技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，具体而言，涉及一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法。
背景技术
[0002] 目前，
预防肺炎链球菌感染的上市
疫苗有23价肺炎球菌多糖疫苗和7价/13价肺炎球菌多糖结合疫苗。肺炎链球菌荚膜多糖(pneumococcal capsular poly-saccharides，PnPs)是疫苗的主要有效成分，研究表明，PnPs的分子量大小直接影响多糖疫苗的免疫原性效果；而在结合疫苗中，PnPs作为疫苗的中间品也是质控的重要指标。
[0003] 截止2019年1月，国内有一家23价肺炎球菌多糖疫苗已上市，多个疫苗厂家正在研发肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖结合疫苗，但《中国药典》三部(2015版)尚未收录23价肺炎球菌多糖疫苗的制造和检定规程，《欧洲药典》7.0版收录的该疫苗制检规程规定使用凝胶排阻色谱法(size-exclusionchromatography，SEC)测定各型PnPs样品在色谱柱中的分配系数(KD)，并规定了各单价多糖的KD限值,但这种方法存在耗时、耗
力、重复性差等缺点。在分子量测定方面，随着高效液相色谱技术日渐成熟，采用高效凝胶排阻色谱-示差折光法(high performance size-exclusion chromatogra-phy withrefractive index，HPSEC-RI)检测与待测样品性质相似的多糖分子量标准品，并以此绘制标准品分子量随样品洗脱时间或体积变化的
质量分布曲线，记录待测样品的相应洗脱指标，通过质量分布曲线测算其分子量。
[0004] 经过大量实验证明，HPSEC-RI法在检测PnPs时，有些血清型PnPs稀释浓度越低，检测分子量结果越大，直到稀释至一定浓度后检测结果不再随浓度而变化。而PnPs的浓度和
粘度有正相关的关系，统计所有PnPs的粘度和分子量的关系，得到溶液的粘度值在1.0-1.3cp之间时检测的分子量结果趋于统一。传统的HPSEC-RI法在检测PnPs时未考虑粘度因素的影响，存在较大误差，本发明优化了流动相，在样品稀释的过程中增加了粘度控制，从而提高HPSEC-RI法在检测PnPs的准确性。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种检测肺炎球菌荚膜多糖分子量的方法。
[0006] 处理后的样品用HPSEC-RI法检测肺炎链球菌荚膜多糖(pneumococcal capsular poly-saccharides，PnPs)分子量更准确的方法。
[0007] 本发明所述的检测方法，包括如下步骤：
[0008] (1)配制0.1mol/L
磷酸盐缓冲溶液作为流动相；
[0009] (2)精确称取PnPs加入到流动相后溶解，用流动相稀释，过滤后作为供试品溶液；
[0010] (3)选取多个分子量不同的葡聚糖标准品，用流动相分别稀释至1mg/ml，进样，用液相色谱分析，建立分子量标准曲线和回归方程；
[0011] (4)在相同试验条件下检测并记录供试品，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的分子量。
[0012] 其中，流动相为磷酸盐缓冲溶液，以配制1000ml总液量为例，配方为:称取0.4g十二
水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g
氯化钠,补加去离子水水至1000g。
[0013] 其中，所述液相色谱分析所用的色谱柱为
硅胶色谱柱，色谱柱为日本TOSOH株式会社，TSK G5000PWXL(7.8mm ID×30cm)分析柱，HPSEC-RI检测条件为：监测器
温度30℃，流速0.5ml/min，将分子量标准品分别用流动相配置成浓度为1mg/ml的溶液，各取100μl溶液进样。
[0014] 其中，针对不同血清型PnPs不同的粘度用流动相稀释至1mg/ml-0.02mg/ml，使溶液的粘度值在1.0-1.3cp之间，再进行高效凝胶排阻色谱-示差折光法(HPSEC-RI)检测其分子量大小。
[0015] 其中，此方法适用于所有肺炎链球菌PnPs。
[0016] 其中，肺炎链球菌血清型为1型、2型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和
33F型等粘度相对较小PnPs稀释至0.2mg/ml～2mg/ml，检测其粘度，应在1.0-1.3cp之间。
[0017] 其中，肺炎链球菌血清型3型PnPs稀释至0.05mg/ml～0.2mg/ml，检测其粘度，应在1.0-1.3cp之间。
[0018] 优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
[0019] (1)配制0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液作为流动相；
[0020] (2)精确称取PnPs，加入流动相溶解12-24小时，用流动相稀释，多糖浓度为0.2mg/ml，3型应稀释至0.05mg/ml，摇匀后过滤，检测粘度应在1.0-1.3CP之间，即为供试品溶液；
[0021] (3)选取多个分子量不同的葡聚糖标准品，用流动相分别稀释至1mg/ml，进样，用液相色谱分析，建立分子量标准曲线和回归方程；所述液相色谱检测条件为：试验温度30℃，系统流动相0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.5ml/min；
[0022] (4)在相同试验条件下检测并记录供试品，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的分子量。
