血脑屏障穿梭体
阅读：431发布：2021-06-15
专利汇可以提供血脑屏障穿梭体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供包含脑效应子实体和脑靶向肽的血脑屏障穿梭体。，下面是血脑屏障穿梭体专利的具体信息内容。
1.一种血脑屏障穿梭体，其包含脑效应子实体和脑靶向肽，所述脑靶向肽包含三氨基酸肽基序，其中包含三氨基酸肽基序的所述脑靶向肽由SEQ ID NO：8的序列组成，并且所述脑效应子实体是蛋白质或肽，其中所述脑效应子实体选自由以下各项组成的组：神经学病症药物，生长因子，酶，细胞毒性剂，针对脑靶标的肽，其中所述脑靶标选自由下述组成的组：β-分泌酶1，Aβ，表皮生长因子，表皮生长因子受体2，Tau，载脂蛋白E4，α突触核蛋白，α突触核蛋白的寡聚片段，CD20，亨廷顿蛋白，朊病毒蛋白，富亮氨酸重复的激酶2，帕金蛋白，早老蛋白2，γ分泌酶，死亡受体6，淀粉状蛋白前体蛋白，p75神经营养蛋白受体和胱天蛋白酶
6。
2.权利要求1所述的血脑屏障穿梭体，其中所述针对脑靶标的肽是针对脑靶标的抗体。
3.权利要求2所述的血脑屏障穿梭体，其中所述针对脑靶标的抗体是针对脑靶标的单克隆抗体。
4.权利要求1所述的血脑屏障穿梭体，其中所述脑效应子实体是神经营养因子。
5.权利要求1的血脑屏障穿梭体，其中所述脑效应子实体是多肽。
6.权利要求1的血脑屏障穿梭体，其中所述Tau是磷酸化的Tau。
7.权利要求1或2的血脑屏障穿梭体，其中所述脑效应子实体包含针对脑靶标的全长抗体。
8.权利要求2的血脑屏障穿梭体，其中所述脑效应子实体包含全长IgG。
9.权利要求7的血脑屏障穿梭体，其中所述脑效应子实体是针对Aβ的全长抗体。
10.权利要求7的血脑屏障穿梭体，其中所述脑效应子实体是针对磷酸化的Tau的全长抗体。
11.权利要求7的血脑屏障穿梭体，其中所述脑效应子实体是针对α突触核蛋白的全长抗体。
12.包含权利要求1-11任一项的血脑屏障穿梭体和药用载体的药物制剂。
13.权利要求1-2任一项的血脑屏障穿梭体，其用作药物。
14.权利要求1-11任一项的血脑屏障穿梭体在制备药物中的应用。
15.权利要求14的应用，其中所述药物用于治疗神经变性病症。
16.权利要求15的应用，其中所述神经变性病症是阿尔茨海默病。
17.权利要求1-2任一项的血脑屏障穿梭体，其将所述脑效应子实体转运穿过血脑屏障。
血脑屏障穿梭体
发明领域
[0002] 背景
[0003] 具有低脑渗透性的神经学病症药物(诸如，例如，大的生物治疗药物或小分子药物)的脑渗透和/或CSF渗透受到广泛且不可渗透的血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)或血-CSF屏障BCSFB(blood-CSF barrier，BCSFB)连同神经血管单元(neurovascular unit，NVU)的其他细胞成分的严格限制。已经检测了多种克服这一障碍的策略，并且一种是利用由在脑毛细血管内皮上表达的内源性受体介导的胞转作用。已经设计了针对这些受体的重组蛋白，诸如单克隆抗体或肽，以能够允许生物治疗剂和诊断剂到脑的受体介导的递送。然而，还没有研究使脑摄入最大化同时使脑内皮细胞(brain endothelial cells，BECs)内的错误分选和在BECs中某些细胞器(尤其是导致生物治疗剂降解的细胞器)内的积聚程度最小化的策略。
[0004] 单克隆抗体和其他生物治疗剂具有治疗中枢神经系统(central nervous system，CNS)中的病理学的巨大治疗潜力。然而，它们进入脑的路径受到BBB的妨碍。之前的研究已经表明注射到血流中的IgG有非常少的百分量(约0.1％)能够渗透到CNS区室中(Felgenhauer，Klin.Wschr.52：1158-1164(1974))。由于抗体在CNS内的低浓度，这必然将限制任何的药理学作用。脑脊液(CSF)直接与CNS中的神经元接触。
[0005] 因此，对于靶向生物体的脑的神经学病症药物的递送系统存在需求。
[0006] 发明概述
[0007] 在第一方面，本发明提供一种血脑屏障穿梭体，其包含脑效应子实体和脑靶向肽，所述脑靶向肽包含选自由下述组成的组的三氨基酸肽基序：
[0008] Phe-Lys-Leu(FKL)，Arg-Gly-Leu(RGL)，Ser-Arg-Gly(SRG)，Tyr-Val-Leu(YVL)，Trp-Gly-Phe(WGF)，Val-Leu-His(VLH)，Leu-Tyr-Val(LYV)，Leu-Trp-Gly(LWG)，Leu-His-Ser(LHS)，His-Ser-Arg(HSR)，Gly-Leu-Trp(GLW)，Gly-Phe-Lys(GFK)，Arg-Leu-Ser(RLS)，Gly-Ser-Val(GSV)，Ser-Val-Ser(SVS)，Leu-Gly-Ser(LGS)，Val-Arg-Phe(VRF)，Ser-Asn-Thr(SNT)，Arg-Phe-Arg(RFR)，Asn-Thr-Arg(NTR)，Leu-Ser-Asn(LSN)，Gly-Phe-Val(GFV)，Phe-Val-Arg(FVR)，Phe-Arg-Leu(FRL)，Trp-Arg-Val(WRV)，Phe-Ser-Leu(FSL)，Val-Phe-Ser(VFS)，Val-Ala-Trp(VAW)，Ser-Leu-Phe(SLF)，Arg-Val-Phe(RVF)，Leu-Phe-Trp(LFW)，Lys-Val-Ala(KVA)，Phe-Trp-Lys(FWK)，Ala-Trp-Arg(AWR)，Val-His-Gly(VHG)，Ser-Val-His(SVH)，His-Gly-Val(HGV)，Arg-Val-Cys(RVC)，Arg-Pro-Gln(RPQ)，Gln-Lys-Ile(QKI)，Pro-Gln-Lys(PQK)，Asn-Gly-Ala(NGA)，Lys-Ile-Asn(KIN)，Ile-Asn-Gly(ING)，Gly-Arg-Pro(GRP)，Gly-Ala-Arg(GAR)，Ala-Arg-Val(ARV)，Leu-Ser-Gly(LSG)，Val-Asp-Ser(VDS)，Ser-Val-Asp(SVD)。
[0009] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，包含三氨基酸肽基序的脑靶向肽包含1-25个三氨基酸肽基序，具体是1-15个，更具体是1-10个，甚至更具体是1-5个三氨基酸肽基序。
[0010] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，脑穿梭体包含脑效应子实体、接头和包含三氨基酸肽基序的脑靶向肽，其中所述接头将所述效应子实体连接到所述包含三氨基酸肽基序的脑靶向肽。
[0011] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，所述包含三氨基酸肽基序的脑靶向肽选自由Seq.Id.No.1-36、优选由Seq.Id.No.1、6和8组成的组。
[0012] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，所述脑效应子实体选自由下述组成的组：神经学病症药物，神经营养因子，生长因子，酶，细胞毒性剂，针对脑靶标的抗体，针对脑靶标的单克隆抗体，针对脑靶标的肽。
[0013] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，脑靶标选自由下述组成的组：β-分泌酶1，Aβ，表皮生长因子，表皮生长因子受体2，Tau，磷酸化的Tau，载脂蛋白E4，α突触核蛋白，α突触核蛋白的寡聚片段，CD20，亨廷顿蛋白，朊病毒蛋白，富亮氨酸重复的激酶2，帕金蛋白(parkin)，早老蛋白2，γ分泌酶，死亡受体6，淀粉状蛋白前体蛋白，p75神经营养蛋白受体和胱天蛋白酶6。
[0014] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，所述脑效应子实体选自由蛋白、多肽和肽组成的组。
[0015] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，所述脑效应子实体包含针对脑靶标的全长抗体，优选全长IgG。
[0016] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，所述效应子实体是针对Aβ的全长抗体。
[0017] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，所述效应子实体是针对磷酸化的Tau的全长抗体。
[0018] 在血脑屏障穿梭体的具体实施方案中，所述效应子实体是针对α突触核蛋白的全长抗体。
[0019] 在第二方面，本发明提供包含本发明的血脑屏障穿梭体和药物载体的药物制剂。
[0020] 此外，本发明提供所述脑穿梭体作为药物的应用，特别是所述脑穿梭体用于治疗神经变性病症(特别是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease))和用于治疗神经炎性病症(特别是多发性硬化(Multiple Sclerosis))的应用。
[0021] 本发明的各个方面包括BBB穿梭体，其包含与要递送的试剂共价连接的脑靶向肽。所述试剂可以是药物、化疗剂、放射性同位素、促凋亡剂、抗血管生成剂、激素、酶、细胞因子、生长因子、细胞毒性剂、肽、蛋白、抗生素、抗体、抗体的Fab片段、抗体的较小的片段、成像剂、存活因子、抗凋亡剂、激素拮抗剂或抗原。在本发明的另一方面，抗血管生成剂可以选自由下述组成的组：血小板反应蛋白，制管张素5，色素上皮来源的因子，血管紧张素，层粘连蛋白肽，纤连蛋白肽，纤溶酶原激活物抑制剂，组织金属蛋白酶抑制剂，干扰素，白介素
