技术领域
[0001] 本
发明涉及一种染色方法，尤其涉及一种细胞核DNA染色方法。
背景技术
[0002] 自1954年，Van Duijn发现一种专
门用于染小鼠肝肾细胞核的
硫堇-亚
硫酸盐
试剂以来，此项技术已被广泛应用于细胞核DNA含量的测定。Feulgen染色是显示细胞核DNA较具特异性的一种染色法，DNA双链中的特定
碱基可被酸性物质
水解断开，暴露出游离
醛基(RNA无此特性)，游离的醛基与细胞DNA染色液中的蓝紫色中间产物结合形成蓝紫色的细胞核，即DNA在细胞核内的分布
位置及准确含量。由于传统方法染色过程繁琐，染色时间长，极易受组织固定液种类、酸解时间和
温度的影响，直接影响着细胞DNA含量测定值的准确程度。传统方法使用的
盐酸为易制毒化学品，管制严格不易购买，且挥发性强不利于人体健康。传统细胞DNA染色液配制复杂，过程中需要煮沸，有效贮存期约为2-5 天，如此短的保质期妨碍了这种试剂的存储，也妨碍了它的商业应用。
发明内容
[0003] 为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种细胞核DNA染色方法。
[0004] 为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种细胞核DNA染色方法，由以下步骤组成：
[0005] I、配制AF固定液、水解液、漂洗液以及伊红染色液；
[0006] II、配制细胞DNA染色液；细胞DNA染色液由体积比为1∶1的细胞DNA染色液 A和细胞DNA染色液B组成；其中，细胞DNA染色液A包括
质量份为0.1～1份的硫堇、30～50份的醇、50～70份的酸性过滤水，细胞DNA染色液B包括质量份为 30～50份的醇、1～3份的亚
硫酸盐、50～70份的蒸馏水；
[0007] III、将病理样本放入AF固定液中固定10～15min；流水清洗后，放入水解液中水解15～30min；流水清洗后，放入细胞DNA染色液中染色20～40min；流水清洗后，放入漂洗液中漂洗5-10min；50％
乙醇、75％乙醇、95％乙醇逐级脱水，放入伊红染色液1～3min，无水乙醇脱色，晾干、封片。
[0008] 进一步地，AF固定液由体积比为1∶9的甲醛溶液和95％乙醇组成。
[0009] 进一步地，水解液由质量份为50～150份的酸液和20～50份的超纯水组成；其中酸液由固体盐酸、
磷酸中的一种或两种组成。
[0010] 进一步地，固体盐酸由质量分数为50％的水合肼、36％的盐酸和14％的水组成，烘干制得；磷酸为市售商品。
[0011] 进一步地，漂洗液由质量份为0.5～1份的亚硫酸盐和100份的酸性过滤水组成；其中亚硫酸盐包括质量份为0～1份的亚硫酸氢钠和0～1份的偏重亚硫酸钠。
[0012] 进一步地，酸性过滤水为25℃条件下pH＜3的水。
[0013] 进一步地，伊红染色液包括质量份为0.1～1份的曙红Y和100份的95％乙醇。
[0014] 进一步地，步骤II中醇为乙醇、乙二醇、异丙醇和叔丁醇中的一种或多种按任意比组成。
[0015] 进一步地，步骤II中亚硫酸盐为偏重亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或亚硫酸钠。
[0016] 硫堇，易溶于热水，开始是蓝色，后呈紫色，水溶液加盐酸后变得更蓝，与氢
氧化钠作用产生红棕色沉淀，与硫酸产生黄绿色溶液，稀释时变蓝色，更稀时呈紫色，并有显著的因光异色作用。最大吸收
波长(水中)602.5nm。也是染色剂。如细胞核的染色，类
淀粉蛋白、嗜碱性细胞和黏蛋白染色，活体染色。
[0017] 亚硫酸盐是一种含氧酸盐，亚硫酸盐有很多实际用途，例亚硫酸氢
钙大量用于造纸工业，即用它溶解木质制造纸浆，亚硫酸钠和亚硫酸氢钠大量用于染料工业，也用作漂白织物时的去氯剂。
[0018] 固体盐酸为粉末制剂的固体酸类，可以替代盐酸的常规
酸洗工艺，主要用于清除各种
钢铁、
不锈钢、
铜、
铝等金属零件及其设备表面的锈、氧化皮、水垢、灰垢等污物，特别是钢铁热扎、冷扎过程中生成的高温难清除氧化皮。
[0019] 水合肼，工业上一般应用含量为40％--80％的水合肼水溶液或肼的盐。水合肼液体以二聚物形式存在，与水和乙醇混溶，不溶于乙醚和氯仿；它能侵蚀玻璃、
橡胶、皮革、软木等，在高温下分解成N2、NH3和H2；水合肼还原性极强，与卤素、HN03、KMn04等激烈反应，在空气中可吸收C02，产生烟雾。水合肼及其衍
生物产品在许多工业应用中得到广泛的使用，用作还原剂、抗氧剂，用于制取医药、发泡剂等。
[0020] AF固定液，用于组织化学中细胞或
组织切片的固定，既有脱水作用，也有交联作用。使用时可以防止病理样本被冲洗掉。
[0021] 水解液用于改变细胞膜的通透性，利于染料进入细胞内，并且使染色质中的DNA和
蛋白质分离，有利于DNA染色。
[0022] 细胞DNA染色液用于将细胞核内DNA染色。
[0023] 漂洗液用于将多余的细胞DNA染色液洗掉，便于后续观察。
[0024] 伊红染色液将样本复染，使
细胞质染色呈红色，便于镜检观察。
[0025] 本发明染色时间大大缩短；水解液由非易制毒化学品组成，原料有保证，且不挥发、
腐蚀性弱，属于环境友好型试剂；AF固定液较以往的Bohm- Sprenger固定液，不含乙酸，对人体刺激小；细胞DNA染色液配制简单，无需加热煮沸，有效期长于18个月，即用型，适于商业推广。
