一种E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM多重抗体免疫磁珠及其
制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 循环
肿瘤细胞(CTC)是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，一般以单个细胞或细胞团(又称循环肿瘤微栓子，CTM)的形式存在于循环系统中。转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的
种子。CTC为了获得运动性和侵袭性，会丢失某些上皮细胞的表型(包括形态、表面
抗原、基因表达等)并获得某些间充质细胞的表型，这就是上皮-间质转变(EMT，Epithelial-Mesenchymal Transition)。多数
恶性肿瘤细胞在脱离原发灶的过程中发生EMT。因此CTC存在不同表型，包括上皮表型、间质表型和中间表型。表型分析对于发现肿瘤、判断转移情况、判断
预后、
治疗情况等都有重要意义。研究发现，CTM与间质表型CTC密切相关，并且高比例的间质表型CTC与化疗耐药有关(Science 2013；339：580)。另外的研究显示，CTM可抵御失巢凋亡(anoikis)、耐受细胞毒药物(J Clin Oncol 2012；30:525)、比单个肿瘤细胞具有更强的转移潜能(Clin Cancer Res 2001；7:4080)。因此，CTM和间质细胞表型CTC(EMT CTC)与单个普通CTC相比，与预后的相关性可能更强。
[0003] 同时，CTC在外周血中的浓度非常低，通常在约109个血细胞中仅有数个CTC，大约每105～107个单核细胞中才有几个循环肿瘤细胞。因此，从复杂
血液样本中准确、高效地将CTC分选出来，需要的高捕获率和敏感度。现有的捕获和富集CTC的方法主要包括通过
密度、分子大小等物理性质捕获CTC的方法或基于
生物标识物EpCAM(上皮细胞粘着分子)捕获CTC的方法。通过密度、分子大小等物理性质捕获CTC的方法容易导致CTC漏筛。而基于生物标识物EpCAM捕获CTC的方法，仅可捕获到上皮表型的CTC，当CTC处于间质表型时则无法捕获到，导致结果假阴性，捕获与富集的结果并不准确。
[0004] 基于CTC表面生物标识物的免疫磁珠富集则是目前应用最为广泛的CTC捕获方式之一，其操作容易，捕获效率高，应用前景好。但目前市面上大多用微米级(1200～4500nm)的免疫磁球捕获CTCs，此大小的免疫磁球进行磁分离时容易对细胞造成机械压
力，影响细胞的生物学功能和活性，不利于后续分析和培养。而且由于捕获的CTCs还需要经过磁球释放后才能进一步分析，这使CTCs的检测和分析过程变得比较繁琐。Miltenyi Bioec公司开发的MACS系统以及Veridex公司开发的CellSearch系统采用了
纳米级的免疫磁珠捕获CTCs。其中，MACS系统使用的是粒径为50nm的纳米免疫磁珠，但是磁响应较慢，必须使用较强的
磁场搭配专用的一次性磁分离柱才能完成CTCs的捕获，成本昂贵。CellSearch系统使用的是粒径为120-200nm的纳米免疫磁珠，其在捕获CTCs过程中增加了多步额外的步骤来增强纳米球的
磁性，并且采用了捕获增强
试剂来增强纳米免疫磁珠与抗原的结合，操作比较繁琐，且CellSearch系统的免疫磁珠已自2016年初就已经开始停止销售。
发明内容
[0005] 本发明的主要目的是针对
现有技术存在的不足提供一种E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM多重抗体免疫磁珠，磁珠粒径小，磁响应性好，而且用本发明的免疫磁珠进行循环肿瘤细胞捕获，富集时间短，捕获的循环肿瘤细胞富集率高，减少了结果的假阴性，同时多重抗体免疫磁珠的制备过程简单，成本低。
[0006] 在本发明的一方面，本发明是通过如下技术方案实现的：一种E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM多重抗体免疫磁珠，所述多重抗体免疫磁珠由E-cadherin免疫磁珠、Cadherin-11免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠组成，其中E-cadherin免疫磁珠、Cadherin-11免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠分别为E-cadherin抗体、Cadherin-11抗体和EpCAM抗体和磁性微球偶联得到的免疫磁珠。
[0007] 进一步的，所述E-cadherin免疫磁珠、Cadherin-11免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠的结构式为：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM抗体，或者A表示E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM抗体，B表示磁性微球。