12，血小板因子4，IP-10，Gro-B，血小板反应蛋白，2-甲氧基雌二醇，增殖蛋白相关的蛋白，carboxiamidotriazole，CMI 01，Manmastat，戊聚糖聚硫酸酯(pentosan polysuiphate)，血管生成素2(Regeneron)，干扰素-α，除莠霉素A(herbimycinA)，PNU 1451 56E，16K促乳素片段，利诺胺(Linomide)，沙立度胺(thalidomide)，pentoxifylhne，染料木素
(genistein)，TNP-470，内皮抑素(endostatin)，紫杉酚(paclitaxel)，多西他赛(Docetaxel)，多胺(polyamines)，蛋白酶体抑制剂，激酶抑制剂，信号传导肽，accutin，西多福韦(cidofovir)，长春新碱(vincristine)，博来霉素(bleomycin)，AGM-1470，血小板因子4和米诺环素(minocycline)。在另一方面，细胞因子可以选自由下述组成的组：白介素I(IL-I)，IL-2，IL-5，IL-10，IL-11，IL-12，IL-18，干扰素-γ(IF-γ)，IF-a，IF-，肿瘤坏死因子-ct(TNF-ct)，或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rnacrophage colony
stimulating factor))。在本发明的其他实施方案中，试剂可以是病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微粒、磁珠、酵母细胞、哺乳动物细胞或细胞。在某些方面，病毒是慢病毒(lentivirus)，乳多泡病毒(papovaviruses)，猿猴病毒40(simian virus 40)，牛乳头状瘤病毒(bovine papilloma virus)，多瘤病毒(polyoma virus)，腺病毒(adenovirus)，痘苗病毒(vaccinia virus)，腺伴随病毒(adeno-associated virus)(AAV)，或疱疹病毒(herpes virus)。试剂还可以是真核表达载体，更优选是基因治疗载体。
12，血小板因子4，IP-10，Gro-B，血小板反应蛋白，2-甲氧基雌二醇，增殖蛋白相关的蛋白，carboxiamidotriazole，CMI 01，Manmastat，戊聚糖聚硫酸酯(pentosan polysuiphate)，血管生成素2(Regeneron)，干扰素-α，除莠霉素A(herbimycinA)，PNU 1451 56E，16K促乳素片段，利诺胺(Linomide)，沙立度胺(thalidomide)，pentoxifylhne，染料木素
(genistein)，TNP-470，内皮抑素(endostatin)，紫杉酚(paclitaxel)，多西他赛(Docetaxel)，多胺(polyamines)，蛋白酶体抑制剂，激酶抑制剂，信号传导肽，accutin，西多福韦(cidofovir)，长春新碱(vincristine)，博来霉素(bleomycin)，AGM-1470，血小板因子4和米诺环素(minocycline)。在另一方面，细胞因子可以选自由下述组成的组：白介素I(IL-I)，IL-2，IL-5，IL-10，IL-11，IL-12，IL-18，干扰素-γ(IF-γ)，IF-a，IF-，肿瘤坏死因子-ct(TNF-ct)，或GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rnacrophage colony
stimulating factor))。在本发明的其他实施方案中，试剂可以是病毒、噬菌体、细菌、脂质体、微粒、磁珠、酵母细胞、哺乳动物细胞或细胞。在某些方面，病毒是慢病毒(lentivirus)，乳多泡病毒(papovaviruses)，猿猴病毒40(simian virus 40)，牛乳头状瘤病毒(bovine papilloma virus)，多瘤病毒(polyoma virus)，腺病毒(adenovirus)，痘苗病毒(vaccinia virus)，腺伴随病毒(adeno-associated virus)(AAV)，或疱疹病毒(herpes virus)。试剂还可以是真核表达载体，更优选是基因治疗载体。
[0022] 本发明的脑靶向肽可以连接到固体支持物上，例如，阵列或珠子上。本发明的实施方案还可以包括包含模拟选自由下述组成的组的肽基序的序列的分离的肽模拟物：Phe-Lys-Leu(FKL)，Arg-Gly-Leu(RGL)，Ser-Arg-Gly(SRG)，Tyr-Val-Leu(YVL)，Trp-Gly-Phe(WGF)，Val-Leu-His(VLH)，Leu-Tyr-Val(LYV)，Leu-Trp-Gly(LWG)，Leu-His-Ser(LHS)，His-Set-Arg(HSR)，Gly-Leu-Trp(GLW)，Gly-Phe-Lys(GFK)，Arg-Leu-Ser(RLS)，Gly-Ser-Val(GSV)，Ser-Val-Ser(SVS)，Leu-Gly-Ser(LGS)，Val-Arg-Phe(VRF)，Ser-Asn-Thr(SNT)，Arg-Phe-Arg(RFR)，Asn-Thr-Arg(NTR)，Leu-Ser-Asn(LSN)，Gly-Phe-Val(GFV)，Phe-Val-Arg(FVR)，Phe-Arg-Leu(FRL)，Trp-Arg-Val(WRV)，Phe-Ser-Leu(FSL)，Val-Phe-Ser(VFS)，Val-Ala-Trp(VAW)，Ser-Leu-Phe(SLF)，Arg-Val-Phe(RVF)，Leu-Phe-Trp(LFW)，Lys-Val-Ala(KVA)，Phe-Trp-Lys(FWK)，Ala-Trp-Arg(AWR)，Val-His-Gly(VHG)，Ser-Val-His(SVH)，His-Gly-Val(HGV)，Arg-Val-Cys(RVC)，Arg-Pro-Gln(RPQ)，Gln-Lys-Ile(QKI)，Pro-Gln-Lys(PQK)，Asn-Gly-Ala(NGA)，Lys-Ile-Asn(KIN)，Ile-Asn-Gly(ING)，Gly-Arg-Pro(GRP)，Gly-Ala-Arg(GAR)，Ala-Arg-Val(ARV)，Leu-Ser-Gly(LSG)，Val-Asp-Ser(VDS)，Ser-Val-Asp(SVD)，或包含模拟由Seq.Id.No.1至Seq.Id.No.36组成的肽的序列的肽模拟物，其中所述肽在CSF和脑中富集。
[0023] 其他实施方案包括使试剂的递送靶向受试者中的CSF和脑或其血管系统的方法，其通过获得本文所述的本发明的脑靶向肽，或按照本文所述的本发明的方法，可操作地将所述肽与所述试剂连接，并且将所述肽-连接的试剂施用给所述受试者。受试者可以是，但不限于，灵长类动物，猴，人，小鼠，狗，猫，大鼠，绵羊，马，母牛，山羊或猪。所述试剂可以是药物、化疗剂、放射性同位素、促凋亡剂、抗血管生成剂、酶、激素、细胞因子、生长因子、细胞毒性剂、肽、蛋白、抗生素、抗体、抗体的Fab片段、成像剂、抗原、存活因子、抗凋亡剂、激素拮抗剂、病毒、噬菌体、细菌、激素、微粒、磁珠、显微装置、酵母细胞、哺乳动物细胞、细胞或表达载体。
[0025] 图1A：体内噬菌体展示筛选和CSF取样的示意性描述。在每轮选择中，静脉内(尾静脉)施用噬菌体，然后从CSF和血液中回收，扩增，汇集，并且用于下一轮选择。在每一个后续轮次中特定的噬菌体肽克隆的增加的回收反映优先靶向CSF的肽的选择。图1B：此外，基于第一轮选择的噬斑形成单位(plaque forming units，pfu)示例血液和CSF中噬菌体的动力学。
[0026] 图2A-D：在静脉内施用噬菌体文库后，在CSF和血液中的选择。对于每一轮选择，将从CSF分离的噬菌体提取的所有的三肽汇集并且测序。该图显示某些肽基序在CSF和血液中的富集。与血液区室相比，在CSF区室中的选择要强得多。
[0027] 图3：显示在大鼠中四轮的整体体内选择策略。以两个分支开始，在最后的第四轮选择中汇合在三个不同的动物中选择。
[0028] 图4：四轮体内选择后，在CSF和血液中的特异性噬菌体克隆。该图显示与空噬菌体相比，在噬菌体颗粒上富集的一些肽的数据。与空噬菌体相比，在CSF中发现多得多的噬菌体克隆(基于噬斑形成单位(pfu))。
[0029] 图5：特异性的噬菌体克隆结合脑中的血管系统。静脉内施用特异性的噬菌体克隆以允许在体内靶向。随后，利用免疫组织化学检测特异性结合脑血管和毛细血管的噬菌体。使用空噬菌体没有观察到染色，而特别地，克隆Seq.Id.No.1、Seq.Id.No.6和Seq.Id.No.8在皮层中的脑毛细血管中表现出强烈且特异性的染色。
[0030] 图6A-C：B：在CSF中富集的连接到链霉抗生物素蛋白(SA)上特异性的肽。发现一种特异性的肽(Seq.Id.No.8)(合成的并且通过N-端生物素连接到SA上)在CSF中的浓度高于对照乱序肽(scrambled peptide)。A：这也是肽Seq.Id.No.8被展示在T7噬菌体上的情形。C：该图还显示了在脑毛细血管处用脑血管标记凝集素针对定殖的Seq.Id.No.8噬菌体克隆的染色。
