技术领域
[0001] 本
发明属于
生物工程技术领域，具体涉及猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白，以及纯化方法和应用。
背景技术
[0002] 诺如病毒(Norovirus,NoV)是导致成人和儿童非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，是近年来导致人类由腹泻引起的发病率和死亡率增高的主要原因，诺如病毒可在所有年龄段、不同场所(幼儿园、学校、养老院、餐馆等)引起暴发。诺如
病毒感染的特征为突然发病，呕吐、腹痛和
水样腹泻，可伴有发烧和头痛等，所有年龄人群对该病毒均敏感，一般潜伏期为24h～48h，病程为2d～3d，虽然常自愈，但不断出现的新流行株仍对人类健康造成很大威胁。
[0003] 诺如病毒根据其RNA多聚酶区和衣壳蛋白区序列同源性差异可分为6个基因组：GI、GII、GIII、GIV、GV和GVI。其中，GI、GII、GIV主要感染人，GIII感染
牛，GV感染鼠，GVI感染狗。根据ORF2全基因序列相似性，GI至少可分为9个基因型，GII至少可分为22个基因型，九十年代中期一种特异性的诺如病毒GII.4株是造成世界范围内诺如病毒流行的主要基因型，目前国内流行优势株正逐渐转变为GII.17型。
[0004] 诺如病毒属于杯状病毒科诺瓦克病毒属，直径约为26～35nm，无包膜，球形，呈二十面体对称，基因组为单股正链RNA，全长约为7.5kb，包含三个阅读框，ORF1长约5kb，编码非结构蛋白，经翻译后修饰成6个功能蛋白，包括：N末端蛋白(P48)、NTPase、3A样蛋白、VPg(病毒基因组连接蛋白)、3C样蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶(Pol)。ORF2长约1.8kb，编码530个左右
氨基酸的衣壳蛋白(VP1)，VP1蛋白折叠成两个区域：壳区(S区)和突出区(P区)，其中S区为VP1的内壳，P区位于VP1结构的壳外，包含P1和P2两个亚区，P2亚区位于衣壳蛋白的最外层，易发生变异。ORF3长约0.6kb，编码一个微小结构蛋白(VP2)，VP2蛋白的具体功能未知，有研究认为它可能参与病毒衣壳的构建，并有助于整个衣壳蛋白的稳定。
[0005] 由于诺如病毒目前还无法在体外进行培养，因此基因工程方法是目前诺如病毒
疫苗研发的唯一方法。诺如病毒编码结构蛋白VP1可形成类病毒颗粒(vires-like particles，VLPs)，其在形态和
抗原方面与天然的病毒相似，是宿主识别和发生免疫应答的主要位点，是诺如病毒的重要候选疫苗之一。然而，制备VLPs需要在真核系统中才能很好地形成颗粒，这种方法非常复杂且产量不是很高。研究表明，诺如病毒的P结构域在大肠杆菌中表达后，能自然形成P颗粒，具有很好地抗原性和免疫原性。原核表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统，也是基因工程中应用最广泛的表达系统，该项技术主要方法是将已克隆入目的基因DNA
片段的载体(一般为质粒)转化细菌，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导并最终纯化获得所需目的蛋白，其优点在于操作简单，能够在较短时间内获得基因表达产物，所需成本相对比较低廉，外源基因表达产物水平高，基因背景和表达特性清楚。
[0006] 由于诺如病毒基因变异性大导致诺如病毒的暴发流行，有必要通过原核系统研发诺如病毒的疫苗，并开发病毒感染检测
试剂盒。
发明内容
[0007] 为解决
现有技术不能有效
预防诺如病毒的暴发问题，本发明提供猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白，通过分别构建含中和位点和受体结合位点的诺如病毒P结构域P-RGD及变体蛋白P△R，只需1次免疫注射该蛋白即可诱导小鼠产生较高低度的
抗体，可用于后续GII.17型诺如病毒感染的检测及疫苗研发。
[0008] 本发明通过下列技术方案实现：猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示。
[0009] 上述猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。
[0010] 猴源GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.3所示。
[0011] 上述GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白，其氨基酸基因序列如SEQ ID No.4所示。
[0012] 本发明的另一目的还在于提供上述猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白在GII.17型诺如病毒感染检测和疫苗制备上的应用。具体地，可以用目的蛋白包被ELSIA板，检测疑似诺如病毒感染的病人血清。
