一种制备雌二醇分子印迹磁性微球的方法
技术领域
[0001] 本
发明属于材料科学与工程和环境科学领域，具体来说是一种利用可控活性聚合一锅合成制备雌二醇分子印迹磁性微球的方法。
背景技术
[0002] 17β-雌二醇是最重要的酚类环境内分泌干扰
激素之一，其苯
甲酸酯是决定性激素效价国际单位的基准物质之一。除了调节和维持人体正常的内分泌系统平衡，17β-雌二醇在保持骨骼健康和保护心血管系统方面也扮演着重要
角色，并且能影响人的行为和情绪。然而，越来越多的证据显示，稍微过量的17β-雌二醇就会引发不良生理反应，破坏内分泌系统，诱发癌症甚至造成死亡。17β-雌二醇的低剂量高危害性引起人们的广泛关注，亟需对其进行高效识别和检测，而具有高选择富集能
力的前处理材料和技术随之成为研究的重点。
[0003] 目前，基于分子印迹技术的分子印迹
聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)，由于选择性高、
稳定性好及制备简单，已作为一种新型固相
吸附材料，广泛应用于环境样品等复杂基体中痕量分析物的高选择性分离与富集。分子印迹技术是将模板分子(目标识别分子)与功能
单体通过一定的方式形成超分子复合物，在交联剂的存在下，通过一定的引发方式引发生成高度交联的高分子聚合物，然后用适当的
溶剂洗脱去除模板分子,从而形成对模板分子或其相似分子在形状、大小、功能基团上特异性结合的聚合物，即MIPs。MIPs具有亲合性和选择性高、化学稳定性好、使用寿命长、
费用低等优点，在分离纯化、化学催化、分析传感等领域得到广泛的应用。但是，如何简化制备步骤以加快实验
进程，如何提高聚合产率和产物的稳定性，如何进一步提高印迹容量，如何提高分子印迹材料的洗脱和分离效率等问题，仍然制约着MIPs的制备和应用。
[0004] 磁性分子印迹聚合物(Magnetic MIPs，M-MIPs)是将磁性材料和分子印迹技术结合形成的一种新型功能材料。M-MIPs可以在外加
磁场的作用下进行分离，从而达到主动识别和方便快速分离的目的。M-MIPs也可作为固相萃取吸附剂，节省了传统固相萃取填料装柱的时间和材料用量，且具有优良的选择性，在样品前处理领域富有发展潜力。另一方面，可逆加成-断裂链转移(RAFT)可控活性沉淀聚合，操作简单、容易控制，避免了复杂的表面修饰；分步投料一锅操作，可有效简化表面印迹过程，缩短实验周期。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种结合了可逆加成-断裂链转移可控活性自由基聚合和沉淀聚合一锅合成制备雌二醇印迹磁性微球的方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 一种制备雌二醇分子印迹磁性微球的方法，微球利用可逆加成-断裂链转移可控活性自由基聚合与沉淀聚合的一锅合成方式，以17β-雌二醇为模板的分子印迹与磁敏感材料相结合，即得到雌二醇分子印迹聚合物磁性微球。
[0008] 进一步的说，将Fe3O4磁材料经SiO2修饰，而后在SiO2修饰的Fe3O4磁材料表面活化同时引入活性自由基，得活化修饰的Fe3O4@SiO2微粒，待用；
[0009] 以17β-雌二醇作为模板分子与功能单体丙烯酰胺加入到氯仿和乙腈溶液中预聚合，然后依次加入上述活化修饰的Fe3O4@SiO2微粒、交联剂和引发剂，通氮回流反应，洗涤、干燥并收集产物；产物用甲醇和乙
酸溶液进行索氏提取以洗脱17β-雌二醇，干燥即得雌二醇分子印迹磁性微球。
[0010] 更进一步的说，
[0011] a.Fe3O4磁材料制备：将FeCl3·6H2O溶于乙二醇中，并以无
水乙酸钠作为还原剂，聚乙二醇为
表面活性剂，充分混匀后于密闭水热釜中反应，洗涤后干燥收集黑色产物即得Fe3O4磁材料；
[0012] b.Fe3O4@SiO2核层材料的制备：将上述粒子分散在无水
乙醇和去离子水中，加入
氨水、正