[0031] 图7A和B：具有Seq.Id.No.8的脑穿梭体肽增强脑BACE1肽的抑制性活性。将生物素化的BACE1抑制肽单独地(图7B)或与同样生物素化的具有Seq.Id.No.8的脑穿梭体肽(图7A)预先连接到链霉抗生物素蛋白上，然后分别静脉内注射(10mg链霉抗生物素蛋白/kg)到至少三只CM套管处理的大鼠中。在所示的时间点，在血液(黑色三角形/圆形)和CSF(灰色三角形/圆形)中通过Aβ1-40ELISA测量BACE1肽抑制剂介导的Aβ40减少。为了更好地显现，在图中绘制在100％的虚线。(7A)在注射了预先连接到链霉抗生物素蛋白上的具有3∶1比例的Seq.Id.No.8和BACE1抑制剂肽的脑穿梭体的大鼠中血液(黑色三角形)和CSF(灰色三角形)Aβ40减少的百分数。(7B)在注射了预先连接到链霉抗生物素蛋白上的单独的BACE1抑制剂肽(四聚体展示)的大鼠中血液(黑色圆形)和CSF(灰色圆形)Aβ40减少的百分数。
[0032] 发明实施方案的详述
[0033] 定义
[0034] “血脑屏障”或“BBB”是指外周循环与脑和脊髓之间的生理屏障，其由脑毛细血管内皮质膜内的紧密连接部形成，从而建立限制分子(甚至非常小的分子如尿素(60道尔顿))运输进脑中的紧密屏障。脑内的BBB、脊髓内的血液-脊髓屏障和视网膜内的血液-视网膜屏障，是CNS内的相连毛细血管屏障，并且在本文中被统称为血脑屏障或BBB。BBB还包括血液-CSF屏障(脉络丛)，其中屏障由室管膜细胞而不是毛细血管内皮细胞构成。
[0035] “脑效应子实体”是指要穿过BBB运输至脑的分子。效应子实体通常具有希望递送至脑的特征性治疗活性。效应子实体包括神经学病症药物和神经活性和细胞毒性剂，诸如，例如肽、蛋白、酶和抗体，尤其是针对脑靶标的单克隆抗体或其片段。
[0036] “脑靶向肽”在本文中使用时至少包含选自由下述组成的组的三氨基酸肽基序：Phe-Lys-Leu(FKL)，Arg-Gly-Leu(RGL)，Ser-Arg-Gly(SRG)，Tyr-Val-Leu(YVL)，Trp-Gly-Phe(WGF)，Val-Leu-His(VLH)，Leu-Tyr-Val(LYV)，Leu-Trp-Gly(LWG)，Leu-His-Ser(LHS)，His-Ser-Arg(HSR)，Gly-Leu-Trp(GLW)，Gly-Phe-Lys(GFK)，Arg-Leu-Ser(RLS)，Gly-Ser-Val(GSV)，Ser-Val-Ser(SVS)，Leu-Gly-Ser(LGS)，Val-Arg-Phe(VRF)，Ser-Asn-Thr(SNT)，Arg-Phe-Arg(RFR)，Asn-Thr-Arg(NTR)，Leu-Ser-Asn(LSN)，Gly-Phe-Val(GFV)，Phe-Val-Arg(FVR)，Phe-Arg-Leu(FRL)，Trp-Arg-Val(WRV)，Phe-Ser-Leu(FSL)，Val-Phe-Ser(VFS)，Val-Ala-Trp(VAW)，Ser-Leu-Phe(SLF)，Arg-Val-Phe(RVF)，Leu-Phe-Trp(LFW)，Lys-Val-Ala(KVA)，Phe-Trp-Lys(FWK)，Ala-Trp-Arg(AWR)，Val-His-Gly(VHG)，Ser-Val-His(SVH)，His-Gly-Val(HGV)，Arg-Val-Cys(RVC)，Arg-Pro-Gln(RPQ)，Gln-Lys-Ile(QKI)，Pro-Gln-Lys(PQK)，Asn-Gly-Ala(NGA)，Lys-Ile-Asn(KIN)，Ile-Asn-Gly(ING)，Gly-Arg-Pro(GRP)，Gly-Ala-Arg(GAR)，Ala-Arg-Val(ARV)，Leu-Ser-Gly(LSG)，Val-Asp-Ser(VDS)，Ser-Val-Asp(SVD)。必须理解在本发明的脑靶向肽中的三氨基酸肽基序可以是顺序的和/或重合的。
例如，在重合的基序的情形中，在脑靶向肽中，第一个三氨基酸基序的第二个氨基酸可以是第二个三氨基酸基序的第一个氨基酸，和/或第一个氨基酸基序的第三个氨基酸可以是第三个氨基酸基序的第一个氨基酸。
例如，在重合的基序的情形中，在脑靶向肽中，第一个三氨基酸基序的第二个氨基酸可以是第二个三氨基酸基序的第一个氨基酸，和/或第一个氨基酸基序的第三个氨基酸可以是第三个氨基酸基序的第一个氨基酸。
[0037] 本文中使用的“神经学病症”是指影响CNS和/或具有在CNS中的病因的疾病或病症。示例性的CNS疾病或病症包括、但不限于：神经病、淀粉样变性、癌症、眼的疾病或病症、病毒或微生物感染、自身免疫性、炎症、缺血、神经变性疾病、癫痫发作、行为疾病和溶酶体贮积病。为了本申请的目的，将理解CNS包括眼，其通常通过血液-视网膜屏障与身体的其它部分隔离。神经疾病的具体例子包括、但不限于：神经变性疾病(包括、但不限于，雷维小体病(Lewy body disease)，脊髓灰质炎后综合征(postpoliomyelitis syndrome)，夏伊-德雷格综合征(Shy-Draeger syndrome)，橄榄体脑桥小脑萎缩(olivopontocerebellar atrophy)，帕金森病(Parkinson’sdisease)，多系统萎缩(multiple system atrophy)，纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)，Tau病变(tauopathies)(包括、但不限于，阿尔茨海默病(Alzheimer disease)和核上性麻痹(supranuclear palsy))，朊病毒病(prion disease)(包括、但不限于，牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalopathy)，痒病(scrapie)，克-雅综合征(Creutzfeldt-Jakob syndrome)，库鲁病(kuru)，格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)，慢性消耗性疾病(chronic wasting disease)，和致命性家族性失眠症(fatal familial insomnia))，延髓性麻痹(bulbar palsy)，运动神经元病(motor neuron disease)，和神经系统heterodegenerative病症(包括、但不限于卡纳范病(Canavan disease)，亨廷顿病(Huntington′s disease)，神经元蜡样脂褐素沉积症(neuronal ceroid-lipofuscinosis)，亚历山大病(Alexander′s disease)，图雷特综合征(Tourette′s syndrome)，门克斯扭结发综合征(Menkes kinky hair syndrome)，科凯恩综合征(Cockayne syndrome)，哈勒沃登-施帕茨综合征(Halervorden-Spatz syndrome)，拉福拉病(lafora disease)，雷特综合征(Rett syndrome)，肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration)，莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan syndrome)，和翁-隆综合征(Unverricht-Lundborg syndrome))，痴呆(包括、但不限于，皮克病(Pick′s disease)，和脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia))，癌症(例如CNS和/或脑的癌症，包括源自身体其它位置的癌症的脑转移)，多发性硬化(复发的缓和的、原发性进展性的和继发性进展性的形式)。
[0038] “神经学病症药物”是治疗一种或多种神经疾病的药物或治疗剂。本发明的神经学病症药物包括，但不限于，小分子化合物，抗体，肽，蛋白质，一种或多种CNS靶标的天然配体，一种或多种CNS靶标的天然配体的修饰形式，适体，抑制性核酸(即，小的抑制性RNAs(siRNA)和短发夹RNAs(shRNA))，核酶，和小分子，或上述中任何一种的活性片段。本发明的示例性神经学病症药物描述于此并且包括，但不限于：抗体，适体，蛋白质，肽，抑制性核酸和小分子和上述中任何一种的活性片段，它们是它们本身或特异性识别和/或作用于(即，抑制，活化，或检测)CNS抗原或靶标分子，如，但不限于，淀粉状蛋白前体蛋白或其部分，淀粉状蛋白β，β-分泌酶，γ-分泌酶，tau，α-突触核蛋白，帕金蛋白，亨廷顿蛋白，DR6，早老蛋白，ApoE，神经胶质瘤或其它CNS癌症标志物，和神经营养因子。神经学病症药物的非限制性例子以及可以使用它们治疗的对应疾病：脑衍生的神经营养因子(BDNF)，慢性脑损伤(神经发生)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，抗-表皮生长因子受体脑癌，(EGFR)-抗体，神经胶质细胞系衍生的神经因子，帕金森病，(GDNF)，脑衍生的神经营养因子(BDNF)，肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis)，抑郁症，溶酶体酶，脑的溶酶体贮积疾病，睫状神经营养因子(CNTF)，肌萎缩性侧索硬化，神经调节蛋白-1，精神分裂症(Schizophrenia)，抗-HER2抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab))，来自HER2-阳性癌症的脑转移。
[0039] “成像剂”是这样的化合物：其具有允许它的存在和/或位置被直接或间接检测到的一种或多种性质。这样的成像剂的例子包括蛋白和小分子化合物，其掺入允许检测的标记的实体。
