用于调节HTRA1表达的反义寡核苷酸
阅读：100发布：2021-07-31
专利汇可以提供用于调节HTRA1表达的反义寡核苷酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及与HTRA1互补的反义寡核苷酸(寡聚体)，其导致HTRA1表达的调节。HTRA1表达的调节对于一系列医学病症诸如黄斑变性如年龄相关的黄斑变性有益。，下面是用于调节HTRA1表达的反义寡核苷酸专利的具体信息内容。
1.长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸靶向HTRA1核酸，并包含10-22个核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与SEQ ID NO 113至少有90％诸如100％的互补性。
2.权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述连续的核苷酸区域与选自由SEQ ID No
231，186，192和205组成的组的序列完全互补。
3.权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含与选自由SEQ ID NO 124-230组成的组的序列完全互补的至少12个连续核苷酸。
4.权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含与SEQ ID NO 113完全互补的至少12个连续核苷酸。
5.权利要求1-4中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域包含与SEQ ID NO 113完全互补的至少14个连续核苷酸。
6.权利要求1-5中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域由下述序列组成或包含下述序列：选自SEQ ID NO 67，73和86中的任一个，或其至少12个连续核苷酸。
7.权利要求1-6中任一项的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含一个或更多个2’糖修饰的核苷，诸如独立地选自由以下各项组成的组的一个或更多个2’糖修饰的核苷：2’-O-烷基-RNA，2’-O-甲基-RNA，2’-烷氧基-RNA，2’-O-甲氧基乙基-RNA，2’-氨基-DNA，2’-氟-DNA，阿拉伯糖核酸(ANA)，2’-氟-ANA和LNA核苷。
8.权利要求1-7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸区域包含至少一个经修饰的核苷间连接，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间连接，或诸如所述连续核苷酸区域内的所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
9.权利要求1-8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列是或包含gapmer，诸如式5’-F-G-F’-3’的gapmer，其中区域F和F’独立地包含1-7个糖修饰的核苷，且G是能够募集RNA酶H的6-16个核苷的区域，其中与区域G相邻的区域F和F’的核苷是糖修饰的核苷。
10.权利要求9所述的反义寡核苷酸，其中，区域F和F’中的至少一个或两者各自包含至少一个LNA核苷。
11.权利要求1-10中任一项的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域选自以下各项的组：
TTCtatctacgcaTTG(SEQ ID NO 67)，
CTTCttctatctacgcAT(SEQ ID NO 73)，和
TACTttaatagcTCAA(SEQ ID NO86)；
其中大写字母是LNA核苷酸，小写字母是DNA核苷，且胞嘧啶残基任选是5-甲基胞嘧啶。
12.权利要求10或11所述的反义寡核苷酸，其中所述LNA核苷为β-D-氧基LNA核苷。
13.权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸区域的核苷酸之间的核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷酸间连接。
14.寡核苷酸，其包含选自由下述组成的组的寡核苷酸或由其组成：
TsTsmCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG(SEQ ID NO 67，1)，
mCsTsTsmCststscstsastscstsasmcsgscsAsT(SEQ ID NO 73，1)，和
TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA(SEQ ID NO 86，1)；
其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母是DNA核苷，下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接，mC代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且mc代表5甲基胞嘧啶DNA核苷。
15.权利要求1-14中任一项所述的寡核苷酸的药学上可接受的盐。
16.缀合物，其包含权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸和至少一个共价附接至所述寡核苷酸的缀合物部分。
17.药物组合物，其包含权利要求1-15所述的寡核苷酸或权利要求16所述的缀合物和药学上可接受的稀释剂，溶剂，载体，盐和/或佐剂。
18.用于在表达HTRA1的靶细胞中调节HTRA1表达的体内或体外方法，所述方法包括以有效量施用权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸或权利要求16所述的缀合物或权利要求17所述的药物组合物至所述细胞。
19.一种治疗或预防疾病的方法，该方法包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防有效量的权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸或权利要求16所述的缀合物或权利要求17所述的药物组合物。
20.权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸或权利要求16所述的缀合物或权利要求17所述的药物组合物，其用于药物中。
21.权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸或权利要求16的缀合物或权利要求17的药物组合物，其用于治疗或预防选自由以下各项组成的组的疾病：黄斑变性(诸如湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中期dAMD，糖尿病性视网膜病)，帕金森病，阿尔茨海默病，迪谢内肌营养不良，关节炎(如骨关节炎)和家族性缺血性脑小血管疾病。
22.权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸或权利要求16的缀合物或权利要求17的药物组合物在制备用于治疗或预防选自由以下各项组成的组的疾病的药物中的用途：黄斑变性(诸如湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中期dAMD，糖尿病性视网膜病)，帕金森病，阿尔茨海默病，迪谢内肌营养不良，关节炎，如骨关节炎，和家族性缺血性脑小血管疾病。
23.权利要求19-22中任一项所述的用途或方法，其中所述方法或用途是用于治疗黄斑变性。
1.下式的寡核苷酸：
TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA(SEQ ID NO 86)；
其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母是DNA核苷，下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接，且mC代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷。
2.权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸为下式的寡核苷酸：
3.权利要求1或2所述的寡核苷酸的药学上可接受的盐。
4.权利要求3所述的药学上可接受的盐，其中所述盐是钾盐。
5.权利要求4所述的药学上可接受的盐，其中所述盐是钠盐。
6.药物组合物，其包含下式的寡核苷酸：
TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA(SEQ ID NO 86)；
其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母是DNA核苷，下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接，且mC代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷；和药学上可接受的稀释剂，载体，盐和/或佐剂。
7.权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的稀释剂。
8.权利要求7所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的稀释剂是磷酸缓冲盐水。
9.权利要求6-8中任一项所述的药物组合物，其中所述寡核苷酸是药学上可接受的盐的形式。
10.权利要求9所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的盐是钠盐。
11.缀合物，其包含权利要求1或2所述的寡核苷酸，或权利要求3-5中任一项所述的药学上可接受的盐，和至少一个共价附接至所述寡核苷酸的缀合物部分。
12.权利要求1或2所述的寡核苷酸，或权利要求3-5中任一项所述的药学上可接受的盐，或权利要求6-10中任一项所述的药物组合物，或权利要求11所述的缀合物用于药物中的用途。
13.权利要求1或2所述的寡核苷酸，或权利要求3-5中任一项所述的药学上可接受的盐，或权利要求6-10中任一项所述的药物组合物，或权利要求11所述的缀合物用于治疗或预防黄斑变性的用途。
14.权利要求13所述的用途，其中所述用途是用于治疗湿性AMD，干性AMD，地图状萎缩，中期dAMD或糖尿病性视网膜病。
15.权利要求14所述的用途，其中所述用途是用于治疗地图状萎缩或中期dAMD。
用于调节HTRA1表达的反义寡核苷酸
发明领域
[0001] 本发明涉及与HTRA1互补的反义寡核苷酸(寡聚体)，其导致HTRA1表达的调节。HTRA1表达的调节对于一系列医学病症诸如黄斑变性如年龄相关的黄斑变性有益。
背景技术
[0002] 人高温需求A(human high temperature requirement A，HTRA)家族的丝氨酸蛋白酶普遍表达的PDZ蛋白酶，其通过蛋白酶和分子伴侣的双重功能，参与维持细胞外区室的蛋白质稳态。HTRA蛋白酶与细胞外基质的组织，细胞增殖和衰老有关。HTRA活性的调节与严重疾病有关 ，所述严重疾病包括迪谢内肌营养不良 (Bakay等2002，Neuromuscul.Disord.12：125-141)，关节炎(诸如骨关节炎(Grau等2006，JBC 281：6124-
6129)，癌症，家族性缺血性脑小血管疾病和年龄相关的黄斑变性，以及帕金森病和阿尔茨海默病。人HTRA1含有胰岛素样生长因子(IGF)结合结构域。已经提出其调节IGF的可用性和细胞生长(Zumbrunn和Trueb，1996，FEES Letters 398：189-192)并展现出肿瘤抑制特性。
HTRA1表达在转移性黑色素瘤中下调，并因此可能指示黑色素瘤的进展程度。转移性黑素瘤细胞系中HTRA1的过表达减少了体外增殖和侵袭，并且在异种移植小鼠模型中减少了肿瘤的生长(Baldi等，2002，Oncogene 21：6684-6688)。在卵巢癌中，HTRA1表达也下调。在卵巢癌细胞系中，HTRA1过度表达诱导细胞死亡，而反义HTRA1表达促进锚定非依赖性生长(Chien等，2004，Oncogene 23：1636-1644)。
6129)，癌症，家族性缺血性脑小血管疾病和年龄相关的黄斑变性，以及帕金森病和阿尔茨海默病。人HTRA1含有胰岛素样生长因子(IGF)结合结构域。已经提出其调节IGF的可用性和细胞生长(Zumbrunn和Trueb，1996，FEES Letters 398：189-192)并展现出肿瘤抑制特性。
HTRA1表达在转移性黑色素瘤中下调，并因此可能指示黑色素瘤的进展程度。转移性黑素瘤细胞系中HTRA1的过表达减少了体外增殖和侵袭，并且在异种移植小鼠模型中减少了肿瘤的生长(Baldi等，2002，Oncogene 21：6684-6688)。在卵巢癌中，HTRA1表达也下调。在卵巢癌细胞系中，HTRA1过度表达诱导细胞死亡，而反义HTRA1表达促进锚定非依赖性生长(Chien等，2004，Oncogene 23：1636-1644)。
[0003] 除了对IGF途径的作用外，HTRA1还抑制TGFβ家族生长因子的信号传导(Oka等，2004，Development 131：1041-1053)。HTRA1能够切割淀粉样前体蛋白(APP)，HTRA1抑制剂引起Aβ肽在培养细胞中的积累。因此，HTRA1也与阿尔茨海默病有关(Grau等，2005，Proc.Nat.Acad.Sci.USA.102：6021-6026)。
[0004] 此外，已经观察到HTRA1上调并且似乎与迪谢内肌营养不良(Bakay等2002，Neuromuscul.Disord.12：125-141)和骨关节炎(Grau等2006，JBC 281：6124-6129)和AMD(Fritsche，等Nat Gen 2013 45(4)：433-9)有关。
[0005] HTRA1启动子区域(rs11200638)中的单核苷酸多态性(SNP)与发生年龄相关的黄斑变性(AMD)的风险增加了10倍有关。此外，HTRA1 SNP与发展年龄相关的黄斑变性(AMD)的风险增加有关的ARMS2 SNP(rs10490924)存在连锁不平衡。风险等位基因与HTRA1 mRNA和蛋白质表达增加2-3倍相关，并且HTRA在AMD患者的玻璃疣中存在(Dewan等，2006，Science 314：989-992；Yang等，2006，Science 314：992-993)。HtrA1的过表达在小鼠中诱导AMD样表型。hHTRA转基因小鼠(Veierkottn，PlosOne 2011)揭示了Bruch膜弹性层的降解，确定脉络膜血管异常(Jones，PNAS，2011年)，并增加了息肉状脉络膜血管病变(Polypoidal choroidal vasculopathy，PCV)病变(Kumar，IOVS 2014)。此外，已报道hHTRA1 Tg小鼠中的Bruch膜损伤，这决定了其暴露于香烟烟雾后增加CNV 3倍(Nakayama，IOVS 2014)。
[0006] 年龄相关的黄斑变性(AMD)是65岁以上人群不可逆视力丧失的主要原因。随着AMD的发作，眼后部的光敏感光感受器细胞，在代谢上支持他们的下层色素上皮细胞以及他们提供的清晰的中央视觉逐渐丧失。年龄是AMD发病的主要危险因素：55岁后患AMD的可能性增至三倍。吸烟，浅的虹膜颜色，性别(女性风险更大)，肥胖以及反复暴露于UV辐射也会增加患AMD的风险。AMD进展可分为三个阶段：1)早期AMD，2)中期AMD和3)晚期AMD。晚期AMD有两种形式：干性AMD(也称为地图状萎缩，GA)和湿性AMD(也称为渗出性AMD)。干性AMD的特征在于光感受器和视网膜色素上皮细胞的丧失，其导致视觉丧失。湿性AMD与病理性脉络膜的(也称为视网膜下的)新血管形成有关。在此过程中形成的异常血管的泄漏会破坏黄斑并损伤视力，最终导致失明。在某些情况下，患者可以表现出与两种类型的晚期AMD相关的病理。湿性AMD的治疗策略需要经常注射到眼睛中，并且主要集中在延迟疾病的进展上。目前尚无用于干性AMD的治疗方法。因此，在提供治疗黄斑变性病况例如湿性和干性AMD的有效药物方面存在未满足的医学需求。WO 2008/013893要求保护用于治疗患有年龄相关的黄斑变性的受试者的组合物，其包含核酸分子，所述核酸分子包含与HTRA1基因或mRNA杂交的反义序列：没有公开反义分子。
[0007] WO2009/006460提供靶向HTRA1的siRNA及其在治疗AMD中的用途。
[0008] 发明目的
[0009] 本发明提供体内或体外调节HTRA1的反义寡核苷酸。本发明鉴定了存在于人HTRA1 mRNA(包括前mRNA)中的隐蔽靶序列基序，其可以被反义寡核苷酸靶向以产生有效的HTRA1抑制。本发明还提供能够抑制HTRA1的有效的反义寡核苷酸序列和化合物，以及它们在治疗指示HTRA1的疾病或病症中的用途。
发明内容
[0010] 本发明涉及靶向哺乳动物HTRA1核酸的寡核苷酸，即是能够抑制HTRA1的表达并治疗或预防与HTRA1的功能有关的疾病的。靶向HTRA1的寡核苷酸是反义寡核苷酸，即是与其HTRA1核酸靶标互补的。
[0012] 因此，本发明提供反义寡核苷酸，其包含长度为10-30个核苷酸的，具有与哺乳动物HTRA1核酸的至少90％的互补性的(诸如完全互补的)连续核苷酸序列，诸如SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4。
[0013] 在另一方面，本发明提供包含本发明的寡核苷酸和药学上可接受的稀释剂，载体，盐和/或佐剂的药物组合物。
[0014] 本发明提供LNA反义寡核苷酸，诸如LNA gapmer寡核苷酸，其包含长度为10-30个核苷酸的，具有与HTRA1核酸至少90％的互补性的(诸如完全互补的)连续核苷酸序列，诸如选自由SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4组成的组的序列。
[0015] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含在10-30个(诸如12至22个)核苷酸的连续核苷酸区域，其中所述连续核苷酸区域与SEQ ID NO 113至少90％互补，诸如100％互补。
[0016] 本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含10-30个(诸如12-22个)核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与以下序列至少
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 113：
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 113：
[0017]
[0018] SEQ ID NO 113的反向互补序列是SEQ ID NO 119：
[0019]
[0020] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含10-30个(诸如12至22个)核苷酸的连续核苷酸区域，其中所述连续核苷酸区域与SEQ ID NO 114至少90％互补，诸如100％互补。
[0021] 本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含10-30个(诸如12-22个)核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与以下序列至少
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 114：5’
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 114：5’
[0022]
[0023] SEQ ID NO 114的反向互补序列是SEQ ID NO 120：
[0024]
