生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂及制备方法和其应用
阅读：41发布：2021-05-14
专利汇可以提供生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂及制备方法和其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 生物 相容性 碱 土金属过 氧 化物纳米制剂及制备方法和其应用，所述方法为常温一步 水 相合成法，在水醇混合 溶剂 体系中直接制备得到透明质酸钠包裹的碱土金属过氧化物纳米制剂，具有良好体内生物相容性，可作为抗 肿瘤 纳米制剂。该纳米制剂具有以下特性：（1）原料廉价易得；（2）方法简单快速，不需要特殊的昂贵设备，适合扩大化规模生产；（3）含有具备肿瘤杀伤功效的活性过氧化氢和 金属离子 组分，可以通过肿瘤酸性微环境而降解释放；（4）粒径小于100纳米，有利于生物体内循环和快速代谢。本发明的纳米制剂，通过利用肿瘤组织酸性微环境的特性，特异性杀死肿瘤组织并抑制增殖，在临床医学中具有非常重要的应用潜 力 。，下面是生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂及制备方法和其应用专利的具体信息内容。
1.一种生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：
步骤1：将透明质酸钠用氢氧化钠溶液充分溶解，得到澄清透明溶液；加入稀盐酸调节pH值至7.0，得到透明质酸钠的水溶液；其中，溶解温度为25 45℃，氢氧化钠溶液的摩尔浓~
度为1 5 mol/L，稀盐酸溶液的摩尔浓度为0.1 0.5 mol/L，透明质酸钠水溶液的浓度为0.1~ ~
0.5 mg/mL；
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步骤2：将碱土金属化合物用去离子水充分溶解，得到澄清透明的碱土金属化合物水溶液；其中，碱土金属化合物水溶液的摩尔浓度为1 4 mol/L；
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步骤3：将透明质酸钠的水溶液和碱土金属化合物水溶液加入到醇液中，搅拌，得到混合物溶液；其中，透明质酸钠的水溶液的加入体积为醇液体积的0.1 7%；所述碱土金属化合~
物的水溶液的加入体积为醇液体积的0.5 7%；透明质酸钠的水溶液和碱土金属化合物水溶~
液的加入方式为缓慢滴加，于1分钟内滴加完成；所述搅拌方式为磁力搅拌，转速为300 800~
转/分钟，时间为5 10分钟；
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步骤4：将过氧化氢溶液和碱液依次加入到步骤3的混合物溶液中，持续搅拌，离心洗涤，得到所述生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂；其中，反应温度为0 70℃；所述过氧~
化氢溶液的质量浓度为3 30%；加入方式为缓慢滴加，于1 2分钟内滴加完成；
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所述碱液的加入量为使混合物溶液的pH值维持在8 11之间；加入过氧化氢溶液和碱液~
后，得到的混合物溶液中溶剂的水醇体积比为1∶（7 60）；所述搅拌方式为磁力搅拌，转速为~
500 800转/分钟，时间为5 10分钟，以无色透明混合溶液变浑浊为准；所述离心方式为高速~ ~
离心管中离心分离，并弃去上清液，离心转速为13000 20000转/分钟，离心时间为10 20分~ ~