[0040] “CNS抗原”或“脑靶标”是在CNS(包括脑)中表达的抗原和/或分子，其可以被抗体或小分子所靶向。这样的抗原和/或分子的例子包括，但不限于：β-分泌酶1(BACE1)、淀粉状蛋白β(Aβ)、表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(HER2)、Tau、载脂蛋白E4(ApoE4)、α-突触核蛋白、CD20、TREM2亨廷顿蛋白、朊病毒蛋白(PrP)、富亮氨酸重复的激酶2(LRRK2)、帕金蛋白、早老蛋白1、早老蛋白2、γ分泌酶、死亡受体6(DR6)、淀粉状蛋白前体蛋白(APP)、p75神经营养因子受体(p75NTR)和胱天蛋白酶6。在一个实施方案中，所述抗原是BACE1。
[0041] 术语“抗体”在本文中以最宽的含义使用，并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如、双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性即可。
[0042] “抗体片段”在本文中包括保持结合抗原的能力的完整抗体的一部分。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，诸如例如单链Fab、scFv，和由多个抗体片段形成的多特异性抗体。“单链Fab”形式例如描述在Hust M.等.BMC Biotechnol.(BMC生物技术)2007年3月8日；7：14中。
[0043] 本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能的变体(该变体可以在产生单克隆抗体的过程中出现，此类变体通常以少量存在)外，构成群体的个体抗体是相同的和/或结合相同的表位。相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们不受其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过最先由Kohler等，Nature(自然)，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)制备。“单克隆抗体”也可以使用在Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库分离。本文中的单克隆抗体的具体实例包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，包括它们的抗原结合片段。
单克隆抗体在本文中具体地包括：“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；
Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类源化(primatized)”抗体，该抗体包含来源于非人灵长类动物(例如旧大陆猴(Old World Monkey)，如狒狒、恒河猴(rhesus)或食蟹猴(cynomolgus monkey))的可变结构域抗原-结合序列以及人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
单克隆抗体在本文中具体地包括：“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而所述链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；
Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)81：6851-6855(1984))。本文感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类源化(primatized)”抗体，该抗体包含来源于非人灵长类动物(例如旧大陆猴(Old World Monkey)，如狒狒、恒河猴(rhesus)或食蟹猴(cynomolgus monkey))的可变结构域抗原-结合序列以及人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
[0044] 术语“细胞毒性剂”用在本文中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括，但不限于：放射性同位素(例如，At211，1131，1125，Y90，Re186，Re188，Sm153，Bi212，P32，Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体。
[0045] 试剂例如药物制剂的”有效量”是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
[0046] 本文中使用的“接头”是指化学接头或肽接头，其将本发明的血脑屏障穿梭体的不同实体共价地连接在一起。例如，所述接头将脑效应子实体与本发明的脑靶向肽连接。
[0047] 可以使用肽接头，其包含1-20个通过肽键连接的氨基酸。在某些实施方案中，所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些其它实施方案中，所述氨基酸中的一个或多个选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在其它实施方案中，所述接头是化学接头。在某些实施方案中，所述接头是具有至少25个氨基酸长度的氨基酸序列的单链肽，优选地具有32-50个氨基酸的长度。在一个实施方案中，所述接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸(x＝3、n＝8、9或10且m＝0、1、2或3)或(x＝4和n＝6、7或8且m＝0、1、2或3)，优选地，其中x＝4，n＝6或7且m＝0、1、2或3，更优选地，其中x＝4，n＝7且m＝2。在一个实施方案中，所述接头是(G4S)4(Seq.Id.No.17)。在一个实施方案中，所述接头是(G4S)6G2(Seq.Id.No.13)。
[0048] 可以使用多种化学接头进行缀合。例如，使用多种双功能的蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯HC1)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(诸如二-(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)，可以缀合脑穿梭肽和脑效应子实体。所述接头可以是“可切割的接头”，从而促进效应子实体在递送至脑以后的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
[0049] 共价缀合可以直接进行或通过接头进行。在某些实施方案中，直接缀合通过构建蛋白融合体进行(即，通过编码脑靶向肽和效应子实体的两种基因的基因融合并且表达为单一蛋白)。在某些实施方案中，直接缀合通过在脑穿梭肽的两部分之一上的反应基团与脑效应子实体上的对应基团或接受体之间形成共价键进行。在某些实施方案中，直接缀合通过将要缀合的两种分子中的一种进行修饰(即基因修饰)而进行，从而包括在适当条件下形成与要缀合的其它分子的共价连接的反应基团(作为非限制性例子，巯基或羧基)。作为一个非限制性例子，可以引入具有期望的反应基团(即，半胱氨酸残基)的分子(即，氨基酸)，例如，引入到脑穿梭肽中，并且与神经学药物形成二硫键。使核酸与蛋白共价缀合的方法也是本领域已知的(即，光交联，参见，例如，Zatsepin等.Russ.Chem.Rev.(俄罗斯化学综述)74：77-95(2005))。还可以使用多种接头进行缀合。例如，使用多种双功能的蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(诸如己二亚氨酸二甲酯HC1)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、二-叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、二-重氮鎓衍生物(诸如二-(对重氮鎓苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性的氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)，可以缀合脑穿梭肽和效应子实体。也可以使用包含通过肽键连接的1-
20个氨基酸的肽接头。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些其它这样的实施方案中，一个或多个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。接头可以是“可切割的接头”，从而促进效应子实体在递送至脑后的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
20个氨基酸的肽接头。在某些这样的实施方案中，氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在某些其它这样的实施方案中，一个或多个氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。接头可以是“可切割的接头”，从而促进效应子实体在递送至脑后的释放。例如，可以使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等，Cancer Res.(癌症研究)52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