[0025] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含10-30个(诸如12至22个)核苷酸的连续核苷酸区域，其中所述连续核苷酸区域与SEQ ID NO 115至少90％互补，诸如100％互补。
[0026] 本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含10-30个(诸如12-22个)核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与以下序列至少
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 115：5’
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 115：5’
[0027]
[0028] SEQ ID NO 115的反向互补序列是SEQ ID NO 121：
[0029]
[0030] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含10-30个(诸如12至22个)核苷酸的连续核苷酸区域，其中所述连续核苷酸区域与SEQ ID NO 116至少90％互补，诸如100％互补。
[0031] 本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含10-30个(诸如12-22个)核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与以下序列至少
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 116：5’
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 116：5’
[0032]
[0033] SEQ ID NO 116的反向互补序列是SEQ ID NO 122：
[0034]
[0035] 本发明提供一种反义募核苷酸，其包含10-30个(诸如12全22个)核苷酸的连续核苷酸区域，其中所述连续核苷酸区域与SEQ ID NO 117至少90％互补，诸如100％互补。
[0036] 本发明提供长度为10-30个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含10-30个(诸如12-22个)核苷酸的连续核苷酸区域，所述连续核苷酸区域与以下序列至少
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 117：5’
90％(诸如100％)互补：SEQ ID NO 117：5’
[0037]
[0038] SEQ ID NO 117的反向互补序列是SEQ ID NO 123：
[0039]
[0040] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸不是序列5’gcaatgtgtaagaagt 3’(SEQ ID NO 112)。在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸不包含序列5’gcaatgtgtaagaagt 3’或不由其组成。在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸不包含序列5’gcaatgtgtaagaagt 3’中存在的10个或更多个连续核苷酸或不由其组成。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸不是5’GCAatgtgtaagaAGT 3’，其中大写字母代表LNA核苷(使用β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，小写字母代表DNA核苷，带有上标m的DNA胞嘧啶代表5-甲基C-DNA核苷。所有核苷间连接(linkages)都是硫代磷酸酯核苷间连接。
[0041] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 5-111中的任何一个中的至少10个连续核苷酸的连续核苷酸区域。本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 5-111中的任何一个中的至少12个连续核苷酸的连续核苷酸区域。本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 5-111中的任何一个中的至少14个连续核苷酸的连续核苷酸区域。本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 5-111中的任何一个中的至少15个或至少16个连续核苷酸的连续核苷酸区域。本发明提供一种反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的连续核苷酸序列包含选自由SEQ ID NO 5-111中的任何一个组成的组的核碱基序列，或由所述核碱基序列组成。
[0042] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 118：5’CTTCTTCTATCTACGCATTG 3’的至少10个或至少12个，或至少14个或至少15个或至少16个连续核苷酸的连续核苷酸区域。SEQ ID NO 118的反向互补序列是SEQ ID NO 231：
CAATGCGTAGATAGAAGAAG。
CAATGCGTAGATAGAAGAAG。
[0043] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO 231互补的至少10个或至少12个，至少13个，或至少14个或至少15个或至少16个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0044] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 67的至少10个或至少12个，或至少13个，或至少14个或至少15个或16个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0045] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 86的至少10个或至少12个，或至少13个，或至少14个或至少15个或16个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0046] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 73的至少10个或至少12个，或至少13个，或至少14个或至少15个或至少16个或至少17或18个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0047] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO 186互补的至少10个或至少12个，或至少13个，或至少14个或至少15个或16个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0048] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO 205互补的至少10个或至少12个，或至少13个，或至少14个或至少15个或16个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0049] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO 192互补的至少10个或至少12个，或至少13个，或至少14个或至少15个或至少16个或至少17或18个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0050] 本发明提供一种寡核苷酸，其包含选自以下各项组成的组的寡核苷酸或由其组成：
[0051] TsTsmCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG(SEQ ID NO 67，1)，
[0052] mCsTsTsmCststscstsastscstsasmcsgscsAsT(SEQ ID NO 73，1)，和
[0053] TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA(SEQ ID NO 86，1)；
[0054] 其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母是DNA核苷，下标s代表硫代磷酸酯m m核苷间连接，C代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且c代表5甲基胞嘧啶DNA核苷。
[0055] 本发明提供下式的寡核苷酸：
[0056] TsTsmCstsastscstsasmcsgscsasTsTsG(SEQ ID NO 67，1)，
[0057] 其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母是DNA核苷，下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接，mC代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且mc代表5甲基胞嘧啶DNA核苷。
[0058] 本发明提供下式的寡核苷酸：
[0059] mCsTsTsmCststscstsastscstsasmcsgscsAsT(SEQ ID NO 73，1)
[0060] 其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母是DNA核苷，下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接，mC代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且mc代表5甲基胞嘧啶DNA核苷。
[0061] 本发明提供下式的寡核苷酸：
[0062] TsAsmCsTststsasastsasgscsTsmCsAsA(SEQ ID NO 86，1)
[0063] 其中大写字母代表β-D-氧基LNA核苷，小写字母是DNA核苷，下标s代表硫代磷酸酯核苷间连接，mC代表5甲基胞嘧啶β-D-氧基LNA核苷，且mc代表5甲基胞嘧啶DNA核苷。
[0064] 本发明提供实施例中提供的寡核苷酸。
[0065] 本发明提供缀合物，其包含根据本发明的寡核苷酸和与共价附接所述寡核苷酸的至少一个缀合物部分。
[0066] 本发明提供本发明的寡核苷酸或缀合物的药学上可接受的盐。
[0067] 在另一方面，本发明提供通过向表达HTRA1的细胞中施用有效量的本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物来调节所述细胞中的HTRA1表达的体内或体外方法。
[0068] 在另一方面，本发明提供用于治疗或预防与HTRA1的体内活性相关的疾病，病症或功能障碍的方法，所述方法包括向患有或易患所述疾病，病症或功能障碍的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸或其缀合物。
[0069] 在另一方面，本发明的寡核苷酸或组合物用于治疗或预防黄斑变性，和与HTRA1有关的其他病症。
[0070] 本发明提供本发明的寡核苷酸或缀合物，其用于治疗选自包含下述各项的列表的疾病或病症：迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)，关节炎，诸如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管疾病(familial ischemic cerebral small-vessel disease)，阿尔茨海默病和帕金森病。
[0071] 本发明提供本发明的寡核苷酸或缀合物，其用于治疗黄斑变性，诸如与湿性或干性年龄相关的黄斑变性(诸如wAMD，dAMD，地图状萎缩，早期AMD，中期AMD)或糖尿病性视网膜病。
[0072] 本发明提供本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物在制备用于治疗黄斑变性诸如湿性或干性黄斑变性(wAMD，dAMD，地图状萎缩，中期dAMD)或糖尿病性视网膜病的药物中的用途。
[0073] 本发明提供本发明的寡核苷酸，缀合物或化合物在制备用于治疗选自由以下各项组成的组的疾病或病症的药物中的用途：迪谢内肌营养不良，关节炎，诸如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管疾病，阿尔茨海默病和帕金森病。
[0074] 本发明提供一种治疗患有选自由以下各项组成的组的疾病或病症的受试者的方法：迪谢内肌营养不良，关节炎，诸如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管疾病，阿尔茨海默病和帕金森病，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物的步骤。
[0075] 本发明提供一种治疗患有眼疾病，诸如黄斑变性，诸如与湿性或干性年龄相关的黄斑变性(例如wAMD，dAMD，地图状萎缩，中期dAMD)或糖尿病性视网膜病的受试者的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的寡核苷酸，缀合物或组合物的步骤。
[0076] 本发明提供一种治疗患有眼疾病，诸如黄斑变性，诸如与湿性或干性年龄相关的黄斑变性(例如wAMD，dAMD，地图状萎缩，中期AMD)或糖尿病性视网膜病的受试者的方法，所述方法包括以约10μg-200μg的剂量在眼内注射中施用至少两个剂量的本发明的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中连续施用之间的剂量间隔为至少4周(即“剂量间隔≥4周)或至少一个月(即剂量间隔≥1个月)。
[0078] 图1.在U251细胞系中以5μM筛选n＝231 HTRA1 LNA寡核苷酸文库。残留的HTRA1 mRNA表达水平通过qPCR测定，并显示为对照(PBS处理的细胞)的％。位于位置53113-53384之间的n＝10个寡核苷酸相对活跃。
[0079] 图2.在U251细胞系中以5μM筛选n＝210 HTRA1 LNA寡核苷酸文库。残留的HTRA1 mRNA表达水平通过qPCR测定，并显示为对照(PBS处理的细胞)的％。位于位置53113-53384之间的n＝33个寡核苷酸相对活跃。
[0080] 图3.在U251和ARPE19细胞系中分别以5和25μM筛选n＝305个HTRA1 LNA寡核苷酸文库。残留的HTRA1 mRNA表达水平通过qPCR测定，并显示为对照(PBS处理的细胞)的％。位于位置53113-53384之间的n＝95个寡核苷酸与其余位置相比相对活跃。
[0081] 图4.用LNA寡核苷酸治疗人原代RPE细胞后HTRA1 mRNA水平的剂量应答，治疗10天。乱序的(scrambled)序列是具有与Htra1靶序列无关的乱序的序列的对照寡核苷酸。
[0082] 图5.NHP PK/PD研究，IVT给药，25μg/眼。A)通过qPCR测量的视网膜中HTRA1 mRNA水平。B)通过寡核苷酸ELISA测量的视网膜中的寡核苷酸含量。C)由ISH说明的HTRA1 mRNA水平。D-E)通过IP-MS分别定量视网膜和玻璃体中HTRA1蛋白水平。点显示个体动物的数据。误差线显示了技术重复的标准误差(n＝3)。F-G)视网膜和玻璃体中HTRA1蛋白水平的降低，其分别通过蛋白质印迹(western blot)进行了说明。
[0083] 图6.本发明的A化合物(化合物ID NO 67，1)。该化合物可以是药用盐的形式，诸如钠盐或钾盐。
[0084] 图7.本发明的A化合物(化合物ID NO 86，1)。该化合物可以是药用盐的形式，诸如钠盐或钾盐。
[0085] 图8.本发明的化合物(化合物ID NO73，1)。该化合物可以是药用盐的形式，诸如钠盐或钾盐。
[0086] 图9.化合物67，1：M+的药用盐的实例是合适的阳离子，通常是正金属离子，诸如钠或钾离子。阳离子与寡核苷酸阴离子的化学计量比将取决于所用阳离子的电荷。适当地，带+ ++ +++有一个，两个或三个正电荷的阳离子(可以使用M ，M 或M )。出于说明目的，与二价阳离子(如Ca2+.)相比，需要二倍量的带单个+电荷的阳离子(单价的)，如Na+或K+。
[0087] 图10.化合物86，1的药用盐的实例：有关阳离子M+的说明，请参见图9的图例。
[0088] 图11.化合物73，1的药用盐的示例：有关阳离子M+的说明，请参见图9的图例。
[0089] 图12A.在食蟹猴(cynomolgus monkeys)中玻璃体内施用化合物#15，3和#17，并在注射后第3，8，15和22天收集房水样品。来自未稀释样品的蛋白质使用Peggy Sue设备通过毛细管电泳分析(蛋白样品)。HTRA1使用定制的多克隆兔抗血清检测。呈现了来自动物#J60154(赋形剂)，J60158(C.Id#15，3)，J60162(C.Id#17)的数据。
[0090] 图12B.通过与纯化的重组(S328A突变体)HTRA1蛋白(Origene，#TP700208)进行比较来量化信号强度。此处显示校准曲线。
[0091] 图12C.上图：来自个体动物的计算出的HTRA1房水浓度针对注射后的时间作图。下图：确定了每个时间点上赋形剂组的平均HTRA1浓度，并计算了治疗动物的相应相对浓度。空心圆：个体值，实心圆：组平均值。显示了第22天的％HTRA1降低。
[0092] 图13.在用各种靶向HTRA1转录本的LNA分子处理过的食蟹猴的房水(蓝色菱形)或视网膜(红色方块)中，HTRA1 mRNA针对HTRA1蛋白水平作图。值表示为相对于PBS对照标准化的百分比。
[0093] 图14.在用各种靶向HTRA1转录本的LNA分子处理的食蟹猴房水中的HTRA1蛋白与(A)视网膜中HTRA1蛋白和(B)视网膜中HTRA1 mRNA的相关性。值表示为相对于PBS对照标准化的百分比。
[0094] 定义
[0095] 寡核苷酸
[0096] 如本文所用，术语“寡核苷酸”被定义为技术人员通常理解为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚体。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化来制备。当提及寡核苷酸的序列时，参考共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一种或多种经修饰的核苷或核苷酸。
[0097] 反义寡核苷酸
[0098] 本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸杂交，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，并且因此不是siRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。
[0099] 连续核苷酸区域
[0100] 术语“连续核苷酸区域”是指寡核苷酸与靶核酸互补的区域。该术语在本文中可以与术语“连续核苷酸序列”或“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸都存在于连续核苷酸区域中。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续的核苷酸区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团连接至连续的核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区可以与靶核酸互补或可以不互补。在一些实施方案中，存在于连续核苷酸区域的核苷酸之间的核苷间连接全部是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含一种或更多种糖修饰的核苷。