[0013] 上述猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白，是经过下列步骤得到：
[0014] (1)将pGEX-4T-1质粒用BamH I和Not I进行双酶切，1％琼脂糖核酸胶酶切后进行基因回收，得到含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒；
[0015] (2)将腹泻猴子的
粪便制成悬液，通过RT-PCR技术及测序获得猴源GII.17诺如病毒VP1基因序列，按照大肠杆菌密码子使用的偏好性优化VP1蛋白的核苷酸序列，人工合成VP1基因；以此基因为模板，通过如下P-RGD引物和PΔR引物进行PCR扩增，分别得到含RGD序列的P结构域基因(P-RGD)和不含精氨酸聚合区的P结构域变体(PΔR)基因，即带酶切位点的两个质粒P-RGD、P△R：
[0016] P-RGD引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc
[0017] R：1、gcagaagcag tcaccacggc agtcgcactg cgcacgacgg
[0018] 2、cagtcagtca cgatgcggcc gcttagcaga agcagtcacc ac
[0019] PΔR引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc
[0020] R：cagtcagtca cgatgcggcc gcttacccat tcccggtgc
[0021] 扩增后的基因片段纯化后通过无缝拼接分别克隆进入步骤(1)的含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒，得到两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST；
[0022] (3)将步骤(2)得到的两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证；
[0023] (4)将步骤(3)测序验证正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(市购)，经过菌落PCR扩增(扩增所使用的引物同步骤2的引物，扩增是为了初步鉴定质粒构建是否成功)，鉴定质粒构建成功后，即得到P-RGD-GST、PΔR-GST表达克隆子；
[0024] (5)利用IPTG诱导步骤(4)得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表达克隆子，得到高效表达的P-RGD-GST、PΔR-GST目的蛋白，用超声方法对目的蛋白进行细胞壁
破碎，经离心，分别收集上清和沉淀，SDS-PAGE
电泳鉴定各蛋白存在形式，用GST亲和纯化柱对P-RGD-GST、PΔR-GST重组蛋白进行纯化，用Thrombin酶切掉GST标签，纯化后分别得到P-RGD和PΔR目的蛋白。
[0025] 所述步骤(2)的猴源GII.17诺如病毒VP1基因序列的基因库收录号为：KX356908。
[0026] 所述步骤(2)的人工合成VP1基因是5，端和3，端分别含有限制性内切酶BamH I和Not I酶切位点序列。
[0027] 所述步骤(2)的P-RGD引物有两段下游引物，首先将上游和下游引物1进行PCR扩增，扩增后产物再用上游引物和下游引物2进行PCR扩增。
[0028] 所述步骤(2)的无缝拼接是将带酶切位点的两个质粒P-RGD和P△R各取50纳克，分别与100纳克含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒和2微升5×Infusion HD Enzyme Premix混合，得到两个混合样，再分别用水补足至10微升混匀后在50℃下孵育15分钟进行转化，得到两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST。
[0029] 所述步骤(5)中高效表达和纯化是经下列具体步骤得到：
[0030] a、蛋白表达：将步骤(4)得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表达克隆子20微升分别转接到含0.01％氨苄西林的100mL LB培养基(即100mL LB培养基中含0.01克氨苄西林)，于37℃、220r/min的条件下培养至OD600为0.5时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，于22℃、220r/min过夜诱导表达；将过夜诱导表达的菌液于12000g、4℃离心10min，弃上清；用10mL 4℃预冷的PBS(pH＝7.4)重悬菌体，于12000g、4℃离心10min，弃上清，菌体沉淀用于进一步的蛋白纯化或保存于-80℃备用；
