓缩溶液的质量加入增稠剂羟丙基甲基纤维素,使增稠剂的最终质量分数为8%,搅拌均匀得到氧化苦参碱缓释微凝胶药膏,其载药量为
100%,其中40%分布在微凝胶外面,60%分布在微凝胶里面。
[0073] (3)药物释放效果研究
[0074] 分别称量所制得的氧化苦参碱缓释微凝胶药膏和对照样(制备方法同氧化苦参碱缓释微凝胶药膏但不含季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶)各1.0g,转移至透析袋中(MW:8000-14000),然后放入10mL生理盐水溶液中,在37℃下进行透析,分别在1h、2h、4h、8h、
12h、24h、36h、48h、60h用等体积的生理盐水替换全部透析液体。利用紫外分光光度计测量每个时间点的透析液在220nm处的吸光度值,以累计释放百分率对时间作图,得到氧化苦参碱缓释微凝胶药膏和对照样的体外释放曲线。结果显示,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏的药物释放速率明显比对照样要慢,对照样在12h时释放70%,而氧化苦参碱缓释微凝胶药膏在
48h后才超过70%,说明季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶对药物释放起到了缓释效果。
[0075] 实施例3
[0076] (1)季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的配制
[0077] 分别配制浓度为2.0mg/mL的季铵盐壳聚糖(将购买得到的季铵盐壳聚糖溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为2.0×104)和透明质酸(将购买得到的透明质酸溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为5.0×104)水溶液,以季铵盐壳聚糖:透明质酸=1:3的质量比制备季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶:在磁力搅拌作用下,利用注射泵将10mL季铵盐壳聚糖溶液以10mL/h的速度缓慢注入到30mL透明质酸溶液中,搅拌6h,得到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液。利用马尔文激光粒度仪测试季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶粒径为325.0±13.1nm,电位为-22.7±1.6mV,用场发射透射电镜观察季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶形貌为大小较均匀的圆球形。季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶在生理盐水中的稳定性好,常温下放置24h的粒径为335.1±4.5nm。
[0078] (2)氧化苦参碱缓释微凝胶药膏的制备
[0079] 以氧化苦参碱:季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶质量比为4:1的投药比,将320mg氧化苦参碱加入到步骤(1)制备得到的季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液中,磁力搅拌(200~400rpm)20h后,用旋转蒸发仪在真空度30kPa、温度45℃条件下将溶液浓缩至3.0mg/mL(通过6000rpm离心收集上层药物溶液,用紫外分光光度计测得药物在微凝胶中的分布为70%,在水溶液中的分布为30%)。根据浓缩溶液的质量加入增稠剂羟丙基甲基纤维素,使增稠剂的最终质量分数为2%,搅拌均匀得到氧化苦参碱缓释微凝胶药膏,其载药量为
100%,其中30%分布在微凝胶外面,70%分布在微凝胶里面。
[0080] (3)药物释放效果研究
[0081] 分别称量所制得的氧化苦参碱缓释微凝胶药膏和对照样(制备方法同氧化苦参碱缓释微凝胶药膏但不含季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶)各1.0g,转移至透析袋中(Mw:8000-14000),然后放入10mL生理盐水溶液中在37℃下进行透析,分别在1h、2h、4h、8h、12h、
24h、36h、48h、60h用等体积的生理盐水替换全部透析液体。利用紫外分光光度计测量每个时间点的透析液在220nm处的吸光度值,以累计释放百分率对时间作图,得到氧化苦参碱缓释微凝胶药膏和对照样的体外释放曲线。结果显示,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏的药物释放速率明显比对照样要慢,对照样在12h时释放90%,而氧化苦参碱缓释微凝胶药膏在48h后才超过90%,说明季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶对药物释放起到了缓释效果。