[0050] 术语“药物制剂”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对被施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0051] “药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0052] 本文中使用的“治疗(treatment)”(及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变被治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括、但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在某些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
[0053] 术语“噬菌体展示文库”是指多个噬菌体，其中随机的异源肽已被改造成为噬菌体衣壳蛋白并且呈现在噬菌体表面上。在某些方面中，肽可能受肽的半胱氨酸残基的限制。方法可以进一步包括将分离自第二受试者的噬菌体施用给至少第三受试者，从第三受试者获得一种或多种组织或流体(包括CSF)的样品，并且鉴定由分离自第三受试者的组织或液体(包括CSF)的噬菌体所展示的肽序列。在某些方面，噬菌体的施用通过注射，优选地通过静脉内注射进行。受试者可以是哺乳动物，并且在具体的方面中，所述哺乳动物是啮齿动物、非人灵长动物或人。所述方法可以进一步包括在施用给另外的受试者之前，扩增分离自一名受试者的样品的噬菌体。扩增可能需要PCR扩增全部或部分的噬菌体核酸，然后将扩增的片段克隆到第二噬菌体中，和/或通过噬菌体宿主生物体进行噬菌体增殖，所述噬菌体宿主生物体例如是支持噬菌体复制的细菌。
[0054] 术语“体内脑脊液(CSF)取样”是指专门获得受试者中的CSF。受试者可以是哺乳动物，并且在具体的方面中，所述哺乳动物是啮齿动物、非人灵长动物或人。样品使用插入到小脑延髓池(cisterna magna)中的套管获得，如在本申请中具体所述。
[0055] 术语“同时地”可以用于意指在提供来自CSF的样品采集的时间阶段(数分钟至数小时至数天)内获得样品。本发明的其他实施方案包括通过本文所述的方法鉴定的分离的肽。
[0056] 术语“肽基序”是指具有靶向或结合特定组织或受体的能力或具有被转运通过BBB或BCSFB的能力的三氨基酸肽序列。
[0057] 用于本文时，“选择性结合”决不排除与其他细胞或物质的结合，但是意指靶组织、器官、血管系统或其受体的优先结合。与非选择的组织/靶标相比，选择性结合可以包括针对所选的组织/靶标2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍的优先性。
[0058] “脑靶向肽”用在本文中是包含至少一个本文定义的肽基序的肽，其特征在于选择性定位在CSF和/或脑或其血管系统中。脑靶向肽可以包含多于一种肽基序，并且肽基序可以是邻接的或通过非基序氨基酸序列隔开。
[0059] 例如，可以通过下文公开的方法确定选择性定位，其中将推定的靶向天序列结合在展示在噬菌体外表面上的蛋白中。向受试者施用已经遗传改造表达多种所述不同氨基酸序列的靶向肽的所述噬菌体文库，然后采集来源于一名或多名受试者的CSF或脑，并且鉴定存在于所述液体或器官中或与所述液体或器官相关的噬菌体。如果与对照流体或器官相比，表达靶向肽序列的噬菌体在所述液体或器官中表现出更大的结合或定位，则认为所述表达靶向肽序列的噬菌体选择性定位在液体或器官中。优选地，与对照流体或器官相比，靶向肽的选择性定位应该导致噬菌体或肽在所述流体或器官中两倍以上的富集。更优选与对照器官相比在靶标流体或器官中导致至少三倍、四倍、五倍、六倍、七倍、八倍、九倍、十倍以上的富集的选择性定位。备选地，当将从靶标或选择的流体或器官回收的噬菌体注射到第二、第三、第四或更多的受试者或与第二、第三、第四或更多的受试者接触用于另外的筛选时，与对照流体或器官相比，表达表现出选择性定位的靶向肽序列的噬菌体优选地在靶标流体或器官中表现出增加的富集。与表达非特异性肽或没有遗传改造表达任何推定的靶肽的对照噬菌体相比，确定表达推定的靶肽的噬菌体的选择性定位或结合的另一种备选方式优选地在靶标流体或器官中表现出两倍，更优选地三倍或更高的富集。确定选择性定位的另一种方式是表达靶肽的噬菌体在靶标流体或器官的定位至少部分被共同施用的包含所述靶肽序列的合成肽所阻断。
[0060] 脑脊液体内选择
[0061] 通过体内噬菌体展示的血管绘图揭示在不同血管系统内选择性表达的生化“地址(addresses)”。这种类型的方法已经用于发现可以用于将试剂递送至特定组织的配体-受体系统(Arap等，1998，Pasqualini等，1996，Arap等，2002，Kolonin等，2001，Pasqualini等，2000)。这种筛选方法是基于来自组合文库(展示在基于M13的噬菌体载体上)的短配体肽在系统施用后靶向特定器官的能力(Pasqualini等，2000)。肽靶向组织和疾病状态已经分离，并且，在一些情形中，导致相应的血管受体的鉴定(Arap等，1998，Pasqualini等，1996，Arap等，2002，Kolonin等，2001，Rajotte和Ruoslahti，1999，Kolonin，等，2002，Kolonin等，
2004)。值得注意地，研究者已经报道了噬菌体展示文库在癌症患者中的应用。被鉴定为白介素-11样肽的一种配体基序及其对白介素-11受体的靶向用作在人前列腺癌中的靶向的治疗剂递送的潜在的策略(Zurita等，2004)。体内噬菌体展示随机肽文库的选择的关键步骤是取样策略，即，怎样回收噬菌体和在何处回收噬菌体。优选地，例如，该体内选择策略应该不仅基于与组织或受体的结合，而且包括作为转运通过细胞屏障的功能性步骤。当目的是鉴定涉及血脑屏障(BBB)或血液CSF屏障(BCSFB)的新型转运系统时，这是特别重要的。
2004)。值得注意地，研究者已经报道了噬菌体展示文库在癌症患者中的应用。被鉴定为白介素-11样肽的一种配体基序及其对白介素-11受体的靶向用作在人前列腺癌中的靶向的治疗剂递送的潜在的策略(Zurita等，2004)。体内噬菌体展示随机肽文库的选择的关键步骤是取样策略，即，怎样回收噬菌体和在何处回收噬菌体。优选地，例如，该体内选择策略应该不仅基于与组织或受体的结合，而且包括作为转运通过细胞屏障的功能性步骤。当目的是鉴定涉及血脑屏障(BBB)或血液CSF屏障(BCSFB)的新型转运系统时，这是特别重要的。
[0062] 在某些情形中，人们可能需要获得高度富集的样品，这不仅依赖于结合，而且依赖于通过细胞膜的转运。在这些情形中，典型的筛选方法不是最佳的，由此本文所述的方法提供更有效的鉴定具有能开发成药物、靶向剂或诊断剂的特征的靶向肽的方法。本文所述的方法用于进一步富集所选择的噬菌体群体，并且基于结合和转运特性二者选择不同的肽。单一活受试者中的单次筛选选择肽的亚群，但是该群体需要针对选择性的和转运的肽进行富集。本发明人提供一种获得例如可以用在人受试者中的靶向肽的富集的改进的方法。“受试者”通常是指哺乳动物。在某些优选的实施方案中，受试者是啮齿动物、灵长动物、猴或人。在更优选的实施方案中，受试者是人。
[0063] 靶向肽的鉴定
[0064] 本发明包括用于鉴定可用于将组合物定位在CSF、脑或相关的血管系统的一种或多种脑靶向肽或分子靶标的方法。筛选受试者的流体或器官以筛选具有N个残基的肽，其中N可以是5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15个或更多个残基，随机噬菌体文库产生几种肽基序。在一个实例中，包含下述三肽基序的不同的克隆在CSF中脑中表现出高频率、选择性靶向或结合和存在：
[0065] Phe-Lys-Leu(FKL)，Arg-Gly-Leu(RGL)，Ser-Arg-Gly(SRG)，Tyr-Val-Leu(YVL)，Trp-Gly-Phe(WGF)，Val-Leu-His(VLH)，Leu-Tyr-Val(LYV)，Leu-Trp-Gly(LWG)，Leu-His-Ser(LHS)，His-Ser-Arg(HSR)，Gly-Leu-Trp(GLW)，Gly-Phe-Lys(GFK)，Arg-Leu-Ser(RLS)，Gly-Ser-Val(GSV)，Ser-Val-Ser(SVS)，Leu-Gly-Ser(LGS)，Val-Arg-Phe(VRF)，Ser-Asn-Thr(SNT)，Arg-Phe-Arg(RFR)，Asn-Thr-Arg(NTR)，Leu-Ser-Asn(LSN)，Gly-Phe-Val(GFV)，Phe-Val-Arg(FVR)，Phe-Arg-Leu(FRL)，Trp-Arg-Val(WRV)，Phe-Ser-Leu(FSL)，Val-Phe-Ser(VFS)，Val-Ala-Trp(VAW)，Ser-Leu-Phe(SLF)，Arg-Val-Phe(RVF)，Leu-Phe-Trp(LFW)，Lys-Val-Ala(KVA)，Phe-Trp-Lys(FWK)，Ala-Trp-Arg(AWR)，Val-His-Gly(VHG)，Ser-Val-His(SVH)，His-Gly-Val(HGV)，Arg-Val-Cys(RVC)，Arg-Pro-Gln(RPQ)，Gln-Lys-Ile(QKI)，Pro-Gln-Lys(PQK)，Asn-Gly-Ala(NGA)，Lys-Ile-Asn(KIN)，Ile-Asn-Gly(ING)，Gly-Arg-Pro(GRP)，Gly-Ala-Arg(GAR)，Ala-Arg-Val(ARV)，Leu-Ser-Gly(LSG)，Val-Asp-Ser(VDS)，Ser-Val-Asp(SVD)。所选的具有可在在线蛋白数据库中获得的序列的肽基序的比较表明多种候选蛋白与这些肽基序共有同源性或相似的序列。围绕这些基序的机制研究继续为用于靶向CSF液和脑与相关的血管系统以及它们的组合的肽和靶标的鉴定提供了新的平台。由于新鉴定的基序可以作为肽模拟物药物线索并且可以被优化以指导不同治疗性结构部分的递送，该发现还将具有重要的临床意义。一种方法包括静脉内注射噬菌体文库，并且在几分钟后回收样品。