钟；所述洗涤方式为采用甲醇溶液和甲醇-水混合液分别洗涤离心1～2次，并弃去上清液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱土金属化合物为碱土金属元素镁、钙、锶或钡的氯化物、氢氧化物、甲酸盐或乙酸盐中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述醇液为甲醇、乙醇或异丙醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱液为氨水、氢氧化钠或胆碱中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述碱土金属化合物水溶液的加入摩尔量与步骤4所述过氧化氢溶液的加入摩尔量的比为1∶（1 5）。
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6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所制得的生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂分散在乙醇中保存。
7.一种权利要求1所述方法制得的生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂。
8.根据权利要求7所述生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂，其特征在于，所述制剂粒径至多100纳米，仅在微酸性环境中发生降解，产生的金属离子和过氧化氢分子作为有效成分来抑制肿瘤细胞的增殖生长。
9.一种权利要求7所述生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂在制备抗肿瘤药物制剂的应用。
生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂及制备方法和其应用
技术领域
[0001] 本发明属于纳米生物医学与成像范畴，涉及一种具有良好生物相容性的碱 土金属过氧化物纳米制剂的制备及其在制备肿瘤治疗药物中的应用，具体的说， 是制备一种碱土金属过氧化物纳米制剂，以及其作为肿瘤治疗药物的应用。该 纳米制剂不会对活体正常组织器官产生损伤，具有良好的生物相容性，但富集 到肿瘤部位后，响应肿瘤酸性微环境发生降解，释放毒性成分杀死肿瘤细胞， 属于纳米生物医学与成像范畴。
背景技术
[0002] 纳米制剂在肿瘤治疗领域已经被广泛研究，其优点主要在于，比表面积大， 容易进行靶向修饰和改性，因此可以实现药物负载和靶向用药，以降低药物副 作用并提高药物的生物利用率。当前使用的纳米药物载体主要是脂质体，它可 以通过膜融合方式进入受体细胞，进而释放包裹的药物分子。但是，这种脂质 体制剂制备过程耗时较长，工艺参数复杂，药物包封率低，并且在储存以及应 用过程中，容易受到物理(比如温度)、化学和生物等因素影响，发生结构上 的变化，进而直接影响其载药稳定性和生物功能。更为重要的是，利用脂质体 来负载药物仍然存在非靶向部位的药物泄露风险。基于以上缺陷，开发新型的 药物负载纳米制剂，提高药物包封率并避免药物在非靶向部位的泄露，已成为 纳米药物开发的重要研究方向。
[0003] 近年来，随着肿瘤组织以及肿瘤微环境的研究逐渐深入，一些基于改善或 利用肿瘤微环境的治疗手段相继被开发出来。肿瘤微环境是肿瘤生存发展的细 胞环境，肿瘤细胞通过释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成、诱导外周免疫耐 受等方式影响和改造微环境，以提高和巩固自身的生存进化能力。因此，肿瘤 部位的微环境与正常组织的微环境有所不同，其中，偏酸性是肿瘤微环境的显 著特征之一。由于异常的血管结构以及肿瘤细胞的过度增殖，肿瘤组织通常处 于缺氧状态，导致其代谢过程发生改变。相对于正常组织以有氧代谢为主的代 谢过程，肿瘤组织的代谢则更多地依赖于无氧糖酵解，其代谢产物乳酸与呼吸 作用产生的CO2，共同造成了肿瘤微环境的酸化特性。目前，已有构筑酸响应 性聚合物作为药物载体，实现基于肿瘤微环境的特异性药物释放的研究。然而， 这种响应性聚合物的制备过程十分复杂，产率低下，且药物负载率低，不利于 技术转化。因此，如何利用简单的制备工艺，合成具有肿瘤微环境酸响应的生 物相容性纳米制剂，并保持较高的药物包封率，是抗肿瘤纳米制剂的研究趋势。
