首页 / 专利库 / 酸,碱,盐,酸酐和碱 / 磷酸 / 用于改良植物性状的方法

用于改良植物性状的方法

阅读:107发布:2021-08-01

专利汇可以提供用于改良植物性状的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于筛选和鉴定期望的 植物 改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:(a)从预定来源的 采样 获得遗传物质,以及(b)从所述遗传物质构建表达文库。前述方法还包括以下步骤:(c)产生用所述表达文库转化的植物,其转化效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;(d)筛选表达所述期望性状的转化植物;和(e)鉴定所述转化植物的表达所述期望性状的所述转基因。,下面是用于改良植物性状的方法专利的具体信息内容。

1.一种用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:
a.从预定来源的采样获得遗传物质;
b.从所述遗传物质构建表达文库;
其中所述方法还包括以下步骤:
c.产生用所述表达文库转化的植物,转化效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;
d.筛选表达所述期望性状的转化植物;和
e.鉴定所述转化植物的表达所述期望性状的所述转基因。
2.根据权利要求1所述的方法,还包括根据从所述转基因获得的遗传信息编辑期望作物植物中的靶基因的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法,其中使用任何基因组编辑系统或方法进行所述靶基因的所述编辑,包括使用选自由以下所组成的组的工程化核酸酶的系统:大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统及其任意组合。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述预定来源包括环境生态位的植物、生物真菌或其它生物或其部分。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述筛选步骤包括与对照植物相比对所述转化植物的测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、植物地上部分鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花产量、荚或果实产量、缺绿症、叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述对照植物是与所述转基因植物相同属但是缺少所述转基因的植物,或者与所述转基因植物相同属、缺少所述转基因并且用赋予所述植物改良性状的已知基因转化的植物。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤(a)还包括通过在富培养基或选择性培养基上生长来富集所述遗传物质的步骤。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤(a)还包括通过在针对所述期望性状的选择性培养基上培养所述遗传物质来增强所述期望性状的表达的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤(b)包括产生原核cDNA文库或真核cDNA文库或两者的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤(b)还包括将所述cDNA文库克隆到至少一种双元载体中的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述双元载体包含组成型启动子或胁迫诱导型启动子。
12.根据权利要求10所述的方法,其中所述双元载体包含细菌选择标志物和植物转化选择标志物。
13.根据权利要求10所述的方法,还包括将所述克隆的双元载体转化到宿主细胞中的步骤。
14.根据权利要求10所述的方法,还包括将所述克隆的双元载体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法,还包括将所述转化的根癌农杆菌引入到以下至少一种中的步骤:整株植物、植物组织和植物细胞。
16.根据权利要求15所述的方法,包括通过向所述植物喷洒包含转化的农杆菌的接种物来引入所述转化的根癌农杆菌的步骤。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤(d)包括在对所述期望性状具有选择性的条件下生长所述转化植物。
18.根据权利要求1所述的方法,还包括以下步骤:
f.从步骤(d)的所述转化植物收集T1种子
g.确定所述T1种子的种子文库转化效率;
h.在允许筛选和选择表达所述期望性状的转化植物的选择条件下播种步骤(e)的所述T1种子;
i.测试步骤(g)的所述选择的表达所述期望性状的植物中所述转基因的存在;和j.对步骤(h)的对于所述转基因阳性测试的所述选择的转化植物的所述转基因进行分离和测序。
19.根据权利要求18所述的方法,还包括以下步骤:
k.从(h)的发现对于所述转基因的存在为阳性的所述植物收集T2种子;
l.与用赋予所述期望性状的已知基因转化的对照植物相比,在允许筛选和选择表达所述期望性状的转化植物的选择条件下生长所述T2种子的植物;和
m.任选地,对步骤(j)的所述选择的植物的所述转基因进行分离和测序。
20.根据权利要求18和19中的任一项所述的方法,包括以下步骤:
a.对步骤(i)和/或(l)的所述分离的转基因进行重克隆和测序;
b.将所述重克隆的转基因转化到植物中;
c.筛选步骤(b)的所述转化植物以选择表达所述期望性状的转化植物;
d.从步骤(c)的所述选择的植物中分离所述转基因;和
e.任选地,重复步骤(a)至(d)。
21.根据权利要求4所述的方法,其中所述环境生态位包括生态生态位、种群、生境、基因库、原核培养物、真核培养物及其任意组合。
22.根据权利要求4所述的方法,其中所述环境生态位包括微生物组、微生物群、微生物培养物、植物、酵母、藻类、线虫或任何其它生物或其组合。
23.根据权利要求4所述的方法,其中所述环境生态位包括预定的生物因子、非生物因子及其组合。
24.根据权利要求1所述的方法,其中所述采样包括土壤样品、样品、有机物样品及其任意组合。
25.根据权利要求1所述的方法,其中所述期望性状选自由以下所组成的组:对至少一种生物胁迫的抗性或耐受性、对至少一种非生物胁迫的抗性或耐受性、提高的产量、提高的生物量、提高的食物品质和价值、提高的谷物产量、除草剂或化学物质抗性或耐受性及其任意组合。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述非生物胁迫选自由以下所组成的组:干旱、盐分、热、冷、肥料吸收、肥料使用效率及其任意组合。
27.根据权利要求25所述的方法,其中所述生物胁迫选自由以下所组成的组:植物疾病、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益和有害昆虫、杂草和栽培的或天然的植物或其任意组合。
28.根据权利要求1所述的方法,其中所述步骤(a)包括从所述预定环境生态位的所述采样中提取RNA的步骤。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述RNA提取根据标准商业试剂盒或根据任何其它用于从环境采样中提取RNA的方案进行。
30.根据权利要求29所述的方法,其中所述用于从环境采样中提取RNA的方案包括以下步骤:
a.获得土壤样品;
b.将所述土壤样品与提取缓冲液混合,所述提取缓冲液包含500mM pH 8的磷酸盐缓冲液和5%w/v的鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)以及比率为25:24:1的苯酚(pH 8)/氯仿/IAA;
c.使步骤(b)的所述混合物经受37℃下振摇15分钟或珠打浆机1分钟;
d.在室温下将步骤(c)的所述混合物在2500g下离心约10分钟以获得水相;
e.将所述水相转移到新管中;
f.向步骤(e)的所述管内的所述水相添加等量的补充有20mg/ml的结晶紫溶液的异丙醇,以获得紫色染色溶液;
g.通过倒转步骤(f)的所述管来混合所述溶液,然后将所述管在室温下孵育约30分钟;
h.在室温下将步骤(g)的所述管在2500g下离心约30分钟,以获得紫色染色层;
i.将所述紫色染色层转移到新管中,并将所述管以最大速度离心约5min,以获得沉淀和上清液;
j.用80%v/v冷的乙醇洗涤所述沉淀并且再离心5分钟,以获得沉淀和上清液;
k.除去步骤(j)的所述上清液并使所述沉淀干燥;和
l.将所述干燥的沉淀以100μl水比2克步骤(a)的土壤的比例混悬在水中。
31.一种植物,包含通过权利要求1至30中任一项所述的方法鉴定的所述转基因。
32.根据权利要求31所述的植物,其中与缺少所述转基因的相同属的植物相比,所述植物具有至少一种植物改良性状。
33.多核苷酸序列,可通过根据权利要求1至30中任一项所述的方法获得。
34.根据权利要求33所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1-
148及其任意组合所组成的组的多核苷酸序列中所示的序列相对应的核苷酸序列。
35.多核苷酸序列,与根据权利要求33和34中任一项所述的多核苷酸序列具有至少
