技术领域
[0001] 本
发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的定量检测试剂盒。
背景技术
[0002] 胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)是能与胰岛素样生长因子(IGFs)结合的调节蛋白，主要调节IGFs与其受体的结合能
力，影响胰岛素样生长因子受体(IGFR)下游
信号转导通路中信号强度，从而调控靶细胞的生长和增殖。越来越多的研究表明，IGFBP-3可直接对包括
乳腺癌细胞、
肺癌细胞、大肠癌细胞等多种细胞具有明显的促进凋亡,抑制增殖作用
[0003] 目前，胰岛素样生长因子结合蛋白3的检测，早期使用的方法多为酶联免疫法，其原理是将一个
抗体结合到某种固相载体表面，同时使用酶标记另外一个抗体，在测定时固相抗体、待测
抗原、酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物，加入酶作用的显色底物，在一定的OD值下测定吸光度，吸光度和待测抗原含量成正比，利用标准曲线计算待测抗原的含量。如公开号CN107991492的中国
专利《一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3的定量检测试剂盒及其非诊断目的的检测方法》采用酶联免疫法定量检测胰岛素样生长因子结合蛋白-3。该方法自动化程度低、易受环境影响，灵敏度较低。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的定量检测试剂盒。该定量检测试剂盒灵敏度高、精
密度高、准确性好。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 本发明提供了一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的定量检测试剂盒，包括：包被有IGFBP-3单克隆抗体的磁微粒，酶标记的IGFBP-3单克隆抗体，样品稀释液；
[0007] 所述样品稀释液为
盐酸、
柠檬酸、苹果酸、
磷酸、磺基
水杨酸中的任一种。
[0008] 本发明采用双抗体夹心法的原理，即磁微粒包被抗体、待测抗原、酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物，加入酶促
化学发光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体会到基态时便发出
光子，形成发光反应通过光量子阅读系统记录光子
能量，并通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。
[0009] 本发明采用特定的样品稀释液，提高了试剂盒的临床符合率。在本发明样品稀释液的作用下，样本中的IGF-1、ALS、IGFBP-3发生解离，有效提高了IGFBP-3抗体和抗原的结合能力，从而提高了临床符合率。
[0010] 一些实施方案中，所述样品稀释液为一水合柠檬酸水溶液。一些具体
实施例中，样品稀释液为
质量分数为1％的一水合柠檬酸水溶液。
[0011] 一些实施方案中，所述磁微粒的粒径1.00～3μm，磁含量为40％。
[0012] 一些实施方案中，所述酶标记的IGFBP-3单克隆抗体为辣根过
氧化物酶标记的IGFBP-3单克隆抗体。
[0013] 一些实施方案中，所述辣根过氧化物酶标记的IGFBP-3单克隆抗体由辣根过氧化物酶、IGFBP-3单克隆抗体和酶稀释液制成，所述酶稀释液由缓冲液、保护蛋白和
防腐剂组成，
牛血清
白蛋白组成，所述酶稀释液的pH为6.0～8.0。其中：
[0014] 所述缓冲液为Bis-Tris、Tris-Nacl、PBS中的任一种。
[0015] 所述保护蛋白为牛血清白蛋白、牛血清、
酪蛋白中的一种或两种。
[0016] 所述防腐剂为ProClin300、BRONIDOX(5-溴-5硝基-1,3-二恶烷)、MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3-
酮盐酸盐)、NaN3(叠氮化钠)中的任意一种或多种。
[0017] 一些实施方案中，所述试剂盒还包括化学发光底物，所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺。
[0018] 一些实施方案中，本发明试剂盒还包括IGFBP-3抗原校准品，所述IGFBP-3抗原校准品由IGFBP-3抗原和校准品稀释液制成，所述校准品稀释液为含2％牛血清白蛋白的Tris-NaCl缓冲液。
[0019] 进一步的，所述IGFBP-3抗原校准品的浓度为0～16μg/mL。
[0020] 本发明提供的胰岛素样生长因子结合蛋白3的定量检测试剂盒包括：包被有IGFBP-3单克隆抗体的磁微粒，酶标记的IGFBP-3单克隆抗体，样品稀释液所述样品稀释液为盐酸、柠檬酸、苹果酸、磷酸、磺基水杨酸中的任一种。本发明试剂盒采用双抗体夹心法结合特定的样品稀释液，大幅提高了灵敏度，提高了阳性样本的检出率，灵敏度低至0.01μg/ml，并将检测时间缩短至18min。
附图说明
[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或
现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0022] 图1示本发明试剂盒与西
门子试剂盒的相关性分析图；
[0023] 图2示对照试剂盒1与西门子试剂盒的相关性分析图。
具体实施方式
[0024] 本发明公开了一种胰岛素样生长因子结合蛋白3的定量检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0025] 对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种
修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