[0031] b、蛋白纯化：用10mL PBS(pH7.4)重悬步骤a的菌体沉淀，加入蛋白酶
抑制剂PMSF至终浓度为1mM，
超声波破碎菌体后，于12000g、4℃离心10min，丢弃沉淀，收集上清10mL；将上清用0.22μm滤
膜过滤后，用GST亲和纯化柱对P-RGD-GST、PΔR-GST重组蛋白进行纯化。
[0032] 用免疫印迹法分析纯化得到的目的蛋白，发现表达纯化的蛋白具有相应的抗原性，可用于GII.17型诺如病毒感染的检测及GII.17诺如病毒
亚单位疫苗的研发。
[0033] 检测所得目的蛋白的的免疫原性：免疫印迹显示两个蛋白免疫后均能诱导产生针对自身分子的抗体，ELISA法(酶联
免疫吸附法)以P/N值大于等于2判为阳性，两个蛋白抗体滴度均可达到1:32000。
[0034] 因此，所得P-RGD和PΔR目的蛋白通过免疫印迹法和ELISA验证具有较好的抗原性，可用于GII.17型诺如病毒感染检测试剂盒的研发。
[0035] 本发明涉及从猴子粪便中分离得到的一株GII.17型诺如病毒P结构域及其变体蛋白的表达与纯化，本发明主要包含：按照大肠杆菌密码子使用的偏好性来设计VP1基因对应的核苷酸序列，通过人工方法合成相应的核苷酸序列，通过PCR得到其P结构域基因P-RGD及变体基因P△R，然后将得到的各双链核苷酸基因片段通过无缝连接的方式插入到带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1中，构建成重组质粒。将这些重组质粒转化大肠杆菌BL21，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，通过GST亲和柱纯化诱导表达的蛋白，最终得到猴源GII.17型诺如病毒P结构域蛋白P-RGD及变体蛋白P△R，并通过免疫印迹法验证了表达的蛋白具有抗原性。这2个蛋白免疫小鼠诱导产生的抗体效价为1:32000。本发明基于大肠杆菌原核表达系统，将猴源GII.17的P结构域核苷酸依据大肠杆菌密码子使用偏好性进行优化后，实现了病毒蛋白的高效表达，且表达的蛋白具有很好的免疫原性，可以作为开发诺如病毒检测试剂盒的原料。
[0036] 为了便于后续的研究，设计P结构域引物时，加入了一段编码RGD的核苷酸序列，称之为P-RGD。设计引物时去掉P颗粒C端富含精氨酸的部分得到的就是P结构域变体，称之为PΔR。通过原核系统表达并得到了纯化的、具有很好抗原性的蛋白，能用于诺如病毒的疫苗研发和病毒感染检测试剂盒的开发。
[0037] 本发明的优点和效果如下：
[0038] 1)制备简单：利用基因工程技术在原核系统即可实现高水平的重组蛋白表达，并容易得到纯化的目的蛋白。
[0039] 2)免疫原性强：只需要有限的免疫次数和较低剂量的抗原蛋白注射，即可以诱导高效价的特异性抗体。
[0040] 3)安全：本方法构建得到的猴源GII.17型诺如病毒蛋白可用于亚单位疫苗研发，相比于灭活疫苗、减毒疫苗等，不仅不具有潜在的感染性，还去除了许多可能引起副反应的物质，只保留了能使
机体产生中和抗体的抗原表位，安全性得到了提高，为可能暴发流行的GII.17型诺如病毒感染的检测和疫苗研发奠定了
基础。
附图说明
[0041] 图1为步骤(2)通过RT-PCR技术及测序获得猴源GII.17诺如病毒VP1基因通过重组构建得到的未优化组重组融合蛋白表达的SDS-PAGE分析；
[0042] 图2为步骤(2)的扩增产物的检测图；
[0043] 图3为步骤(2)的原核表达质粒构建示意图；其中A为原核表达质粒P-RGD-GST的构建示意图，B为原核表达质粒PΔR-GST的构建示意图；
[0044] 图4为步骤(5)通过重组构建得到的优化组重组融合蛋白表达的SDS-PAGE分析；
[0045] 图5为步骤(5)b纯化后重组GST融合蛋白的SDS-PAGE分析；
[0046] 图6为步骤(5)b纯化后重组GST融合蛋白的Western blot分析；
[0047] 图7为步骤(5)b所得无GST标签目的蛋白的SDS-PAGE分析；
[0048] 图8为步骤(5)b所得无GST标签目的蛋白的Western blot分析；
[0049] 图9为ELISA分析免疫小鼠后产生的特异性抗体效价；其中A为P-RGD目的蛋白的ELISA分析图，B为PΔR目的蛋白的ELISA分析图；
[0050] 图10为本发明所得猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白与genebank中最相似的序列(KX356908)的比对图；
[0051] 图11为本发明所得猴源GII.17型诺如病毒P结构域及其变体的目的蛋白与genebank中其他最相似的序列(KT149172)的比对图。
具体实施方式
[0052] 下面通过
实施例对本发明做进一步说明。