80%序列相似性。
36.多肽序列,可通过根据权利要求1所述的方法获得。
37.根据权利要求36所述的多肽序列,其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:149-321及其任意组合所组成的组的多肽序列中所示的序列相对应的基酸序列。
38.多肽序列,与根据权利要求36和37中任一项所述的多肽序列具有至少60%序列相似性。
39.根据权利要求1所述的方法用于鉴定赋予植物改良性状的基因的用途,所述植物改良性状选自由以下所组成的组:对非生物胁迫的抗性或耐受性、对生物胁迫的抗性或耐受性、提高的产量、提高的生物量、提高的食物品质和价值、提高的谷物产量、除草剂或化学物质抗性或耐受性及其任意组合。
40.根据权利要求39所述的用途,其中所述非生物胁迫选自由以下所组成的组:干旱、盐分、热、冷、肥料利用及其任意组合。
41.根据权利要求39所述的用途,其中所述生物胁迫选自由以下所组成的组:植物疾病、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益和有害昆虫、杂草和栽培的或天然的植物或其任意组合。
42.一种用于筛选和鉴定植物中的干旱或盐分抗性或耐受性改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得来源于低水分或高盐分来源样品的遗传物质;
b.从所述遗传物质构建表达文库;
其中所述方法还包括以下步骤:
c.产生用所述表达文库转化的植物,转化效率为至少0.5%至30%,代表至少102-1010个转基因;
d.筛选对预定干旱或盐分条件具有抗性或耐受性的转化植物;
e.鉴定步骤(d)的所述干旱或盐分抗性或耐受性转化植物的所述转基因。
43.根据权利要求42所述的方法,还包括根据从所述转基因获得的遗传信息编辑期望作物植物中的靶基因的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法,其中使用任何基因组编辑系统或方法进行所述靶基因的所述编辑,包括使用选自由以下所组成的组的工程化核酸酶的系统:大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统及其任意组合。
45.根据权利要求42所述的方法,其中所述预定来源包括环境生态位的植物、微生物、真菌或其它生物或其部分。
46.根据权利要求42所述的方法,其中所述筛选步骤包括与对照植物相比对所述转化植物的测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、植物地上部分鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花产量、荚或果实产量、缺绿症、叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述对照植物是与所述转基因植物相同属但是缺少所述转基因的植物,或者与所述转基因植物相同属、缺少所述转基因并且用赋予所述植物改良性状的已知基因转化的植物。
48.根据权利要求42所述的方法,其中所述步骤(b)还包括将所述表达文库克隆到至少一种双元载体中的步骤。
49.根据权利要求42所述的方法,还包括以下步骤:
f.从步骤(c)的所述转化植物收集T1种子;
g.将所述T1种子播种在对转化植物有选择性的水含量为约100%容量的土壤中;
h.在干旱或盐分条件下和/或不灌溉的情况下生长所述T1种子的植物,直到大部分植物死亡,以产生在所述干旱或盐分条件下存活的转化植物;
i.使所述干旱或盐分存活转化植物生长以产生T2种子;
j.筛选步骤(i)的所述干旱或盐分存活转化植物中转基因的存在;
k.对步骤(j)的阳性筛选植物的所述转基因进行分离和测序。
50.根据权利要求49所述的方法,还包括以下步骤:
l.从步骤(j)的每一个所述含转基因的阳性筛选的干旱或盐分存活转化植物收集T2种子;
m.与相同属但缺少所述转基因或者用赋予干旱或盐分耐受性或干旱或盐分抗性的已知基因转化的对照植物相比,在预定干旱或盐分条件下从步骤(l)的每一个所述含转基因的T2种子生长T2植物;
n.与所述对照植物相比,对每一个所述含转基因的T2植物进行干旱耐受性或抗性筛选测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花和荚产量、缺绿症和叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合;
o.从步骤(n)的所述筛选的干旱或盐分抗性性能T2植物分离所述转基因;
p.任选地,将所述转基因重克隆到双元载体中;
q.任选地,将所述克隆的双元载体转化到植物中,并且在预定干旱或盐分条件下生长所述转化植物;和
r.任选地,重复步骤(l)至(q)。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述生长T2植物的步骤包括以下步骤:
a.将所述T2种子播种在对转化植物有选择性的水含量为约100%容量的土壤中;和b.当所述土壤中的水含量达到约5-10%时,灌溉所述植物。
52.根据权利要求50所述的方法,其中所述预定干旱或盐分条件选自由以下所组成的组:低水分、高盐分、干燥土壤和热。
53.多核苷酸序列,可通过根据权利要求42所述的方法获得。
54.根据权利要求53所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:148及其任意组合所组成的组的多核苷酸序列中所示的序列相对应的核苷酸序列。
55.多核苷酸序列,与根据权利要求53和54中任一项所述的多核苷酸序列具有至少
80%序列相似性。
56.多肽序列,可通过根据权利要求42所述的方法获得。
57.根据权利要求56所述的多肽序列,其中所述多肽序列包含与选自由SEQ ID NO:
149-321及其任意组合所组成的组的多肽序列中所示的序列相对应的氨基酸序列。
58.多肽序列,与根据权利要求56和57中任一项所述的多肽序列具有至少60%序列相似性。
59.一种用于从土壤样品中提取RNA的方法,包括以下步骤:
a.获得土壤样品;
b.将所述土壤样品与提取缓冲液混合,所述提取缓冲液包含500mM pH 8的磷酸盐缓冲液和5%w/v的鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)以及比率为25:24:1的苯酚(pH 8)/氯仿/IAA;
c.使步骤(b)的所述混合物经受37℃下振摇15分钟或珠打浆机1分钟;
d.在室温下将步骤(c)的所述混合物在2500g下离心约10分钟以获得水相;
e.将所述水相转移到新管中;
f.向步骤(e)的所述管内的所述水相添加等量的补充有20mg/ml的结晶紫溶液的异丙醇,以获得紫色染色溶液;
g.通过倒转步骤(f)的所述管来混合所述溶液,然后将所述管在室温下孵育约30分钟;
h.在室温下将步骤(g)的所述管在2500g下离心约30分钟,以获得紫色染色层;
i.将所述紫色染色层转移到新管中,并将所述管以最大速度离心约5min,以获得沉淀和上清液;
j.用80%v/v冰冷的乙醇洗涤所述沉淀并且再离心5分钟,以获得沉淀和上清液;
k.除去步骤(j)的所述上清液并使所述沉淀干燥;和
l.将所述干燥的沉淀以100μl水比2克步骤(a)的土壤的比例混悬在水中。
60.一种用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:
a.获得预定来源的采样;
b.根据权利要求60所述的方法从所述采样提取RNA;
c.从步骤(b)的所述RNA构建表达文库;
其中所述方法还包括以下步骤:
d.产生用所述表达文库转化的植物,效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;
e.筛选表达所述期望性状的转化植物;和
f.鉴定所述转化植物的表达所述期望性状的所述转基因。
61.根据权利要求60所述的方法,还包括根据从所述转基因获得的遗传信息编辑期望作物植物中的靶基因的步骤。
62.根据权利要求61所述的方法,其中使用任何基因组编辑系统或方法进行所述靶基因的所述编辑,包括使用选自由以下所组成的组的工程化核酸酶的系统:大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统及其任意组合。
63.根据权利要求60所述的方法,其中所述预定来源包括环境生态位的植物、微生物、真菌或其它生物或其部分。
64.根据权利要求60所述的方法,其中所述筛选步骤包括与对照植物相比对所述转化植物的测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、植物地上部分鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花产量、荚或果实产量、缺绿症、叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合。
65.根据权利要求64所述的方法,其中所述对照植物是与所述转基因植物相同属但是缺少所述转基因的植物,或者与所述转基因植物相同属、缺少所述转基因并且用赋予所述植物改良性状的已知基因转化的植物。
66.分离的多核苷酸,与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:148及其任意组合所组成的组的核苷酸序列具有至少80%序列相似性。
67.分离的多肽,与选自由SEQ ID NO:149-321及其任意组合所组成的组的氨基酸序列具有至少60%序列相似性。