硅酸乙酯，搅拌反应，洗涤后干燥收集产物即得Fe3O4@SiO2；
[0013] c.Fe3O4@SiO2核层材料的表面修饰：
[0014] (1)表面活化：加入链转移剂4-氯甲基苯基三氯硅烷，将上述所得Fe3O4@SiO2粒子分散于无水
甲苯中，再加入三乙胺反应，洗涤、干燥并收集产物；
[0015] (2)活性自由基引入：苯基溴化镁与四氢呋喃混匀，加入二硫化
碳后反应，向其中加入上述所得活化产物，在氮气氛围中回流反应，洗涤、干燥并收集产物；
[0016] d.印迹壳层的制备：首先将模板分子17β-雌二醇与功能单体丙烯酰胺加入到氯仿和乙腈溶液中自组装预聚合，然后依次加入上述活化修饰的Fe3O4@SiO2微粒、交联剂二乙烯苯，引发剂偶氮二异丁腈，通氮回流反应，洗涤、干燥并收集产物,产物用甲醇和乙酸溶液进行索氏提取以洗脱17β-雌二醇，干燥即得雌二醇分子印迹磁性微球。
[0017] 所述步骤a.中将1.0-2.0g的FeCl36H2O充分溶解于80-120mL乙二醇中，加入2.0-3.0g无水乙酸钠，搅拌均匀后加入2.0-4.0g聚乙二醇4000，在40-70℃的水浴中搅拌至充分溶解；然后将溶液全部转移至聚四氟乙烯反应釜中，在160-240℃的烘箱中反应8-14h；反应后冷却至室温，分别用无水乙醇和去离子水洗涤3-6次，然后20-30℃
真空干燥即得到黑色Fe3O4磁性材料。
[0018] 所述步骤b.中称取1.0-2.0g上述Fe3O4磁性材料，分散于40-80mL乙醇和10-30mL去离子水中，超声处理10-30min；然后边机械搅拌边逐滴加入0.5-2mL氨水、1-3mL正
硅酸乙酯，继续反应18-26h；然后洗涤干燥，即得Fe3O4@SiO2核层材料，将所得产物密封保存，待用。
[0019] 所述Fe3O4@SiO2核层材料用去离子水洗涤3-6次，用无水乙醇洗3-6次，再用去离子水洗3-6次，30-50℃真空干燥20-28h，收集待用。
[0020] 所述步骤c.中将1-3mL的4-氯甲基苯基三氯硅烷加入到50-60mL的无水甲苯中并摇匀，然后加入0.5-2g所述的Fe3O4@SiO2并超声处理10-30min后，缓慢加入0.5-2mL三乙胺与3-6mL无水甲苯的混合溶液，在氮气保护下50-70℃回流18-28h进行表面活化反应，反应后洗涤、干燥、收集表面活化产物；
[0021] 上述所得产物依次用丙
酮洗涤3-6次，甲醇洗涤3-6次，然后35-50℃真空干燥18-28h；第二步自由基活化反应结束后用甲醇洗涤3-6次，用氯仿洗涤3-6次，然后35-50℃真空干燥18-28h，待用。
[0022] 将10-16mL苯基溴化镁加入到100-150mL精制过的四氢呋喃中，再加入3-4mL二硫化碳后于40-50℃下反应1-3h；而后加入0.3-1.0g的上述表面活化产物，在氮气保护下55-70℃自由基活化反应36-50h，洗涤干燥并收集产物。
[0023] 所述表面活化反应后依次用丙酮洗涤3-6次，甲醇洗涤3-6次，然后35-50℃真空干燥18-28h；所述自由基活化反应结束后用甲醇洗涤3-6次，用氯仿洗涤3-6次，然后35-50℃真空干燥18-28h。
[0024] 所述步骤d.中将6-10mmol丙烯酰胺和1-3mmol的17β-雌二醇溶解于40-60mL氯仿/乙腈溶液(v/v，1:4)中，在
冰水浴中反应搅拌过夜，然后加入200-250mg上述活化修饰的Fe3O4@SiO2，在50-70℃缓慢加入30-50mmol二乙烯苯和40-60mg偶氮二异丁腈，25-40min后升温至60-80℃，通氮气反应18-30h；
[0025] 将上述产物分别用丙酮和氯仿清洗3-6次，然后用
滤纸包好进行索氏提取30-40h，以甲醇和乙酸溶液(v/v，9：1)为洗脱液，每隔10-16h更换上述洗脱液(即，甲醇和乙酸溶液(v/v，9：1))，最后25-50℃烘干，待用。
[0026] 所述微球用于对17β-雌二醇的检测。