[0053] (1)将pGEX-4T-1质粒(市购，其部分核苷酸基因序列如SEQ ID No.5所示)用BamH I和Not I进行双酶切，1％琼脂糖核酸胶酶切后进行基因回收，得到含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒；
[0054] (2)将腹泻猴子的粪便制成悬液，用RNA提取试剂盒进行常规总RNA提取，并用逆转录试剂盒通过常规的逆转录得到总RNA逆转录为cDNA，经测序比对后得到一株猴源GII.17诺如病毒VP1基因序列(其核苷酸基因序列如SEQ ID No.6所示，收录号为：KX356908)；若将此VP1基因插入到pGEX-4T-1载体后按照本例中目的蛋白的构建及表达步骤进行未优化组重组融合蛋白原核表达(如图1)，发现未优化组重组融合蛋白表达量较低，不足以用来做纯化；
[0055] 本例按照大肠杆菌密码子使用的偏好性优化VP1蛋白的核苷酸序列，5，端和3，端分别含有限制性内切酶BamH I和Not I酶切位点序列，人工合成VP1基因(其核苷酸基因序列如SEQ ID No.7所示，氨基酸基因序列如SEQ ID No.8所示)，此VP1基因与从粪便中获得的基因(收录号为：KX356908)相似度为86％(见图10)，与genebank中其他最相似的序列KT149172比对，相似度为85％(见图11)；
[0056] 以此基因为模板，通过如下P-RGD引物和PΔR引物进行PCR扩增，分别得到含RGD序列的P结构域基因(P-RGD)和不含精氨酸聚合区的P结构域变体(PΔR)基因(如图2所示)，即带酶切位点的两个质粒P-RGD、P△R，是在genebank中找不到完全相同序列的两个新序列；
[0057] 所述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体如下：
[0058] P-RGD引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc
[0059] R：1、gcagaagcag tcaccacggc agtcgcactg cgcacgacgg
[0060] 2、cagtcagtca cgatgcggcc gcttagcaga agcagtcacc ac
[0061] PΔR引物F：tctggttccg cgtggatcct ctaaaaccaa acc
[0062] R：cagtcagtca cgatgcggcc gcttacccat tcccggtgc
[0063] 其中，P-RGD引物有两段下游引物，首先将上游和下游引物1进行PCR扩增，扩增后产物再用上游引物和下游引物2进行PCR扩增；P-RGD引物的核苷酸基因序列如SEQ ID No.9、10和11所示；PΔR引物的核苷酸基因序列如SEQ ID No.12和13所示；
[0064] 扩增后的基因片段纯化后，将带酶切位点的两个质粒P-RGD和P△R各取50纳克，分别与100纳克含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒和2微升5×Infusion HD Enzyme Premix混合，得到两个混合样，再分别用水补足至10微升混匀后在50℃下孵育15分钟进行转化，即通过无缝拼接试剂盒(购自大连宝生物工程有限公司，目录号：639636)分别克隆进入步骤(1)的含GST标签的线性pGEX-4T-1载体质粒，得到两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST(构建示意图如图3)；原核表达质粒P-RGD-GST的核苷酸基因序列如SEQ ID No.14所示，氨基酸基因序列如SEQ ID No.15所示；原核表达质粒PΔR-GST核苷酸基因序列如SEQ ID No.16所示，氨基酸基因序列如SEQ ID No.17所示)；
[0065] (3)将步骤(2)得到的两个原核表达质粒P-RGD-GST和PΔR-GST分别转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(市购)中，涂布含有氨苄西林的LB平板并筛选阳性克隆，将阳性克隆进行培养后提取质粒并送测序验证；经过测序验证，两个目的质粒基因均以正确的序列插入到了pGEX-4T-1载体基因序列的BamH I和Not I酶切位点之间；
[0066] (4)将步骤(3)测序验证正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(市购)，经过菌落PCR扩增(扩增所使用的引物同步骤2的引物，扩增是为了初步鉴定质粒构建是否成功)，鉴定质粒构建成功后，即得到P-RGD-GST、PΔR-GST表达克隆子；
[0067] (5)a、蛋白表达：将步骤(4)得到的P-RGD-GST、PΔR-GST表达克隆子20微升分别转接到含0.01％氨苄西林的100mL LB培养基(即100mL LB培养基中含0.01克氨苄西林)，于37℃、220r/min的条件下培养至OD600为0.5时，加入IPTG至终浓度为0.5mM，于22℃、220r/min过夜诱导表达；将过夜诱导表达的菌液于12000g、4℃离心10min，弃上清；用10mL 4℃预冷的PBS(pH＝7.4)重悬菌体，于12000g、4℃离心10min，弃上清，菌体沉淀用于进一步的蛋白纯化或保存于-80℃备用；