说明书全文

用于改良植物性状的方法

[0001] 序列表
[0002] 本申请包含序列表,该序列表已经以ASCII txt格式电子方式提交,并且其全部内容通过引用并入本文。所述ASCII副本的名称为seq.listing 1754-P-01-PCT_ST25,大小为491KB。

技术领域

[0003] 本发明一般涉及改良植物性状的领域。更具体地,本发明涉及通过将来自预定来源的表达文库转化到植物中并筛选期望的性状来改良植物的性状。

背景技术

[0004] 到2050年,世界人口估计将达到92亿。要充分养活这一人口,粮食总产量必须增长60%-70%。气候模型预测,本世纪中的温暖温度以及干旱的频率和持续时间的增加将对农业生产率产生负面影响。例如,非洲的玉米生产可能面临重大减产的险,因为研究人员预测,如果植物获得足够的分,作物在高于30℃的温度下每花费一度日(degree-day),产量就会降低1%。这些预测与美国玉米产量报道的类似。进一步表明,在干旱条件下,作物在高于30℃的温度下每花费一度日,非洲玉米产量就下降1.7%。在2010年,俄罗斯的小麦产量下降了近三分之一,这很大程度是是由于夏季热浪。同样,2010年中国和印度的小麦产量也显著下降,分别主要是由于干旱和温度突然升高从而造成了强制成熟。这些新的全球挑战需要更复杂的一体化农业。
[0005] 此外,全球变暖导致许多非生物和生物胁迫同时存在,从而影响农业生产率。非生物胁迫的发生可以通过增强宿主植物对病原生物、昆虫的易感性以及降低与杂草的竞争能来改变植物与害虫之间的相互作用。与之相反,一些害虫可能会改变植物对非生物胁迫因素的反应。
[0006] 生物胁迫因素由病原体、昆虫、害虫、杂草或种内资源竞争引起。生物胁迫因素导致产量或质量损失的能力取决于环境,因此可能因地区而异,也可能因农业生态而异。例如,在澳大利亚,大麦叶病是导致大量产量和质量损失的一些主要生物胁迫因素。尽管已知一些植物物种对多种疾病具有抗性,但是这些植物物种很难或甚至不能以常规方法进行繁殖。
[0007] 挑战是产生的作物对生物胁迫因素具有抗性并且灵活且适应多种环境和种群。当前有两种主要的使作物适应新环境的方法:通过常规育种开发新作物(从驯化开始的长期努力)和通过植物育种(包括基因工程)将靶性状引入现有作物。为了在气候变化加剧的情况下保持生产力,需要不断开发种群和植物品种以抵御“新的”极端气候和其它胁迫,例如疾病、病原体、昆虫、害虫等。此外,还对寻找对于新化学物质和新除草剂作用方式的新除草剂耐受性或抗性基因具有不断需求。
[0008] 基因工程有潜力解决农民面临的通过单独常规植物育种不容易解决的一些最具挑战性的生物和非生物限制。
[0009] 这些遗传修饰的有利结果包括增加食物生产、可靠性和产量;增强口味和营养价值;以及减少由于各种生物和非生物胁迫(例如真菌和细菌病原体)而导致的损失。这些目标持续激励着现代育种者和食品科学家,他们正在寻求更新的遗传修饰方法来鉴定、选择和分析具有遗传增强特征的个体生物。
[0010] 选择用外来基因和/或来自很难或不可能繁殖的相同物种或属的基因转化植物克服了物种障碍,从而有可能开发无法通过常规方法获得的强大“超性状”。但是,引入的转基因和内源基因的分子相互作用和结果是不可预测的。
[0011] 当转移编码某些性状的基因(通常是从一种植物物种到另一种)时,除非环境以预期方式与基因相互作用以触发期望反应,否则期望性状不会总是表达,这取决于插入有所述基因的调节序列。这意味着在实验室条件下在受控气候下开发的新转基因品种必须像与在更传统的育种方法中一样的田间条件下进行测试,因此目前两种方法在使新品种释放的速度中几乎没有差异。
[0012] 从基础植物研究中获得的知识将为未来的作物改良奠定基础,但是将研究发现快速有效转化为公益性农业的有效机制仍有待开发。
[0013] 美国专利6030779和美国专利6368798公开了一种用于鉴定具有指定酶活性的克隆的方法,其如下实现:使用多核苷酸探针从基因组DNA群体中选择性分离靶核酸,所述多核苷酸探针鉴定编码具有特定酶活性的酶的核酸序列;和用分离的靶核酸转化宿主以产生克隆文库,筛选克隆文库的指定酶活性。
[0014] 美国专利6972183公开了一种用于筛选表达文库以鉴定表达具有期望活性的酶的克隆的方法。该方法涉及从一种或多种微生物的基因组DNA样品中产生包含多个重组细胞克隆的表达文库,然后向毛细管阵列中的毛细管中引入底物和克隆的子集。底物与表达具有期望活性的酶的克隆的相互作用产生光学可检测的信号,然后可对其进行空间检测以鉴定包含产生这种信号的克隆的毛细管。然后可以从鉴定的毛细管中回收产生信号的克隆。
[0015] 欧洲专利申请1025262和美国专利申请20020150949教导了一种用于通过以下来鉴定具有指定目的活性的克隆的方法:(i)产生从直接分离自环境的核酸得到的表达文库;(ii)将所述文库暴露于特定的一种或多种目的底物;和(iii)利用荧光激活细胞分选来筛选所述经过暴露的文库以鉴定与一种或多种底物反应的克隆。
[0016] 美国专利申请20100152051涉及一种用于鉴定和/或表征来自表达文库的赋予期望的生物学特性的克隆的方法。该方法包括以下步骤:筛选与所述表达文库的克隆的重组插入物一起表达为融合蛋白的至少一种(多)肽(例如标签)的表达。所述(多)肽可以在N末端或C末端与所述插入物融合。该方法还包括使与赋予所述期望生物学特性的克隆的插入物表达的(多)肽特异性相互作用的配体接触的步骤。
[0017] 所有上述方法均基于通过与预定探针的相互作用筛选DNA文库(由微生物或环境样品产生)的特定序列或生化活性。另外,具有预定序列或活性的克隆的筛选和选择在转化入植物细胞之前进行,并且可以在植物细胞(组织培养物)中表达,但不能在整株植物中表达。因此,通过最新使用的方法,仅预先选定的克隆在植物中表达,并且所选序列在植物中的表达和作用是不可预测的。另外,在上述方法中,仅可以基于先验知识筛选已知活性。因此,这些方法被限制在已知酶活性和酶家族以及先前已知功能的范围内。
[0018] 鉴于上述情况,长期以来一直需要用于筛选和鉴定赋予期望的植物改良性状的未知序列的有效方法。