[0101] 核苷酸
[0102] 核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，核苷酸包括天然存在和非天然存在的核苷酸。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸包含核糖部分，核碱基部分和一个或更多个磷酸基团(在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
[0103] 经修饰的核苷
[0104] 本文所用的术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选的实施方案中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。
[0105] 经修饰的核苷间连接
[0106] 术语“经修饰的核苷间连接”被定义为如技术人员通常所理解的，除磷酸二酯(PO)连接以外的连接，其将两个核苷共价偶联在一起。具有经修饰的核苷间连接的核苷酸也称为“经修饰的核苷酸”。在一些实施方案中，与磷酸二酯连接相比，经修饰的核苷间连接增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间连接包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯连接的磷酸基团。经修饰的核苷间连接特别可用于稳定体内使用的寡核苷酸，并可用于防止本发明寡核苷酸中DNA或RNA核苷区域(诸如在gapmer寡核苷酸的间隙区域内，以及在经修饰的核苷区域内)的核酸酶切割。
[0107] 在一个实施方案中，寡核苷酸包含从天然磷酸二酯修饰为例如对核酸酶攻击更具抗性的连接的一个或更多个核苷间连接。核酸酶抗性可以通过在血清中温育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定法(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者都是本领域熟知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间连接称为核酸酶抗性核苷间连接。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷间连接或其连续核苷酸序列都被修饰。应当认识到，在一些实施方案中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团(诸如缀合物)连接的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷间连接或其连续核苷酸序列都是核酸酶抗性核苷间连接。
[0108] 在一些实施方案中，经修饰的核苷间连接可以是硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，经修饰的核苷间连接与本发明的寡核苷酸的RNA酶H募集相容，例如硫代磷酸酯。
[0109] 在一些实施方案中，核苷间连接包括硫(S)，诸如硫代磷酸酯核苷间连接。
[0110] 硫代磷酸酯核苷间连接由于核酸酶抗性，有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷间连接或其连续核苷酸序列是硫代磷酸酯。
[0111] 核碱基
[0112] 术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(诸如尿嘧啶，胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基也涵盖经修饰的核碱基，所述经修饰的可能不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在本文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，尿嘧啶，黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。这样的变体例如描述于Hirao等(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1。
[0113] 在一些实施方案中，核碱基部分通过将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶而修饰，经修饰的嘌呤或嘧啶诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶，假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)，5-甲基胞嘧啶，5-硫代-胞嘧啶的核碱基，5-丙炔基-胞嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，5-溴尿嘧啶5-噻唑并尿嘧啶，2-硫代-尿嘧啶，2’硫代-胸腺嘧啶，肌苷，二氨基嘌呤，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
[0114] 核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码表示，例如，A，T，G，C或U，其中每个字母可任选地包括具有等同功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A，T，G，C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA gapmer，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。在一些实施方案中，在5’cg3’基序中的胞嘧啶核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
[0115] 经修饰的寡核苷酸
[0116] 术语经修饰的寡核苷酸描述了包含一个或更多个糖修饰的核苷和/或经修饰的核苷间连接的寡核苷酸。术语“嵌合的”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有经修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
[0117] 互补性
[0118] 术语互补性描述了核苷/核苷酸的沃森-克里克碱基配对的能力。沃森-克里克碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解，寡核苷酸可包含具有经修饰的核碱基的核苷，例如通常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰和修饰的核碱基之间的沃森-克里克碱基配对碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷，第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
[0119] 如本文所用，术语“％互补”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸区域或序列的核苷酸数百分比，其在给定位置与单独的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列互补(即形成沃森-克里克碱基对)。百分比通过计算在两个序列之间形成对的比对碱基的数量，除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100计算出。在这种比较中，不对齐(不形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。
[0120] 应当理解，当提及两个序列之间的互补性时，在两个序列中较短的长度(诸如在连续核苷酸区域或序列的长度)上，测量互补性的确定。
[0121] 术语“完全互补”是指100％互补性。在没有％的术语值或不匹配指示的情况下，互补意指完全互补。
[0122] 同一性
[0123] 如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的核苷酸数百分比，其在给定位置与单独的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置处的连续核苷酸序列相同(即在与互补核苷形成沃森-克里克碱基对的能力方面)。百分比通过计算在两个序列(包括缺口)之间是相同的比对碱基的数量，除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100计算出。同一性百分比＝(匹配x 100)/对齐区域(带有缺口)的长度。
[0124] 当确定寡核苷酸的连续核苷酸区域的同一性时，在连续核苷酸区域的整个长度上计算同一性。因此，在寡核苷酸的整个连续核苷酸序列是连续核苷酸区域的实施方案中，因此在寡核苷酸的核苷酸序列的整个长度上计算同一性。在这方面，连续核苷酸区域可以与参考核酸序列的区域相同，或者在一些实施方案中可以与整个参考核酸相同。除非另有说明，否则与参考序列具有100％同一性的序列被称为相同。
[0125] 例如，参考序列可以选自由SEQ ID NO 5-111中的任何一个组成的组。
[0126] 但是，如果寡核苷酸包含在连续核苷酸区域(例如区域D’或D”)侧翼的另外的核苷酸，则在确定同一性时可以忽略这些另外的侧翼核苷酸。在一些实施方案中，可以在整个寡核苷酸序列上计算同一性。
[0127] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少10个连续核苷酸与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的序列相同的连续核苷酸区域。
[0128] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少12个连续核苷酸与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的序列相同的连续核苷酸区域。
[0129] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少13个连续核苷酸与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的序列相同的连续核苷酸区域。
[0130] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少14个连续核苷酸与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的序列相同的连续核苷酸区域。
[0131] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少15个连续核苷酸与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的序列相同的连续核苷酸区域。
[0132] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少16个连续核苷酸与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的序列相同的连续核苷酸区域。
[0133] 在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含SEQ ID NO 113-118或SEQ ID NO 5-111组成的组的序列的至少10个连续核苷酸或由其组成，所述至少10个连续核苷酸诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的整个的连续序列包含SEQ ID NO至少10个连续核苷酸或由其组成，所述至少10个连续核苷酸诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。
[0134] 在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列包含SEQ ID NO 119至少10个连续核苷酸或由其组成，所述至少10个连续核苷酸诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。
[0135] 在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列包含SEQ ID NO 120至少10个连续核苷酸或由其组成，所述至少10个连续核苷酸诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。
[0136] 在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列包含SEQ ID NO 121至少10个连续核苷酸或由其组成，所述至少10个连续核苷酸诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。
[0137] 在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列包含SEQ ID NO 122至少10个连续核苷酸或由其组成，所述至少10个连续核苷酸诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。
[0138] 在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列包含SEQ ID NO 123至少10个连续核苷酸或由其组成，所述至少10个连续核苷酸诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。
[0139] 本发明提供一种反义寡核苷酸，其包含存在于SEQ ID NO 118：5’cttcttctatctacgcattg 3’的至少10个或至少12个，或至少13个，或至少14个或至少15个或至少16个或至少17或至少18个连续核苷酸的连续核苷酸区域。
[0140] 在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含与SEQ ID NO 67相同的10，11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0141] 在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含与SEQ ID NO 73相同的10，11，12，13，14，15，16，17或18个连续核苷酸。
[0142] 在一些实施方案中，连续核苷酸区域包含与SEQ ID NO 86相同的10，11，12，13，14，15或16个连续核苷酸。
[0143] 本发明提供长度为11-30个核苷酸，诸如长度为12至20个核苷酸的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的序列相同的连续核苷酸序列。
[0144] 本发明提供包含连续核苷酸序列或由其组成的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的参考序列跨越该参考序列的至少10个连续核苷酸相同。
[0145] 本发明提供包含连续核苷酸序列或由其组成的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的参考序列跨越该参考序列的至少12个连续核苷酸相同。
[0146] 本发明提供包含连续核苷酸序列或由其组成的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的参考序列跨越该参考序列的至少14个连续核苷酸相同。
[0147] 本发明提供包含连续核苷酸序列或由其组成的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 5-111组成的组的参考序列跨越该参考序列的长度相同。
[0148] 杂交
[0149] 如本文所用，术语“进行杂交”或“杂交”应理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用解链温度(Tm)来描述，解链温度定义为一半寡核苷酸与靶核酸双链体化的温度。在生理条件下，Tm与亲和力并不严格成比例(Mergny和Lacroix，2003，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更精确表示，并且通过ΔG＝-RTln(Kd)与反应的解离常数(Kd)相关，其中R是气体常数，且T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与如下水溶液浓度为1M，pH为7，温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验来测量，例如，通过使用例如，Hansen等，1965，Chem.Co mM.36-38和Holdgate等，2005，Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)。技术人员将知道商用设备可用于“ΔG°测量。ΔG也可以通过使用SantaLucia，1998，Proc Natl Acad Sci USA.95：1460-1465中描述的最近邻模型，使用Sugimoto et al.，1995，Biochemistry 34：11211-11216和McTigue et al.，2004，Biochemistry 43：5388-5405中描述的适当衍生的热力学参数进行数值估计。为了具有通过杂交调节其预期核酸靶标的可能性，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸以估计的低于-10kcal的ΔG值与靶核酸杂交。在一些实施方案中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可以以估计的低于-10kcal的范围(诸如低于-15kcal，诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal)的ΔG°值与靶核酸杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸以约-10至-60kcal，诸如-12至-40，诸如从-15至-30kcal或-16至-27kcal诸如-18至-25kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。
[0150] 靶序列
[0151] 寡核苷酸包含与靶核酸分子的子序列互补或杂交的连续核苷酸区域。如本文所用，术语“靶序列”是指靶核酸中存在的核苷酸序列，其包含与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸区域或序列互补的核碱基序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸区域或序列互补的区域组成。在一些实施方案中，靶序列比单个寡核苷酸的互补序列长，并且可以例如代表可以被本发明的若干种寡核苷酸靶向的靶核酸的优选区域。
[0152] 本发明的寡核苷酸包含与靶核酸如靶序列互补的连续核苷酸区域。
[0153] 寡核苷酸包含至少10个核苷酸的连续核苷酸区域，其中所述连续核苷酸区域与靶核酸分子中存在的靶序列互补或杂交。连续核苷酸区域(以及因此靶序列)包含至少10个连续核苷酸，诸如11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22个，连续核苷酸，诸如从12-22，诸如从14-18个连续核苷酸。
[0154] 在一些实施方案中，靶序列存在于选自由SEQ ID NO 113，114，115，116，117和118组成的组的序列内。
[0155] 靶细胞