[0068] b、蛋白纯化：用10mL 4℃预冷PBS(pH7.4)重悬步骤a的菌体沉淀，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mM，以30HZ功率和工作2秒停3秒的程序
超声波30分钟破碎菌体后，于12000g、4℃离心10min，丢弃沉淀，收集上清10mL；通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况(如图
4)，所构建的2个重组基因都得到了表达，且表达的蛋白主要在上清里；将上清用0.22μm滤膜过滤后，用GST亲和纯化柱(购自GE公司，目录号：17-5131-02)对P-RGD-GST、PΔR-GST重组蛋白进行纯化，并通过SDS-PAGE分析纯化的蛋白，如图5结果表明通过GST亲和柱纯化后，得到了较纯的、预期分子量大小的蛋白；
[0069] 用Thrombin酶切掉GST标签，GST亲和柱纯化后分别得到P-RGD和PΔR目的蛋白，如图7。
[0070] 所得猴源GII.17型诺如病毒P结构域的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.1所示；其氨基酸基因序列如SEQ ID No.2所示。
[0071] 猴源GII.17型诺如病毒P结构域变体的目的蛋白，其核苷酸基因序列如SEQ ID No.3所示；其氨基酸基因序列如SEQ ID No.4所示。
[0072] (6)重组蛋白免疫印迹检测：
[0073] 用10％SDS-PAGE凝胶对步骤(5)b纯化后的重组蛋白P-RGD-GST、P△R-GST样品进行电泳，先于80伏电泳30min，然后于150伏电泳1h(如图5)。电泳完成后，将凝胶上的蛋白通过转膜的形式转移至
硝酸纤维素(NC)膜上，转膜参数为45V、1h。取出转有蛋白的NC膜，用含5％
脱脂奶粉的封闭液在常温下封闭1hour。用PBST漂洗封闭完的NC膜一次。加一抗(1：
5000)后于4℃过夜孵育，一抗为抗GST单克隆抗体(购自CAT，目录号2625s)。次日，用PBST洗膜3次，10min/次，然后孵育辣根过
氧化物酶标记的(HRP-labeled)抗鼠二抗(1：5000)(购自CST公司，目录号：7076)，于室温孵育2hour。用PBST洗膜3次，20min/次，最后用增强
化学发光法(ECL)进行显色，结果如图6所示。发现表达纯化的蛋白具有相应的抗原性，可用于GII.17型诺如病毒感染的检测及GII.17诺如病毒亚单位疫苗的研发。
[0074] (7)检测所得目的蛋白的的免疫原性
[0075] 1)免疫原(100微升/剂)：P-RGD蛋白(20ug)+Quick Antibody新型免疫佐剂、P△R蛋白(20ug)+Quick Antibody新型免疫佐剂,佐剂(购自北京博奥龙免疫技术有限公司，目录号：KX0210043)。
[0076] 2)动物：8周龄清洁级Balb/c雄性小鼠，随机分为2组，2只/组。
[0077] 3)方法：
[0078] ①免疫印迹法：分别在对应组的小鼠后腿大腿处肌肉注射两种免疫原，左右腿各一剂，免疫后第14天眼部
采血分离得到血清，用免疫印迹法分析抗体特异性和酶联免疫吸附法测量抗体效价。免疫印迹法一抗为抗诺如病毒P-RGD、P△R小鼠血清(1:1000)，二抗为辣根过氧化物酶标记的(HRP-labeled)抗鼠IgG(1:5000)。
[0079] ②ELISA法：以1微克/毫升、每孔100微升蛋白包被酶标板4℃过夜，以含5％牛血清
白蛋白PBST(5％BSA-PBST)溶液于37℃封闭酶标板1hour，分别以1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:12800稀释免疫后血清作为一抗，以HRP标记的鼠抗IgG(1:5000)为二抗，用TMB显色液显色30分钟，2M H2SO4终止反应，于
波长450纳米处测定OD值，以样品OD值与阴性对照OD值的比值(P/N)大于2，判定样品为阳性，临界值处对应的血清稀释度即为抗体的最高效价。
[0080] 4)检测结果：
[0081] 免疫印迹显示两个蛋白免疫后均能诱导产生针对自身分子的抗体，如图8，ELISA法(酶联免疫吸附法)以P/N值大于等于2判为阳性，两个蛋白抗体滴度均可达到1:32000，如图9。
[0082] 因此，所得P-RGD和PΔR目的蛋白通过免疫印迹法和ELISA验证具有较好的抗原性，可用于GII.17型诺如病毒感染检测试剂盒的研发。
[0083]
[0084]
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