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用于选择性地分离梭菌属细菌的培养基

阅读：638发布：2020-05-08

专利汇可以提供用于选择性地分离梭菌属细菌的培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种培养基，其中多种梭菌属细菌可在同一培养基上选择性地检测且针对每一物种进行辨识。一种用于检测梭菌属细菌的培养基包含(a)环丝氨酸、(b)多粘菌素B、(c)氨基糖苷系抗生素、(d) 牛磺胆酸钠及(e)能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物。，下面是用于选择性地分离梭菌属细菌的培养基专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测梭菌属细菌的培养基的用途，其中所述培养基包含(a)环丝氨酸、(b)多粘菌素B、(c)氨基糖苷系抗生素、(d)牛磺胆酸钠及(e)能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述培养基还包含(f)糖或糖醇，所述糖或糖醇包含选自由甘露醇、果糖及松三糖组成的群组中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述培养基还包含(g)卵磷脂。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述梭菌属细菌选自产气荚膜梭菌、艰难梭菌及产芽孢梭菌的群组。
5.一种用于检测梭菌属细菌的培养基，包含(a)环丝氨酸、(b)多粘菌素B、(c)氨基糖苷系抗生素、(d)牛磺胆酸钠及(e)能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物。
6.根据权利要求5所述的培养基，还包含(f)糖或糖醇，所述糖或糖醇包含选自由甘露醇、果糖及松三糖组成的群组中的一种或多种。
7.根据权利要求5或6所述的培养基，还包含(g)卵磷脂。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的培养基，其中所述梭菌属细菌选自产气荚膜梭菌、艰难梭菌及产芽孢梭菌的群组。
9.一种用于检测梭菌属细菌的方法，包括将分析物接种到如权利要求5到8中任一项所述的培养基中的工序、培养包含在所述分析物中的微生物的工序及检测所述微生物的菌落的工序。

说明书全文

用于选择性地分离梭菌属细菌的培养基

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于选择及分离梭菌属细菌以检测所述细菌的培养基。

背景技术

[0002] 梭菌属细菌是革兰氏阳性专性厌氧孢子形成细菌。在所述细菌中，特别是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，下文中，也被称为“Cp”)或艰难梭菌(Clostridium difficile，下文中，也被称为“Cd”)被称为病原菌。此外，产芽胞梭菌(Clostridium sporogenes，下文中，也被称为“Cs”)是一种非毒素生产者，但用作食品污染的指标。

[0003] Cp是人或动物大肠中的固有细菌，且还广泛分布在土壤、污水、河流、海洋等，并且例如肉、鱼及贝类以及蔬菜等大量食品被Cp污染。此外，当孢子形成且所述孢子通过热处理不会被完全杀死并且还会从熟食或经加工食品中检测到时，Cp会产生作为毒素的肠毒素。因此，Cp经常会导致食物中毒，且从食品卫生及食品安全的角度来看，也强调对Cp的检测(非专利文献第1号及第2号)。

[0004] Cd在医院、老年康复设施等的医院感染中被称为机会性感染细菌，且当通过在住院患者中施用抗生素而导致肠Cd异常生长时，会引起伪膜性结肠炎。近年来，由高毒性Cd引起的大规模感染在欧洲及美国频繁发生，这被视为一个问题(非专利文献第1号及第2号)。

[0005] 作为Cp的选择性分离培养基，已知含有环丝氨酸、多粘菌素B及卡那霉素的胰蛋白示亚硫酸盐环丝氨酸琼脂(Tryptose Sulfite Cycloserine agar，TSC琼脂)等。如果将分析物施加到TSC琼脂，然后进行厌氧培养，则Cp会导致亚硫酸盐还原而形成黑色菌落，且包括Cd在内的大多数其他梭菌属细菌得到抑制(非专利文献第3号及第4号)。

[0006] 此外，作为Cd的选择性分离培养基，环丝氨酸头孢西丁果糖琼脂(Cycloserine Cefoxitin Fructose Agar，CCFA琼脂)等是已知的。如果将分析物施加到CCFA琼脂，然后进行厌氧培养，则Cd会形成粗糙型菌落，但大多数肠道细菌等的生长被环丝氨酸及头孢西丁抑制(非专利文献第5号)。

[0007] 引文列表

[0008] 非专利文献

[0009] 非专利文献(Non Patent Literature，NPL)1：食品安全法规中的标准分析方法：微生物的分析方法(Standard methods of analysis in food safety regulation:
Analytical Methods for Microorganisms)，2015年，日本食品卫生协会(Japan Food Hygiene Association)，第412到428页，发布于2015年3月31日。