[0156] 如本文所用，术语靶细胞是指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以在体内或体外。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞，例如灵长类细胞，诸如猴子细胞或人细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是视网膜细胞，诸如视网膜色素上皮(PRE)细胞。在一些实施方案中，该细胞选自由RPE细胞，双极细胞，无长突细胞，内皮细胞，神经节细胞和小胶质细胞组成的组。对于体外评估，靶细胞可以是原代细胞或已建立的细胞系，诸如U251，ARPE19...。
[0157] 靶核酸
[0158] 根据本发明，靶核酸是编码哺乳动物HTRA1的核酸，并且可以例如是基因，RNA，mRNA，和前mRNA，成熟的mRNA或cDNA序列。该靶标因此可以被称为HTRA1靶核酸。
[0159] 合适地，靶核酸编码HTRA1蛋白，特别是哺乳动物HTRA1，诸如人HTRA1(参见例如表1&2，其提供人和大鼠HTRA1的mRNA和前mRNA序列)。
[0160] 在一些实施方案中，靶核酸选自由SEQ ID NO：1，2，3和4组成的组，或其天然存在的变体(诸如，编码哺乳动物HTRA1蛋白的序列)。
[0161] 靶细胞是表达HTRA1靶核酸的细胞。在优选的实施方案中，靶核酸是HTRA1 mRNA，诸如HTRA1前mRNA或HTRA1成熟mRNA。对于反义寡核苷酸靶向，通常不考虑HTRA1 mRNA的poly A尾巴。
[0162] 如果在研究或诊断中采用本发明的寡核苷酸，则靶核酸可以是cDNA或来源于DNA或RNA的合成核酸。
[0163] 靶序列可以是靶核酸的子序列。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸区域与HTRA1子序列(诸如选自由SEQ ID NO 113，114，115，116，117或231的序列组成的组的序列)完全互补或仅包含一个或两个错配。
[0164] 靶序列可以是靶核酸的子序列。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸区域与HTRA1子序列(诸如选自由SEQ ID NO 124-230组成的组的序列)完全互补或仅包含一个或两个错配。在一些实施方案中，寡核苷酸或连续核苷酸区域与HTRA1子序列SEQ ID NO 231完全互补或仅包含一个或两个错配。
[0165] 在寡核苷酸或其连续核苷酸区域的长度上测量与靶标或其子序列的互补性。
[0166] 对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸通常能够在抑制HTRA1靶核酸在表达HTRA1靶核酸的细胞中的表达。本发明的寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与HTRA1靶核酸互补，如在寡核苷酸的整个长度上测量的，任选地除了一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将寡核苷酸连接至任选的官能团(诸如缀合物)的基于核苷酸的接头区域，或其他非互补末端核苷酸(诸如区域D)。在一些实施方案中，靶核酸可以是RNA或DNA，诸如信使RNA，诸如成熟的mRNA或前mRNA。在一些实施方案中，靶核酸是编码哺乳动物HTRA1蛋白(诸如人HTRA1)的RNA或DNA，例如人HTRA1人HTRA1 mRNA序列，诸如SEQ ID NO 1(NM_002775.4，GI：190014575)所公开的。表1&2提供有关示例性靶核酸的更多信息。
[0167] 表1.人类和Cyno HTRA1的基因组和装配信息。
[0168]
[0169] Fwd＝正向链。基因组坐标提供前mRNA序列(基因组序列)。NCBI参考提供mRNA序列(cDNA序列)。
[0170] *国家生物技术信息中心(The National Center for Biotechnology Information)参考序列数据库是一套综合的，完整的，无冗余的，注释充分的参考序列，包括基因组，转录本和蛋白质。它位于www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq。
[0171] **在NCBI参考序列中，存在从位置126到位置227共100个核苷酸的一段，其身份未知。在SEQ ID NO 3&4中，此段已被该区域的人和猕猴(Macaca mulatta)HTRA1前mRNA序列中出现的核苷酸所替代。
[0172] 表2.人和食蟹猴HTRA1的序列详细信息。
[0173] 物种 RNA类型 长度(nt) SEQ ID NO人 mRNA 2138 1
人 前体mRNA 53384 2
食蟹猴 mRNA 2123 3
食蟹猴 前体mRNA 52575 4
人 前体mRNA 53384 2
食蟹猴 mRNA 2123 3
食蟹猴 前体mRNA 52575 4
[0174] 天然存在的变体
[0175] 术语“天然存在的变体”是指HTRA1基因或转录物的变体，其源自与靶核酸相同的遗传基因座，但是例如由于以下而不同：遗传密码的简并性(其导致编码相同氨基酸的密码子的多样性)，或由于前mRNA的可变剪接，或多态性的存在，诸如单核苷酸多态性，和等位基因变体。基于与寡核苷酸的足够互补序列的存在，本发明的寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。在一些实施方案中，天然存在的变体与哺乳动物HTRA1靶核酸(诸如选自由SEQ ID NO 1，2，3或4组成的组的靶核酸)具有至少95％，诸如至少98％或至少99％的同源性。
[0176] 表达的调节
[0177] 如本文所用，术语“表达的调节”应理解当与施用寡核苷酸之前的HTRA1的量相比时寡核苷酸改变HTRA1的量的能力的总称。备选地，可以通过参考不施用本发明的寡核苷酸的对照实验来确定表达的调节。一种调节类型是寡核苷酸例如通过降解mRNA或阻断转录抑制，下调，降低，阻抑，去除，停止，阻断，预防，减轻，减少，避免或终止HTRA1表达的能力。本发明的反义寡核苷酸能够抑制，下调，降低，阻抑，去除，停止，阻断，预防，减轻，减少，避免或终止HTRA1的表达。
[0178] 高亲和力经修饰的核苷
[0179] 高亲和力经修饰的核苷是一种经修饰的核苷酸，当被掺入寡核苷酸时，其可增强寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，诸如通过解链温度(Tm)进行测量。本发明的高亲和力经修饰的核苷优选导致解链温度升高到每个修饰的核苷+0.5至+12℃之间，更优选+1.5至+10℃之间，最优选在+3至+8℃。许多高亲和力经修饰的核苷在本领域中是已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁定核酸((locked nucleic acid，LNA))(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443 and Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213)。
[0180] 糖修饰
[0181] 本发明的寡聚体可以包含一种或更多个具有经修饰的糖部分的核苷，即与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时糖部分的修饰。
[0182] 已经制备了许多具有核糖部分的经修饰的核苷，主要是为了改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
[0183] 此类修饰包括其中核糖环结构被修饰(诸如通过用己糖环(HNA)或双环替代)的那些，其通常在核糖环(LNA)的C2和C4碳之间具有双基桥(biradicle bridge)，或通常缺乏C2和C3碳之间的键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括以下核苷，其中例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下糖部分被非糖部分替代。
[0184] 糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2’-OH基团而进行的修饰。取代基可以，例如在2’，3’，4’或5’位置引入。具有经修饰的糖部分的核苷还包括经2’修饰的核苷，诸如经2’取代的核苷。实际上，已经将很多注意力集中在开发经2’取代的核苷上，并且已发现许多经2’取代的核苷在掺入寡核苷酸时具有有益的性质，例如增强的核苷抗性和增强的亲和力。
[0185] 经2’修饰的核苷
[0186] 经2’糖修饰的核苷是在2’位置具有除H或-OH以外的取代基(经2’取代的核苷)或包含2’连接的双基，和包括2’取代的核苷和LNA(2’-4’双基桥联)核苷的核苷。例如，经2’修饰的糖可以为寡核苷酸提供增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。经2’取代修饰的核苷的实例是2’-O-烷基-RNA，2’-O-甲基-RNA，2’-烷氧基-RNA，2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)，2’-氨基-DNA，2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。有关其他实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213，以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面是一些经2’取代修饰的核苷的图示。
[0187]
[0188]
[0189] 锁定核酸核苷(LNA)
[0190] LNA核苷是经修饰的核苷，其包含核苷酸的核糖糖环的C2’和C4’之间的连接基团(称为双基或桥)。这些核苷在文献中也称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。
[0191] 在一些实施方案中，本发明的寡聚体的经修饰的核苷或LNA核苷具有式I或II的一般结构：
[0192]
[0193] 其中W选自-O-，-S-，-N(Ra)-，-C(RaRb)-，诸如，在一些实施方案中为-O-；
[0194] B表示核碱基部分；
[0195] Z表示与相邻核苷的核苷间连接，或5’-末端基团；
[0196] Z*表示与相邻核苷的核苷间连接，或3’-末端基团；
[0197] X表示选自由以下各项组成的列表的组：-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-和＞C＝Z。
[0198] 在一些实施方案中，X选自由以下各项组成的组：-O-，-S-，NH-，NRaRb，-CH2-，CRaRb，-C(＝CH2)-和-C(＝CRaRb)-。
[0199] 在一些实施方案中，X为-O-。
[0200] Y表示选自由以下各项组成的组的组：-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-和＞C＝Z。
[0201] 在一些实施例中，Y选自由以下各项组成的组：-CH2-，-C(RaRb)-，-CH2CH2-，-C(RaRb)-C(RaRb)-，-CH2CH2CH2-，-C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-和-C(Ra)＝N-。
[0202] 在一些实施方案中，Y选自以下各项组成的组：-CH2-，-CHRa-，-CHCH3-，CRaRb-，[0203] 或-X-Y-一起表示二价连接基团(也称为基)一起表示由1，2或3个选自由以下各项组成的组的基团/原子组成的二价连接基团：-C(RaRb)-，-C(Ra)＝C(Rb)-，-C(Ra)＝N-，-O-，-Si(Ra)2-，-S-，-SO2-，-N(Ra)-和＞C＝Z。
[0204] 在一些实施方案中，-X-Y-表示选自有以下各项组成的组的双基：-X-CH2-，-X-CRaRb-，-X-CHRa-，-X-C(HCH3)-，-O-Y-，-O-CH2-，-S-CH2-，-NH-CH2-，-O-CHCH3-，-CH2-O-CH2，-O-CH(CH3CH3)-，-O-CH2-CH2-，OCH2-CH2-CH2-，-O-CH2OCH2-，-O-NCH2-，-C(＝CH2)-CH2-，-NRa-CH2-，N-O-CH2，-S-CRaRb-和-S-CHRa-。
[0205] 在一些实施例中，-X-Y-表示-O-CH2-或-O-CH(CH3)-。
[0206] 其中Z选自-O-，-S-和-N(Ra)-，
[0207] 且Ra和，当存在时Rb，各自独立地选自氢，任选取代的C1-6-烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的C2-6-炔基，羟基，任选取代的C1-6-烷氧基，C2-6-烷氧基烷基，C2-6-链烯氧基，羧基，C1-6-烷氧羰基，C1-6-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，氨基甲酸酯，C1-6-烷酰氧基，磺酰基(sulphono)，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基(sulphanyl)，C1-6-烷硫基，卤素，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且两个孪位取代基Ra和Rb一起可以表示任选地经取代的亚甲基(＝CH2)，其中对于所有手性中心，可以在R或S取向上找到不对称基团。
[0208] 其中R1，R2，R3，R5和R5*独立地选自：氢，任选取代的C1-6烷基，任选取代的C2-6-链烯基，任选取代的C2-6-炔基，羟基，C1-6-烷氧基，C2-6-烷氧基烷基，C2-6-链烯氧，羧基，C1-6-烷氧基羰基，C1-6-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(C1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基，C1-6-烷基-羰基氨基，脲基，C1-6-烷酰氧基，磺酰基(sulphono)，C1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基(sulphanyl)，C1-6-烷硫基，卤素，其中芳基和杂芳基可任选被取代，并且其中两个孪位取代基一起可表示氧代，硫代(thioxo)，亚氨基，或任选取代的亚甲基。
[0209] 在一些实施例中，R1，R2，R3，R5和R5*独立地选自C1-6烷基，诸如甲基，和氢。
[0210] 在一些实施方案中，R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。
[0211] 在一些实施例中，R1，R2，R3都是氢，并且R5和R5*也是氢，而R5和R5*的另一个不是氢，诸如C1-6烷基诸如甲基。
[0212] 在一些实施方案中，Ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，Rb是氢或甲基。
[0213] 在一些实施方案中，Ra和Rb之一或两者为氢。
[0214] 在一些实施方案中，Ra和Rb之一是氢，另一个不是氢。
[0215] 在一些实施方案中，Ra和Rb之一是甲基，另一个是氢。
[0216] 在一些实施方案中，Ra和Rb均是甲基。
[0217] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。这样的LNA核苷在WO99/014226，WO00/66604，WO98/039352和WO2004/046160(其全部通过引用并入本文)中公开，并且包括通常称为β-D-氧基LNA和α-L-氧基LNA核苷的那些。
[0218] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-S-CH2-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。这样的硫代LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160(其通过引用并入本文)中公开。
[0219] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-NH-CH2-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。这样的氨基LNA核苷在WO99/014226和WO2004/046160(其通过引用并入本文)中公开。
[0220] 在一些实施方案中，双基-O-CH2-CH2--或-O-CH2-CH2-CH2-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。这样的LNA核苷在WO00/047599和Morita等，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12 73-76(其通过引用并入本文)中公开，并且包括通常称为2’-O-4’C-亚乙基桥连的核酸(ENA)。
[0221] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH2-，W是O，并且所有R1，R2，R3以及R5和R5*中的一个都是氢，而R5和R5*中的另一个不是氢，诸如C1-6烷基，如甲基。这样的经5’取代的LNA核苷在WO2007/134181(其通过引用并入本文)中公开。
[0222] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中Ra和Rb之一或两者都不是氢，诸如1 2 3 5 5* 5 5*
甲基，W是O，并且所有R ，R ，R以及R和R 中的一个都是氢，而R和R 中的另一个不是氢，诸如C1-6烷基，诸如甲基。此样的双修饰的LNA核苷在WO2010/077578(其通过引用并入本文)中公开。
甲基，W是O，并且所有R ，R ，R以及R和R 中的一个都是氢，而R和R 中的另一个不是氢，诸如C1-6烷基，诸如甲基。此样的双修饰的LNA核苷在WO2010/077578(其通过引用并入本文)中公开。
[0223] 在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价接头基团-O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸-Seth at al.，2010，J.Org.Chem.Vol 75(5)pp.1569-81)。在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价接头基团-O-CH(CH2OCH3)-(2’O-乙烷基乙基双环核酸-Seth at al.，2010，J.Org.Chem.Vol 75(5)pp.1569-81)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CHRa-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。这样的经6’取代的LNA核苷在WO10036698和WO07090071(其通过引用并入本文)中公开。
[0224] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是O-CH(CH2OCH3)-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。这样的LNA核苷在本领域中也称为环状MOE(cMOE)，并且在WO07090071中公开。
[0225] 在一些实施方案中，双基-X-Y-表示二价连接基团-O-CH(CH3)-。-处于R-或S-构型。在一些实施方案中，双基-X-Y-一起表示二价接头基团-O-CH2-O-CH2-(Seth at al.，2010，J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CH(CH3)-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。此类经6’甲基LNA核苷在本领域中也称为cET核苷，并且可以是(S)cET或(R)cET立体异构体，如WO07090071(β-D)和WO2010/036698(α-L)(两者均通过引用并入本文)中公开的。