[0008] 优选的，所述磁性微球为
核壳结构的无机或有机高分子包裹的磁性微球。比如
二氧化
硅包裹的磁性四氧化三
铁、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三铁等。最优选的，所述磁性微球为
二氧化硅包裹的磁性四氧化三铁。
[0009] 在本发明的第二方面，提供了一种制备所述E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM多重抗体免疫磁珠的方法，其步骤包括：
[0010] s1.磁性纳米簇的制备；
[0012] s3.肼基修饰的A部分的制备；
[0014] s5.免疫磁珠的制备：将步骤s3所述肼基修饰的A部分与步骤s4所述醛基修饰的B部分混合，在4～25℃下进行偶联反应2～24小时，得到E-cadherin免疫磁珠、Cadherin-11免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，对氨基修饰的磁性微球部分进行醛基修饰，并且对E-cadherin抗体、Cadherin-11抗体和EpCAM抗体分别进行肼基修饰。或者对氨基修饰的磁性微球进行肼基修饰，并且对E-cadherin抗体、Cadherin-11抗体和EpCAM抗体分别进行醛基修饰，均可以实现上述结构的免疫磁珠。
[0016] 进一步的，所述步骤s3中的肼基修饰的A部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为10～50倍的SANH进行肼基修饰后得到的。所述SANH为对-丙腙基吡啶
甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：362522-50-7)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球或抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对抗体的修饰反应时间2～4h。
[0017] 进一步的，所述步骤s4中的醛基修饰的B部分是通过：将氨基修饰的磁性微球或抗体用摩尔当量为5～20倍的SFB进行醛基修饰后得到的。所述SFB为4-甲酰
苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(CAS：60444-78-2)，在室温条件下可以温和的将氨基转换为醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中进行反应，浓度可以根据磁性微球部分或抗体的浓度进行调整，不影响反应结果。该反应过程可以在15～25℃室温条件下进行，反应时间根据本领域技术人员常规的检测技术判断，本发明一般采用对磁性微球的修饰反应时间16～24h，对抗体的修饰反应时间2～4h。
[0018] 所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过
水热法、
溶剂热法或共沉淀法制备得到，也可以采用市售商品。制备磁性纳米簇的方法为本领域技术人员所熟知的技术，得到的产品只需要满足具有良好的磁性，并且可以与无机或有机高分子形成核壳结构即可。
[0019] 作为优选的，所述步骤s1中的磁性纳米簇是通过如下方法制备得到：
[0020] 1)在空气中，向二价铁盐的水溶液中加入
氨水，然后搅拌使溶液变成黑色，得到黑色Fe3O4颗粒；
[0021] 2)向步骤1)中加入油酸，混合均匀后转移至密闭的反应釜中，在60～130℃下加热反应3～5小时，即可得到所述磁性纳米簇。
[0022] 进一步的，所述步骤s2中的氨基修饰的磁性微球部分为核壳结构的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加优于直接在磁性纳米簇粒子表面进行氨基修饰得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本领域技术人员所知的常规方法制备，均不影响本发明的结果。可以使纳米簇聚集在二氧化硅内部，形成核壳结构，增大粒径，并且增加磁性和
稳定性即可。优选的，本发明采用如下方法制备氨基修饰的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性纳米簇的溶液中加入氨水、硅烷化试剂和氨基硅烷
偶联剂，反应1～3天后得到氨基修饰的磁性微球部分；所述磁性纳米簇、氨水、硅烷化试剂、氨基硅烷偶联剂加入的
质量比为：1:
(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的质量百分浓度为25～28％。其中，硅烷化试剂可以为正
硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶联剂可以为(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本领域技术人员在选择其他的硅烷化试剂与氨基硅烷偶联剂时，可以对反应原料的比例进行调整，均不超出本发明的保护范围。