[0023] 进一步优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
[0024] (1)配制流动相
[0025] 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液，以配制1000ml总液量为例，配方为:称取0.4g十二水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g氯化钠,补加去离子水水至1000g。
[0026] (2)建立标准曲线和回归方程
[0027] 将分子量标准品用流动相配置成浓度为0.2mg/ml的溶液，待测样品分别用流动相配置成相应浓度浓度各取100μl溶液进样。
[0028] HPSEC-RI检测条件为：试验温度30℃，系统流动相0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.5ml/min。
[0029] 在线采集样品检测过程中的示差折光检测
信号，用Empower 3
软件记录各样品在RI检测器上的峰尖保留时间。通过HPSEC-RI检测一系列已知分子量的标准品，以峰尖保留时间为横坐标，各标准品Mp的对数值(lgMp)为纵坐标建立分子量分布标准曲线及回归方程。
[0030] (3)肺炎链球菌荚膜多糖稀释
[0031] 用稀释液溶解待测PnPs12-24小时，混匀后用流动相稀释多糖溶液至多糖浓度为0.2mg/ml，3型用流动相稀释至0.05mg/ml。用
粘度计检测粘度，25℃粘度应在1.0-1.3CP之间。
[0032] (4)分子量检测
[0033] HPSEC-RI检测条件为：试验温度30℃，系统流动相0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速0.5ml/min。与标准品相同试验条件下检测并记录待测样品的峰尖保留时间，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的lgMp，并进一步获得其相应的分子量。
[0034] 本发明的检测方法的有益效果，主要体现在：现有的HPSEC-RI法在检测PnPs时未考虑粘度因素的影响，存在较大误差，本发明优化了流动相，在样品稀释的过程中增加了粘度控制，从而提高HPSEC-RI法在检测PnPs的准确性。
[0035] 本发明的检测方法相对于现有方法而言，还具有具有精确性高，重复性好，
稳定性好等特点。
附图说明
[0036] 图1为
实施例1中分子量标准品标准曲线图。
[0037] 图2为实施例1中稀释至不同浓度的血清型8型PnPs GPC图。
[0038] 图3为试验例1中稀释至不同浓度的血清型3型PnPs GPC图。
具体实施方式
[0039] 通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
[0040] 以下实施例中涉及的材料：
[0041] 肺炎链球菌荚膜多糖
[0042] 肺炎链球菌1型、2型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型共24个血清型的PnPs。
[0044] 粘度计、
电子天平、高相液相色谱仪、稀释液及流动相、葡聚糖标准品。
[0045] 实施例1：
[0046] 1)仪器及试剂
[0047] JA2003型电子天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DV2T型粘度计购自BROOK FIELD公司，
转子型号:CPA-40Z；e2695高效液相系统
泵、Waters 2414示差折光检测器购自Waters公司；高效液相层析柱为TSK PWXL Guard保护柱和TSK G5000PWXL(7.8mmID×30cm)分析柱购自日本TOSOH株式会社。
[0048] 试剂：十二水磷酸二氢钠、二水磷酸氢二钠、氯化钠、葡聚糖标准品购自Waters公司和American Polymer Standards Corporation公司。
[0049] 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液配制:称取0.4g十二水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g氯化钠,补加去离子水水至1000g。
[0050] 2)8型血清型PnPs分析样品的制备
[0051] 精确称取8型血清型PnPs 50mg，加入流动相10ml溶解18小时，样品用流动相稀释至2mg/ml、0.4mg/ml和0.08mg/ml，具体浓度见表1；摇匀后过滤，检测粘度在1.0-1.3CP之间，为供试品溶液；
[0052] 3)检测肺炎链球菌8型血清型PnPs
[0053] 检测并记录待测样品的峰尖保留时间，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的lgMp，并进一步获得其相应的分子量(Mp)。2mg/ml的PnPs样品粘度为1.50CP，超出粘度检测范围，可以看到分子量(Mp)结果偏小，舍去不用。0.4mg/ml和0.08mg/ml的PnPs样品粘度在1.0-1.3CP之间，将两个结果平均后分子量(Mp)为1488KD，见表1。8型PnPs GPC图见图3。
[0054] 表1检测血清型19A型PnPs粘度和Mp值结果
[0055]
[0056] 实施例2：
[0057] 1)仪器及试剂
[0058] JA2003型电子天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DV2T型粘度计购自BROOK FIELD公司，转子型号:CPA-40Z；e2695高效液相系统泵、Waters 2414示差折光检测器购自Waters公司；高效液相层析柱为TSK PWXL Guard保护柱和TSK G5000PWXL(7.8mmID×30cm)分析柱购自日本TOSOH株式会社。