[0026] 本发明提供的一种胰岛素样生长因子结合蛋白3定量检测试剂盒的检测试验中，本发明所述试剂盒配合安图
生物工程股份有限公司的全自动检测仪器及配套耗材(清洗液、化学发光底物)进行检测。
[0027] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0028] 实施例1本发明试剂盒的制备
[0029] 1、制备包被有IGFBP-3单克隆抗体的磁微粒
[0030] 将粒径1.00～3μm，磁含量为40％的的磁微粒原液充分混匀后，取出30μl，加入300μl的
磷酸盐缓冲液清洗5次，每次清洗5min，清洗时需使用磁
铁将磁微粒
吸附固定弃去上清；洗涤后，加入100μl
醋酸钠缓冲液溶解的EDC(
碳化亚二胺)、NHS(琥珀酰亚胺酯)活化剂，活化剂浓度20mg/ml，混匀震荡活化1h；活化结束后加入300μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，每次洗涤5min，然后加入0.3μg/人份的胰岛素样生长因子结合蛋白3抗体，混匀震荡包被2h，包被结束后，加入30μl含有2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭4次，最后使用含有2％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液定容至3ml，2～8℃保存。
[0031] 2、制备酶标记的IGFBP-3单克隆抗体
[0032] 向配制好的Tris-Nacl缓冲液中加入2％牛血清白蛋白，混合后即为酶稀释液，将HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗体按照1:5000的比例加入混匀，2～8℃保存。
[0033] 3、制备IGFBP-3抗原校准品
[0034] 向配制好的Tris-Nacl缓冲液中加入2％牛血清白蛋白，混合均匀即为校准品稀释液，用校准品稀释液将IGFBP-3抗原稀释成6个梯度，0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL，分装成1ml/瓶，2～8℃保存。
[0035] 4、制备样品稀释液
[0036] 将一水合柠檬酸按照1％的比例加入纯化水，混合后即为样品稀释液，2～8℃保存。
[0037] 实施例2本发明试剂盒的检测方法
[0038] 1、采用正确医用技术收集
全血样本，离心(转速：3500r/min，时间：10min)，提取血清/
血浆用于检测。
[0039] 2、在反应容器(以下简称“孔”)中依次加入校准品和样本，取20μl校准品/样本+380μl样品稀释液，充分混匀后，加入10μL/孔用于检测。
[0040] 3、每孔分别加入磁微粒混悬液20μL。
[0041] 4、每孔分别加入酶结合物100μL。
[0042] 5、混匀后，37℃温育15分钟。
[0043] 6、清洗液洗涤5次。
[0044] 7、每孔加入化学发光底物100μL，混匀后检测发光值。
[0045] 8、结果计算：本试剂盒推荐采用四参数拟合方式，以校准品浓度值为x轴，以校准品发光值的log值为y轴建立定标曲线。根据待测样本的发光值回算相应的浓度值。仪器自动
操作系统可通过存储的定标曲线以及样本测试得到的发光值自动计算样本测试结果。
[0046] 实施例3本发明试剂盒的性能测试
[0047] 1、分析灵敏度检测
[0048] 根据《EP17A—确定检出限制和定量限值的协议》进行分析灵敏度考核，准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个结果非负数的数据，若不足60个，需要按要求实验并补足60个，计算分析灵敏度。
[0049] 表1本发明试剂盒灵敏度检测
[0050]
[0051]
[0052] 从表1结果可以看出，本发明试剂盒的分析灵敏度为0.02μg/ml，远低于现有产品0.1μg/ml，具有较高的分析灵敏度。
[0053] 2、精密度检测
[0054] 根据《EP05A2-定量检测方法的精密度评估》进行精密度评估，取两批试剂使用配套高/中/低值质控品，各测20次计算测定浓度的变异，测定结果如表2所示。
[0055] 表2本发明试剂盒精密性检测结果
[0056]
[0057]
[0058] 表2数据结果表明：本发明试剂盒的变异系数均小于5％，精密度良好。
[0059] 3、准确度检测
[0060] 按照CLSI标准EP15-A2通过测定标准物质评估准确度。将NIBSC标准物质93/560梯度稀释至10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml/0.5μg/ml，两批试剂盒分别复孔测定，计算偏差，测定结果如表3所示。
[0061] 表3本发明试剂盒准确度检测结果
[0062]
[0063] 由表3结果表明，本发明试剂盒的检测结果和标准物质的偏差均小于5％，准确度较高。
[0064] 4、相关性分析
[0065] 目前国内外用于胰岛素样生长因子结合蛋白3全自动检测的试剂盒仅有西门子，其市场认可度高。设置对照试剂盒1：样本稀释液为含0.1％ProClin300的生理盐水，试剂盒中其他组分与本发明实施例1的试剂盒相同。
[0066] 采用本发明试剂盒、对照试剂盒1和西门子试剂盒同时检测50例不同年龄段的样本，年龄8个月～20岁，男女各25例，将本发明试剂盒、对照试剂盒1分别与西门子试剂盒的检测结果进行相关性分析，结果见表4～5、图1～2。
[0067] 表4本发明试剂盒与西门子试剂盒的相关性分析结果
[0068]
[0069] 表5对照试剂盒1与西门子试剂盒的相关性分析结果
[0070]
[0071] 由表4～5和图1～2可知，本发明试剂盒的临床符合率及临床相关性和西门子高度一致。符合率为100％，采用其他样品稀释液的对照试剂盒1与西门子符合率为88，结果表明，本发明试剂盒采用特定的样本稀释液，临床相关性显著提升，临床符合率从88％提高至100％。
[0072] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