[0004] 综上所述，选择合适的纳米材料体系，并充分利用肿瘤微环境与正常组织 微环境的区别，构建一种仅响应肿瘤酸性微环境的纳米制剂，不仅可以避免药 物在非靶向部位的泄露，还能提高药物在肿瘤部位的富集量，这对抗肿瘤纳米 制剂的开发具有较大的开发价值和临床转化意义。
发明内容
[0005] 针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的在于提供一种生物相 容性的碱土金属过氧化物纳米制剂，包括过氧化镁(MgO2)、过氧化钙(CaO2)、 过氧化锶(SrO2)和过氧化钡(BaO2)等。
[0006] 本发明的另一目的在于提供上述生物相容性的碱土金属过氧化物纳米制剂 的制备方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述生物相容性的碱土金属过氧化物纳米制剂 作为响应肿瘤酸性微环境的抗肿瘤药物制剂的应用。
[0008] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009] 一种生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂的制备方法，该方法包括以下 具体步骤：
[0010] 步骤1：将透明质酸钠用氢氧化钠溶液充分溶解，得到澄清透明溶液；加入 稀盐酸调节pH值至7.0，得到透明质酸钠的水溶液；其中，溶解温度为25～45℃， 氢氧化钠溶液的摩尔浓度为1～5mol/L，稀盐酸溶液的摩尔浓度为0.1～0.5mol/L， 透明质酸钠水溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL；
[0011] 步骤2：将碱土金属化合物用去离子水充分溶解，得到澄清透明的碱土金属 化合物水溶液；其中，碱土金属化合物水溶液的摩尔浓度为1～4mol/L；
[0012] 步骤3：将透明质酸钠的水溶液和碱土金属化合物水溶液加入到醇液中，搅 拌，得到混合物溶液；其中，透明质酸钠的水溶液的加入体积为醇液体积的 0.1～7％；所述碱土金属化合物的水溶液的加入体积为醇液体积的0.5～7％；透明 质酸钠的水溶液和碱土金属化合物水溶液的加入方式为缓慢滴加，于1分钟内 滴加完成；所述搅拌方式为磁力搅拌，转速为300～800转/分钟，时间为5～10 分钟；
[0013] 步骤4：将过氧化氢溶液和碱液依次加入到步骤3的混合物溶液中，持续搅 拌，离心洗涤，得到所述生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂；其中，反应 温度为0～70℃；所述过氧化氢溶液的质量浓度为3～30％；加入方式为缓慢滴加， 于1～2分钟内滴加完成；所述碱液的加入量为使混合物溶液的pH值维持在8～11 之间；加入过氧化氢溶液和碱液后，得到的混合物溶液中溶剂的水醇体积比为1∶ (7～60)；所述搅拌方式为磁力搅拌，转速为500～800转/分钟，时间为5～10 分钟，以无色透明混合溶液变浑浊为准；所述离心方式为高速离心管中离心分 离，并弃去上清液，离心转速为13000～20000转/分钟，离心时间为10～20分钟； 所述洗涤方式为采用甲醇溶液和甲醇-水混合液分别洗涤离心1～2次，并弃去上 清液。
[0014] 所述碱土金属化合物为碱土金属元素镁、钙、锶或钡的氯化物、氢氧化物、 甲酸盐或乙酸盐中的至少一种。
[0015] 所述醇液为甲醇、乙醇或异丙醇中的至少一种。
[0016] 所述碱液为氨水、氢氧化钠或胆碱中的至少一种。
[0017] 步骤3所述碱土金属化合物水溶液的加入摩尔量与步骤4所述过氧化氢溶液 的加入摩尔量的比为1∶(1～5)。