[0066] “噬菌体展示文库”是已经被遗传改造在其外表面上表达一组推定的靶向肽的噬菌体的集合。在优选的实施方案中，将编码所述推定的靶向肽的DNA序列符合阅读框地插入到编码噬菌体衣壳蛋白的基因中。在其他优选的实施方案中，所述推定的靶向肽序列部分是所有20种氨基酸的随机混合物，部分是非随机物。在某些优选的实施方案中，噬菌体展示文库的推定的靶向肽在所述靶向肽序列内的固定的或随机的位置展现出一个或多个半胱氨酸残基。例如，半胱氨酸可以用于产生环形肽。选择性结合不同的器官、组织或细胞类型的靶向肽可以通过“生物淘选(biopanning)”分离(Pasqualini和Ruoslahti，1996，Pasqualini，1999)。简言之，将包含推定的靶向肽的噬菌体的文库施用给动物，并且采集包含噬菌体的器官、组织、流体或细胞类型的样品。在适于裂解性噬菌体的优选的实施方案中，噬菌体可以在细菌中的多轮生物淘选之间在体外繁殖。细菌被噬菌体裂解，从而分泌多个拷贝的展示特定的插入物的噬菌体。可以从靶标流体或器官收集结合靶分子或被转运到特定的流体或组织中的噬菌体，然后通过将其在宿主细菌中生长而扩增。如果需要，可以将扩增的噬菌体施用给宿主，然后再次采集流体和器官的样品。可以进行多轮生物淘选，直到获得选择性结合剂和转运蛋白群体。通过对与噬菌体基因组中的靶向肽对应的DNA测序而确定肽的氨基酸序列。然后，可以通过标准的蛋白化学技术以合成肽产生鉴定的靶向肽。这种方法允许在没有偏好性的功能测定中循环待检测的靶向肽，而没有关于它们的靶标的性质的任何预先想到的观念。一旦候选靶标被鉴定为靶向肽的受体，可以使用标准的生化方法将其分离。纯化并克隆。在某些实施方案中，可以利用减去流程(subtraction protocol)来进一步减少背景噬菌体结合。减去的目的是从文库中去除与目的组织之外的组织结合的噬菌体。在备选的实施方案中，可以针对不具有所选择的流体、组织或器官的受试者预先筛选噬菌体文库。噬菌体展示技术涉及遗传操作噬菌体，以便能够在它们的表面上表达小肽(Smith和Scott，1985和1993)。对于这种技术，潜在的应用范围是相当广泛的，并且过去的十年已经看到了噬菌体展示的肽文库的构建和使用文库来分离肽配体的筛选方法的研发中的相当大的进展。例如，肽文库的使用使表征多种蛋白(参与炎性反应的抗体或介导细胞粘附的整联蛋白)中的相互作用位点和受体-配体结合基序成为可能。这一方法还用于鉴定作为研发除肽之外的肽模拟物药物或成像剂(Arap等，1998a)的线索的新型肽配体，较大的蛋白结构域，诸如单链抗体，也可以展示在噬菌体颗粒的表面上(Arap等，1998a)。
[0067] 噬菌体展示系统的选择
[0068] 之前在小鼠中进行的体内选择研究优先利用作为与基因III荚膜蛋白的融合蛋白在fUSE5载体中表达的随机的肽的文库(Pasqualini和Ruoslahti，1996)。用于鉴定转运蛋白肽的优选的噬菌体系统是T7噬菌体系统。T7噬菌体颗粒非常小(直径约50nm)，允许利用天然的细胞器细胞内分选而通过细胞转运。M13噬菌体系统在尺寸上显著更大，并且可能防止细胞摄入和细胞内分选。因此，防止靶肽在流体和器官内的富集受细胞膜诸如血脑屏障(BBB)和血液CSF屏障(BCSFB)的保护。在给定的文库中存在的个体克隆的数目和多样性是成功的体内选择的重要因素。优选使用一级文库(primary libraries)，其较不可能具有缺陷性噬菌体克隆的过度表现。优选使用具有高多样性与等比例的所有噬菌体克隆的一级文库。文库的制备应该优化为108-109个噬斑形成单位(pfu)/ml。在某些实施方案中，在每轮选择之前应用大量扩增策略。在本发明的范围内可以使用展示线性、环形或双环形肽的噬菌体文库。然而，优选展示5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15个或更多个残基的噬菌体文库。环形肽也是优选的。然而，由于具有不同二硫键排列的多种构象异构体，产生同源的合成肽，尽管是可能的，但可能是复杂的。
[0069] 靶向递送
[0070] 已经将靶向血管系统的肽连接到细胞毒性药物或促凋亡肽上，以产生比亲本化合物更有效且毒性更小的化合物。
[0071] 本发明描述了用于选择性靶向CSF液和脑的方法和组合物。针对靶向肽的“受体”包括，但不限于，直接或间接与靶向肽结合的任何分子或大分子复合物。受体的非限制性实例包括肽、蛋白、糖蛋白、脂蛋白、表位、脂质、碳水化合物、多分子结构和一种或多种分子的特定构象。在优选的实施方案中，“受体”是天然存在的分子或存在于靶标组织或器官内的细胞表面上的分子的复合物。优选地，“受体”是天然存在的分子或存在于组织、器官、血流或其血管系统之上或之内的分子的复合物。更优选地，“受体”是内在化在细胞上并且通过胞转机制转运到细胞的相对一侧的转运受体。在某些实施方案中，治疗试剂可以连接到靶向肽或融合蛋白上，例如，用于选择性递送至CSF和脑。适合使用的试剂或因子可以包括对脑部疾病具有治疗作用的任意化学化合物或生物制品。化疗剂和施用方法、剂量等是本领域技术人员公知的(例如，参见"Physicians’Desk Reference(医师的案头参考)″，Goodman&Oilman′s″The Pharmacological Basis of Therapeutics(治疗剂的药理学基础)″和″Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药典)″第15版，第1035-1038和1570-1580页，每一篇通过引用相关部分而结合在本文中)，并且，根据本文的公开内容，可以与本发明组合。取决于被治疗的受试者的病况，需要发生剂量的某些变化。在任何情形中，负责施用的人确定用于个体受试者的适当的剂量。
[0072] 药物组合物
[0073] 当考虑临床应用时，可能需要制备适于目的应用的形式的药物组合物-表达载体、病毒储液、蛋白、抗体和药物。一般地，这将需要制备基本上不含可能对人或动物有害的杂质的组合物。人们通常需要使用适当的盐和缓冲液使递送载体稳定并且允许被靶细胞摄入。当将重组细胞引入到患者中时，还使用缓冲液。本发明的水性组合物可以包含有效量的蛋白、肽、融合蛋白、重组噬菌体和/或表达载体，其溶解或分散在制药学可接受的载体或水性介质中。短语“制药学或药理学可接受的”是指在施用给动物或人时不产生不利的、过敏性或其他不需要的反应的分子实体和组合物。用于本文时，“制药学可接受的载体”包括任意和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述介质和试剂作为药物活性物质的应用在本领域中是公知的。在可能的范围内，除了与本发明的蛋白或肽不相容的任何常规的介质或试剂之外，考虑其在治疗组合物中的应用。还可以在组合物中掺和补充的活性成分。本发明的活性组合物可以包括经典的药物制剂。本发明所述的这些组合物的施用通过任意常规的途径进行，只要通过所述途径可获得靶标流体、组织或器官即可。这包括口服、鼻、口腔、直肠、阴道或局部方式。备选地，施用可以通过正位的(orthotopic)、皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内或静脉内注射进行。所述组合物通常作为制药学可接受的组合物(同前所述)施用。适于注射应用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末剂。在所有情形中，形式必须是无菌的，必须是存在容易注射性的程度的流体。在制备和存储的条件下，其必须是稳定的，必须保存防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。所得者(earner)可以是溶剂或分散介质，例如，包含水、乙醇、(例如，甘油、丙二醇、和液态聚乙二醇等)、它们的适当的混合物和植物油。例如，通过使用包衣，诸如卵磷脂，在分散剂的情形中，通过保持需要的粒度，和通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。微生物作用的防止可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂导致，例如，对羟基苯甲酸酯(paraberis)，氯丁醇(chiorobutanol)，苯酚，山梨酸，硫柳汞(thimerosal)等。在多种情形中，优选地包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。注射组合物的延长的吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)而导致。通过将活性化合物以需要的量同所需要的上文列出的多种其他成分结合在适当的溶剂中，然后过滤除菌，而制备无菌注射溶液。通常，通过将多种除菌的活性成分结合到包含基本的扩散介质和来自上文列举的所需要的其他成分的无菌赋形剂中，而制备分散剂。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末剂的情形中，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其由之前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任意另外的需要的成分的粉末。实施例