[0027] 本发明所具有的优点：
[0028] 本发明采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)可控活性沉淀聚合一锅法制备雌二醇分子印迹聚合物，操作简单快速、反应条件温和、经济环保，并且产率较高、结果稳定可靠。所得微球对17β-雌二醇具有高的吸附容量、快速的动态特性、优异的识别选择性，并在外加磁场左右下方便、快速分离，重复使用性能好。并且17β-雌二醇印迹磁性微球形貌规则、粒径均一，单分散性好。磁性核使得该微球在外加磁场作用下能方便快速的分离；印迹壳层对17-β雌二醇显示出很高的选择性吸附能力。
[0029] 本发明采用分子印迹磁固相萃取摆脱传统固相萃取柱的束缚，直接将吸附材料分散在样品中，传质速率加快，利于达到平衡；磁场控制更加简便，可进行
定位富集，快速、经济，且重复使用性能好；可以对复杂基质中痕量17-β雌二醇进行高效的富集和
净化。
[0030] 另外，本发明充分利用可逆加成-断裂链转移可控活性聚合的特性，采用分步投料一锅操作，制备
核壳结构印迹微球，有效简化了表面印迹过程、缩短了实验周期，大大提高了识别速率和增加了印迹容量。本发明操作简便快捷、成本低、重现性好，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0031] 图1A为本发明
实施例提供的雌二醇印迹磁性微球制备的实验操作过程示意图。
[0032] 图1B为本发明实施例提供的印迹原理和磁分离过程示意图。
[0033] 图2为本发明实施例提供的红外谱图。
[0034] 图3为本发明实施例提供的
磁滞回线图，插图为本发明实施例提供的磁分离效果实物图(左侧为澄清的17β-雌二醇溶液，中间为将该溶液中分散有M-MIPs，右侧为在溶液瓶旁边放置磁
铁)。
[0035] 图4为本发明实施例提供的对17-β雌二醇的静态吸附曲线。
[0036] 图5为本发明实施例提供的对17-β雌二醇及其类似物的吸附容量柱状图。
具体实施方式
[0037] 实施例1
[0038] a.Fe3O4磁材料制备：准确称取1.35g的FeCl36H2O放于100mL的小烧杯中，加入40mL的乙二醇。搅拌均匀后加入2.17g无水乙酸钠，超声处理30min，待溶解完全后加入3g聚乙二醇4000，在60℃的水浴中搅拌至溶解。然后将溶液转移至50mL的反应釜中，置于200℃的烘箱中反应10h，自然冷却后取出，产物分别用无水乙醇和去离子水清洗5次，然后放在通
风橱中自然风干，将得到的纯黑色的Fe3O4产物密封保存。
[0039] b.Fe3O4@SiO2核层材料的制备：将2.0g上述Fe3O4分散于60mL乙醇和10mL去离子水中，放于250mL的单口圆底烧瓶中，超声处理15min，接着边机械搅拌边逐滴加入1mL氨水，然后室温条件下以每分钟5滴的速度加入2mL正硅酸乙酯，然后密封好，继续搅拌反应24h。反应结束后用大量的乙醇和去离子水清洗，然后40℃真空干燥24h，将获得的褐黑色Fe3O4@SiO2产物密封保存。
[0040] c.Fe3O4@SiO2核层材料的表面修饰：(一)先对Fe3O4@SiO2微球的表面进行活化。称取1g的上述Fe3O4@SiO2微球分散于50mL的无水甲苯中，放于100mL三颈烧瓶中，超声处理15min混匀，然后依次往其中以每分钟5滴的速度逐滴加入2mL的4-氯甲基苯基三氯硅烷和
1mL的三乙胺。然后在氮气保护下将混合溶液加热至回流状态并回流反应24h，反应结束后，用丙酮洗涤5次并储存备用，所得产物记为Fe3O4@SiO2-Cl。(二)引入自由基进行活化改性。
将3mL的二硫化碳分散到100mL的四氢呋喃和10mL的苯基溴化镁的混合溶液中，在45℃下搅拌反应2h。随后，准确称取0.5g上述活化产物Fe3O4@SiO2-Cl分散到混合溶液中，氮气保护65℃下搅拌反应48h，产物分别用丙酮和甲苯重复洗涤5次，50℃下真空干燥24h，将获得的棕色产物密封储存备用，记为Fe3O4@SiO2-RAFT。