[0010] NPL 2：容易且快速的微生物测试方法指南(Guidebook of Easy and Rapid Microbial Test Methods)，由静伸IGIMI(Shizunobu IGIMI)等人编辑，科技系统有限公司(Technosystem Co.,Ltd.)，第197到198页，发布于2013年11月16日。

[0011] NPL 3：默克TSC琼脂目录(Merck TSC Agar Catalog)(默克微生物手册第12版(12th edition of the Merck Microbiology Manual))。

[0012] http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/TSC-agar,MDA_CHEM-111972[0013] NPL 4：新型细菌培养基学讲座(Shin Saikinbaichigaku Koza)(新细菌培养基(New Bacterial Culture Media))II(第二版)，由坂崎良一(Riichi Sakazaki)编辑，金代舒潘有限公司(Kindai Shuppan Co.,Ltd.)，第48到50页，发布于1990年1月20日。

[0014] NPL 5：BD CCFA目录(BD CCFA Catalog)

[0015] https://www.bdj.co.jp/micro/products/1f3pro00000s7gwy.html发明内容

[0016] 技术问题

[0017] 迄今为止，既没有提供能够在同一培养基上选择性地检测多种梭菌属细菌(例如Cp及Cd)的培养基，也没有明显地提供能够在同一培养基上辨识这两者的培养基，因此需要在适合每一者的培养条件下在培养基中分别进行测试。然而，不管食品分析物及临床分析物的种类如何，快速且可靠地检测所述分析物中易对人体有害的梭菌属细菌(例如Cp或Cd)的存在是重要的。

[0018] 鉴于这种情况，设想本发明提供一种培养基，其中多种梭菌属细菌可在同一培养基上选择性地检测且可对二者进行辨识。

[0019] 问题的解决方案

[0020] 本发明人已努力地继续进行研究，以解决上述问题。结果，本发明人已发现具有特定组成的培养基能够引起多种梭菌属细菌的生长，且每一物种的菌落进一步的外观性质在培养基上是不同的，且完成了本发明。

[0021] 更具体来说，本发明包括以下阐述的各项。

[0022] 项1.一种用于检测梭菌属细菌的培养基的用途，其中所述培养基包含(a)环丝氨酸、(b)多粘菌素B、(c)氨基糖苷系抗生素、(d)牛磺胆酸钠及(e)能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物。

[0023] 项2.根据项1所述的用途，其中所述培养基还包含(f)糖或糖醇，所述糖或糖醇包含选自由甘露醇、果糖及松三糖组成的群组中的一种或多种。

[0024] 项3.根据项1或2所述的用途，其中所述培养基还包含(g)卵磷脂。

[0025] 项4.根据项1到3中任一项所述的用途，其中所述梭菌属细菌选自产气荚膜梭菌、艰难梭菌及产芽孢梭菌的群组。

[0026] 项5.一种用于检测梭菌属细菌的培养基，包含(a)环丝氨酸、(b)多粘菌素B、(c)氨基糖苷系抗生素、(d)牛磺胆酸钠及(e)能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物。

[0027] 项6.根据项5所述的培养基，还包含(f)糖或糖醇，所述糖或糖醇包含选自由甘露醇、果糖及松三糖组成的群组中的一种或多种。

[0028] 项7.根据项5或6所述的培养基，还包含(g)卵磷脂。

[0029] 项8.根据项5到7中任一项所述的培养基，其中所述梭菌属细菌选自产气荚膜梭菌、艰难梭菌及产芽孢梭菌的群组。

[0030] 项9.一种用于检测梭菌属细菌的方法，包括将分析物接种到根据项5到8中任一项所述的培养基中的工序、培养包含在所述分析物中的微生物的工序及检测所述微生物的菌落的工序。

[0031] 本发明的有利效果

[0032] 如果使用根据本发明的培养基，则多种梭菌属细菌可选择性地生长且被清楚地检测及辨识为对于每一物种具有不同外观性质的菌落。因此，在分析物被各种病菌污染的环境中的分析物、其中的食品分析物及其中的临床分析物中，可在同一培养基上容易地检测及辨识多种梭菌属细菌(例如Cp及Cd)。附图说明

[0033] 图1示出根据本发明的培养基上的Cp菌落的照片。

[0034] 图2示出根据本发明的培养基上的Cd菌落的照片。

[0035] 图3示出根据本发明的培养基上的Cd、Cp及Cs菌落的照片。

具体实施方式

[0036] 根据本发明的一种培养基包含(a)环丝氨酸、(b)多粘菌素B、(c)氨基糖苷系抗生素、(d)牛磺胆酸钠及(e)能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物。