[0018] 所制得的生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂分散在乙醇中保存。
[0019] 一种上述方法制得的生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂。
[0020] 所述制剂粒径至多100纳米，仅在微酸性环境中发生降解，产生的金属离子 和过氧化氢分子作为有效成分来抑制肿瘤细胞的增殖生长。
[0021] 一种上述生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂在制备抗肿瘤药物制剂的 应用。
[0022] 本发明的生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂，是由碱土金属过氧化物 和表面的透明质酸钠包裹层组成的生物相容性良好的纳米粒子。表面包裹的透 明质酸钠可以保证纳米颗粒的生物相容性，并具有一定的肿瘤靶向功能。在肿 瘤酸性微环境中所述纳米制剂可降解释放出金属离子和过氧化氢分子，起到肿 瘤杀伤作用。
[0023] 与以往的纳米制剂相比较，本发明具有如下优点和效果：
[0024] (1)本发明制备的生物相容性碱土金属过氧化物纳米制剂，表面包裹的透明质 酸钠使得纳米制剂具有良好的生物相容性，并具有一定的肿瘤靶向功能。
[0025] (2)本发明制备的纳米制剂利用碱土金属离子和过氧化氢分子作为肿瘤杀伤的 有效成分，并实现了较高的过氧化氢负载率。
[0026] (3)本发明制备的纳米制剂具有响应肿瘤酸性微环境的特性，它仅在肿瘤部位 发生降解并释放毒性成分，起到杀死肿瘤细胞的作用；而对正常组织不具有生 物毒副作用。
[0028] 图1为本发明实施例1制得的透明质酸钠包裹的过氧化钙(SH-CaO2)纳米制剂 的透射电镜(TEM)照片图；
[0029] 图2为本发明实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂的XRD图谱；
[0030] 图3为本发明实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂在不同pH值的缓冲溶液中降解 释放钙离子的曲线图；
[0031] 图4为本发明实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂对肿瘤细胞的毒性评价；
[0032] 图5为本发明实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂与肿瘤细胞共培养不同时间后， 细胞团切片的透射电镜图；
[0033] 图6为本发明实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂经尾静脉注射到balb/c小鼠体 内，或经局部注射到肿瘤部位后，在14天内观察到的肿瘤体积变化曲线图；
[0034] 图7为本发明实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂经尾静脉注射到balb/c小鼠体 内后的不同时间，纳米制剂在小鼠体内的生物分布图。
具体实施方式
[0035] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细说明。
[0036] 实施例1
[0037] (1)称取10mmol(1470.20mg)CaCl2·2H2O粉末，用5mL的去离子水溶解 备用。称取15mg透明质酸钠粉末，用10mL的NaOH水溶液(1mol/L)超声 完全溶解后，再用稀盐酸水溶液中和至中性，然后加入去离子水至30mL，最终 得到0.5mg/mL透明质酸钠中性水溶液备用。
取0.5mL的质量浓度为30％的过 氧化氢溶液，用去离子水稀释10倍，得到3％的过氧化氢溶液备用。
取0.5mL的质量浓度为30％的过 氧化氢溶液，用去离子水稀释10倍，得到3％的过氧化氢溶液备用。