[0041] d.一锅法合成磁性印迹微球：将6mmol的功能单体丙烯酰胺和1mmol的模板分子17β-雌二醇混合，溶解于50mL的氯仿/乙腈溶液(v/v，1:4)中，放于250mL三颈烧瓶中，在冰水浴中预反应过夜。接着一次性加入220mgFe3O4@SiO2-RAFT，用恒压滴液漏斗缓慢加入20mmol的二乙烯苯，待体系
温度升高至60℃后加入50mg的偶氮二异丁腈，将体系温度升高至70℃后并恒温，在氮气保护下搅拌反应24h。产物现用丙酮和氯仿分别清洗5次，然后用甲醇/乙酸(v/v,9：1)溶液作为洗脱液进行索氏提取36h，且每隔12h更换一次洗脱液(甲醇/乙酸(v/v,9：1))，进行充分洗脱至不再检测出模板分子为止。经40℃真空干燥24h，将获得的灰色磁性17β-雌二醇分子印迹聚合产物密封保存，记为M-MIPs。操作过程参见图1A。印迹原理和磁分离过程原理参见图1B。
[0042] 非印迹聚合物磁性微球的制备：按照上述操作规程，除了不加模板离子17β-雌二醇之外，其他步骤同上，记为M-NIPs。
[0043] 上述制备所得M-MIPs进行电镜扫描，表明制备得到500nm粒径均一、形貌规则的微球颗粒。由图2红外谱图所示，表明通过可逆加成-断裂链转移活性聚合表面印迹成功制备了17β-雌二醇的分子印迹磁性微球。
[0044] 实施例2
[0045] 室温条件下，称取17β-雌二醇标准品0.5mg，用乙腈溶解并定容至100mL的容量瓶中，得到5mg/L的17β-雌二醇溶液，储存备用。将20mg的磁性分子印迹聚合物(M-MIPs)投入到含有上述5mg/L的17β-雌二醇的2mL乙腈溶液中，在室温下经过3h振荡吸附后，用
磁铁在小瓶的一侧吸附10min，即可把印迹微球吸附到一侧，重新得到澄清的溶液。如图3插图所示，该微球对17β-雌二醇具有强吸附能力，且分离过程快速、简单。参见图3磁滞回线，表明该M-MIPs磁强度较高。
[0046] 实施例3
[0047] 室温条件下，称取17-β雌二醇标准品20mg，用乙腈溶解并定容至100mL的容量瓶中，得到200mg/L的17β-雌二醇溶液，储存备用。然后用乙腈溶液分别稀释到1、10、20、40、60、80、100mg/L，分别取2mL置于7支10mL的磨口带塞试管中，往其中加入20mg的磁性分子印迹聚合物(M-MIPs)。作为对比，往另外7支中加入20mg的磁性非印迹聚合物(M-NIPs)。室温下，振荡吸附12h，接着将此
混合液离心分离，用0.45μm的微孔滤
膜过滤，上清液中17β-雌二醇的浓度用HPLC-UV测定，原始17β-雌二醇浓度减去上清液中剩余浓度即为印迹微球的吸附量，每组实验平行测定3次。结果如图4所示，随着初始浓度增大，M-MIPs和M-NIPs对17β-雌二醇的吸附容量都增大，其中M-MIPs的吸附容量显著高于M-NIPs，表明M-MIPs中存在选择性位点，对17β-雌二醇具有特异性吸附。
[0048] 实施例4
[0049] 称取20mg的M-MIPs，置于10mL的磨口具塞试管中，分别加入2mL浓度为50mg/L的17β-雌二醇及其7种结构类似物(雌三醇、17α-雌二醇、雌酮、己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和双酚A)的乙腈溶液，室温下振荡24h，然后将此混合液离心分离，用HPLC-UV测定上清液中17β-雌二醇及其结构类似物的浓度，并依此计算出M-MIPs对各种酚类雌激素的吸附容量，每组实验平行测定3次。作为对照，称取20mg的M-NIPs进行同样的实验。结果如图5所示，M-MIPs对17β-雌二醇的吸附容量明显高于其他7种酚类雌激素，表明M-MIPs对17β-雌二醇有高的选择性；而M-NIPs对8种酚类雌激素的吸附容量没有明显差异，说明M-NIPs中不存在选择性位点，属于非特异性吸附。