[0037] (a)环丝氨酸是一种细胞壁合成抑制剂，且可抑制除梭菌属细菌外的大多数细菌的生长。因此，梭菌属细菌可在不受外来细菌影响的情况下分离。

[0038] 根据本发明的培养基中环丝氨酸的含量优选为1mg/L到1,000mg/L，且更优选为150mg/L到300mg/L，作为使用期间的浓度(下文中，在微生物生长期间，应同样适用)。

[0039] (b)多粘菌素B能抑制革兰氏阴性菌。此外，梭菌属细菌的生长不受影响。

[0040] 根据本发明的培养基中多粘菌素B的含量优选为1mg/L到100mg/L，且更优选为5mg/L到50mg/L，作为使用期间的浓度。

[0041] (c)氨基糖苷系抗生素可抑制除梭菌属细菌外的大多数细菌的生长。氨基糖苷系抗生素的具体实例优选地包括卡那霉素(kanamycin)、庆大霉素(gentamicin)、妥布霉素(tobramycin)及链霉素(streptomycin)。

[0042] 根据本发明的培养基中氨基糖苷系抗生素的含量优选为1mg/L到100mg/L，且更优选为5mg/L到50mg/L，作为使用期间的浓度。

[0043] (d)牛磺胆酸钠(胆汁酸)是促进Cd生长及有利于形成粗糙类型的特征性及清晰菌落的成分。

[0044] 根据本发明的培养基中牛磺胆酸钠的含量优选为0.1g/L到5g/L，且更优选为0.5g/L到2g/L，作为使用期间的浓度。

[0045] (e)使用能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物，以形成梭菌属细菌作为根据色原化合物的经着色菌落。随着梭菌属细菌在培养基上的生长，所述底物被细菌所拥有的磷酸酶水解，经着色色原化合物被释放以对菌落着色。

[0046] 能够释放经着色色原化合物的磷酸酶底物的具体实例包括5-溴-3-吲哚基磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸及5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸。当使用这种底物时，需要通过培养后返回需氧状态而引起所释放的色原化合物的氧化缩合，从而将所述化合物着色。除此之外，磷酸酶底物的具体实例优选地包括1-{2-[4-(二甲氨基)苯甲酰基]苯基}-1H-吲哚-3-基磷酸盐、二钠盐(奥杜尔(Aldol)515-磷酸盐，由生物合成AG公司(Biosynth AG)制造)。当使用所述材料时，不需要所释放的色原化合物的氧化缩合，因此菌落可在厌氧条件下培养期间着色。

[0047] 根据本发明的培养基中磷酸酶底物的含量优选为0.01g/L到0.5g/L，且更优选为0.05g/L到0.15g/L，作为使用期间的浓度。

[0048] 根据本发明的培养基优选地还包含(f)糖或糖醇。这种糖或糖醇优选地包含选自由甘露醇(甘露糖醇)、果糖及松三糖组成的群组中的一种或多种，且甘露醇在这一群组中是更优选的。Cd可引起这种糖或糖醇的同化，因此会促进Cd的生长，且可进一步容易地检测到Cd。此外，Cd菌落周围的培养基的pH通过糖或糖醇被Cd同化而降低，且促进通过由Cd所拥有的酸性磷酸酶来释放经着色色原化合物。此外，Cp及Cs通常不会引起甘露醇、果糖及松三糖的同化。

[0049] 即使培养基不含糖或糖醇，根据本发明的培养基也可引起包括Cd在内的梭菌属细菌的生长，且所述细菌可分别被辨识为具有不同外观性质的菌落(Cp：红色菌落，Cd：无色菌落，Cs：桃色菌落)。然而，当糖或糖醇被并入其中时，糖或糖醇两者都会导致细菌生长为经着色及色调不同的菌落(Cp：红色菌落，Cd：橙色菌落，Cs：桃色菌落)，因此细菌更容易被检测及辨识，且这种情况是优选的。

[0050] 根据本发明的培养基中糖或糖醇的含量优选为1g/L到30g/L，且进一步优选为1g/L到10g/L，作为使用期间的浓度。

[0051] 根据本发明的培养基优选地还包含(g)卵磷脂。因此，卵磷脂被Cp所拥有的卵磷脂酶分解，在Cp菌落周围产生混浊(不透明区)(所谓的蛋黄反应(egg-yolk reaction))，且菌落的可见性及从Cd的辨识得到增强。此外，Cd及Cs二者都不具有卵磷脂酶，因此没有表现出这种混浊。