[0074] 包括下述实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，下述实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实施过程中作用良好的技术，并且由此可以被认为组成了其实施的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以在公开的具体实施方案中进行多种变化，并且仍然获得相同的或相似的结果。
[0075] 实施例1：在小脑延髓池中手术植入套管。
[0076] 使用之前由Sarna等.(1983)(Waring等.2010，192249-253)(Sarna等.1983，383-388)所述的方法的改进方案，将套管插入到小脑延髓池(CM)中。将麻醉的Wistar大鼠(200-
350g)封固到立体定位装置上，并且在剃过头发的头顶做出一个正中切口(一直回到肩胛间区(inter-scapular region))。在顶区钻两个孔，并且在孔中安装封固螺丝。在枕外嵴处钻另一个孔，并且用于立体引导套管进入CM。在套管和螺丝周围使用牙科粘固粉，以使其保持在适当的位置。在粘固粉晾干后，用4/0超聚酰胺丝线(supramid yarn)缝合皮肤伤口。当套管放置好时，发生脑脊液(CSF)的自动流出。将大鼠从立体定位装置上取下，接受适当的手术后止痛处理，并且允许恢复至少一周，直到在CSF中没有观察到血液的迹象。所有的动物程序完全由机构动物护理权威核准(Permission#2474)。
350g)封固到立体定位装置上，并且在剃过头发的头顶做出一个正中切口(一直回到肩胛间区(inter-scapular region))。在顶区钻两个孔，并且在孔中安装封固螺丝。在枕外嵴处钻另一个孔，并且用于立体引导套管进入CM。在套管和螺丝周围使用牙科粘固粉，以使其保持在适当的位置。在粘固粉晾干后，用4/0超聚酰胺丝线(supramid yarn)缝合皮肤伤口。当套管放置好时，发生脑脊液(CSF)的自动流出。将大鼠从立体定位装置上取下，接受适当的手术后止痛处理，并且允许恢复至少一周，直到在CSF中没有观察到血液的迹象。所有的动物程序完全由机构动物护理权威核准(Permission#2474)。
[0077] 实施例2：从未麻醉的成年大鼠连续采集CSF和血液。
[0078] 将CM插管的清醒的大鼠轻轻拿在手中。从套管中抽出mandrain，并且收集10μL自发流出的CSF。由于套管的流畅性最终受到损害，因此，在该研究中仅包括澄清的CSF样品，没有血液污染或脱色迹象。从尾巴末端的小切口平行采集10-20μL血液到包含肝素(Sigma-Aldrich)的管中。在静脉内注射噬菌体后的不同时间点采集CSF和血液。在采集每份CSF样品之前，弃掉10-15μL流体，其表示导管死体积。
[0079] 实施例3：T7噬菌体肽文库改造。
[0080] 如T7Select系统手册(Novagen)(Rosenberg等.InNovations 6，1-6 1996)所述，使用T7Select 10-3b载体，构建文库。简言之，以下述格式合成随机的12-mer插入物DNA：
[0081] 5’-GGGGATCCGAATTCT(NHH)12TAAGCTTGCGGCCGCA-3`(Seq.Id.No.37)
[0082] ←3`-TCGAACGCCGGCGT-5’(Seq.Id.No.38)
[0083] 使用NHH密码子以避免在插入物内的两个终止密码子和氨基酸的过度表示。N表示手动混合的(hand-mixed)等摩尔比例的每种核苷酸，H是手动混合的等摩尔的腺嘌呤和胞嘧啶两种核苷酸。通过在37℃在Klenow缓冲液(New England Biolabs)中与dNTPs(Novagen)和Klenow酶(New England Biolabs)持续温育3小时，将单链区转化为双链体DNA。反应后，通过EtOH沉淀回收双链DNA。将得到的DNA用EcoRI和HindIII限制性酶(二者均来自Roche)消化。然后将消化并纯化的(QIAquick，Qiagen)插入物在衣壳10B基因的氨基酸
348后符合阅读框地连接(T4连接酶，New England Biolabs)到预先消化的T7载体中。连接反应在16℃温育18小时，然后进行体外包装。按照T7Select 10-3b克隆试剂盒(Novagen)上所附的使用说明，进行体外包装成噬菌体，并且用大肠杆菌(E.coli)(BLT5615，Novagen)增殖包装溶液一次，直到裂解。将裂解物离心，滴定并且作为甘油储液冷冻在-80℃。
348后符合阅读框地连接(T4连接酶，New England Biolabs)到预先消化的T7载体中。连接反应在16℃温育18小时，然后进行体外包装。按照T7Select 10-3b克隆试剂盒(Novagen)上所附的使用说明，进行体外包装成噬菌体，并且用大肠杆菌(E.coli)(BLT5615，Novagen)增殖包装溶液一次，直到裂解。将裂解物离心，滴定并且作为甘油储液冷冻在-80℃。
[0084] 实施例4：PCR噬菌体鉴定。
[0085] 使用内部设计的454/Roche-扩增子融合引物，将肉汤或平板增殖的噬菌体的可变区域直接进行PCR扩增。正向融合引物包含侧连可变区(NNK)12(模板特异性的)的序列、GS FLX钛衔接子A和四碱基文库关键序列(TCAG)：
[0086] 5`-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGGGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3`(Seq.Id.No.39)
[0087] 反向融合引物也携带用于连接到捕获珠子上的生物素和在乳液PCR过程中克隆扩增所需要的GS FLX钛衔接子B：
[0088] 5`-生物素-
[0089] CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGAACCCCTCAAGACCCGTTrA-3`(Seq.Id.No.40)[0090] 然后，按照454GS-FLX钛流程，使扩增子进行454/Roche焦磷酸测序。对于人工Sanger测序(Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA分析仪)，将T7噬菌体DNA进行PCR扩增，并且用下述引物对测序：
[0091] PCR正向：5｀-AGTACGCAATGGGCCACG-3｀(Seq.Id.No.41)
[0092] PCR反向：5｀-GAGCGCATATAGTTCCTCC-3`(Seq.Id.No.42)
[0093] 测序正向：5`-CAGGAGCTGTCGTATTCC-3`(Seq.Td.No.43)
[0094] 测序反向：5`-AAAAACCCCTCAAGACCCG-3`(Seq.Id.No.44)
[0095] 使用Roche快速启动DNA聚合酶试剂盒(按照供应商的使用说明)PCR扩增个体噬菌体蚀斑的插入物。进行热启动(95℃，10min)，和35个扩增循环：95℃ 50sec，50℃1min和72℃1min。
[0096] 实施例5：噬菌体制各、应用和选择。
[0097] 将来自文库的噬菌体、野生型噬菌体、CSF和血液回收的噬菌体或个体克隆在大肠杆菌(Escherichia coli)BL5615中在肉汤培养基(TB培养基)中(Sigma Aldrich)或在500cm2平板(ThermoScientific)上在37℃增殖4小时。通过用Tris-EDTA缓冲溶液(Fluka Analytical)润洗平板或用无菌移液器末端挑取蚀斑而从平板提取噬菌体。通过一轮聚乙二醇沉淀(PEG8000)(Promega)由培养物上清或提取缓冲液回收噬菌体，并且重悬在Tris-EDTA缓冲溶液中。
[0098] 在静脉内(i.v.)注射(500μL/只动物)之前，使用内毒素去除珠子(Miltenyi Biotec)对增殖的噬菌体进行2-3轮内毒素去除。通过按照供应商的使用说明(T7Select System Manual)的蚀斑计数测定，确定在所示时间点收集的CSF和血液样品中的噬菌体含量。通过静脉内尾静脉注射纯化的文库或通过再次注射之前选择轮次的CSF回收的噬菌体进行噬菌体选择。然后，在注射后10min、30min、60min、90min、120min、180min和240min采集CSF和血液样品。总共进行四轮体内淘选，其中保持两个选择分支，并且在前三轮选择中独立分析。使前两轮选择的所有CSF回收的噬菌体插入物进行454/Roche焦磷酸测序，而后两轮选择的所有CSF回收的克隆进行人工测序。第一轮选择的所有血液收集的噬菌体也进行454/Roche焦磷酸测序。
[0099] 实施例6：滤除和处理读数数据
[0100] 通过使用vendor软件(http：//454.com/my454/documentation/gs-flx system/emanuals/Part_C/wwhelp/wwhimpl/js/html/wwhelp.htm#href＝PartC.1.087.html#9003035)，将Roche-454原始数据由二进制标准flowgram格式(sff，http：//