[0038] (2)用量筒量取60mL的无水甲醇，加入空白的透明玻璃反应瓶中，并加入干 净的磁子，置于磁力搅拌器上以300转/分钟的速度搅拌。
[0039] (3)用移液管吸取1mL的氯化钙水溶液和1mL的透明质酸钠水溶液，缓慢滴 加到无水甲醇溶液中，持续磁力搅拌5分钟使其充分混合。
[0040] (4)用移液管吸取1mL的过氧化氢溶液滴加到反应液中，搅拌1分钟后，将 转速调至500转/分钟，在室温下快速注入0.3mL的质量浓度为5％的氨水溶液 来促进反应发生。
[0041] (5)当反应液颜色由无色变为淡蓝色后，继续磁力搅拌10分钟，然后转入高 速离心管中离心分离，离心转速20000转/分钟，离心时间15分钟，弃去上清液。
[0042] (6)离心沉淀物经甲醇重新超声分散后，转入高速离心管中离心分离，离心转 速20000转/分钟，离心时间15分钟。再次经甲醇/水溶液(2∶1，体积比)超 声分散并离心分离，最后离心产物分散在乙醇中保存。图1所示：(a)SH-CaO2纳米制剂的TEM图像；(b)SH-CaO2纳米制剂的高分辨率TEM图像；
[0043] (c)SH-CaO2纳米制剂的TEM电子衍射图像；图2为SH-CaO2纳米制剂的XRD 图谱。
[0044] 实施例2
[0045] (1)称取10mmol(1761.80mg)乙酸钙一水合物，用10mL的去离子水溶解 备用。称取15mg透明质酸钠粉末，用10mL的NaOH水溶液(1mol/L)超声 完全溶解后，再用稀盐酸水溶液中和至中性，然后加入去离子水至30mL，最终 得到0.5mg/mL透明质酸钠中性水溶液备用。
[0046] (2)用量筒量取60mL的无水乙醇，加入空白的透明玻璃反应瓶中，并加入干 净的磁子，置于磁力搅拌器上以300转/分钟的速度搅拌。
[0047] (3)用移液管吸取1mL的乙酸钙水溶液和1mL的透明质酸钠水溶液，缓慢滴 加到无水乙醇溶液中，持续磁力搅拌5分钟使其充分混合。
[0048] (4)用移液管吸取0.1mL的质量浓度为30％的过氧化氢溶液滴加到反应液中， 搅拌3分钟后，将转速调至500转/分钟，并将反应瓶转移到50℃水浴锅中。然 后快速注入0.1mL，1mol/L的氢氧化钠溶液来促进反应发生。
[0049] (5)当反应液颜色由无色变为淡蓝色后，继续磁力搅拌5分钟，然后转入高速 离心管中离心分离，离心转速20000转/分钟，离心时间15分钟，弃去上清液。
[0050] (6)离心沉淀物经甲醇重新超声分散后，转入高速离心管中离心分离，离心转 速20000转/分钟，离心时间15分钟。再次经甲醇/水溶液(2∶1，体积比)超 声分散并离心分离，最后离心产物分散在乙醇中保存。
[0051] 实施例3
[0052] (1)称取10mmol(2033.00mg)MgCl2·6H2O粉末，用5mL的去离子水溶 解备用。称取15mg透明质酸钠粉末，用10mL的NaOH水溶液(1mol/L)超 声完全溶解后，再用稀盐酸水溶液中和至中性，然后加入去离子水至30mL，最 终得到0.5mg/mL透明质酸钠中性水溶液备用。
[0053] (2)用量筒量取60mL的无水乙醇，加入空白的透明玻璃反应瓶中，并加入干 净的磁子，置于磁力搅拌器上以300转/分钟的速度搅拌。
[0054] (3)用移液管吸取1mL的氯化镁水溶液和1mL的透明质酸钠水溶液，缓慢滴 加到无水乙醇溶液中，持续磁力搅拌5分钟使其充分混合。
[0055] (4)用移液管吸取0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液滴加到反应液中， 搅拌5分钟后，将转速调至500转/分钟，在室温下快速注入0.2mL的氢氧化钠 溶液(1mol/L)来促进反应发生。
[0056] (5)当反应液颜色稍微变浊后，继续磁力搅拌10分钟，然后转入高速离心管 中离心分离，离心转速20000转/分钟，离心时间15分钟，弃去上清液。
[0057] (6)离心沉淀物经甲醇重新超声分散后，转入高速离心管中离心分离，离心转 速20000转/分钟，离心时间15分钟。再次经甲醇/水溶液(2∶1，体积比)超 声分散并离心分离，最后离心产物分散在乙醇中保存。