[0082] 对比例1
[0083] 分别配制浓度为0.1mg/mL的季铵盐壳聚糖(将购买得到的季铵盐壳聚糖溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为45.0×104)和透明质酸(将购买得到的透明质酸溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为60.0×104)水溶液,以季铵盐壳聚糖:透明质酸=1:1的质量比制备季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶:在磁力搅拌作用下,利用注射泵将10mL季铵盐壳聚糖溶液以10mL/h的速度缓慢注入到10mL透明质酸溶液中,进行搅拌,在微凝胶制备过程中出现絮状沉淀,无法形成均匀分散的纳米微凝胶。
[0084] 对比例2
[0085] (1)季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的配制
[0086] 分别配制浓度为2.0mg/mL的季铵盐壳聚糖(将购买得到的季铵盐壳聚糖溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为0.5×104)和透明质酸(将购买得到的透明质酸溶解于去离子水中,用孔径为0.22μm过滤器过滤,然后使用凝胶色谱仪(GPC,美国Waters1515)测量分子量为1.0×104)水溶液,以季铵盐壳聚糖:透明质酸=1:3的质量比制备季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶:在磁力搅拌作用下,利用注射泵将10mL季铵盐壳聚糖溶液以10mL/h的速度缓慢注入到30mL透明质酸溶液中,搅拌6h,得到季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶水溶液。制备得到的微凝胶稳定性差,在生理盐水中存放24h后会发生解体。
[0087] (2)氧化苦参碱普通药膏的制备
[0088] 按实施例3步骤(2)制备,得到的氧化苦参碱普通药膏的缓释效果较差,基本同实施例1-3中的对照样。
[0089] 对比例3
[0090] 季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的配制基本同实施例1,区别仅在于:季铵盐壳聚糖和透明质酸的质量比为2:1时,得到的微凝胶粒径分布不均匀,粒径200~600nm,PDI大于0.5。
[0091] 对比例4
[0092] 季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的配制基本同实施例1,区别仅在于:季铵盐壳聚糖和透明质酸的质量比为1:4时,在微凝胶制备过程中出现絮状沉淀。
[0093] 对比例5
[0094] 季铵盐壳聚糖/透明质酸微凝胶的配制按实施例1制备。氧化苦参碱缓释微凝胶药膏的制备基本同实施例1,区别仅在于增稠剂为淀粉或明胶,得到的氧化苦参碱缓释药膏增稠效果不明显,增稠后的产物呈流动状,缓释效果变差,12h释放达到50%。
[0095] 实施例4氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠的镇痛、治疗组胺非依赖性瘙痒的作用
[0096] (一)实验材料
[0097] (1)实验仪器及耗材
[0098] SHIMADZU-ATY124型电子分析天平(日本岛津公司)、HDC-HS250型摄像机(日本Panasonic公司)、505型游标卡尺(日本Mitutoyo Mfg公司)、蓝光播放机(日本Panasonic公司)、DMC-LX100型数码相机(日本Panasonic公司)、1-15K型冻离心机(德国sigma公司)、ND2000C型超微量紫外分光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)、LightCycler480型实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)、 96-Well Thermal Cycler(美国Applied Biosystems公司)、小鼠行为学鼠盒(美国Acrylic公司)、MSV269型体式显微镜(德国Leica公司)、PCR8联排管(美国Axygen公司,Lot:06417002)、方形镜片、三脚摄像架、10×10cm2蓝色PVC塑料板,1×2m2黑色吸光背景布、一次性1mL注射器镊子、眼科剪等。
[0099] (2)实验药品及试剂