[0226] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-O-CRaRb-，其中在Ra或Rb中都不是氢，W是O，并且所有R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra和Rb都是甲基。这样的经6’取代的LNA核苷在WO 2009006478(其通过引用并入本文)中公开。
[0227] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-S-CHRa-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。这样的经6’取代的硫代LNA核苷在WO11156202(其通过引用并入本文)中公开。在一些经6’取代的硫代LNA实施方案中，Ra是甲基。
[0228] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是-C(＝CH2)-C(RaRb)-，诸如-C(＝CH2)-CH2-或-C(＝CH2)-CH(CH3)-W为O，且所有的R1，R2，R3，R5和R5*均为氢。这样的乙烯基carbo LNA核苷在WO08154401和WO09067647(其均通过引用并入本文)中公开。
[0229] 在一些实施方案中，双基-X-Y-是N(-ORa)-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基诸如甲基。这样的LNA核苷也被称为N取代的LNA，并且在WO2008/150729(其通过引用并入本文)中公开。在一些实施方案中，双基-X-Y-一起表示二价接头基团-O-NRa-CH3-(Seth at al.，2010，J.Org.Chem)。在一些实施方案中，双基-X-Y-是N(Ra)-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*全部都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基诸如甲基。
[0230] 在一些实施方案中，R5和R5*中的一个或两个是氢，并且当被取代时，R5和R5*中的另一个是C1-6烷基诸如甲基。在这样的实施例中，R1，R2，R3都可以是氢，并且双基-X-Y-可以选自-O-CH2-或-OC(HCRa)-，诸如-OC(HCH3)-。
[0231] 在一些实施方案中，双基是-CRaRb-O-CRaRb-，诸如CH2-O-CH2-，W是O，并且R1，R2，R3，R5和R5*都是氢。在一些实施方案中，Ra是C1-6烷基诸如甲基。这样的LNA核苷也被称为构象限制性核苷酸(CRN)，并且在WO2013036868(其通过引用并入本文)中公开。
[0232] 在一些实施方案中，双基是-O-CRaRb-O-CRaRb-，诸如CH2-O-CH2-，W是O，并且R1，R2，3 5 5* a
R ，R 和R 都是氢。在一些实施方案中，R是C1-6烷基诸如甲基。这样的LNA核苷也称为COC核苷酸，并且在Mitsuoka等，Nucleic Acids Research 2009 37(4)，1225-1238(其通过引用并入本文)中公开。
R ，R 和R 都是氢。在一些实施方案中，R是C1-6烷基诸如甲基。这样的LNA核苷也称为COC核苷酸，并且在Mitsuoka等，Nucleic Acids Research 2009 37(4)，1225-1238(其通过引用并入本文)中公开。
[0233] 除非另有说明，否则将认识到，LNA核苷可以是β-D或α-L立体异构体。
[0234] LNA核苷的实例在方案1中给出。
[0235] 方案1
[0236]
[0237] 如实施例中所示，在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸中的LNA核苷是β-D-氧基-LNA核苷。
[0238] 核酸酶介导的降解
[0239] 核酸酶介导的降解是指当与这样的序列形成双链体时能够介导互补核苷酸序列降解的寡核苷酸。
[0240] 在一些实施方案中，寡核苷酸可以通过核酸酶介导的靶核酸降解起作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选核酸内切核酸酶(RNase)，诸如RNA酶H。通过核酸酶介导的机制起作用的寡核苷酸设计的实例是以下寡核苷酸，其通常包含至少5或6个DNA核苷的区域，并且在一侧或两侧侧接亲和力增强的核苷，例如gapmer，头体(headmer)和尾体(tailmer)。
[0241] RNA酶H的活性和募集
[0242] 反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其与互补RNA分子双链体时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供用于测定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于测定募集RNA酶H的能力。通常如果是以下情况则认为寡核苷酸能够募集RNA酶H：当与互补靶核酸序列一起提供时所述寡核苷酸具有使用寡核苷酸(其与被测试的经修饰的寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有DNA单体，寡核苷酸中所有单体之间具有硫代磷酸酯连接)以及使用WO01/23613(通过引用并入本文)的实施例91-95提供的方法测定的初始速率的至少5％，诸如至少10％，或者20％以上的以pmol/1/min测量的初始速率。
[0243] Gapmer
[0244] 如本文所用，术语gapmer是指反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包含募集寡核苷酸的RNA酶H的区域(缺口)，所述区域5’和3’侧接包含一个或更多个经亲和力增强修饰的核苷(侧翼或翼)。本文描述了各种缺口设计。头体和尾体是能够募集RNA酶H的寡核苷酸，其中一个侧翼缺失，即寡核苷酸的仅一个末端包含经亲和力增强修饰的核苷。对于头体，3’侧翼是缺失的(即5’侧翼包含增强亲和力的经修饰的核苷)，对于尾体，5’侧翼是缺失的(即3’侧翼包含经亲和力增强修饰的核苷)。
[0245] LNA gapmer
[0246] 术语LNA gapmer是gapmer寡核苷酸，其中至少一个经亲和力增强修饰的核苷是LNA核苷。在一些实施方案中，LNA gapmer中的LNA核苷是β-D-氧基LNA核苷和/或6’甲基β-D-氧基LNA核苷(诸如(S)cET核苷。
[0247] 混合翼gapmer
[0248] 术语混合翼gapmer是指LNA gapmer，其中侧翼区域包含至少一个LNA核苷和至少一个非LNA修饰的核苷，诸如至少一个DNA核苷或至少一个经2’取代修饰的核苷，诸如，例如，2’-O-烷基-RNA，2’-O-甲基-RNA，2’-烷氧基-RNA，2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)，2’-氨基-DNA，2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施方案中，混合翼gapmer具有一个包含LNA核苷(例如5’或3’)的侧翼，和另一个包含经2’取代修饰的核苷的侧翼(分别为3’或5’)。在一些实施方案中，混合翼gapmer中的LNA核苷是β-D-氧基LNA核苷和/或6’甲基β-D-氧基LNA核苷(诸如(S)cET核苷。
[0249] 缀合物
[0250] 如本文所用，术语缀合物是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的寡核苷酸。
[0251] 如本文所用，术语缀合物是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的寡核苷酸。
[0252] 在一些实施方案中，非核苷酸部分选自由以下各项组成的组：蛋白质，诸如酶，抗体或抗体片段或肽；亲脂部分，诸如脂质，磷脂，甾醇；聚合物，诸如聚乙二醇或聚丙二醇；受体配体；小分子；报告分子；和非核苷的碳水化合物。
[0253] 接头
[0254] 连接或接头是两个原子之间的连接，其通过一个或更多个共价键一个化学基团或目标片段连接到另一个化学基团或目标片段。缀合部分可直接或通过连接部分(例如接头或系链)连接至寡核苷酸。接头用于共价连接第三区域(例如缀合物部分)至寡核苷酸(例如，区域A或C的末端)。
[0255] 在本发明的一些实施方案中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可任选地包含位于寡核苷酸和缀合物部分之间的接头区。在一些实施方案中，缀合物和寡核苷酸之间的接头是可生物切割的。
[0256] 包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物切割的接头，该接头在哺乳动物体内通常遇到的条件或与之相似的条件下可被切割。生理上不稳定的连接子经历化学转化的条件(诸如裂解)包括化学条件，诸如pH，温度，氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中发现的盐浓度或在哺乳动物细胞中遇到的那些相似的盐浓度。哺乳动物细胞内状况还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性的存在，所述酶活性诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施方案中，生物可切割的接头对S1核酸酶切割敏感。在一个优选的实施方案中，核酸酶敏感性接头包含1至10个核苷，诸如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个核苷，更优选2至6个核苷，最优选2和4个之间的连接的核苷，其包含至少两个连续的磷酸二酯连接，例如至少3或4或5个连续的磷酸二酯连接。优选地，核苷是DNA或RNA。含有生物可切割的接头的磷酸二酯在WO2014/076195(通过引用结合于此)中有更详细的描述，并且可以在本文中称为区域D。
[0257] 缀合物也可以通过非生物可切割的接头与寡核苷酸连接，或者在一些实施方案中，缀合物可以包含与生物可切割的接头共价附接的不可切割的接头。接头不一定是生物可切割的，但主要用于将缀合物部分共价连接至寡核苷酸或生物可切割的接头。可包含链结构或重复单元(例如乙二醇，氨基酸单元或氨基烷基)的寡聚体。在一些实施方案中，接头(区域Y)是氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基，包括诸如C6至C12氨基烷基。在一些实施方案中，接头(区域Y)是C6氨基烷基。缀合物接头基团可以通过使用经氨基修饰的寡核苷酸和缀合物基团上的活化酯基团常规附接到寡核苷酸上。
[0258] 治疗
[0259] 本文所用的术语’治疗’是指治疗现有疾病(例如本文所述的疾病或病症)或预防(prevention)疾病，即预防(prophylaxis)。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。
发明内容
[0260]
[0261] 本发明的寡核苷酸
[0262] 本发明涉及能够抑制HTRA1表达的寡核苷酸。调节可以通过与编码HTRA1或参与HTRA1调节的靶核酸杂交实现。靶核酸可以是哺乳动物HTRA 1序列，诸如选自由SEQ ID 1，2，3或4组成的组的序列。
[0263] 本发明的寡核苷酸是靶向HTRA1(例如哺乳动物HTRA1)的反义寡核苷酸。
[0264] 在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸能够通过抑制或下调靶标来调节靶标的表达。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少20％的表达的抑制，诸如与所述靶标的正常表达水平相比至少30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％的抑制。在一些实施方案中，使用ARPE-19细胞，本发明的化合物可能能够在体外使HTRA1 mRNA的表达水平抑制至少60％或70％。在一些实施方案中，使用ARPE-19细胞，本发明的化合物可能能够在体外使HTRA1 mRNA的表达水平抑制至少60％或70％。在一些实施方案中，使用ARPE-19细胞，本发明的化合物可能能够在体外使HTRA1蛋白质的表达水平抑制至少50％。合适地，实施例提供可用于测量HTRA1 RNA或蛋白质抑制的测定。通过寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸之间的杂交触发靶标调节。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含寡核苷酸和靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可足以显示HTRA1表达的所期望的调节。由错配导致的降低的结合亲和力可以有利地通过寡核苷酸中核苷酸数量的增加和/或能够增加与靶标结合亲和力的经修饰核苷酸的数量的增加来补偿，所述经修饰的核苷诸如存在于寡核苷酸序列中的2’修饰的核苷酸，包括LNA。
[0265] 本发明的一个方面涉及一种反义寡核苷酸，其包含长度为10至30个核苷酸的与HTRA1靶序列具有至少90％的互补性(诸如与HTRA1靶序列(例如选自由SEQ ID NO 1，2，3&4组成的组的核酸)完全互补)的连续核苷酸区域。
[0266] 在一些实施方案中，寡核苷酸包含与靶核酸的区域至少90％互补，诸如至少91％，诸如至少92％，诸如至少93％，诸如至少94％，诸如至少的95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，或100％互补的连续序列。
[0267] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列与靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施方案中，可在包含一个或两个在寡核苷酸和靶核酸之间的错配。
[0268] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 119，120，121，122或123组成的组的序列区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0269] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO 124-230组成的组的序列区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0270] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 186的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0271] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 192的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0272] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 205的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0273] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少13个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 186的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0274] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少13个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 192的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0275] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少13个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 205的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0276] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少14个核苷酸的连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO 113，114，115，116，117和231的序列完全(或100％)互补。
[0277] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少14个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 186的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0278] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少14个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 192的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0279] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少14个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 205的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0280] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少15个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 186的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0281] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少15个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 192的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0282] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少15个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 205的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0283] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少16个核苷酸的连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO SEQ ID NO 113，114，115，116，117和231的序列完全(或100％)互补。.