[0023] 优选的，所述步骤s5中，磁性微球和抗体的质量比为1：(0.01～1)。抗体与磁性微球的质量比越高越有利于磁性微球表面偶联抗体，但是考虑到抗体的成本因素，本发明采用磁性微球和抗体的质量比为1：(0.01～0.2)。
[0024] 在本发明的第三方面，提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的
试剂盒，所述试剂盒中含有上述多重抗体免疫磁珠，其中，多重抗体免疫磁珠为E-cadherin免疫磁珠、Cadherin-11免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠混合得到。由于不同的肿瘤细胞表达的表面抗原量不同，因此E-cadherin免疫磁珠、Cadherin-11免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠混合的比例可以根据肿瘤的类型不同进行选择，本发明采用1:1:1。
[0025] 本发明的有益效果为：
[0026] (1)将本发明的多重抗体免疫磁珠用于捕获CTC，可以捕获到处于不同表型的CTC细胞，扩大捕获和富集CTC细胞的
覆盖范围，同时特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高。避免了捕获的CTC损伤，CTC可以用于进一步的分析和培养。也可以用于外泌体、体液或活检组织的肿瘤细胞捕获与分析。
[0027] (2)本发明的免疫磁珠，其磁性微球部分和抗体部分通过腙键结构相连，得到的免疫磁珠在弱
碱性条件下(血液中)性质稳定，同时粒径小，磁响应性好、分散性好。
[0028] (3)本发明的制备方法简单，反应条件温和，氨基、醛基和肼基修饰的过程均可以在室温下进行，不容易造成抗体的变质、降解等，同时避免了使用还原剂，使抗体可以在低温下与细胞孵育，保持抗体和细胞的活性。
[0029] (4)本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，抗体包被量大，具有很强的实用性。
附图说明
[0030] 图1为本发明多重抗体免疫磁珠分选的肿瘤细胞免疫
荧光图。
具体实施方式
[0031] 以下通过具体
实施例来进一步说明本发明：下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品
说明书选择。
[0032] 实施例1多重抗体免疫磁珠的制备
[0033] (1)磁性纳米簇的制备：
[0034] a.在空气中，将7g FeCl2·4H2O加入到50mL去离子水中，得到浓度为0.14g/mL的FeCl2水溶液。向50mL FeCl2水溶液中加入氨水30mL，搅拌45min后，
颜色逐渐变为浅绿色，再变深绿色，最后变为黑色；
[0035] b.向步骤a中加入1.1g油酸，混合均匀后将
混合液置于密闭的反应釜中，在110℃下加热反应4小时，然后用去离子水和
乙醇交替洗涤各一次，磁分离后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性纳米簇Fe3O4。
[0036] (2)氨基修饰的磁性微球的制备：向10mg磁性纳米簇Fe3O4 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反应1天后进行磁分离，并且用乙醇和水交替洗涤各两次，并用0.1M的pH 7～8的
磷酸缓冲液分散后得到浓度为5mmol/L的氨基修饰的磁性微球1。
[0037] (3)肼基修饰的EpCAM抗体的制备：将5μL SANH的DMF溶液(浓度为5mmol/L)加入到100μL EpCAM抗体溶液(浓度为10μmol/L)中，在室温反应2h后，用
超滤柱纯化得到肼基修饰的EpCAM抗体(简写为EpCAM-SANH)1。
[0038] 检测EpCAM-SANH的浓度：通过BCA法计算修饰后的EpCAM-SANH的浓度为1.20mg/mL。
[0039] 检测肼基修饰率：用定量的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液检测肼基修饰率。取纯化后的EpCAM-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰钠盐溶液中，涡旋混匀后于37℃反应1h，Nanodrop检测348nm处的吸光值为0.24。通过348nm处的吸光值和EpCAM-SANH的浓度计算出EpCAM-SANH的肼基修饰率为2.8。
[0040] (4)醛基修饰的磁性微球的制备：将5μL的氨基修饰的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(浓度为5mmol/L)50μL中，在室温反应20h后，进行磁分离纯化，得到醛基修饰的磁性微球1。
[0041] (5)免疫磁珠的制备：将1mg步骤(4)中的醛基修饰的磁性微球与0.01mg步骤(3)中的肼基修饰的EpCAM抗体混合，在25℃下PBS缓冲液中混合4小时后，进行磁分离得到EpCAM免疫磁珠。