发明内容

[0019] 因此,本发明的一个目的是公开一种用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:(a)从预定来源的采样获得遗传物质;(b)从所述遗传物质构建表达文库;其中所述方法还包括以下步骤:(c)产生用所述表达文库转化的植物,转化效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;(d)筛选表达所述期望性状的转化植物;和(e)鉴定所述转化植物的表达所述期望性状的所述转基因。
[0020] 本发明的另一个目的是公开如以上所限定的方法,该方法还包括根据从所述转基因获得的遗传信息编辑期望作物植物中的靶基因的步骤。
[0021] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中使用任何基因组编辑系统或方法进行所述靶基因的所述编辑,包括使用选自由以下所组成的组的工程化核酸酶的系统:大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统及其任意组合。
[0022] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述预定来源包括环境生态位的植物、微生物、真菌或其它生物或其部分。
[0023] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述筛选步骤包括与对照植物相比对所述转化植物的测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、植物地上部分鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花产量、荚或果实产量、缺绿症、叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合。
[0024] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述对照植物是与所述转基因植物相同属但是缺少所述转基因的植物,或者与所述转基因植物相同属、缺少所述转基因并且用赋予所述植物改良性状的已知基因转化的植物。
[0025] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述步骤(a)还包括通过在富培养基或选择性培养基上生长来富集所述遗传物质的步骤。
[0026] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述步骤(a)还包括通过在针对所述期望性状的选择性培养基上培养所述遗传物质来增强所述期望性状的表达的步骤。
[0027] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述步骤(b)包括产生原核cDNA文库或真核cDNA文库或两者的步骤。
[0028] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述步骤(b)还包括将所述cDNA文库克隆到至少一种双元载体中的步骤。
[0029] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述双元载体包含组成型启动子或胁迫诱导型启动子。
[0030] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述双元载体包含细菌选择标志物和植物转化选择标志物。
[0031] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括将所述克隆的双元载体转化到宿主细胞中的步骤。
[0032] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括将所述克隆的双元载体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的步骤。
[0033] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括将所述转化的根癌农杆菌引入到以下至少一种中的步骤:整株植物、植物组织和植物细胞。
[0034] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法包括通过向所述植物喷洒包含转化的农杆菌的接种物来引入所述转化的根癌农杆菌的步骤。
[0035] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述步骤(d)包括在对所述期望性状具有选择性的条件下生长所述转化植物。
[0036] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括以下步骤:(f)从步骤(d)的所述转化植物收集T1种子;(g)确定所述T1种子的种子文库转化效率;(h)在允许筛选和选择表达所述期望性状的转化植物的选择条件下播种步骤(e)的所述T1种子;(i)测试步骤(g)的所述选择的表达所述期望性状的植物中所述转基因的存在;和(j)对步骤(h)的对于所述转基因阳性测试的所述选择的转化植物的所述转基因进行分离和测序。
[0037] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括以下步骤:(k)从(h)的发现对于所述转基因的存在为阳性的所述植物收集T2种子;(l)与用赋予所述期望性状的已知基因转化的对照植物相比,在允许筛选和选择表达所述期望性状的转化植物的选择条件下生长所述T2种子的植物;和(m)任选地,对步骤(j)的所述选择的植物的所述转基因进行分离和测序。
[0038] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法包括以下步骤:(a)对步骤(i)和/或(l)的所述分离的转基因进行重克隆和测序;(b)将所述重克隆的转基因转化到植物中;(c)筛选步骤(b)的所述转化植物以选择表达所述期望性状的转化植物;
(d)从步骤(c)的所述选择的植物中分离所述转基因;和(e)任选地,重复步骤(a)至(d)。
[0039] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述环境生态位包括生态生态位、种群、生境、基因库、原核培养物、真核培养物及其任意组合。
[0040] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述环境生态位包括微生物组、微生物群、微生物培养物、植物、酵母、藻类、线虫或任何其它生物或其组合。
[0041] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述环境生态位包括预定的生物因子、非生物因子及其组合。
[0042] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述采样包括土壤样品、水样品、有机物样品及其任意组合。
[0043] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述期望性状选自由以下所组成的组:对至少一种生物胁迫的抗性或耐受性、对至少一种非生物胁迫的抗性或耐受性、提高的产量、提高的生物量、提高的食物品质和价值、提高的谷物产量、除草剂或化学物质抗性或耐受性及其任意组合。
[0044] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述非生物胁迫选自由以下所组成的组:干旱、盐分、热、冷、肥料吸收、肥料使用效率及其任意组合。
[0045] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述生物胁迫选自由以下所组成的组:植物疾病、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益和有害昆虫、杂草和栽培的或天然的植物或其任意组合。
[0046] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述步骤(a)包括从所述预定环境生态位的所述采样中提取RNA的步骤。
[0047] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述RNA提取根据标准商业试剂盒或根据任何其它用于从环境采样中提取RNA的方案进行。
[0048] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述用于从环境采样中提取RNA的方案包括以下步骤:(a)获得土壤样品;(b)将所述土壤样品与提取缓冲液混合,所述提取缓冲液包含500mM pH 8的磷酸盐缓冲液和5%w/v的鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)以及比率为25:24:1的苯酚(pH 8)/氯仿/IAA;(c)使步骤(b)的所述混合物经受37℃下振摇15分钟或珠打浆机1分钟;(d)在室温下将步骤(c)的所述混合物在2500g下离心约10分钟以获得水相;(e)将所述水相转移到新管中;(f)向步骤(e)的所述管内的所述水相添加等量的补充有20mg/ml的结晶紫溶液的异丙醇,以获得紫色染色溶液;(g)通过倒转步骤(f)的所述管来混合所述溶液,然后将所述管在室温下孵育约30分钟;(h)在室温下将步骤(g)的所述管在2500g下离心约30分钟,以获得紫色染色层;(i)将所述紫色染色层转移到新管中,并将所述管以最大速度离心约5min,以获得沉淀和上清液;(j)用80%v/v冷的乙醇洗涤所述沉淀并且再离心5分钟,以获得沉淀和上清液;(k)除去步骤(j)的所述上清液并使所述沉淀干燥;和(l)将所述干燥的沉淀以100μl水比2克步骤(a)的土壤的比例混悬在水中。
[0049] 本发明的另一个目的是公开一种植物,该植物包含通过以上任一者所限定的方法鉴定的所述转基因。
[0050] 本发明的另一个目的是公开如以上所限定的植物,其中与缺少所述转基因的相同属的植物相比,所述植物具有至少一种植物改良性状。
[0051] 本发明的另一个目的是公开可通过以上任一者所限定的方法获得的多核苷酸序列。
[0052] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1-148及其任意组合所组成的组的多核苷酸序列中所示的序列相对应的核苷酸序列。
[0053] 本发明的另一个目的是公开多核苷酸序列,该多核苷酸序列与上述任一项所定义的多核苷酸序列具有至少80%序列相似性。
[0054] 本发明的另一个目的是公开一种可通过以上任一者所限定的方法获得的多肽序列。
[0055] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的多肽序列,其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:149-321及其任意组合所组成的组的多肽序列中所示的序列相对应的基酸序列。
[0056] 本发明的另一个目的是公开多肽序列,该多肽序列与以上任一者所限定的多肽序列具有至少60%序列相似性。
[0057] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法用于鉴定赋予植物改良性状的基因的用途,所述植物改良性状选自由以下所组成的组:对非生物胁迫的抗性或耐受性、对生物胁迫的抗性或耐受性、提高的产量、提高的生物量、提高的食物品质和价值、提高的谷物产量、除草剂或化学物质抗性或耐受性及其任意组合。
[0058] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的用途,其中所述非生物胁迫选自由以下所组成的组:干旱、盐分、热、冷、肥料利用及其任意组合。