[0100] 方形酸二丁酯(SADBE,Tokyo Chemicals Inc,Japan,Lot:RIDHO-H,CAS:2892-62-8;1%戊巴比妥钠(Sigma Inc,America,Lot:150828);复方醋酸地塞米松软膏(华润三九医药股份有限公司,China,Lot#1804032H);氯化钠注射液(江西科伦药业有限公司,China,Lot:C18011407);氧化苦参碱(纯度97%,艾览(上海)化工科技有限公司,China,CAS:
16837-52-8,Lot:CEBF150009);SADBE溶于丙酮中配制成1%的SADBE丙酮溶液,戊巴比妥钠溶于生理盐水中配成1%的戊巴比妥钠溶液。
[0101] (3)实验动物及分组
[0102] 雄性SPF级C57BL/6小鼠69只,6周龄,体重20~25g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,No.11401300083737,许可证号:SCXK(京)2014-0004,饲养于广东省暨南大学实验动物管理中心,实验单位使用许可证编号:SYXK(粤)2017-0174,小鼠自由饮水饮食。同样地,小鼠适应性喂养1周后,按照随机分组原则将小鼠分为溶剂对照组(12只)、空白药膏组(14只)、模型组(15只)、氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组(14只)、阳性药组(复方醋酸地塞米松软膏组,14只)。
[0103] (二)造模及给药
[0104] 各组小鼠均在造模前两天即第-1天,用1%的戊巴比妥钠进行短暂麻醉后,用电推刀将小鼠腹部(面积约2×2cm2)毛发刮去,其中溶剂对照组与空白药膏组小鼠在致敏期(第1天至第3天)连续3天在腹部刮毛部位均匀涂以25μL丙酮,而模型组、氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组、阳性药组小鼠则在相同部位涂以25μL 1%的SADBE丙酮溶液,实验从第-1天开始,将小鼠放到用于观察行为学的特制透明亚克力盒中进行适应性训练,每天1次,每次两小时。实验第6天,小鼠用1%的戊巴比妥钠进行短暂麻醉后,将小鼠左右两侧面颊(面积约1×1cm2)毛发刮去,并用游标卡尺测量右侧面颊的皮肤折叠厚度。实验第8-9天(激发期),在溶剂对照组和空白药膏组小鼠右侧面颊刮毛部位均匀涂以25μL丙酮溶液,其他组小鼠则在相同部位涂以25μL 1%的SADBE丙酮溶液。6小时后,按照溶剂对照组、空白药膏组、模型组、阳性药组、氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组的顺序在各组小鼠腹部刮毛部位分别涂抹60μL纯净水、60mg空白软膏、60mg空白药膏、60mg复方醋酸地塞米松软膏(30g:22.5mg)、60mg氧化苦参碱缓释微凝胶药膏(实施例2中制备得到),在右侧面颊刮毛部位则按相同组别顺序分别涂抹30μL纯净水、30mg空白药膏、30mg空白药膏、30mg复方醋酸地塞米松软膏(30g:
22.5mg)、30mg氧化苦参碱缓释微凝胶药膏,每天只用涂抹一次即可。实验第10天,按照第8天、第9天相同的给药方式在相同时间进行涂抹给药,每天一次。各组小鼠均不再在小鼠腹部及面颊部位涂抹丙酮或者1%的SADBE丙酮溶液,第11天,将小鼠置于行为学鼠盒中适应,
30分钟后,进行1.5小时录像,记录小鼠的自发行为,行为学实验进程表参考图7。
[0105] (三)行为学录像方法及行为数据分析
[0106] (1)小鼠面颊行为学模型的建立及录像方法
[0107] 目前,小鼠面颊模型已经被越来越多的研究者应用于研究瘙痒及疼痛行为,并且该面颊模型主要由三叉神经支配,通过对类似于痒的搔抓面颊以及类似于痛的擦拭面颊的行为进行统计分析,可以用来评价药物的镇痛以及治疗组胺非依赖性瘙痒的作用。因此,本研究均采用小鼠面颊模型氧化苦参碱缓释微凝胶药膏进行药效学评价,详见图8。
[0108] 参考美国耶鲁大学LaMotte课题组的录像方法,在进行行为学录像时,每次将两只小鼠分别置于各自独立、透明的亚力克适应性盒子内,并加入适量小鼠垫料。每个亚克力盒子大小为9×9×13cm3。盒子的上部边缘开有4个1cm2圆形通气小孔,盒子底部同样也有5个大小一致的通气小孔,并且每个盒子底部均贴有10×10cm2蓝色PVC塑料板,最后将两个盒子相对放置于1×2m2黑色吸光背景布上面。摄像机置于亚力克盒子的正上方,以保证每次能同时对两只小鼠进行录像。每个亚力克盒子的四周分别放置一面镜子,镜子与地面的夹约为60~75度,录像前,通过调节镜子位置使得摄像机能够能以全方位的视角清楚地记录小鼠的自发行为。为保证录像时间的连续性,以便后期统计校对,每个摄像机下面放置2个计时器。详情见图9。