[0052] 这里，卵磷脂优选为蛋黄卵磷脂。此外，卵磷脂通常是以蛋黄的形式添加到根据本发明的培养基中。

[0053] 根据本发明的培养基中卵磷脂的含量优选为1g/L到20g/L，且更优选为5g/L到10g/L，作为使用期间的浓度。此外，当卵磷脂以蛋黄的形式并入其中时，蛋黄的含量优选为
1质量％到10质量％，且更优选为1质量％到3质量％，作为使用期间的浓度。

[0054] 根据本发明的培养基通常是固体(包括凝胶形式)。因此，根据本发明的培养基优选地包含胶凝剂。这里，胶凝剂意指通过包含水而引起溶胀及胶凝的物质，并起基质的作用以用于成形培养基。

[0055] 胶凝剂通常是聚合物化合物，且可为通常用于培养微生物的固体培养基中的物质，例如粘度提高多糖及吸收性聚合物。其具体实例包括琼脂、瓜尔胶、黄原胶、刺槐豆胶、结冷胶、聚乙烯醇、例如甲基纤维素及乙基纤维素等烷基纤维素、例如羧甲基纤维素及羧乙基纤维素等羧烷基纤维素以及例如羟甲基纤维素及羟乙基纤维素等羟烷基纤维素，且可使用一种或者两种或更多种组合形式的混合物。此外，关于聚合物化合物的量值(平均分子量、聚合程度等)，当化合物用于培养微生物的固体培养基中时，只需要使用一般范围内的化合物。例如，可使用重量平均分子量优选地介于5,000到200,000范围内且皂化程度优选地介于75％到99％、更优选地85％到90％范围内的聚乙烯醇。

[0056] 当胶凝剂用于培养微生物的固体培养基中时，根据本发明的培养基中胶凝剂的含量应调整到一般范围，作为使用期间的浓度。例如，当使用重量平均分子量介于5,000到200,000范围内且皂化程度介于75％到99％范围内的聚乙烯醇时，其含量优选为140g/L到
300g/L，且更优选为160g/L到260g/L作为使用期间的浓度。此外，例如，当使用重量平均分子量介于10,000到1,000,000范围内的琼脂时，其含量优选为5g/L到30g/L，且更优选为
10g/L到20g/L作为使用期间的浓度。通过将含量调整到这种水平，可容易地处理及成形培养基。

[0057] 除了上述成分之外，根据本发明的培养基可任意包含抗菌物质、营养成分、无机盐、任何其他糖类、粘度改进剂及pH调节剂。

[0058] 抗菌物质的具体实例包括聚赖氨酸、硫酸鱼精蛋白、甘氨酸及山梨酸。

[0059] 作为营养成分，例如优选为蛋白胨、动物肉提取物、酵母提取物或鱼肉提取物。

[0060] 无机盐的具体实例包括无机酸金属盐，例如氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁及硫代硫酸钠；以及有机酸金属盐，例如丙酮酸钠、柠檬酸铁铵及柠檬酸钠。

[0061] 任何其他糖类的具体实例包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、纤维二糖及麦芽糖。

[0062] 粘度改进剂的具体实例包括淀粉及其衍生物、透明质酸、丙烯酸衍生物、聚醚及胶原。

[0063] pH调节剂的具体实例包括碳酸钠及碳酸氢钠。

[0064] 此外，除上述物质之外的选择性物质，例如抗生素(例如头孢西丁)或表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS))、吐温(Tween)80及胆盐(例如胆酸钠)在几种情况下会阻止梭菌属细菌的生长，因此优选地实质上不并入根据本发明的培养基中。特别是，头孢西丁优选地实质上不并入其中，因为Cp具有头孢西丁敏感性。这里，表达“实质上不并入其中”意指其含量优选为0.1mg/L或小于0.1mg/L，更优选为0.001mg/L或小于0.001mg/L，且更优选为0mg/L作为使用期间的浓度。

[0065] 此外，根据本发明的培养基通常不同时包含铁离子及亚硫酸根离子。原因是在铁离子及亚硫酸根离子组合存在下，菌落会变成黑色，因此两种菌落变得难以辨识。

[0066] 在根据本发明的培养基中，从梭菌属细菌生长的角度来看，在培养基制备期间的pH优选为6.0到8.0，且更优选为7.0到7.4。

[0067] 根据本发明的培养基的形式不受特别限制，且除了培养基在陪替氏培养皿(petri dish)等中凝固的形式之外，培养基可被制备成片状简单干燥培养基等。

[0068] 片状简单干燥培养基的具体实例包括具有通过层压包含多孔材料的层及包含胶凝剂的层形成的构型的片状培养基，如在WO 97/24432A中所述。在上述情况下，包含胶凝剂的层应被用作根据本发明的培养基。