附图说明
[0026] 图1为本发明的整体流程示意图。
[0028] 图3为实施例二的染色效果图。
[0029] 图4为实施例三的染色效果图。
[0030] 图5为实施例四的染色效果图。
具体实施方式
[0031] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
[0032] 如图1所示的一种细胞核DNA染色方法，由以下步骤组成：
[0033] I、配制AF固定液、水解液、漂洗液以及伊红染色液；
[0034] II、配制细胞DNA染色液；细胞DNA染色液由体积比为1∶1的细胞DNA染色液 A和细胞DNA染色液B组成；其中，细胞DNA染色液A包括质量份为0.1～1份的硫堇、30～50份的醇、50～70份的酸性过滤水，细胞DNA染色液B包括质量份为 30～50份的醇、1～3份的亚硫酸盐、50～70份的蒸馏水；其中，醇为乙醇、乙二醇、异丙醇和叔丁醇中的一种或多种按任意比组成。亚硫酸盐为偏重亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或亚硫酸钠。
[0035] III、将病理样本放入AF固定液中固定10～15min；流水清洗后，放入水解液中水解15～30min；流水清洗后，放入细胞DNA染色液中染色20～40min；流水清洗后，放入漂洗液中漂洗5-10min；50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇逐级脱水，放入伊红染色液1～3min，无水乙醇脱色，晾干、封片。
[0036] AF固定液由体积比为1：9的甲醛溶液和95％乙醇组成。
[0037] 水解液由质量份为50～150份的酸液和20～50份的超纯水组成；其中酸液由固体盐酸、磷酸中的一种或两种任意比组成。固体盐酸由质量分数为50％的水合肼、36％的盐酸和14％的水组成，烘干制得；磷酸为市售商品。
[0038] 漂洗液由质量份为0.5～1份的亚硫酸盐和100份的酸性过滤水组成；其中亚硫酸盐包括质量份为0～1份的亚硫酸氢钠和0～1份的偏重亚硫酸钠。酸性过滤水为25℃条件下pH＜3的水。
[0039] 伊红染色液包括质量份为0.1～1份的曙红Y和100份的95％乙醇。
[0040] 一下结合具体实施例对本发明进一步说明：
[0041] 实施例一、
[0042] 一种细胞核DNA染色方法，由以下步骤组成：
[0043] I、按照体积比为1∶9的甲醛溶液和95％乙醇配制AF固定液；
[0044] II、按照表1配制细胞DNA染色液、水解液、漂洗液以及伊红染色液；
[0045] 表1
[0046]
[0047] III、将病理样本放入AF固定液中固定10～15min；流水清洗后，放入水解液中水解15～30min；流水清洗后，放入细胞DNA染色液中染色20～40min；流水清洗后，放入漂洗液中漂洗5-10min；50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇逐级脱水，放入伊红染色液1～3min，无水乙醇脱色，晾干、封片。染色后效果图如图2所示。
[0048] 实施例二、
[0049] 与实施例一的区别在于，按照表2配制细胞DNA染色液、水解液、漂洗液以及伊红染色液。
[0050] 表2
[0051]
[0052] 染色后效果图如图3所示。
[0053] 实施例三、
[0054] 与实施例一的区别在于，按照表3配制细胞DNA染色液、水解液、漂洗液以及伊红染色液。
[0055] 表3
[0056]
[0057]
[0058] 染色后效果图如图4所示。
[0059] 实施例四、
[0060] 与实施例一的区别在于，按照表4配制细胞DNA染色液、水解液、漂洗液以及伊红染色液。
[0061] 表4
[0062]
[0063]
[0064] 染色后效果图如图5所示。
[0065] 实施例五、
[0066] 与实施例一的区别在于，按照表5配制细胞DNA染色液、水解液、漂洗液以及伊红染色液。
[0067] 表5
[0068]
[0069]
[0070] 实施例六、
[0071] 与实施例一的区别在于，按照表6配制细胞DNA染色液、水解液、漂洗液以及伊红染色液。
[0072] 表6
[0073]
[0074] 实施例七、
[0075] 与实施例一的区别在于，按照表7配制细胞DNA染色液、水解液、漂洗液以及伊红染色液。
[0076] 表7
[0077]
[0078]
[0080] a、染色时间大大缩短；
[0081] b、水解液由非易制毒化学品组成，原料有保证，且不挥发、腐蚀性弱，属于环境友好型试剂；
[0082] c、AF固定液较以往的Bohm-Sprenger固定液，不含乙酸，对人体刺激小；
[0083] d、细胞DNA染色液配制简单，无需加热煮沸，有效期长于18个月，即用型，适于商业推广。
[0084] 上述实施方式并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，
本技术领域的技术人员在本发明的技术方案范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也均属于本发明的保护范围。