[0109] 小鼠对外界的干扰很敏感,从而会影响其行为。因此,在整个实验过程中,我们采取以下措施,以便尽可能减少外界对小鼠行为的干扰:(1)不论是适应阶段,还是录像阶段,每只小鼠均单独放置于适应性鼠盒中,每个鼠盒四周均有一面镜子,鼠盒之间没有干扰;(2)录像时,环境温度保持在23-27℃之间,每天固定在9:00-16:00之间进行录像;(3)适应性鼠盒内放置少量小鼠所在喂养笼盒中的垫料,一方面是使小鼠更好地适应适应性笼盒的环境,另一方面是用来吸收小鼠排出的尿液;(4)为了使小鼠适应实验环境,所有小鼠在正式实验前都要进行为期5日的适应性训练;(5)录像开始后,实验者应迅速离开实验室,以免干扰小鼠行为;(6)实验在隔音室中进行,同时用收音机播放白噪音,以掩盖外界的其他噪音;(7)正式实验时,小鼠要先放到鼠盒中适应半小时,然后再进行录像。
[0110] (2)小鼠行为学数据记录及分析方法
[0111] 瘙痒和疼痛都属于主观感觉,动物虽不能直接表达其感受,但却可以通过搔抓和擦拭动作表现出瘙痒与疼痛。小鼠的搔抓尤其是擦拭动作非常迅速,为了排除其他干扰动作的影响,我们将录像视频通过蓝光影碟机连接到高清电视机进行反复慢速播放,由不清楚实验分组和实验目的的人员对数据进行双盲分析。
[0112] 对于搔抓行为,指的是小鼠利用后肢对面颊进行搔抓的动作,通常从小鼠抬起后肢到后肢放回地面或嘴中记作一次搔抓行为发作。一次搔抓行为可能包括一次或多次后肢反复搔抓面颊的动作,所以有时一次搔抓行为可能持续约0.5-2秒甚至更长时间,小鼠搔抓面颊后,后爪一般会有少量的皮肤或毛发碎屑残留,因此小鼠经常会在搔抓结束后,将后爪放入嘴中进行清理。
[0113] 对于擦拭行为,指的是小鼠利用前肢对面颊进行擦拭的动作,通常指小鼠利用其单侧前肢从面颊的后部或朵前部开始,朝着鼻子方向迅速移动,与搔抓行为相比,这些动作简短、轻柔、快速,单次动作持续不超过0.5秒。小鼠常用前肢的内侧来擦拭面颊,动作发生时,小鼠的前爪一般是握着的,且不与面颊接触。擦拭行为要与小鼠梳理毛发的行为相区分,通常小鼠在梳理毛发时,其两侧前肢同时擦拭面颊,或者从耳朵后面开始,接着通过整个面颊部位。注意小鼠两侧前肢交互擦拭面颊的行为并不记录统计。
[0114] 最后,通过对每分钟内小鼠搔抓和擦拭脸颊的次数进行统计,最后计算出整个观察时间段内小鼠总的搔抓,擦拭面颊的行为次数。小鼠行为记录表如下表1所示。
[0115] 表1
[0116]
[0117] (四)小鼠右侧面颊激发处皮肤折叠厚度变化的测定
[0118] 分别由两名不清楚实验目的及实验分组的实验人员使用游标卡尺测量小鼠右侧面颊激发前与激发后的皮肤折叠厚度。测定时,每只小鼠共测量3次并取3次数值的平均值。第1次于第6天刮毛后进行,记录为激发前小鼠右侧面颊皮肤折叠厚度。第2次于第11天录像结束后进行,记录为激发及给药后小鼠右侧面颊皮肤折叠厚度。通过第2次的数值减去第1次的数值,便可以得出小鼠右侧面颊激发处皮肤折叠厚度的变化值。
[0119] (五)小鼠脾脏及胸腺指数的测定
[0120] 颈椎脱臼处死小鼠,完整摘取小鼠脾脏及胸腺,用分析型电子天平测定其重量,分别以每10g体重小鼠的脾重(mg)和胸腺重(mg)作为脾脏指数和胸腺指数。
[0121] (六)小鼠右侧面颊激发处皮肤HE染色及甲苯胺蓝染色
[0122] 小鼠颈椎脱臼处死后,将小鼠右侧面颊激发处皮肤毛发清理干净,之后在小鼠右侧面颊激发处皮肤的下部沿水平方向剪开一个小口,使用10cm尖弯手术剪分离皮肤,用镊子向下扯动以剥离皮肤,并使用眼科剪剪下皮肤(面积约1cm2)。置于生理盐水中洗净,用滤纸吸干后,放于4%的多聚甲溶液中固定,常规石蜡包埋,于皮肤中部沿水平方向连续切取数张5μm厚的切片,作苏木精-伊红(HE)及甲苯胺蓝(TB)染色,以观察皮肤结构。
[0123] (七)统计学分析
[0124] 采用SPSS18.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准误(mean±SEM)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)以及Dunnett t3检验(方差不齐的情况下),当p<0.05时,认为具有显著性差异。
[0125] (八)实验结果
[0126] (1)图10是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏实验中小鼠在90分钟内搔抓、擦拭右侧面颊的行为总数。从结果来看,与溶剂对照组相比,空白药膏组小鼠的搔抓行为并没有显著性差异,擦拭行为有明显增加(p<0.05)。与模型组相比,空白药膏组、氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组小鼠搔抓次数均显著减少(p<0.01),阳性药组小鼠搔抓行为有降低趋势;空白药膏组、氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组、阳性药组小鼠擦拭行为均显著减少(p<0.01)。