[0058] 实施例4
[0059] (1)称取10mmol(2442.70mg)BaCl2·2H2O粉体，用10mL的去离子水溶 解备用。称取10mmol(680.10mg)甲酸钠，用10mL的去离子水溶解备用。 称取15mg透明质酸钠粉末，用
10mL的NaOH水溶液(1mol/L)超声完全溶 解后，再用稀盐酸水溶液中和至中性，然后加入去离子水至30mL，最终得到 0.5mg/mL透明质酸钠中性水溶液备用。取0.5mL的质量浓度为
30％的过氧化 氢溶液，用去离子水稀释10倍，得到3％的过氧化氢溶液备用。
10mL的NaOH水溶液(1mol/L)超声完全溶 解后，再用稀盐酸水溶液中和至中性，然后加入去离子水至30mL，最终得到 0.5mg/mL透明质酸钠中性水溶液备用。取0.5mL的质量浓度为
30％的过氧化 氢溶液，用去离子水稀释10倍，得到3％的过氧化氢溶液备用。
[0060] (2)用量筒量取60mL的无水甲醇，加入空白的透明玻璃反应瓶中，并加入干 净的磁子，置于磁力搅拌器上以300转/分钟的速度搅拌。缓慢滴入1mL的透 明质酸钠水溶液到无水甲醇中，持续磁力搅拌5分钟使其充分混合。
[0061] (3)用移液管移取1mL的氯化钡水溶液和2mL的甲酸钠水溶液进行超声混合， 然后缓慢滴入上述反应液中，持续磁力搅拌5分钟。
[0062] (4)用移液管吸取1mL的过氧化氢溶液滴加到反应液中，搅拌1分钟后，将 转速调至500转/分钟，在室温下快速注入0.02mL的胆碱溶液(45wt.％)来促 进反应发生。
[0063] (5)当反应液颜色由无色变为淡蓝色时，继续磁力搅拌5分钟，然后转入高速 离心管中离心分离，离心转速15000转/分钟，离心时间15分钟，弃去上清液。
[0064] (6)离心沉淀物经甲醇重新超声分散后，转入高速离心管中离心分离，离心转 速15000转/分钟，离心时间15分钟。再次经甲醇/水溶液(2∶1，体积比)超 声分散并离心分离，最后离心产物分散在乙醇中保存。
[0065] 实施例5
[0066] (1)称取2mmol(533.24mg)SrCl2·6H2O粉体，用12mL的去离子水溶解 备用。称取15mg透明质酸钠粉末，用10mL的NaOH水溶液(1mol/L)超声 完全溶解后，再用稀盐酸水溶液中和至中性，然后加入去离子水至30mL，最终 得到0.5mg/mL透明质酸钠中性水溶液备用。
[0067] (2)用量筒量取60mL的无水甲醇，加入空白的透明玻璃反应瓶中，并加入干 净的磁子，置于磁力搅拌器上以300转/分钟的速度搅拌。
[0068] (3)用移液管吸取6mL的氯化锶水溶液和0.5mL的透明质酸钠水溶液，缓慢 滴加到无水甲醇溶液中，持续磁力搅拌5分钟使其充分混合。
[0069] (4)用移液管吸取0.1mL质量浓度为30％的过氧化氢溶液滴加到反应液中， 搅拌1分钟后，将转速调至500转/分钟，在室温下快速注入0.1mL的新鲜氨水 溶液来促进反应发生。
[0070] (5)当反应液颜色稍微变浊后，继续磁力搅拌5分钟，然后转入高速离心管中 离心分离，离心转速20000转/分钟，离心时间15分钟，弃去上清液。
[0071] (6)离心沉淀物经甲醇重新超声分散后，转入高速离心管中离心分离，离心转 速20000转/分钟，离心时间15分钟。再次经甲醇/水溶液(2∶1，体积比)超 声分散并离心分离，最后离心产物分散在乙醇中保存。
[0072] 实施例6
[0073] 实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂在酸性环境中的降解实验 实验方法：SH-CaO2纳米制剂在酸性条件下能够发生降解，并同时释放出钙离 子和过氧化氢分子。根据化学反应方程式，释放出的钙离子和过氧化氢分子的 摩尔比为1∶1。
[0074] CaO2+2H+→Ca2++H2O2