[0069] 在根据本发明的培养基中，多种梭菌属细菌生长为对于每一物种具有不同外观性质的菌落，且可被清楚地检测及辨识。此外，在根据本发明的培养基中，其多个种类也可从其他细菌中选择性地分离。因此，培养基可优选地用于根据本发明的用于检测梭菌属细菌的方法中，且培养基优选地适用于检测Cp、Cd及Cs的方法，且更优选地适用于检测Cp及Cd的方法。

[0070] 根据本发明的方法包括将分析物接种到根据本发明的培养基中的工序，培养包含在分析物中的微生物的工序，以及检测微生物的菌落的工序。这里，在培养工序中，细菌优选地在33℃到45℃下厌氧培养24小时到48小时。

[0071] 应用于根据本发明的培养基的分析物的具体实例包括易腐食品，例如肉、鱼及贝类、蔬菜及水果；经加工食品及饮料，例如奶酪、乳酸发酵饮料及发酵食品；以及临床分析物，例如粪便、饮用水、淡水、海水及烹饪场所、医院等中的擦拭分析物。此外，也可使用通过在例如硫乙醇酸盐培养基及熟肉培养基等富集培养基中预培养分析物而获得的培养液。

[0072] 实例

[0073] 接下来，将通过实例更详细地阐述本发明，但本发明不限于所述实例。

[0074] (1)制备培养基

[0075] 向970毫升纯水中添加了1升用量的表1所示的组合物成分，将所得混合物温热并在121℃下溶解15分钟，且冷却到约50℃进入基础培养基中，并且对基础培养基进行加热及灭菌。对溶解在纯水中的环丝氨酸及卡那霉素进行过滤并灭菌，然后添加到其中，并充分混合。此外，向其中添加了用二甲基亚砜溶解的奥杜尔(注册商标名)-515磷酸盐(生物合成AG公司)并充分混合(表2)。然后，向其中添加了无菌收集的蛋黄以使最终浓度为3质量％，并充分混合。将所得混合物分配到陪替氏培养皿中，每一者为15mL，并静置直到培养基凝固，以制备根据本发明的培养基。所制备的培养基在厌氧状态下存储两天或更长时间，以减小培养基的表面，然后用于随后阐述的样本测试。

[0076] 表1

[0077] 表1

[0078]

[0079] (pH 7.2±0.2)

[0080] [表2]

[0081] 表2

[0082]

[0083] (pH 7.2±0.2)

[0084] (2)提供菌株

[0085] 在样本菌株中，关于Cp、Cd及Cs，使用在厌氧条件下在羊血琼脂培养基中预培养24小时的材料作为样本细菌。对于其他菌株，使用在需氧条件下在羊血琼脂培养基中预培养24小时的材料作为样本细菌。通过使用铂环将每个样本菌株划线在(1)中制备的培养基上，且在35℃下厌氧培养48小时后，确认了菌落的生长及外观性质。

[0086] 结果示于表3及图1到图3中。

[0087] [表3]

[0088] 表3

[0089]

[0090] 在样本菌株中，只有Cp、Cd及Cs能够在根据本发明的培养基上生长。此外，如图1所示，Cp生长为在菌落周围具有不透明区的清晰红色菌落，且如图2所示，Cd被检测为在菌落周围没有不透明区的橙色菌落，且如图3所示，Cs被检测为在菌落周围没有不透明区的桃色金属色调菌落，并且所述菌株能够在具有相同组成的培养基上被辨识为具有不同外观性质的菌落。此外，同样地当培养在同一培养基上共存的多种梭菌属细菌的分析物时，所述细菌能够被辨识为具有不同外观性质的菌落。即使利用能够释放并入培养基中的经着色色原化合物的一种磷酸酶底物，引起可由Cd、Cp及Cs菌落辨识的色调差异的原因仍被认为是由两种菌株所拥有的磷酸酶的种类差异引起的。

[0091] 此外，当除了表1中的组合物中只排除甘露醇之外以类似的方式提供Cp及Cd作为样本时，Cp生长为红色菌落，Cd生长为无色菌落，且Cs生长为桃色菌落。

[0092] 工业适用性

[0093] 本发明提供一种培养基，其中多种梭菌属细菌能够选择性地生长，且能够被清楚地检测及辨识为具有不同外观性质的菌落。因此，在分析物被各种细菌污染的环境中的分析物、其中的食品分析物及其中的临床分析物中的梭菌属细菌可在同一培养基上容易地检测及辨识，且因此实现对人体有害的病原菌的快速及简单检测，因此这种培养基是有用的。

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