[0284] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少16个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 186的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0285] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少16个诸如16，17或18个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 192的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0286] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少16个核苷酸的连续核苷酸序列与SEQ ID NO 205的区域至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0287] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域与选自由选自由以下各项组成的组的序列组成的组的序列完全(或100％)互补：SEQ ID NO SEQ ID NO 113，114，115，116，117和231。
[0288] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域与选自由选自由SEQ ID NO 124-230组成的组的序列组成的组的序列完全(或100％)互补。
[0289] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域与SEQ ID NO 186完全(或100％)互补。
[0290] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域与SEQ ID NO 192完全(或100％)互补。
[0291] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域与SEQ ID NO 205完全(或100％)互补。
[0292] 应当理解，可以修饰寡核苷酸基序序列以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。在定义和″寡核苷酸设计″部分中描述了修饰。
[0293] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域与靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或者在一些实施方案中，可包含一个或两个在寡核苷酸和靶核酸之间的错配。在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，与靶核酸序列至少90％互补，诸如完全(或100％)互补。
[0294] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO 5至111的序列具有100％同一性。
[0295] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少14个核苷酸的连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO 5至111的序列具有100％同一性。
[0296] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其至少16个核苷酸的连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO 5至111的序列具有100％同一性。
[0297] 在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域包含选自SEQ ID NO 5-111的序列或由其组成。
[0298] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸选自下组(注意，靶标子序列是寡核苷酸基序的反向互补序列)：
[0299]
[0300]
[0301]
[0302]
[0303] 或其缀合物；其中对于标题为化合物设计的列，大写字母为LNA核苷，小写字母为DNA核苷，胞嘧啶核苷任选为5甲基胞嘧啶，核苷间连接为至少80％，诸如至少90％或100％修饰的核苷间连接，如硫代磷酸酯核苷间连接。在一些实施方案中，上表的化合物设计列中的化合物的所有核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。基序和靶标子序列是核碱基序列。
[0304] 本发明提供以下寡核苷酸：
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309] 或其缀合物；其中在上表的化合物中，大写字母表示β-D-氧基LNA核苷，所有LNA胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(如上标m所示)，小写字母表示DNA核苷，小写字母c之前的上标m代表5甲基胞嘧啶DNA核苷。所有核苷间连接(linkages)都是硫代磷酸酯核苷间连接。
[0310] 寡核苷酸设计
[0311] 寡核苷酸设计是指寡核苷酸序列中核苷糖修饰的模式。本发明的寡核苷酸包含糖修饰的核苷，并且还可以包含DNA或RNA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含糖修饰的核苷和DNA核苷。将经修饰的核苷掺入本发明的寡核苷酸中可以增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力。在那种情况下，经修饰的核苷可以称为经亲和力增强修饰的核苷酸。
[0312] 在一个实施方案中，寡核苷酸包含至少1个修饰的核苷，诸如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15或至少16个经修饰的核苷。在一个实施方案中，寡核苷酸包含1至10个经修饰的核苷，诸如2至9个经修饰的核苷，诸如3至8个经修饰的核苷，诸如4至7个经修饰的核苷，诸如6或7个经修饰的核苷。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可包含修饰，其独立地选自这三种类型的修饰经修饰的糖，经修饰的核碱基和经修饰的核苷间连接)或其组合。优选地，寡核苷酸包含一种或多种糖修饰的核苷，诸如2’糖修饰的核苷。优选地，本发明的寡核苷酸包含一个或多个经2’糖修饰的核苷，其独立地选自2’-O-烷基-RNA，2’-O-甲基-RNA，2’-烷氧基-RNA，2’-O-甲氧基乙基-RNA，2’-氨基-DNA，2’-氟-DNA，阿拉伯糖核酸(arabino nucleic acid，ANA)，2’-氟-ANA和LNA核苷。甚至更优选地，所述一种或更多个修饰的核苷是LNA。
[0313] 在一些实施方案中，至少1个经修饰的核苷是锁核酸(LNA)，诸如至少2个，诸如至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个或至少8个经修饰的核苷是LNA。在又另一个实施方案中，所有经修饰的核苷均为LNA。
[0314] 在另一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间连接。在一个优选的实施方案中，在连续核苷酸序列内的核苷间连接是硫代磷酸酯或硼酸磷酸核苷间连接。在一些实施方案中，寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间连接是硫代磷酸酯连接。
[0315] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷，所述经修饰的核苷是2’-MOE-RNA，诸如2，3，4，5，6，7，8，9或102’-MOE-RNA核苷单元。在一些实施方案中，所述修饰的核苷中的至少一个是2’-氟DNA，诸如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2’-氟DNA核苷单元。
[0316] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单元，诸如1，2，3，4，5，6，7或8个LNA单元，诸如2至6个LNA单元，诸如3至7个LNA单元，4至8个LNA单元或3，4，5，6或7个LNA单元。在一些实施方案中，所有经修饰的核苷都是LNA核苷。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸区域具有在核苷酸序列的5’端具有至少1个LNA单元，和在核苷酸序列的3’端具有至少2个LNA单元。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸中存在的所有胞嘧啶核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
[0317] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个LNA单元和至少一个经2’取代修饰的核苷。
[0318] 在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸包含2’糖修饰的核苷和DNA单元。
[0319] 在本发明的一个实施方案中，本发明的寡核苷酸能够募集RNA酶H。
[0320] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域是gapmer寡核苷酸。
[0321] Gapmer设计
[0322] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸区域具有gapmer设计或结构，在本文中也称为“Gapmer”。在gapmer结构中，寡核苷酸以’5→3”方向包含至少三个不同的结构区域，5’-侧翼，缺口和3’-侧翼，F-G-F’在该设计中，侧翼区域F和F’(也称为翼区)包含至少一个与区域G相邻的糖修饰的核苷，并且在一些实施方案中可以包含2-7个糖修饰的核苷的连续区段，或者是糖修饰的和DNA核苷的连续区段(包含糖修饰的和DNA核苷的混合翼)。因此，与缺口区域相邻的5’侧翼区域和3’侧翼区域的核苷是糖修饰的核苷，诸如经2’修饰的核苷。当寡核苷酸与HTRA1靶核酸双链体连接时，缺口区域G包含能够募集RNA酶H的连续核苷酸片段。在一些实施方案中，区域G包含5-16个DNA核苷的连续区段。gapmer区F-G-F’与HTRA1靶核酸互补，因此可以是寡核苷酸的连续核苷酸区。
[0323] 位于区域G的5’和3’末端的区域F和F’可以包含一种或更多种经亲和力增强修饰的核苷。在一些实施方案中，3’侧翼包含至少一个LNA核苷，优选至少2个LNA核苷。在一些实施方案中，5’侧翼包含至少一个LNA核苷。在一些实施方案中，5’和3’侧翼区均包含LNA核苷。在一些实施方案中，侧翼区域中的所有核苷都是LNA核苷。在其他实施方案中，侧翼区可包含LNA核苷和其他核苷(混合侧翼)，诸如DNA核苷和/或非LNA修饰的核苷，诸如经2’取代的核苷。在这种情况下，缺口定义为至少5个RNA酶H募集核苷(如5-16个DNA核苷)在5’和3’端侧接有亲和力增强修饰核苷(如LNA)的连续序列作为β-D-氧基-LNA。
[0324] 区域F
[0325] 附接于区域G的5’末端的区域F(5’侧翼或5’翼)包含或含有至少一个糖修饰的核苷，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个经修饰的核苷或由其组成。在一些实施方案中，区域F包含1至7个经修饰的核苷或由其组成，诸如2至6个经修饰的核苷，诸如2至5个经修饰的核苷，诸如2至4个经修饰的核苷，诸如1至3个经修饰的核苷。核苷，诸如1，2，3或4个经修饰的核苷。
[0326] 在一个实施方案中，区域F中的一个或更多个或所有的经修饰的核苷是经2’修饰的核苷。
[0327] 在另一个实施方案中，区域F中的经2’修饰的核苷中的一个或多个选自2’-O-烷基-RNA单元，2’-O-甲基-RNA，2’-氨基-DNA单元，2’-氟-DNA单元，2’-烷氧基-RNA，MOE单元，LNA单元，阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元。
[0328] 在本发明的一个实施方案中，区域F中的所有修饰的核苷均为LNA核苷。在另一个实施方案中，区域F中的LNA核苷独立地选自由β-D或α-L构型的氧基-LNA，硫代-LNA，氨基-LNA，cET和/或ENA或其组合组成的组。在一个优选的实施方案中，区域F在连续序列的5’末端具有至少1个β-D-氧基LNA单元。
[0329] 区域G
[0330] 区域G(缺口区域)可以包含，含有或由能够募集RNA酶H的5-16个连续DNA核苷组成。在另一个实施方案中，区域G包含或含有5至12个，或6至10个或7至9个诸如8个能够募集RNaseH的连续核苷酸单元或由其组成。
[0331] 在另一个实施方案中，区域G中的至少一个核苷单元是DNA核苷单元，例如4至20个或6至18个DNA单元，例如5至16个。在一些实施方案中，区域G的所有核苷是DNA单元。
[0332] 在进一步的实施方案中，区域G可以由DNA和能够介导RNA酶H切割的其他核苷的混合物组成。在一些实施方案中，区域G的至少50％的核苷是DNA，诸如至少60％，至少70％或至少80％或至少90％的DNA。
[0333] 区域F’
[0334] 附接于区域G的3’末端的区域F(3’侧翼或3’翼)包含或含有至少一个糖修饰的核苷，例如至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个经修饰的核苷或由其组成。在一些实施方案中，区域F’包含1至7个经修饰的核苷例如2至6个经修饰的核苷，例如2至5个经修饰的核苷，例如2至4个经修饰的核苷，例如1至3个经修饰的核苷，例如1，2，3或4个经修饰的核苷，或由其组成。
[0335] 在一个实施方案中，区域F’中的一个或更多个或所有修饰的核苷是经2’修饰的核苷。
[0336] 在另一个实施方案中，区域F’中的经2’修饰的核苷中的一个或更多个选自2’-O-烷基-RNA单元，2’-O-甲基-RNA，2’-氨基-DNA单元，2’-氟-DNA单元，2’-烷氧基-RNA，MOE单元，LNA单元，阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元。
[0337] 在本发明的一个实施方案中，区域F’中的所有修饰的核苷均为LNA核苷。在另一个实施方案中，区域F’中的LNA核苷独立地选自由β-D或α-L构型的氧基-LNA，硫代-LNA，氨基-LNA，cET和/或ENA或其组合组成的组。在一个优选的实施方案中，区域F’在连续序列的5’末端具有至少1个β-D-氧基LNA单元。
[0338] 区域D，D’和D”
[0339] 本发明的寡核苷酸包含与靶核酸互补的连续核苷酸区域。在一些实施方案中，寡核苷酸可进一步包含位于连续核苷酸区域5’和/或3’的另外的核苷酸，其在本文中称为区域D。区域D’和D’可以分别连接到区域F’的5’端或区域F’的3’端。在一些实施方式中，D区域(区域D’或D”)可以形成与靶核酸互补的连续核苷酸序列的一部分，或者在其他实施方式中，D区域(一个或多个)可以与靶核酸不互补。
[0340] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含连续核苷酸区域和任选地1-5个另外的5’核苷酸(区域D’)或由其组成。
[0341] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含连续核苷酸区域和任选地1-5个另外的3’核苷酸(区域D”)或由其组成。
[0342] 区域D’或D”可以独立地包含1，2，3，4或5个另外的核苷酸，所述另外的核苷酸可以与靶核酸互补或不互补。在这方面，本发明的寡核苷酸可，在一些实施方案中包含能够调节靶标的连续核苷酸序列，所述靶标在5’和/或3’端侧接有另外的核苷酸。这种另外的核苷酸可用作核酸酶敏感的生物可切割的接头，因此可以用于将诸如缀合物部分的官能团附接到本发明的寡核苷酸上。在一些实施方案中，所述另外的5’和/或3’末端核苷酸与磷酸二酯连接连接，并且可以是DNA或RNA。在另一个实施方案中，所述另外的5’和/或3’末端核苷酸是经修饰的核苷酸，其可以例如被包括以增强核酸酶的稳定性或为了易于合成。在一些实施方案中，除了连续核苷酸区域外，本发明的寡核苷酸还包含区域D’和/或D”。
[0343] 在一些实施方案中，本发明的gapmer寡核苷酸可以由下式表示：
[0344] F-G-F’；特别是F1-7-G4-12-F’1-7
[0345] D’-F-G-F’，特别是D’1-3-F1-7-G4-12-F’1-7
[0346] F-G-F’-D”，特别是F1-7-G4-12-F’1-7-D”1-3
[0347] D’-F-G-F’-D”，特别是D’1-3-F1-7-G4-12-F’1-7-D”1-3。
[0348] 制备方法
[0349] 在另一方面，本发明提供了制备本发明寡核苷酸的方法，所述方法包括使核苷酸单元反应，从而形成寡核苷酸中包含的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，该方法使用亚磷酰胺化学方法(参见诸如Caruthers等，1987，Methods in Enzymology，第154卷，第287-313页)。在另一个实施方案中，所述方法还包括使连续核苷酸序列与缀合部分(配体)反应。
在另一方面，提供了制备本发明组合物的方法，所述方法包括将本发明的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸与药学上可接受的稀释剂，溶剂，载体，盐和/或佐剂混合。