[0042] 按照上述步骤(1)～(5)制备得到E-cadherin免疫磁珠和Cadherin-11免疫磁珠。将E-cadherin免疫磁珠、Cadherin-11免疫磁珠和EpCAM免疫磁珠按照质量比1:1:1混合得到多重抗体免疫磁珠。
[0043] 实施例2多重抗体免疫磁珠的敏感性检测
[0044] 取人
乳腺癌细胞MCF-7、人
前列腺癌细胞PC-3和人表皮癌细胞A-431(均购自中国科学院细胞库)，每组肿瘤细胞分别按照1:103、1:104、1:105、1:106的比例加入到PBMCs(5×106)中。将单独的抗体免疫磁珠以及多重抗体免疫磁珠分别加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟。在2分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，得到用免疫磁珠捕获并回收的肿瘤细胞。统计回收的肿瘤细胞占加入的肿瘤细胞总数的比例，计算免疫磁珠的捕获率，结果如表1所示：
[0045]
[0046] 表1不同免疫磁珠的捕获率
[0047] 表1的结果表明，在EpCAM高度表达的细胞系MCF-7，A-431，EpCAM低度表达的细胞系PC-3中，用单独的EpCAM抗体磁珠捕获肿瘤细胞，捕获率明显下调，但是用多重抗体免疫磁珠捕获肿瘤细胞，在各种细胞系中的捕获效率相近，并且明显高于单独的抗体磁珠捕获效率。同时，随着肿瘤细胞添加比例的增加，捕获肿瘤细胞的数量呈线性。
[0048] 实施例3模拟血液中肿瘤细胞的捕获
[0049] 采集健康志愿者血样，将PC-3细胞与健康人的外周血混合，配成混合细胞悬液，调节PC-3细胞的浓度为1、10、20、50、500、1000个/mL，然后将多重抗体免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟。在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，得到用免疫磁珠捕获并回收的PC-3细胞。统计回收的PC-3细胞占捕获前细胞总数的比例，计算免疫磁珠捕获血液样品中PC-3细胞的捕获效率，与实施例2中结果相近。
[0050] 从实施例2-3的捕获结果来看，多重抗体免疫磁珠在单纯环境中(实施例2)的捕获效率能够精确到1：106，多重抗体免疫磁珠在复杂环境中(实施例3)也可以检测到1个/mL的PC-3细胞，可以满足目前液体活检的要求。
[0051] 对上述孵育后的磁珠用无
钙镁的PBS缓冲液重悬，将洗脱得到的磁珠-细胞用PicoPure RNA Isolation Kit试剂盒(Thermo Cat No：KIT0214)提取纯化总RNA，采用了PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA,Cat No：RR047A)，按说明书要求去除基因组DNA以及进行cDNA链合成。接下来涉及相应Taqman引物，进行qPCR检测，以GAPDH为内标比较qPCR检测结果，在相同条件下，与PC-3细胞的qPCR检测结果一致。说明用本发明的免疫磁珠捕获循环肿瘤细胞不会损伤细胞，可以用于后续细胞分析。并且说明，用本发明的免疫磁珠捕获到的细胞几乎没有PBMCs细胞，PBMCs细胞则基本不与免疫磁珠结合。
[0052] 实施例4癌症病人的CTC细胞捕获
[0053] 取健康人和不同癌症病人的外周血血液，对血液中的CTC进行捕获。要求受试者血常规白细胞值位于2×106～1.2×107个/mL之间，
全血样本未出现溶血或血
块凝结。并且受试者相关信息完整，样本采集、保存方法规范，实验操作规范，具体步骤如下：取不同癌症病人血液3ml，加入多重抗体免疫磁珠依次加入到上述各混合细胞悬液中，在4℃下孵育30分钟，然后在1分钟内进行磁分选并用PBS洗涤2-3次，将孵育回收的CTC进行抗体
染色、并在
载玻片上固定、然后进行细胞核DAPI染色、封片后，用荧光
显微镜鉴定，结果如图1所示，细胞膜表面显示有荧光，在荧光显微镜下为绿光荧光，说明捕获到的细胞表面呈E-cadherin、Cadherin-11、EpCAM中间至少一种阳性，说明为肿瘤细胞。而正常人的血液中没有捕获到肿瘤细胞。作为对照的，对同样的病人血液中加入EpCAM抗体免疫磁珠，然后进行同样的孵育与染色，同样用荧光显微镜鉴定计数，计数结果如表1所示：
[0054] 表1捕获的CTC的荧光检测结果
[0055]
[0056]
[0057] 从表1可以看出，用本发明的多重抗体免疫磁珠捕获到的CTC细胞数量更多，捕获效率更高。
[0058] 如果先对血液进行红细胞裂解，并且用CD45抗体免疫磁珠去除血液中的白细胞后再用多重抗体免疫磁珠进行肿瘤细胞的捕获，捕获效率更高。
[0059] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理以及
权利要求的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