www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/trace.cgi？cmd＝show&f＝formats&m＝doc&s＝format#sff)转化为人可读的Pearson格式(fasta，http：//emboss.sourceforge.net/docs/themes/SequenceFormats.html)。其他核苷酸序列处理使用内部开发的C-程序和脚本程序(未公布的软件包)进行，如下文所述。
www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/trace.cgi？cmd＝show&f＝formats&m＝doc&s＝format#sff)转化为人可读的Pearson格式(fasta，http：//emboss.sourceforge.net/docs/themes/SequenceFormats.html)。其他核苷酸序列处理使用内部开发的C-程序和脚本程序(未公布的软件包)进行，如下文所述。
[0101] 主要数据分析由严谨的多步滤除步骤组成。为了滤除不包含有效的12mer插入物DNA序列的读数，通过进行整体Needleman-Wunsch比对(每次比对允许多至2个错配)(Needleman等，1970)，将读数与核苷酸序列GTGATGCTCGGGGATCCGAAT TCT(Seq.Id.No.45)限定的起始标记、终止标记TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA(Seq.Id.No.46)和背景插入物CCTGC AGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC(Seq.Id.No.47)连续进行比对。因此，从文库中去除没有起始或终止标记的读数和包含背景插入物的读数，即，超过允许的错配数目的比对。关于其余的读数，将以起始标记开始并且在终止标记前终止的N-mer DNA序列片段从原始读数序列上切下，并且进一步处理(在下文称为“插入物”)。当插入物翻译时，从所述插入物上去除从5-引发末端的第一个终止密码子后的部分。另外，还去除在3-引发末端产生不完整的密码子的核苷酸。为了排除仅包含背景序列的插入物，还去除以氨基酸模式“PAG”起始的翻译的插入物。从文库中弃掉在翻译时长度短于3个氨基酸的肽。最后，去除插入物文库中的冗余，并且计算每个特有的插入物的频率。该分析的结果由核苷酸序列(插入物)列表及其(读取)频率组成。
[0102] 实施例7：通过序列相似性对N-mer DNA插入物分组：
[0103] 为了克服Roche-454特异性测序的出错(例如，测序均聚物片段的问题)并且去除较不平常的冗余(例如，由于测序出错导致)，通过迭代算法将之前滤除的N-mer插入物DNA序列(插入物)分类为相似的插入物的组(其中允许多至2个错配)，所述迭代算法如下所述：插入物主要通过其频率(最高的到最小的)分选，并且次要地，在相等频率的情形中，通过其长度(最长的到最短的)分选。结果，最频繁的且最长的插入物限定第一“组”，并且设置“组频率”与插入物的频率相等。然后，通过配对Needleman-Wunsch算法，尝试将分选的列表中的每个剩余的插入物添加到组中。如果比对中错配、插入或缺失的数目不超过阈值2，那么将所述插入物添加到组中，并且因此，所述插入物的频率添加到总组频率中。添加到组中的插入物在使用时标记，并且不进行进一步的处理。如果插入物序列不能添加到现存的组中，那么使用该插入物产生具有相应的插入物频率的新组，并且因此将其标记设定为“使用的”。当每个插入物序列用于形成新组或可以包含在现存的组中时，完成迭代。毕竟，由核苷酸构成的分组的插入物翻译成肽序列(肽文库)。该分析的结果是“分组的插入物”及其相对应的频率的列表，所述频率说明每个插入物测序的读数的数目。
[0104] 实施例8：基序产生和标准化：
[0105] 基于特有的肽的列表，如下文所述产生包含所有可能的氨基酸模式的文库。长度为3的每种可能的氨基酸模式(例如“ABC”)从肽中提出，并且与其反向模式(例如“CBA”)一起加入到包含所有可能的模式的通用基序文库中。将该高度冗余的基序文库分选，并且去除冗余。然后，反复检测文库中的每个基序是否存在于肽文库中。如果就是这样，那么增加基序存在的频率，并且分配到基序文库中的所述基序。这些频率称为“基序计数”。基序产生的结果是两个包含所有存在的3-氨基酸模式(基序)及其相应的基序计数的二维阵列，如上文详细所述，所述基序计数是在滤除、分组和翻译读数时关于导致相应的基序的测序读数数目的量度。
[0106] 最后，利用下式，将每种样品的基序计数标准化：
[0107] Vi＝102ni/∑jnj
[0108] 其中ni是包含基序i的读数的数目。因此，vi表示在样品中包含基序i的读数(或肽)以％表示的频率。P-值或未标准化的基序计数用费舍尔精确检验(Fisher’s exact test)计算。
[0109] 实施例9：在大鼠中使用CSF取样4轮体内选择后的三肽基序击中：
[0110] 本发明包括用于鉴定一种或多种能够用于将组合物定位到CSF、脑或相关的血管系统的靶向肽或分子靶标的方法。筛选受试者的流体和器官的X(N)，其中N可以是7，8，9，10，11，12个或更多个残基，随机噬菌体文库产生一些肽基序。在一个实例中，多种克隆(包含下述三肽基序：Phe-Lys-Leu(FKL)，Arg-Gly-Leu(RGL)，Ser-Arg-Gly(SRG)，Tyr-Val-Leu(YVL)，Trp-Gly-Phe(WGF)，Val-Leu-His(VLH)，Leu-Tyr-Val(LYV)，Leu-Trp-Gly(LWG)，Leu-His-Ser(LHS)，His-Ser-Arg(HSR)，Gly-Leu-Trp(GLW)，Gly-Phe-Lys(GFK)，Arg-Leu-Ser(RLS)，Gly-Ser-Val(GSV)，Ser-Val-Ser(SVS)，Leu-Gly-Ser(LGS)，Val-Arg-Phe(VRF)，Ser-Asn-Thr(SNT)，Arg-Phe-Arg(RFR)，Asn-Thr-Arg(NTR)，Leu-Ser-Asn(LSN)，Gly-Phe-Val(GFV)，Phe-Val-Arg(FVR)，Phe-Arg-Leu(FRL)，Trp-Arg-Val(WRV)，Phe-Ser-Leu(FSL)，Val-Phe-Ser(VFS)，Val-Ala-Trp(VAW)，Ser-Leu-Phe(SLF)，Arg-Val-Phe(RVF)，Leu-Phe-Trp(LFW)，Lys-Val-Ala(KVA)，Phe-Trp-Lys(FWK)，Ala-Trp-Arg(AWR)，Val-His-Gly(VHG)，Ser-Val-His(SVH)，His-Gly-Val(HGV)，Arg-Val-Cys(RVC)，Arg-Pro-Gln(RPQ)，Gln-Lys-Ile(QKI)，Pro-Gln-Lys(PQK)，Asn-Gly-Ala(NGA)，Lys-Ile-Asn(KIN)，Ile-Asn-Gly(ING)，Gly-Arg-Pro(GRP)，Gly-Ala-Arg(GAR)，Ala-Arg-Val(ARV)，Leu-Ser-Gly(LSG)，Val-Asp-Ser(VDS)，Ser-Val-Asp(SVD))在CSF和脑中表现出高频率、选择性结合和存在。
[0111] 实施例10：在大鼠中使用CSF取样4轮体内选择后的肽击中
[0112] 总计924次测序(包括短的读数，仅发现一种的读数和没有产生序列的测序)。每种肽的频率与924次总测序运行相关。
[0113]
[0114]
[0115] 实施例11：
[0116] 为了研究CNS中肽介导的药理学作用，我们进行这样的实验，其中，我们将具有Seq.Id.No.8的脑穿梭肽与具有链霉抗生物素蛋白(SA)的BACE1肽抑制剂(二者均被生物素化)以两种不同的比例混合。对一种样品，我们仅使用BACE1肽抑制剂，对于另一种样品，我们使用1∶3比例的BACE1肽抑制剂与具有Seq.Id.No.8的脑穿梭肽，产生具有大部分具有Seq.Id.No.8的脑穿梭肽和单一BACE1肽抑制剂的混合物的缀合的SA复合物级分，以促进脑递送。静脉内注射两种样品，并且确定血液和CSF中的淀粉状蛋白-β肽40(Aβ40)的水平。如预测的，两种样品在血液中都具有Aβ40水平的实质性减少。然而，只有包含具有Seq.Id.No.8的脑穿梭肽与缀合到SA上的BACE1肽抑制剂的混合物的样品在CSF中诱导明显的Aβ40减少(见图7A，灰色线)。该数据表明，具有Seq.Id.No.8的脑穿梭肽能够将大蛋白(SA)转运到CNS中，并且通过SA缀合的BACE1肽抑制剂诱导药理学作用。
[0117] 方法
[0118] 链霉抗生物素蛋白-肽-BACE1抑制剂复合物的功能性通过Aβ(1-40)ELISA按照供应商的流程(Wako，294-64701)进行评估。简言之，将CSF样品在标准稀释剂中稀释(1∶23)，并且在包被了捕获抗体BNT77的96-孔平板中在4℃温育过夜。五个洗涤步骤后，加入HRP--缀合的BA27抗体，并且在4℃温育2小时，然后是五个洗涤步骤。通过在室温在TMB溶液中温育30分钟检测Aβ(1-40)。在用终止液终止颜色显色后，在450nm读取吸光度。在Aβ(1-40)ELISA之前，对血浆样品进行固相提取。将血浆加入到96-孔平板中的0.2％DEA(Sigma)中，并且在室温温育30分钟。在用100％甲醇然后用水洗涤SPE平板(Oasis，186000679)后，将血浆样品加入到SPE平板中，并且去除任何液体。洗涤样品(5％甲醇，然后是30％甲醇)，并且洗脱在NH4OH/90％甲醇中。将洗脱物在恒定N2-流下在55℃干燥99分钟后，将样品在标准稀释剂中重构，并且如上文所示测量Aβ(1-40)。
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