[0075] 利用pH缓冲液来模拟肿瘤细胞酸性环境，采用透析法记录纳米制剂的钙离子的[0076] 结果：SH-CaO2纳米制剂在中性条件下分解十分缓慢，而在酸性条件下降解速度 逐渐加快，在pH＝5.0的溶液中，12h内降解量高达80％。说明该纳米制剂对环 境pH值十分敏感。
[0077] 实施例7
[0078] 实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂在体外对肿瘤细胞的杀伤效果实验，验证其 体外的抗肿瘤作用。
[0079] 实验方法：通过标准的CCK-8实验来评价SH-CaO2纳米制剂对小鼠的乳腺癌细胞(4T1)的 细胞毒性。具体步骤如下：首先将4T1细胞以每孔104的细胞浓度接种在96孔的细胞培养板 上，并放在含有5％CO2，37℃的恒温细胞培养箱中培养，直到所有细胞贴壁生长。与此同 时，取足量的SH-CaO2纳米制剂离心分离后弃去上清液，紫外线照射灭菌后，加入一定量的 新鲜细胞培养液，以得到不同浓度的溶液(0，5，10，20，40，80，1200，160μg/mL)。同 时利用新鲜培养液作为溶剂，配制相同浓度的CaCl2梯度溶液。此时，弃去培养板中旧的培 养液，马上加入100μL的上述溶液，并设置复孔及对照组。继续培养细胞24h后，每孔加入 10μL的CCK-8溶液并继续孵育1h，最后利用多功能酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度 并计算细胞存活率。此外，以相同的实验方法研究了SH-CaO2纳米制剂对人的肿瘤细胞系 (HeLa，A549和MB231)和人的正常细胞(LO2)的细胞毒性。结果见图4，a为4T1细胞 与不同浓度的CaCl2或SH-CaO2纳米制剂共培养后的细胞存活率。b为人的肿瘤细胞(HeLa、A549、MB231)或人的正常细胞(LO2)与SH-CaO2纳米颗粒共孵育后的细胞存活率。可以 看出，正常细胞对SH-CaO2纳米制剂的耐受作用更强。
[0080] 结果：SH-CaO2纳米制剂在体外实验中对肿瘤细胞具有极强的杀伤作用，它通过降解释放出 大量的钙离子和过氧化氢分子，干扰肿瘤细胞的代谢增殖过程，进而诱导肿瘤细胞死亡。
[0081] 图4a为实施例1制备的SH-CaO2纳米制剂，在各浓度梯度下与小鼠源乳腺癌细胞(4T1)进 行共培养24小时后的细胞存活率。图中：所述纳米制剂的共培养浓度大于20μg/mL(即0.5 mmol/L)时，其细胞杀伤效果迅速提升。
[0082] 图4b为实施例1制备的SH-CaO2纳米制剂在各浓度梯度下与不同人源的肿瘤细胞(HeLa、 A549、MB231)或正常细胞(LO2)进行共培养24h后的细胞存活率。图中：所述纳米制剂 在80μg/mL(即2mmol/L)时，其肿瘤细胞杀伤效果十分明显，肿瘤细胞存活率不足15％； 正常细胞对该浓度纳米制剂的耐受作用更强，细胞存活率仍超过65％。说明人的正常细胞能 够承受更高浓度的纳米制剂所带来的不良影响。
[0083] 实施例8
[0084] 实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂在体外对肿瘤细胞的杀伤效果，通过肿瘤细胞的生物透射 电镜得以证实。
[0085] 实验方法：待4T1细胞长满后，将其接种于100mm的细胞培养皿上，并放在含有5％CO2， 37℃的恒温细胞培养箱中培养，直到所有细胞粘附在底面。去除培养液后，加入SH-CaO2纳米制剂(60μg/mL，分散在新鲜的细胞培养液中)继续培养1h，3h或6h。然后小心地吸 出上清液，加入电镜固定液于4℃下固定4h。接着用细胞刮刀收集细胞，形成团块后进行脱 水，包埋，切片，铀盐和铅盐的阳性染色，最后置于生物透射电镜下成像观察。细胞的微观 形态结构变化结果见图5，4T1细胞与SH-CaO2纳米制剂共培养3h或6h后，细胞的微观形 态结构变化(利用bio-TEM观察)。其中箭头表示发生形态变化的细胞器。可以看出，SH-CaO2纳米制剂诱导了细胞的死亡。