[0059] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的用途,其中所述生物胁迫选自由以下所组成的组:植物疾病、病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益和有害昆虫、杂草和栽培的或天然的植物或其任意组合。
[0060] 本发明的另一个目的是公开一种用于筛选和鉴定植物中的干旱或盐分抗性或耐受性改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:(a)获得来源于低水分或高盐分来源样品的遗传物质;(b)从所述遗传物质构建表达文库;其中所述方法还包括以下步骤:(c)产生用所2 10
述表达文库转化的植物,转化效率为至少0.5%至30%,代表至少10-10 个转基因;(d)筛选对预定干旱或盐分条件具有抗性或耐受性的转化植物;以及(e)鉴定步骤(d)的所述干旱或盐分抗性或耐受性转化植物的所述转基因。
[0061] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括根据从所述转基因获得的遗传信息编辑期望作物植物中的靶基因的步骤。
[0062] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中使用任何基因组编辑系统或方法进行所述靶基因的所述编辑,包括使用选自由以下所组成的组的工程化核酸酶的系统:大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统及其任意组合。
[0063] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述预定来源包括环境生态位的植物、微生物、真菌或其它生物或其部分。
[0064] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述筛选步骤包括与对照植物相比对所述转化植物的测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、植物地上部分鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花产量、荚或果实产量、缺绿症、叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合。
[0065] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述对照植物是与所述转基因植物相同属但是缺少所述转基因的植物,或者与所述转基因植物相同属、缺少所述转基因并且用赋予所述植物改良性状的已知基因转化的植物。
[0066] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述步骤(b)还包括将所述表达文库克隆到至少一种双元载体中的步骤。
[0067] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括以下步骤:(f)从步骤(c)的所述转化植物收集T1种子;(g)将所述T1种子播种在对转化植物有选择性的水含量为约100%容量的土壤中;(h)在干旱或盐分条件下和/或不灌溉的情况下生长所述T1种子的植物,直到大部分植物死亡,以产生在所述干旱或盐分条件下存活的转化植物;(i)使所述干旱或盐分存活转化植物生长以产生T2种子;(j)筛选步骤(i)的所述干旱或盐分存活转化植物中转基因的存在;和(k)从步骤(j)的阳性筛选植物分离所述转基因并且测序。
[0068] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括以下步骤:(l)从步骤(j)的每一个所述含转基因的阳性筛选的干旱或盐分存活转化植物收集T2种子;(m)与相同属但缺少所述转基因或者用赋予干旱或盐分耐受性或干旱或盐分抗性的已知基因转化的对照植物相比,在预定干旱或盐分条件下从步骤(l)的每一个所述含转基因的T2种子生长T2植物;(n)与所述对照植物相比,对每一个所述含转基因的T2植物进行干旱耐受性或抗性筛选测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花和荚产量、缺绿症和叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合;(o)从步骤(n)的所述筛选的干旱或盐分抗性性能T2植物分离所述转基因;(p)任选地,将所述转基因重克隆到双元载体中;(q)任选地,将所述克隆的双元载体转化到植物中,并且在预定干旱或盐分条件下生长所述转化植物;和(r)任选地,重复步骤(l)至(q)。
[0069] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述生长T2植物的步骤包括以下步骤:(a)将所述T2种子播种在对转化植物有选择性的水含量为约100%容量的土壤中;和(b)当所述土壤中的水含量达到约5-10%时,灌溉所述植物。
[0070] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述预定干旱或盐分条件选自由以下所组成的组:低水分、高盐分、干燥土壤和热。
[0071] 本发明的另一个目的是公开可通过以上任一者所限定的方法获得的多核苷酸序列。
[0072] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:148及其任意组合所组成的组的多核苷酸序列中所示的序列相对应的核苷酸序列。
[0073] 本发明的另一个目的是公开多核苷酸序列,该多核苷酸序列与以上任一者所限定的多核苷酸序列具有至少80%序列相似性。
[0074] 本发明的另一个目的是公开可通过以上任一者所限定的方法获得的多肽序列。
[0075] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的多肽序列,所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:149-321及其任意组合所组成的组的多肽序列中所示的序列相对应的氨基酸序列。
[0076] 本发明的另一个目的是公开多肽序列,该多肽序列与以上任一者所限定的多肽序列具有至少60%序列相似性。
[0077] 本发明的另一个目的是公开一种用于从土壤样品中提取RNA的方法,该方法包括以下步骤:(a)获得土壤样品;(b)将所述土壤样品与提取缓冲液混合,所述提取缓冲液包含500mM pH 8的磷酸盐缓冲液和5%w/v的鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)以及比率为25:24:1的苯酚(pH 8)/氯仿/IAA;(c)使步骤(b)的所述混合物经受37℃下振摇15分钟或珠打浆机1分钟;(d)在室温下将步骤(c)的所述混合物在2500g下离心约10分钟以获得水相;(e)将所述水相转移到新管中;(f)向步骤(e)的所述管内的所述水相添加等量的补充有20mg/ml的结晶紫溶液的异丙醇,以获得紫色染色溶液;(g)通过倒转步骤(f)的所述管来混合所述溶液,然后将所述管在室温下孵育约30分钟;(h)在室温下将步骤(g)的所述管在2500g下离心约
30分钟,以获得紫色染色层;(i)将所述紫色染色层转移到新管中,并将所述管以最大速度离心约5min,以获得沉淀和上清液;(j)用80%v/v冰冷的乙醇洗涤所述沉淀并且再离心5分钟,以获得沉淀和上清液;(k)除去步骤(j)的所述上清液并使所述沉淀干燥;和(l)将所述干燥的沉淀以100μl水比2克步骤(a)的土壤的比例混悬在水中。
[0078] 本发明的另一个目的是公开一种用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:(a)获得预定来源的采样;(b)根据权利要求60所述的方法从所述采样提取RNA;(c)从步骤(b)的所述RNA构建表达文库;其中所述方法还包括以下步骤:(d)产生用所述表达文库转化的植物,效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;(e)筛选表达所述期望性状的转化植物;和(f)鉴定所述转化植物的表达所述期望性状的所述转基因。
[0079] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,该方法还包括根据从所述转基因获得的遗传信息编辑期望作物植物中的靶基因的步骤。
[0080] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中使用任何基因组编辑系统或方法进行所述靶基因的所述编辑,包括使用选自由以下所组成的组的工程化核酸酶的系统:大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统及其任意组合。
[0081] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述预定来源包括环境生态位的植物、微生物、真菌或其它生物或其部分。
[0082] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述筛选步骤包括与对照植物相比对所述转化植物的测量,所述测量选自由以下所组成的组:膨压测量、植物死亡、叶面积、植物地上部分鲜重、叶数、枝鲜重、主枝长度、花产量、荚或果实产量、缺绿症、叶损伤、植物的状态或性能及其任意组合。
[0083] 本发明的另一个目的是公开如以上任一者所限定的方法,其中所述对照植物是与所述转基因植物相同属但是缺少所述转基因的植物,或者与所述转基因植物相同属、缺少所述转基因并且用赋予所述植物改良性状的已知基因转化的植物。
[0084] 本发明的另一个目的是公开分离的多核苷酸,该分离的多核苷酸与选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:148及其任意组合所组成的组的核苷酸序列具有至少80%序列相似性。
[0085] 本发明的另一个目的是公开分离的多肽,该分离的多肽与选自由SEQ ID NO:149-321及其任意组合所组成的组的氨基酸序列具有至少60%序列相似性。
附图说明
[0086] 为了理解本发明并看到其如何在实践中实施,现在将参照附图仅通过非限制性实例的方式描述多个实施例,其中:
[0087] 图1A-D示出了用于在启动子(35S、CBF3、ErdlO和Kinl)和HSP终止子之间插入经扩增cDNA克隆的双元载体的示意图。图1A示出了具有组成型CaMV 35S启动子的pPA-35H载体。图1B-D示出了含有拟南芥(Arabidopsis thaliana)的胁迫诱导型启动子的载体:具有CBF3启动子的pPA-CH(图1B),具有ErdlO启动子的pPA-EH(图1C)和具有Kinl启动子的pPA-KH(图
1D);
[0088] 图2示出了对于LB培养皿上3个不同文库计数的农杆菌文库的照片;
[0089] 图3示出了用文库转化的烟草组织培养物的照片:转化后7天(图3A),转化后40天(图3B)和转化后6-8周(图3C);
[0090] 图4示出了说明选择10天龄的拟南芥表达文库幼苗的草丁膦抗性的照片。绿色植物对草丁膦有抗性,而小的黄色植物不存在转基因,因此是易感的。
[0091] 图5示出了温室中T2和T3对照实验的照片;
[0092] 图6示出了筛选对干旱具有抗性的转基因植物的照片结果;
[0093] 图7示出了说明在停止灌溉后数天,表达用作对照的基因的植物中相性对于土壤含水量的膨压损失(深灰色);
[0094] 图8示出了显示与表达GFP的植物相比表达阳性对照的转基因植物的归一化死亡规模的图示;
[0095] 图9图示了通过本发明的方法鉴定的多种干旱抗性基因的结果;以及
[0096] 图10图示了与阳性和阴性对照相比表达鉴定的赋予干旱抗性的新基因的多种转基因植物品系在重克隆之后的叶面积分析。