在另一方面，提供了制备本发明组合物的方法，所述方法包括将本发明的寡核苷酸或缀合的寡核苷酸与药学上可接受的稀释剂，溶剂，载体，盐和/或佐剂混合。
[0350] 药用盐
[0351] 为了用作治疗剂，可以提供本发明的寡核苷酸作为合适的药用盐，诸如钠盐或钾盐。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸是钠盐。
[0352] 药物成分
[0353] 在另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含任何上述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物以及药学上可接受的稀释剂，载体，盐和/或佐剂。药学上可接受的稀释剂包括磷酸缓冲盐水(PBS)，药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是无菌磷酸缓冲盐水。在一些实施方案中，寡核苷酸以50-300μM溶液的浓度在药学上可接受的稀释剂中使用。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸以10-1000μg的剂量施用。
[0354] WO 2007/031091提供药学上可接受的稀释剂，载体和佐剂的合适的和优选的实例(在此此通过引用并入)。WO2007/031091中也提供合适的剂量，制剂，施用途径，组合物，剂型，与其他治疗剂的组合，前药制剂。
[0355] 可以将本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物与药学上可接受的活性或惰性物质混合用于制备药物组合物或制剂。用于配置药物组合物的组合物和方法取决于许多标准，包括但不限于给药途径，疾病程度或施用剂量。
[0356] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是前药。特别是对于寡核苷酸缀合物，特别是对于寡核苷酸缀合物，一旦将前药递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就被从寡核苷酸切割。
[0357] 应用
[0358] 本发明的寡核苷酸可用作研究试剂，例如用于诊断，治疗和预防。
[0359] 在研究中，这种寡核苷酸可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中HTRA1蛋白的合成，从而有助于靶标的功能分析或评估其作为治疗干预靶标的有用性。通常，通过降解或抑制产生蛋白质的mRNA，从而防止蛋白质形成来实现靶标调节，或通过降解或抑制产生蛋白质的基因或mRNA的调节物来实现靶标调控。
[0360] 在诊断中，寡核苷酸可用于通过Northern印迹，原位杂交或类似技术检测和定量细胞和组织中的HTRA1表达。
[0361] 对于治疗剂，怀疑患有疾病或病症的动物或人，可以通过调节HTRA1的表达来治疗。
[0362] 本发明提供用于治疗或预防疾病的方法，该方法包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物。
[0363] 本发明还涉及如本文定义的寡核苷酸，组合物或缀合物，其用作药物。
[0364] 根据本发明的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物通常以有效量施用。
[0365] 本发明还提供如所述的本发明的寡核苷酸或寡核苷酸缀合物在制备用于治疗本文提及所述病症的药物中的用途，或用于本文所提及的病症的治疗方法的用途。
[0366] 如本文所提及的，该疾病或病症与HTRA1的表达有关。在一些实施方案中，疾病或病症可以与在HTRA1基因或其蛋白质产物与HTRA1相关或相互作用的基因中的突变相关。因此，在一些实施方案中，靶核酸是HTRA1序列的突变形式，而在其他实施方案中，靶核酸是HTRA1序列的调节物。
[0367] 本发明的方法优选用于治疗或预防由HTRA1的异常水平和/或活性引起的疾病。
[0368] 本发明进一步涉及如本文所定义的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物在制备用于治疗HTRA1的异常水平和/或活性的药物中的用途。
[0369] 在一个实施方案中，本发明涉及寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物，其用于治疗选自以下各项的疾病或病症：眼疾病，诸如黄斑变性，包括年龄相关的黄斑变性(AMD)，诸如干性AMD或湿性AMD，和糖尿病性视网膜病。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物或药物组合物可以用于治疗地图状萎缩或中期dAMD。HTRA1也已经被显示在阿尔茨海默病和帕金森病中，因此在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物或药物组合物可以用于治疗阿尔茨海默病或帕金森病。HTRA1也已经被显示在在迪谢内肌营养不良，关节炎，诸如骨关节炎，家族性缺血性脑小血管疾病中，因此，在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物或药物组合物可用于治疗迪谢内肌营养不良，关节炎，诸如骨关节炎，或家族性缺血脑小血管疾病。
[0370] 施用
[0372] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸，缀合物或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内，动脉内，皮下，腹膜内或肌内注射或输注，鞘内或颅内，例如脑内或室内(intraventricular)施用。在一些实施方案中，活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物静脉内施用。在另一个实施方案中，皮下施用活性寡核苷酸或寡核苷酸缀合物。
[0373] 用于治疗眼部疾病，诸如黄斑变性，AMD(湿性或干性)，可以使用眼内注射。
[0374] 在一些实施方案中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐通过眼内注射施用，剂量为每眼约10μg至约200μg，诸如每眼约50μg至约150μg，诸如每眼约100μg。在一些实施方案中，剂量间隔，即连续给药之间的时间段是至少每月，诸如至少每两个月或至少每三个月一次。
[0375] 组合疗法
[0376] 在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸，寡核苷酸缀合物或药物组合物用于与另一种治疗剂的组合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或病症的护理标准品实施例
[0377] 材料与方法
[0378] 寡核苷酸合成
[0379] 寡核苷酸合成是本领域公知的。以下是可以应用的方案。本发明的寡核苷酸可以通过在所用的装置，支持物和浓度方面略有变化的方法来制备。
[0380] 寡核苷酸使用亚磷酰胺方法以1μmol规模在Oligomaker 48上在尿苷通用支持物上合成。合成结束时，使用氨水在60℃下将寡核苷酸从固相支持物中切割5-16小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相提取纯化寡核苷酸，并通过UPLC进行表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。
[0381] 寡核苷酸的延伸：
[0382] β-氰基乙基亚磷酰胺(DNA-A(Bz)，DNA-G(ibu)，DNA-C(Bz)，DNA-T，LNA-5-甲基-C(Bz)，LNA-A(Bz)，LNA-G(dmf)，LNA-T)的偶联通过使用0.1M的5’-O-DMT保护的亚酰胺在乙腈中的溶液和DCI(4，5-二氰基咪唑)在乙腈(0.25M)中的溶液作为激活剂进行。对于最后的循环，可以使用具有期望修饰(例如，用于附接缀合物基团或像这样的缀合物基团的C6接头)的亚磷酰胺。用于硫代磷酸酯连接的引入的硫醇化通过使用氢化黄原素(xanthane hydride)(在乙腈/吡啶9∶1中，0.01M)进行。磷酸二酯连接可以在THF/吡啶/水7∶2∶1中使用0.02M碘引入。其余的试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。
[0383] 对于固相合成后的缀合，可以在固相合成的最后一个循环中使用市售的C6氨基接头磷酰胺，并且在从固体载体上去保护和切割后，分离出氨基连接的脱保护的寡核苷酸。通过使用标准合成方法激活官能团来引入缀合物。
[0384] 通过RP-HPLC纯化：
[0385] 通过制备型RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10mm层析柱上纯化粗化合物。使用0.1M醋酸铵pH 8和乙腈作为缓冲液，流速为5mL/min。将收集的级分冻干，得到纯化的化合物，通常为白色固体。
[0386] 缩写：
[0387] DCI：4，5-二氰基咪唑
[0388] DCM：二氯甲烷
[0389] DMF：二甲基甲酰胺
[0390] DMT：4，4’-二甲氧基三苯甲基
[0391] THF：四氢呋喃
[0392] Bz：苯甲酰
[0393] Ibu：异丁酰
[0394] RP-HPLC：反相高效液相层析
[0395] Tm测定：
[0396] 将寡核苷酸和RNA靶标(磷酸酯连接的，PO)双链体在500ml无RNase的水中稀释至3mM，并与500ml 2x Tm-缓冲液(200mM NaCl，0.2mM EDTA，20mM磷酸钠，pH 7.0)混合。将溶液加热到95℃3分钟，然后在室温下退火30分钟。双链体熔解温度(Tm)在配备有Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计上使用PE Templab软件(Perkin Elmer)测量。温度从20℃上升到95℃，然后下降到25℃，记录在260nm处的吸收。熔解和退火的一阶导数和局部最大值用于评估双链体Tm。
[0397] 所用的寡核苷酸：
[0398]
[0399]
[0400]
[0401]
[0402] 对于化合物：大写字母代表LNA核苷(使用了β-D-氧基LNA核苷)，所有LNA胞嘧啶均是5-甲基胞嘧啶，小写字母代表DNA核苷，DNA胞嘧啶前面带有上标m代表5-甲基C-DNA核苷。所有核苷间连接(linkages)都是硫代磷酸酯核苷间连接。在EP16177508.5和EP17170129.5中，化合物A公开为化合物143，1且化合物B公开为145，1，且用作阳性对照化合物。
[0403] 实施例1.以单一浓度测试LNA寡核苷酸在U251细胞系中的体外功效。
[0404] 确定针对HTRA1的有希望的“热点”区域。处理6天后，在5μM的U251细胞系中筛选了n＝231个HTRA1 LNA寡核苷酸的文库。从该文库中，我们鉴定了一系列靶向人HTRA1前体mRNA的活性寡核苷酸(在位置53113-53384之间)，如图1所示(SEQ ID NO 116或117)。
[0405] 人胶质母细胞瘤U251细胞系购自ECACC，并按照供应商的建议在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中维持。为了测定，将15000个U251细胞/孔接种在96多孔板中在饥饿培养基(供应商推荐的培养基，除了1％FBS而不是10％)中。将细胞温育24小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸浓度：5μM。添加寡核苷酸后3-4天，除去培养基并添加新培养基(无寡核苷酸)。加入寡核苷酸后6天，收获细胞。使用PureLink Pro 96 RNA纯化试剂盒(Ambion，根据制造商的说明)提取RNA。然后使用M-MLT逆转录酶，随机十聚体RETROscript，RNase抑制剂(Ambion，按照制造商的说明)，100mM dNTP组(PCR级别，Invitrogen)和无DNase/RNase的水(Gibco)合成cDNA。对于基因表达分析，使用TagMan Fast Advanced Master Mix(2X)(Ambion)以doublex设置进行qPCR。以下TaqMan引物测定用于qPCR：来自Life Technologies的HTRA1，Hs01016151_m1(FAM-MGB)和管家基因TBP，Hs4326322E(VIC-MGB)。n＝2个独立的生物学重复。该表中残留的HTRA1 mRNA表达水平显示为对照(PBS处理的细胞)的％。
[0406]
[0407] 实施例2：以单一浓度测试LNA寡核苷酸在U251细胞系中的体外功效。
[0408] 在新的n＝210HTRA1 LNA寡核苷酸文库中对实施例1中描述的“热点”区域53113-53384进行了进一步验证，该文库已在U251细胞系中以5μM的浓度进行了筛选。n＝33个LNA寡核苷酸靶向人类HTRA1前-mRNA(在位置53113-53384之间)，与其余寡核苷酸相比，这些寡核苷酸相对活跃，如图2所示。
[0409] 如实施例1所述进行测定。n＝2个独立的生物学重复。剩余的HTRA1 mRNA表达水平在表中显示为对照(PBS处理的细胞)的％。
[0410]
[0411]
[0412] 实施例3.以单一浓度测试LNA寡核苷酸在U251和ARPE19细胞系中的体外功效。
[0413] 在新的n＝305 HTRA1 LNA寡核苷酸文库中对实施例1和2中描述的“热点”区域53113-53384进行了进一步验证，该文库已在U251和ARPE19细胞系中分别以5μM和25μM的浓度进行了筛选。n＝95个LNA寡核苷酸靶向人类HTRA1前-mRNA(在位置53113-53384之间)，与其余寡核苷酸相比，这些寡核苷酸相对活跃，如图3所示。
[0414] 人视网膜色素上皮ARPE19细胞系购自ATCC，并在37℃，5％CO2的潮湿培养箱中，在DMEM-F12(Sigma，D8437)，10％FBS，1％pen/strep中维持。U251细胞系在实施例1中描述。为了测定，将2000U251或ARPE19细胞/孔接种在96多孔板中，在供应商推荐的培养基中。将细胞温育2小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸的浓度在U251和ARPE19细胞中分别为5和25μM。加入寡核苷酸后4天，收获细胞。如实施例1所述进行RNA提取，使用qScript XLT one-step RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(Quanta Biosciences)进行cDNA合成和qPCR。接着，将TaqMan引物分析用于U251和ARPE19细胞，以douplex设置：HTRA1，Hs01016151_m1(FAM-MGB)和管家基因GAPDH，Hs4310884E(VIC-MGB)。所有引物组均购自Life Technologies。n＝1个生物学重复。该表中相对的HTRA1 mRNA表达水平显示为对照(PBS处理的细胞)的％。
[0415]
[0416]
[0417]
[0418] 实施例4.在剂量响应曲线中测试所选化合物在U251和ARPE19细胞系中的体外效能和功效。
[0419] U251和ARPE19细胞系分别在实施例1和3中描述了。如实施例1所述进行U251测定。ARPE19测定方法如下：将5000个ARPE19细胞/孔接种到96多孔板中在供应商推荐的培养基中(除了5％FBS而不是10％)。将细胞温育2小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸浓度：从50μM，半对数稀释，8点。加入寡核苷酸后4天，收获细胞。如实施例1中所述进行RNA提取，cDNA合成和qPCR。n＝2个独立的生物学重复。50μM的EC50值和残留的HTRA1 mRNA水平，在表中以对照(PBS)的％显示。
[0420]
[0421] 实施例5，在剂量响应曲线中测试所选化合物在U251和ARPE19细胞系中的体外效力和功效。
[0422] 如实施例3中所述进行测定。寡核苷酸浓度：从50μM，半对数稀释，8个点。对于U251和ARPE19，分别n＝2和n＝1个独立的生物学重复。50μM的EC50值和残留的HTRA1 mRNA水平，在表中以对照(PBS)的％显示。
[0423]
[0424]
[0425] 实施例6.在剂量响应曲线中测试所选化合物在U251细胞系中的体外效能和功效。
[0426] 如实施例3中所述进行测定。寡核苷酸浓度：从50μM，半对数稀释，8个点。n＝2个独立的生物学重复。50μM的EC50值和残留的HTRA1 mRNA水平，在表中以对照(PBS)的％显示。
[0427]
[0428]
[0429] 实施例7.在剂量响应曲线中测试所选化合物在U251细胞系中的体外效能和功效。
[0430] 实施例3描述了ARPE19细胞系。为了进行测定，将ARPE19细胞(每孔24000个细胞)以100μL的密度接种在96多孔板的饥饿培养基(供应商推荐的培养基中，除了1％FBS而不是10％的培养基)中。将细胞温育2小时，然后添加溶解在PBS中的寡核苷酸。寡核苷酸浓度：从
50μM，半对数稀释，8个点。加入寡核苷酸化合物后的第4天和第7天，将75μL不含寡核苷酸的新鲜饥饿培养基添加到细胞中(不去除旧培养基)。如实施例3中所述进行RNA提取，cDNA合成和qPCR。n＝2个独立的生物学重复。50μM的EC50值和残留的HTRA1 mRNA水平，在表中以对照(PBS)的％显示。
50μM，半对数稀释，8个点。加入寡核苷酸化合物后的第4天和第7天，将75μL不含寡核苷酸的新鲜饥饿培养基添加到细胞中(不去除旧培养基)。如实施例3中所述进行RNA提取，cDNA合成和qPCR。n＝2个独立的生物学重复。50μM的EC50值和残留的HTRA1 mRNA水平，在表中以对照(PBS)的％显示。
[0431]
[0432] 实施例8.