[0086] 结果：与对照组相比，在共培养3h后，细胞的染色质出现边集，并沿着核膜的内侧分布； 内质网出现轻微囊泡状扩张，线粒体发生肿胀。在共培养6h后，染色质浓缩分块，变得更 加致密；细胞质中形成了大量空泡，内质网出现严重的囊泡状扩张。说明该纳米制剂诱导了 细胞的死亡。
[0087] 实施例9
[0088] 实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂对小鼠肿瘤模型的肿瘤生长抑制效果实验 实验方法：待4T1细胞长满后，用胰酶消化并收集细胞，使用不含胎牛血清的新鲜培养液离 心清洗数次，然后分散在适量培养液中。将4T1细胞移植入约8周龄的雌性BALB/c小鼠的 腋窝下(每只小鼠106个细胞)，以建立皮下异种移植瘤模型。待肿瘤体积达到80-100mm3后，将这些小鼠随机分为三组，各组小鼠分别作以下实验处理：1)瘤内注射生理盐水作为对 照组；2)瘤内注射50μL的SH-CaO2纳米制剂(50mg/kg，分散在生理盐水中)；3)尾静脉 注射100μL的SH-CaO2纳米制剂。然后，在14天的观察期内，记录各组小鼠的肿瘤体积大 小。肿瘤相对体积的计算公式为：V＝L×W2/2，其中L和W为肿瘤最大长度和宽度。小鼠的 肿瘤相对体积通过各天的肿瘤体积除以第一天的肿瘤体积计算得到。结果见图6，为SH-CaO2纳米制剂经尾静脉注射到balb/c小鼠体内，或经局部注射到肿瘤部位后，在14天内观察到的 肿瘤体积变化。
[0089] 结果：与未经注射的对照组相比，接受尾静脉注射的小鼠在14天的观察期内肿瘤生长几乎停 滞，而接受局部注射的小鼠在14天的观察期内肿瘤逐渐消失，说明所述纳米制剂在小鼠乳腺 癌模型中能够强烈地抑制肿瘤生长。预期该纳米制剂具有作为抗肿瘤治疗药物的发展潜力。
[0090] 实施例10
[0091] 实施例1制得的SH-CaO2纳米制剂在小鼠肿瘤模型中的生物分布实验 实验方法：在小鼠4T1肿瘤模型中，通过尾静脉注射100μL的SH-CaO2纳米制剂(75mg/kg)。 然后在不同的时间段，将小鼠实施安乐死，解剖分离肿瘤组织及其主要器官，浸泡在王水中 充分溶解。
经滤膜过滤后，利用ICP测定样品溶液中的钙离子含量。结果见图7，为SH-CaO2纳米制剂经尾静脉注射到balb/c小鼠体内前后，在不同时间段纳米制剂在小鼠体内的生物分 布。
经滤膜过滤后，利用ICP测定样品溶液中的钙离子含量。结果见图7，为SH-CaO2纳米制剂经尾静脉注射到balb/c小鼠体内前后，在不同时间段纳米制剂在小鼠体内的生物分 布。
[0092] 结果：在注射该纳米制剂2h后，肿瘤部位钙含量增加了一倍，而5h后的钙含量仅降低了约 20％，说明所述纳米制剂可以在肿瘤部位富集并长时间滞留。同时，注射该纳米制剂2h后， 肾脏的钙含量增加了60％，肝脏的钙含量仅增加不到20％，而5h后肾脏和肝脏的钙含量又 恢复正常，说明所述纳米制剂主要通过肾脏途径代谢出体外。
[0093] 上述实施例2～5所制得的碱土金属过氧化物纳米制剂在酸性环境中的降解行为，在体外对肿 瘤细胞的杀伤效果以及在小鼠肿瘤模型上的肿瘤生长抑制效果与实施例1的效果接近，在此 不再赘述。
[0094] 综上所述，与现有的抗肿瘤纳米载药制剂对比，本发明提供的透明质酸钠包裹碱土金属过氧 化物纳米制剂作为抗肿瘤纳米制剂，其制备工艺简单，药物包封率高，在保证生物相容性的 同时能够充分利用肿瘤区域的酸性微环境的特点，即响应肿瘤酸性微环境发生降解，从而释 放出毒性成分杀死肿瘤细胞。这样不仅可以避免药物在非肿瘤部位的泄露，还能提高药物在 肿瘤部位的富集量，这对抗肿瘤纳米制剂的开发具有较大的开发价值和临床转化意义。
[0095] 最后有必要指出的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细说明，不能理解 为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的 改进和调整均属于本发明的保护范围。
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