具体实施方式

[0097] 与本发明的所有章节一起提供了以下描述,以使本领域任何技术人员能够利用本发明,并阐明发明人想到的实施本发明的最佳方式。然而,由于本发明的一般原理已被特别限定以提供用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的手段和方法,因此多种修改对本领域技术人员而言仍然是显而易见的。
[0098] 已知一些植物物种对多种疾病具有抗性。但是,这样的物种通常很难或不可能通过常规技术和方法进行繁殖。
[0099] 本发明提供了一种方法和平台,用于从植物中发现和鉴定具有独特且有价值的特征的基因,例如疾病抗性、非生物胁迫抗性或耐受性、食物改良品质(例如改良的油、蛋白质含量、氨基酸、维生素等),然后通过基因编辑或其它转化技术在期望的作物中插入或表达它们。
[0100] 因此,通过植物育种(包括基因工程和基因(基因组)编辑)将靶性状引入现有作物中在本发明的范围内。
[0101] 本发明提供了一种用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的新方法。所述方法包括以下步骤:(a)获得来自预定环境生态位的采样的遗传物质,或者提取自其它来源(例如相同或其它属的植物)的遗传物质;(b)从所述遗传物质构建表达文库。根据核心方面,本发明还包括以下步骤:(c)产生用所述表达文库转化的植物,效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;(d)筛选表达所述期望性状的转化植物;和(e)鉴定所述转化植物的表达所述期望性状的所述转基因。
[0102] 本发明首次提供了一种用于筛选和选择来自在有价值的作物植物中赋予改良性状的预定来源(例如生态生态位和/或植物)的未知序列的方法。相对于普通和常规筛选方法,本发明方法在以下方面是有效和有利的:
[0103] 1.表达文库是由源自预定来源例如极端环境、植物材料等的遗传物质或遗传库(即RNA)制备的。这样,仅将在预先选定环境条件下表达的基因用于植物中的筛选程序。
[0104] 2.将整个表达文库转化到植物中,效率为0.05%-30%,并且代表至少102-1010个独特的转基因。
[0105] 3.在本发明的方法中,在作为植物的靶生物体中进行表达文库的期望表型的筛选。这样就没有预先选择,并且揭示了在植物中可表达的期望表型的新独特基因。
[0106] 在常规方法中,第一步是在源遗传物质中选择用于预定性状的基因,例如通过在原核或真核细胞中探测具有已知序列的DNA文库,然后才在植物中表达预先选定的基因。这种常规方法的结果是有限的,并且具有以下缺点:
[0107] 1.筛选是在不是靶生物体的宿主细胞/生物中(通常在原核或单细胞生物中)进行。
[0108] 2.由于使用已知序列或探针或活性进行,因此筛选受到限制。已经发现,功能筛选方法需要可检测水平的酶活性,其无法始终实现,例如在基于大肠杆菌的表达系统中可能仅检测到约40%的酶活性(Gabor等人,2004)。此外,本文指出,尽管有可用的先进测序技术,但总蛋白质编码基因中有约35-60%显示出与“假设蛋白质”、“预测蛋白质”或“功能未知的蛋白质”的高度相似性(Culligan等人,2014;Venter等人,2004)。
[0109] 3.仅将预先选定的克隆转化到植物中。
[0110] 4.预先选定克隆在靶植物中的表达和作用是不可预测的。
[0111] 由于上述原因,本发明筛选用表达文库转化的植物的期望表型的新方法是有利的。
[0112] 本文承认干旱和盐分被认为是对植物生长和发育具有重要影响的两种非生物胁迫。
[0113] 关于干旱,其被认为是最具有破坏性的环境胁迫,其降低作物的生长和生产力。干旱严重影响植物的生长和发育,导致生长速率和生物量积累显著降低。植物中干旱的主要后果是降低的细胞分裂和扩增的速率、叶片大小、茎伸长和根增殖、干扰气孔振幅以及水分利用效率(WUE)(Farooq等人.2009)。这种现象涉及遗传、生理和环境事件及其复杂的相互作用。植物生长的速度和量取决于这些事件,其受缺水影响。由于膨压和可用水的减少,细胞生长是对干旱最敏感的生理过程之一(Taiz和Zeiger,2006)。在缺水情况下,高等植物的细胞伸长可能被从木质部到周围伸长细胞的水流的中断而抑制。受损的有丝分裂、降低的细胞伸长和扩增导致植物高度、叶面积和作物生长的降低(Nonami,1998)。
[0114] 盐分也被认为是影响作物生长和生产力的主要的严重非生物因素之一。在盐胁迫期间,所有主要过程(例如光合作用、蛋白质合成以及能量和脂质代谢)都会受到影响(Parida&Das,2005)。在最初暴露于盐分期间,植物会遭受水胁迫,从而减少叶片扩展。盐分胁迫的渗透影响可以在盐施用后立即观察到,并且据信在暴露期间会持续下去,从而导致受抑制的细胞扩增和细胞分裂以及气孔关闭。在长期暴露于盐分期间,植物经历离子胁迫,这可能导致成年叶片的过早衰老,从而减少可用于支持持续生长的光合面积。事实上,过量的钠以及更重要的氯化物可能不利地影响植物酶,导致能量产生减少和其它生理变化。进一步承认的是,离子胁迫导致较老的叶片过早衰老,以及成熟叶片中的毒性症状(缺绿症、坏死)。不希望受到理论的束缚,高钠离子通过破坏蛋白质合成并干扰酶的活性来影响植物(Carillo等人,2011)。
[0115] 本发明提供了一种用于有效筛选在植物并且特别是在有价值的作物中赋予对干旱和/或盐分的抗性或提高的耐受性的新基因的方法。
[0116] 本发明的方法通过使用表达的遗传物质(例如RNA或mRNA)(其代表例如由于环境条件(例如干旱或高盐)而在所选生物中表达的基因)并且产生代表某些生物生态位或其它遗传来源的“宏表达(Meta-Expression)”或宏转录组(metatranscriptome)状态的cDNA文库克服了上述缺点。然后将整个cDNA文库转化到植物中并且表达和筛选植物中期望的表型。
[0117] 本发明的核心方面是从多种来源(包括植物)和环境产生表达文库。将表达文库转化到作为靶生物的植物中,以改善其性状或功能。然后筛选植物表达文库的期望性状,例如盐或干旱抗性或耐受性、提高的生物量和产量、生物胁迫(疾病和病原体)抗性或耐受性、提高的营养价值或提高的肥料利用率。