[0433] 测试在人原代RPE细胞中的体外功效。
[0434] 人原代视网膜色素上皮(hpRPE)细胞购自Sciencell(Cat#6540)。为了进行测定，将5000hpRPE细胞/孔接种在培养基(EpiCM，Sciencell Cat#4101)中的Laminin(Laminin 521，BioLamina Cat#LN521-03)包被的96多孔板中。将它们在此培养基中扩增一周，并在以下培养基中分化2周：补充有N1补充剂(MEM Cat#N-6530)的MEM α培养基(Sigma Cat#M-
4526)，谷氨酰胺-青霉素-链霉素(Sigma Cat#G-1146)，非必需氨基酸(NEAA，Sigma Cat#M-
7145)，牛磺酸(Sigma Cat#T-0625)，氢化可的松(Sigma Cat#H-03966)，三碘甲状腺素(Sigma Cat#T-5516)和牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat#A-9647)。将细胞在37℃，5％CO2的潮湿培养箱培养。
4526)，谷氨酰胺-青霉素-链霉素(Sigma Cat#G-1146)，非必需氨基酸(NEAA，Sigma Cat#M-
7145)，牛磺酸(Sigma Cat#T-0625)，氢化可的松(Sigma Cat#H-03966)，三碘甲状腺素(Sigma Cat#T-5516)和牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat#A-9647)。将细胞在37℃，5％CO2的潮湿培养箱培养。
[0435] 在实验当天，在添加寡核苷酸之前，将细胞与新鲜的分化培养基一起温育1小时。将它们溶于PBS中，并在第0天和第4天应用于细胞。在第7天，更换培养基，在第10天，用50μl具有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(Qiagen Cat#79216)收获细胞。根据Qiagen RNeasy mini试剂盒(产品目录号74104；批号151048073)的用户手册进行RNA提取，包括DNase I处理(产品目录号79254；批号151042674)。RNA质量控制使用Agilent Bioanalyzer Nano Kit(Agilent；Cat#5067-1511；Lot 1446)进行。根据制造商的说明(Thermo Fisher Scientific，Cat#4368814；Lot 00314158)，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(基于随机六聚体寡核苷酸)将总RNA逆转录为cDNA(cDNA合成)。cDNA样品的测量在7900HT实时PCR仪(Thermo Fisher Scientific)上以384孔板形式一式三份地进行。以下TaqMan引物测定用于qPCR：来自Life Technologies的HTRA1，Hs01016151_m1和Hs00170197_m1，管家基因，GAPDH，Hs99999905_m1和PPIA，Hs99999904_m1。n＝3个生物学重复。剩余的HTRA1 mRNA表达水平以对照(PBS)的％显示于图4和下表中。
[0436]
[0437]
[0438] 实施例9.食蟹猴体内药代动力学和药效学研究，治疗21天，玻璃体内(IVT)注射，单剂量。
[0439] 针对人HTRA1前mRNA(位置53113-53384之间)中“热点”的3个HTRA1 LNA寡核苷酸，在视网膜的mRNA以及视网膜和玻璃体内的蛋白水平上均观察到了敲低(见图5)
[0440] 动物
[0441] 所有实验均在食蟹猴(Macaca fascicularis)上进行。
[0442] 每组研究中包括四只动物，总共20只。
[0443] 化合物和给药程序
[0444] 在测试化合物注射之前和之后两天施用丁丙诺啡镇痛。用氯胺酮和甲苯噻嗪肌肉注射麻醉动物。在研究第1天在局部施用丁卡因(tetracaine)麻醉剂后，在麻醉动物的双眼玻璃体内施用(每次施用50μL)测试物品和阴性对照(PBS)。
[0445] 安乐死
[0446] 在生命阶段结束时(第22天)，通过腹膜内过量注射戊巴比妥将所有猴子安乐死。
[0447] 通过qPCR测量寡核苷酸含量并定量Htra1 RNA表达
[0448] 在安乐死后立即将眼组织迅速且小心地在冰上切片，并在-80℃下保存直至装运。视网膜样品在700μL MagNa Pure 96 LC RNA分离组织缓冲液中裂解，并通过使用precellys进化匀浆器每2ml管加入1个不锈钢珠进行匀浆2x 1，5min，然后在室温下温育30分钟。将样品以13000rpm离心5min。留出一半用于生物分析，另一半直接进行RNA提取。
[0449] 对于进行生物分析，将样品稀释10至50倍，用杂交ELISA方法测量寡核苷酸含量。将生物素化的LNA捕获探针和地高辛缀合的LNA检测探针(在5xSSCT中均为35nM，各自与待检测的LNA寡核苷酸的一端互补)与稀释的匀浆或相关标准品混合，在室温下温育30分钟然后添加到链霉亲和素包被的ELISA板中(Nunc目录号436014)。
[0450] 将板在室温温育1小时，在2×SSCT(300mM氯化钠，30mM柠檬酸钠和0.05％v/v Tween-20，pH 7.0)中洗涤。使用缀合有碱性磷酸酶(Roche Applied Science cat.No.11093274910)和碱性磷酸酶底物系统(Blue Phos substrate，KPL product code
50-88-00)的抗-DIG的抗体检测捕获的LNA双链体。寡聚复合物的量在Biotek读数器上测量为在615nm处的吸光度。
50-88-00)的抗-DIG的抗体检测捕获的LNA双链体。寡聚复合物的量在Biotek读数器上测量为在615nm处的吸光度。
[0451] 细胞RNA大容量试剂盒(05467535001，Roche)用于MagNA Pure 96系统，程序如下：组织FF标准LV3.1根据制造商的说明，包括DNAse处理。用Eon读数(Biotek)测量RNA质量控制和浓度。将RNA浓度在样品间标准化，随后使用qScript XLT one-step RT-qPCR ToughMix Low ROX，95134-100(Quanta Biosciences)在一步反应中进行cDNA合成和qPCR。
以下TaqMan引物测定法用于单链体反应中：来自Life Technologies的Htra1，
Mf01016150_，Mf01016152_m1和Rh02799527_m1和管家基因，ARFGAP2，Mf01058488_g1和Rh01058485_m1，和ARL1，Mf02795431_m1。qPCR分析在ViiA7机器(Life Technologies)上进行。眼睛/组：n＝3只眼睛。将每只眼睛视为个体样品。该表中相对的Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的％。
以下TaqMan引物测定法用于单链体反应中：来自Life Technologies的Htra1，
Mf01016150_，Mf01016152_m1和Rh02799527_m1和管家基因，ARFGAP2，Mf01058488_g1和Rh01058485_m1，和ARL1，Mf02795431_m1。qPCR分析在ViiA7机器(Life Technologies)上进行。眼睛/组：n＝3只眼睛。将每只眼睛视为个体样品。该表中相对的Htra1 mRNA表达水平显示为对照(PBS)的％。
[0452] 组织学
[0454] 对于ISH分析，使用全自动的Ventana Dicovery ULTRA染色模块(程序：mRNA Discovery Ultra Red 4.0-v0.00.0152)，使用RNAscope 2.5VS Probe-mMu-HTRA1，REF 486979，Advanced Cell Diagnostics，Inc.处理福尔马林固定的，石蜡包埋的猕猴视网膜组织切片，厚度为4μm。使用的色原是Fastred，苏木精II复染剂。
[0455] 使用基于板的免疫沉淀质谱(IP-MS)方法对HTRA1蛋白进行定量
[0456] 样品制备，视网膜
[0457] 将视网膜在4倍体积(w/v)的具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA，Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，0.25％脱氧胆酸，1％NP-40，1mM EDTA，Millipore)使用Precellys 24匀浆(5500，15s，2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm，3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)。
[0458] 样品制备，玻璃体
[0459] 将玻璃体(300μl)用5x具有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA，Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，0.25％脱氧胆酸，1％NP-40，1mM EDTA)稀释，并使用Precellys 25匀浆(5500，15s，2个循环)。将匀浆物离心(13,000rpm，3min)并测定上清液的蛋白质含量(Pierce BCA蛋白质测定)。
[0460] 基于板的HTRA1免疫沉淀和胰蛋白酶消化
[0461] 用抗HTRA1小鼠单克隆抗体(R&D MAB2916，在50μl PBS中500ng/孔)包被96孔板(Nunc MaxiSorp)，并在4℃下温育过夜。将该板用PBS(200μl)洗涤两次，并用PBS中的3％(w/v)BSA于20°封闭30分钟，然后两次PBS洗涤。将样品(在50μl PBS中的75μg视网膜，100μg玻璃体)随机化并加入板中，然后在4℃在摇床(150rpm)上孵育过夜。然后将板用PBS洗涤两次，并用水洗涤一次。然后将50mM TEAB(30μl)中的10mM DTT加入每个孔中，然后在20℃下孵育1h以还原半胱氨酸巯基。然后将50mM TEAB(5μl)中的150mM碘乙酰胺添加到每个孔中，然后在黑暗中于20℃温育30分钟，以阻断半胱氨酸巯基。向每个孔中加入10μl消化溶液(终浓度：1.24ng/μl胰蛋白酶，20fmol/μl BSA肽，26fmol/μl同位素标记的HTRA1肽，1fmol/μl iRT肽，Biognosys)，然后在20℃温育过夜。
[0462] 通过靶向质谱法的HTRA1肽定量(选择性反应监测，SRM)
[0463] 在与TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific)偶联的Ultimate RSLCnano LC上进行质谱分析。样品(20μL)直接从用于IP的96孔板注射，并在上样缓冲液(0.5％v/v甲酸，2％v/v ACN)中以5μL/min加载到Acclaim Pepmap 100捕获柱(100μm x 2em，C18，5μm， Thermo Scientific)上，持续6min。然后将肽在具有加热至40℃的集成电喷雾发射器的PepMap Easy-SPRAY分析柱(75μm x 15cm，3μm， Thermo
Scientific)上使用以下梯度以250nL/min的流速分离：6min，98％缓冲液A(2％ACN，0.1％甲酸)，2％缓冲液B(ACN+0.1％甲酸)；36min，30％缓冲液B；41min，60％缓冲液B；43min，
80％缓冲液B；49min，80％缓冲液B；50min，2％缓冲液B。TSQ Quantiva在SRM模式下运行，其具有以下参数：循环时间，1.5s；喷雾电压，1800V；碰撞气压，2mTorr；Q1和Q3分辨率，
0.7FWHM；离子传输管温度300℃。获得HTRA1肽″LHRPPVIVLQR″和同位素标记的(L-[U-13C，U-15N]R)合成形式(其用作内标)的SRM转换。
Scientific)上使用以下梯度以250nL/min的流速分离：6min，98％缓冲液A(2％ACN，0.1％甲酸)，2％缓冲液B(ACN+0.1％甲酸)；36min，30％缓冲液B；41min，60％缓冲液B；43min，
80％缓冲液B；49min，80％缓冲液B；50min，2％缓冲液B。TSQ Quantiva在SRM模式下运行，其具有以下参数：循环时间，1.5s；喷雾电压，1800V；碰撞气压，2mTorr；Q1和Q3分辨率，
0.7FWHM；离子传输管温度300℃。获得HTRA1肽″LHRPPVIVLQR″和同位素标记的(L-[U-13C，U-15N]R)合成形式(其用作内标)的SRM转换。
[0464] 使用Skyline 3.6版进行数据分析。
[0465] 蛋白质印迹
[0466] 0.5个Precellyses管(CK14_0.5ml，Bertin Technologies)中经切片的视网膜样品在带有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA的蛋白酶-抑制剂mini，11 836 170 001，Roche)的RIPA裂解缓冲液(20-188，Milipore)中裂解并匀浆。
[0467] 将玻璃体样品加入0.5Precellyses管(CK14_0.5ml，Bertin Technologies)中，并在带有蛋白酶抑制剂(完全无EDTA的蛋白酶-抑制剂mini，11 836 170 001，Roche)的1/4x RIPA裂解缓冲液(20-188，Milipore)中裂解并匀浆。
[0468] 在还原条件下，以4-15％梯度凝胶(#567-8084 Bio-Rad)分析样品(视网膜20μg蛋白，玻璃体40μg蛋白)，并使用使用来自Bio-Rad的Trans-Blot Turbo设备转移至硝酸纤维素(#170-4159 Bio-Rad)上。
[0469] 一抗：兔抗人HTRA1(SF1)是Sascha Fauser(科隆大学)的友好馈赠，小鼠抗人Gapdh(#98795 Sigma-Aldrich)。二抗：山羊抗兔800CW和山羊抗小鼠680RD来自Li-Cor。
[0470] 在来自Li-Cor的Odyssee CLX上对印迹进行成像和分析。
[0471] 实施例10-食蟹猴体内评估：房水中的HTRA1蛋白测定以及与视网膜中的HTRA1 mRNA和蛋白抑制的比较。
[0472] 实验方法：请参见上面的实施例。采集房水样品并按照实施例9的玻璃体样品制备样品。食蟹猴水样房水样品(AH)通过大小测定法在Analytical Methodology：Capillary Electrophoresis System(Peggy SueTM，Proteinsimple)上进行了分析。
[0473] 将样品在冰上解冻，不稀释使用。对于定量，重组HTRA1-S328A突变体(Origene#TP700208)。如提供者所述进行制备。
[0474] 第一兔抗人HTRA抗体SF1由Sascha Fauser博士教授提供，并以1：300的比例稀释使用。所有其他试剂均来自Proteinsimple。
[0475] 样品在技术上一式三份处理，使用12-230kDa分离模块，一式两份校准曲线。使用Xlfit(IDBS软件)计算并分析峰下面积。
[0476] 结果
[0477]
[0478]
[0479] 注-图12-14中所示的化合物ID利用不同编号系统作为其余实施例。上表提供与先前的实施例和本文其他地方使用的编号相比的对于图12-14使用的编号的索引。
[0480] 图12A显示了施用化合物B和#73，1的猴子的房水中HTRA1蛋白水平的可视化，样品在注射后第3，8，15和22天采集。图12B提供用于计算HTRA1蛋白水平的校准曲线。图12C提供来自个体动物的房水的计算出的HTRA1水平针对注射后的时间作图。
[0481] 图13示出了房水中的HTRA1蛋白水平与视网膜中的HTRA1 mRNA水平之间的直接相关性。因此，房水HTRA1蛋白水平可用作HTRA1视网膜mRNA水平或HTRA1视网膜mRNA抑制的生物标记。
[0482] 图14说明了视网膜中HTRA1蛋白水平与房水中HTRA1蛋白水平之间也存在相关性，尽管在本实验中，该相关性不如视网膜中HTRA1 mRNA抑制与房水中的HTRA1蛋白水平之间的相关性强，其指示房水HTRA1蛋白水平特别适合作为HTRA1 mRNA拮抗剂的生物标记。
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