[0059] 试剂：十二水磷酸二氢钠、二水磷酸氢二钠、氯化钠、葡聚糖标准品购自Waters公司和American Polymer Standards Corporation公司。
[0060] 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液配制:称取0.4g十二水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g氯化钠,补加去离子水水至1000g。
[0061] 2)33F型血清型PnPs分析样品的制备
[0062] 精确称取33F型血清型PnPs 50mg，加入流动相10ml溶解16小时，样品用流动相稀释至0.2mg/ml，检测粘度在1.0-1.3CP之间，为供试品溶液；
[0063] 3)检测肺炎链球菌33F型血清型PnPs
[0064] 检测并记录待测样品的峰尖保留时间，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的lgMp，并进一步获得其相应的分子量(Mp)。连续检测2次，将两个结果平均后分子量(Mp)为2766KD，见表2。
[0065] 表2检测血清型33F型PnPs粘度和Mp值结果
[0066]
[0067] 试验例1：比较实验
[0068] 将本发明的检测方法和现有的方法进行比较，通过实验数据证明本发明的优越性：现有的HPSEC-RI法在检测PnPs分子量时样品上样浓度是固定的，且不同实验室检测时所用的浓度并不完全相同，但不同血清型PnPs在粘度上差异很大，相同血清型PnPs，不同批次也有一定差异，实验中发现粘度对HPSEC-RI法检测分子量有较大影响，本发明在样品稀释的过程中增加了粘度控制，从而提高HPSEC-RI法在检测PnPs的准确性。
[0069] 此试验例用3型血清型PnPs不同上样浓度模拟现有的HPSEC-RI法检测，与本发明增加了粘度控制的结果做对比。在0.25-2.0mg/ml区间，粘度值为1.45-5.54CP，HPSEC-RI法在检测PnPs分子量Mp值结果差异大，RSD值为23.01％；在0.03125-0.125mg/ml区间，粘度值在控制区间内(1.0-1.3CP),HPSEC-RI法在检测PnPs分子量Mp值结果无明显差异，RSD值为1.19％。见表5。本发明在样品稀释的过程中增加了粘度控制，从而提高HPSEC-RI法在检测PnPs的准确性。
[0070] 1)仪器及试剂
[0071] JA2003型电子天平购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DV2T型粘度计购自BROOK FIELD公司，转子型号:CPA-40Z；e2695高效液相系统泵、Waters 2414示差折光检测器购自Waters公司；高效液相层析柱为TSK PWXL Guard保护柱和TSK G5000PWXL(7.8mmID×30cm)分析柱购自日本TOSOH株式会社。
[0072] 试剂：十二水磷酸二氢钠、二水磷酸氢二钠、氯化钠、葡聚糖标准品购自Waters公司和American Polymer Standards Corporation公司。
[0073] 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液配制:称取0.4g十二水磷酸二氢钠,6.0g二水磷酸氢二钠,9.0g氯化钠,补加去离子水水至1000g。
[0074] 2)3型血清型PnPs分析样品的制备
[0075] 精确称取3型血清型PnPs 50mg，加入流动相10ml溶解18小时，样品用流动相从5mg/ml稀释至0.03125mg/ml，具体浓度见表3；然后再将样品用流动相稀释至0.05mg/ml，取
10份，分别记作3型-样1至3型-样10，见表4；摇匀后过滤，检测粘度应在1.0-1.3CP之间，即为供试品溶液；
[0076] 3)检测肺炎链球菌3型血清型PnPs
[0077] 检测并记录待测样品的峰尖保留时间，应用已建立的标准曲线及回归方程计算样品的lgMp，并进一步获得其相应的分子量。样品分子量(Mp)不同浓度之间差异很大，浓度降低至0.125mg/ml以下检测Mp无明显差异，对应粘度为1.26CP，见表3。
[0079] 对3型同一批次10个不同的样品进行检查，结果显示：该方法检测浓度为0.05mg/ml血清型3型PnPs，粘度在1.20至1.23之间，分子量Mp结果差异较小，RSD值为1.29％，精密度较好，见表4。
[0080] 表3检测血清型3型PnPs粘度和Mp值结果
[0081]
[0082] 表4检测0.05mg/ml血清型3型PnPs粘度和Mp值结果
[0083]
[0084]
[0085] 试验例2：筛选实验
[0086] 发明的核心点，即本发明主要改进的地方为:通过稀释将检测样品的粘度控制在一定范围，使检测结果更准确。通过检测24个血清型PnPs不同粘度的Mp值，进行筛选，得到本发明最优选的检测方法，将检测样品的粘度进行控制在1.0-1.3CP之间，结果精确性高，重复性好，稳定性好。
[0087] 以1型PnPs、3型PnPs和19A型PnPs为例，三个血清型的多糖样品的粘度均随浓度的下降而降低，粘度在1.3以上时Mp值随粘度变小而增大，粘度在1.0-1.3CP之间则无明显变化。计算其精密度，1型PnPs粘度在1.0-1.3之间浓的度区间为0.03125-0.5mg/ml，其RSD值为1.84％；3型PnPs粘度在1.0-1.3之间的浓度区间为0.03125-0.125mg/ml，其RSD值为1.19％；19A型PnPs粘度在1.0-1.3之间的浓度区间为0.03125-0.5mg/ml，其RSD值为
4.85％,见表5。所以，将检测样品的粘度进行控制在1.0-1.3之间为最优选的检测方法。
[0088] 表5 1型PnPs、3型PnPs和19A型PnPs粘度和Mp值结果
[0089]
[0090]