[0118] 本文承认,植物生长于其中的环境(例如土壤)被微生物群落所栖息,例如一克土壤含有约107-109个微生物细胞(估计每克土壤中细菌物种的数量在2000至830万之间变化,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2970868/),其包含约一千兆基(gigabase)的序列信息,或更多。居住在植物生长环境(例如土壤)中的微生物群落非常复杂,并且尽管具有重要的经济意义,但仍然所知甚少。这样的微生物联盟(consortia)为植物生长提供了必要的生态系统,包括固定大气中的氮、营养循环、疾病抑制以及螯合和其它金属。
[0119] 使用功能性宏基因组学和宏转录组学方法来探索赋予植物改良性状的新基因在本发明的范围内。
[0120] 现在参考根据一些方面的由本发明所采用的宏基因组学方法。宏基因组学是对来自环境样品的遗传物质的研究。其通常指环境基因组学、生态基因组学或群落基因组学。尽管传统的微生物学和微生物基因组测序以及基因组学依赖于培养的克隆培养物,但是环境基因测序克隆特定基因以在天然样品中产生多样性谱。在一些方面,宏基因组学利用微生物群落中基因组的研究来构成研究微生物组的第一步。其的主要目的是推断微生物群落的分类学概况。全宏基因组测序(WMS)提供有关微生物群落功能概况的数据。这样的工作表明,通过基于培养的方法,错过了绝大多数微生物生物多样性。事实上,据估计,在地球上几乎每个环境中,超过99%的微生物无法在实验室中进行培养。
[0121] 本文的宏基因组学还指代宏转录组学,其研究并关联一组相互作用的生物或物种的转录组。宏转录组学涉及对微生物群落的完整(宏)转录组进行测序。在一些方面,宏转录组学告知由整个群落表达的基因。通过使用表达基因的功能注释,可以推断特定条件下群落的功能概况,这通常取决于宿主的状态。尽管宏基因组学提供了在不同条件下的微生物群落组成的数据,而宏转录组学则提供了在不同条件下共同表达的基因的数据。宏转录组学涉及对整个群落的基因表达(RNA-seq)进行分析。在特定方面,宏转录组学描述了在特定微生物环境中表达的基因。因此,宏转录组学是对来自环境样品的完整转录本(RNA-seq)的功能和活性的研究。
[0122] 应注意,基因表达呈对数状分布,例如,表达最高的前100个基因可覆盖所有转录本的多至30%。甚至单个基因也可覆盖10%的比例。因此,需要很高的测序深度才能看到表达水平较低的基因。
[0123] 通过使用诸如“枪”或PCR定向测序(PCR directed sequencing)的方法,可以从采样群落的成员中获得很大程度上无偏的基因样品。本文承认宏基因组学方法提供了利用微生物生态学来改善植物性状的强大工具,例如,可用于农业的生物学机制和改善的植物性状。
[0124] 如本文所用,术语“约”表示所限定的量或量度或值的±25%。
[0125] 如本文所用,术语“相似”表示约±20%、特别是±15%、更特别约±10%、并且甚至更特别约±5%的对应或相似范围。
[0126] 如本文所用,术语“平均值”是指通过测量某一植物种群的每株植物中的预定参数并根据所述种群中植物的数目计算平均值而获得的平均值。
[0127] 在本说明书和所附权利要求书中,除非上下文另外明确指出,否则未用数量词限定的名词指示一个/种或多个/种指示对象。因此,例如,提及“植物”时包括一个/种或多个/种植物,提及“性状”时包括一个/种或多个/种性状,提及“细胞”时包括细胞的混合物、组织等。
[0128] 如本文所用,“植物”是指处于任何发育阶段的任何植物,包括植物种子。
[0129] 术语“植物”包括整株植物或其任何部分或衍生物,例如植物细胞、植物原生质体、可从其再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈合组织或愈伤组织、分生组织细胞、小孢子、胚、未成熟的胚、花粉、胚珠、花药、果实、花、叶、子叶、雌蕊、种子、种皮、根、根尖等。
[0130] 本文使用的术语“植物细胞”是指植物的结构和生理单位,包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养的细胞的形式,或者作为较高组织单元例如植物组织、植物器官或整株植物的一部分。
[0131] 如本文所用,术语“植物细胞培养物”或“组织培养物”是指植物单位的培养物,例如原生质体、可再生细胞、细胞培养物、细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、处于不同发育阶段的合子和胚、叶、根、根尖、花药、分生细胞、小孢子、花、子叶、雌蕊、果实、种子、种皮或其任意组合。
[0132] 如本文所用,术语“植物材料”或“植物部分”是指植物的叶、茎、根、根尖、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、合子、种子、种皮、插条、细胞或组织培养物或任何其它部分或产品或其任何组合。
[0133] 如本文所用,“植物器官”是指植物的独特且可见的结构化和分化的部分,例如根、茎、叶、花、花芽或胚。
[0134] 如本文所用,“植物组织”是指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。该术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物、原生质体、分生细胞、愈伤组织以及组织成结构和/或功能单元的任何一组植物细胞。该术语与以上所列或以其它方式由本定义所涵盖的任何特定类型的植物组织结合使用或在不存在后者时使用,并不旨在排除任何其它类型的植物组织。
[0135] 如本文所用,术语“性状”是指特征或表型,尤其是指植物改良特征或表型。表型性状可以指个体的外观或其它可检测的特征,由其基因组、蛋白质组和/或代谢组与环境的相互作用而产生。例如,在本发明的上下文中,植物改良性状或期望的植物改良性状涉及对至少一种生物胁迫的抗性或耐受性、对至少一种非生物胁迫的抗性或耐受性、提高的产量或生物量、提高的谷物产量、提高的肥料吸收和使用效率及其任意组合。
[0136] 性状可以显性或隐性方式或者以部分或不完全显性方式遗传。性状可以是单基因的(即由单个基因座决定)或多基因的(即由多于一个基因座决定),或者也可以由一个或多个基因与环境的相互作用产生。显性性状导致在杂合或纯合状态时的完整表型表现。通常,隐性性状仅在以纯合状态存在时才表现出来。
[0137] 在本发明的范围内,术语“表型”应理解为是指遗传控制性状的可区别特征。
[0138] 如本文所用,短语“表型性状”是指个体的外观或其它可检测的特征,由其基因组、蛋白质组和/或代谢组与环境的相互作用产生。