[0127] (2)图11是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏实验中小鼠右侧面颊激发处皮肤折叠厚度的变化,与溶剂对照组相比,空白药膏组小鼠的面颊皮肤厚度差值有显著的增加(p<0.05)。与模型组相比,空白药膏组、氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组及阳性药组小鼠的右侧面颊皮肤厚度差值则呈现非常显著的下降(p<0.01)。
[0128] (3)图12是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏对痛痒共病小鼠脾脏与胸腺指数的影响。与溶剂对照组相比,空白药膏组小鼠的胸腺指数与脾脏指数均有显著的增加(p<0.05或
0.01)。与模型组相比,空白药膏组、氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组及阳性药组小鼠的胸腺指数与脾脏指数均呈现非常显著的下降(p<0.05或0.01)。
[0129] (4)图13是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏实验中小鼠右侧面颊皮肤激发区域及腹部皮肤致敏区域的代表性图片,从图中可以明显看出,溶剂对照组与空白药膏组小鼠的面颊与腹部没有明显不同;而与模型组相比,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组尤其是阳性药组小鼠面颊结痂情况明显改善,一些小鼠的痂开始脱落,面颊激发处皮肤红肿减轻,有些完全消退。
[0130] (5)图14是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏实验中小鼠右侧面颊激发处皮肤HE染色结果,与溶剂对照组(A)相比,空白药膏组(B)小鼠皮肤表皮稍有增厚,但深层皮肤结构未出现破坏。模型组(C)小鼠皮肤表皮重度角化过度,角质层及棘细胞层增厚并有结痂脱落;有苔藓样浸润,皮沟加深,皮嵴突起;表皮与真皮的界限不清,大量淋巴细胞在真皮上部呈带状浸润。与模型组相比,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组(D)及阳性药组(E)小鼠表皮厚度显著地减小,炎性细胞浸润程度减轻,皮肤的病理情况具有一定程度的改善。
[0131] (6)图15是氧化苦参碱缓释微凝胶药膏实验中小鼠右侧面颊激发处皮肤甲苯胺蓝染色结果,与溶剂对照组(A)相比,空白药膏组(B)小鼠皮肤中肥大细胞数目没有显著性差异。而与空白凝胶组相比,模型组(C)小鼠面颊皮肤中肥大细胞严重浸润,数目显著增加(p<0.01)。与模型组相比,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组(D)及阳性药组(E)小鼠面颊皮肤中肥大细胞数目显著减少(p<0.01)。
[0132] (九)结论:首先我们通过正交实验探究季铵盐壳聚糖/透明质酸最佳配比及制备方法,制备出了季铵盐壳聚糖/透明质酸纳米粒子,粒径在150~350nm左右,zeta电位为-30~-20mV,通过透射电镜观察粒子形貌为球形且粒径较为统一。并且,研究了投药量对纳米粒子载药量的影响,发现在一定范围内有最适载药量,投药量与载药量之间并不呈现简单的正比关系。在投药比为2:1时,季铵盐壳聚糖/透明质酸纳米粒子的内部载药量在80%,水溶液中分布20%。最后通过体外释放实验发现,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏在使用48h后氧化苦参碱释放率能够超过90%。
[0133] 然后,我们利用氧化苦参碱缓释微凝胶药膏通过在痛痒共病小鼠模型的激发期连续3天,每天1次面颊涂抹,结果显示:此种氧化苦参碱缓释微凝胶药膏能够显著减少小鼠擦拭面颊的疼痛行为,同时能够显著减少小鼠搔抓面颊的瘙痒行为。除此之外,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏能够显著降低小鼠面颊皮肤折叠厚度(p<0.05),脾脏、胸腺指数(p<0.01)。并且从各组小鼠面颊与腹部表观情况分析,此种氧化苦参碱缓释微凝胶药膏能够改善结痂、减轻红肿。HE染色结果显示,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组小鼠皮肤表皮厚度显著地减小,炎性细胞浸润程度减轻,皮肤的受损情况具有一定程度的改善。甲苯胺蓝染色结果显示,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏组小鼠皮肤中肥大细胞浸润情况明显减轻,肥大细胞数目减少。综上所述,氧化苦参碱缓释微凝胶药膏外用具有治疗组胺非依赖性瘙痒、镇痛、抗炎的作用。
[0134] 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
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