[0139] 在本发明的范围内,“胁迫”可以定义为对植物生长、功能和/或繁殖具有负面影响的任何外部因素。
[0140] 术语“非生物胁迫”在本文中通常被定义为在特定环境中非生命因素对植物的负面影响。非生命变量必须以超出正常变化范围影响环境,以显著方式不利地影响植物或植物种群的性能或生理。非生物胁迫因素或胁迫源或环境因素的非限制性实例可包括诸如阳光、风、温度(冷、热)、盐分、过度浇水(洪水)、干旱等因素,以及诸如肥料吸收和肥料使用效率的因素,及其任意组合。非生物胁迫抗性或耐受性可以增强植物特别是作物的生长和生产力。已经表明,非生物胁迫因素是最有害的,并且当与非生物胁迫因素一起出现时,可能会产生协同效应。
[0141] 术语“干旱”在下文中是指通常由长时间低于平均的降水或灌溉所引起的物理现象。例如,不足或低的水分(土壤或空气中)、供水短缺、干燥土壤、水分状况、高盐分、热及其任何组合。干燥条件可能由于不同的原因而形成。其可能对生态系统和农业产生重大影响,例如降低产量和作物损害。
[0142] 许多生物具有干旱抗性生理和遗传适应性。
[0143] “生物胁迫”在本文中定义为由于其它活生物(例如细菌、病毒、真菌、粉虱、蓟、蜘蛛、线虫、寄生虫、有益和有害昆虫、杂草以及栽培或原生植物)对植物造成的损害而产生的胁迫。施加在植物上的生物胁迫的类型可能取决于地理和气候两者以及寄主植物及其抵抗特定胁迫的能力。
[0144] 如本文所用,词语“抗性”是指与相似环境条件下的易感植物相比,植物限制特定病原体的生长和发育和/或对植物造成的损害的能力。抗性植物在病原体或害虫压力下或在非生物胁迫条件下可能表现出某些疾病症状或损害。
[0145] 进一步在本发明的范围内,抗性是指植物自身完全免疫特定的胁迫,例如生物营养性病原体感染。根据本发明的特定实施例,通过将表达文库转化至宿主植物,经转化的宿主获得了抗性基因,其阻止病原体的增殖和/或赋予对特定非生物胁迫(例如干旱)的抗性。
[0146] 根据一些方面,抗性是绝对术语,其中植物自身完全免疫特定胁迫。应当指出,这并不意味着在生物或非生物胁迫下无法获得耐受性。
[0147] 术语“耐受性”在下文中是指在通常会对相同物种的其它植物造成更大伤害的条件下,允许植物避免、耐受生物或非生物胁迫源或从其中恢复的植物特征。这些可遗传的特征影响对植物造成的损害程度。就农业生产的耐受性而言,意味着植物可处于胁迫(疾病/感染/或生理攻击)之下,但损失程度不超过经济阈值水平(损失程度不妨碍产品的经济潜力)。根据本发明的其它一些方面,耐受性是相对术语。耐受性的实例可存在于植物病原体和所有非生物胁迫的情况下,尤其是在由多个因素控制的复杂性状的情况下。
[0148] 通常,“抗性”和“耐受性”是用来表示植物应对生物或非生物胁迫的能力的术语。
[0149] 本文所用的术语“转化”是指通过将外源DNA引入细胞而引起的遗传改变或修饰。这包括将外源DNA整合进宿主基因组,和/或将包含外源DNA的质粒DNA引入植物细胞。这样的转化过程导致外源遗传物质(外源DNA,例如从生态生态位采样制备的表达文库)的摄取、并入和表达。植物转化可以是指利用分子和细胞生物学开发的直接或间接手段将外源基因引入植物细胞、组织或器官。
[0150] 术语“环境生态位”或“生态生态位”通常是指生活在特定环境条件下的物种的行为。其包括居住于给定环境位置的微生物、真菌、植物或其它生物(极端微生物)。生态生态位描述了生物体或种群如何响应于资源和竞争者的分布,以及反过来又如何改变那些相同的因素。构成环境生态位规模的变量的类型和数量在物种之间变化,并且特定环境变量对于物种的相对重要性可能会根据地理非生物和生物环境而变化。
[0151] 根据其它方面,术语“环境生态位”或“生态生态位”描述了物种或种群在生态系统中的关系位置。更具体地说,其描述了种群如何响应于其丰富的资源和竞争者以及如何影响这些相同的因素。非生物或物理环境也是生态位的一部分,因其影响种群如何影响资源和竞争以及如何被资源和竞争影响。生态位的描述可能包括生物体的生活史、生境以及在食物链中的位置的描述。在本发明的上下文中,“环境生态位”或“生态生态位”可以根据生物因素或非生物因素来定义,例如高盐分、干旱条件、高温、寒冷条件、pH或任何其它极端环境条件。
[0152] 在本发明的范围内,遗传物质来自预定环境生态位的采样,包括来自土壤、水、植物生物质、微生物、酵母、藻类、线虫等。
[0153] 如本文所用,术语“微生物组”或“微生物群”是指在从植物到动物的所有多细胞生物中和上发现的共生、共栖和致病微生物的生态群落。微生物群包括细菌、古细菌、原生生物、真菌和病毒。已经发现微生物群对于其宿主的免疫稳态、激素稳态和代谢稳态是至关重要的。同义术语微生物组描述了存在于环境生态位中的微生物的集体基因组或微生物本身。微生物组和宿主在进化过程中以表观遗传学和基因组特征的协同单位出现,有时统称为共生功能体(holobiont)。
[0154] 术语“遗传物质”或“遗传库”在下文中是指给定时间种群的遗传物质的总和。其包括种群中的所有基因和基因组合(等位基因的总和)。
[0155] 下文所用的术语“分离的”是指将材料从其原始环境(例如,如果是天然存在,则从自然环境)中去除。例如,从天然系统中的一些或全部共存物质分离的天然存在的多核苷酸或多肽是分离的。
[0156] 从微生物或任何生物分离或来源的核酸可优选插入载体或质粒。这样的载体或质粒优选是包含表达调节序列(包括括适合在植物中表达的启动子、增强子等)的那些。在本文阐述的方案中详细描述了特别优选的质粒及其引入和转化的方法。
[0157] 下文所用的术语“表达文库”是指包含以被宿主生物(在本发明的上下文中为植物)转录和/或翻译的方式构建的cDNA或基因组片段的代表性样品的载体或病毒(例如用作病毒载体的植物病毒)或质粒或噬菌体的集合。该技术使用表达载体产生克隆文库,每个克隆转录一种RNA和/或表达一种蛋白质。然后筛选该表达文库的目的特性,并且回收目的克隆以进行进一步分析。一个且非限制性的实例是使用表达文库分离可以赋予干旱抗性或耐受性的基因。
[0158] 在本发明的范围内,可以将表达文库(通常来源于微生物遗传物质)构建在能够在多种宿主(例如大肠杆菌(E.coli)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))中复制以产生遗传修饰植物的双元载体(或转移DNA(T-DNA)双元系统或穿梭载体)中。这些是从根癌农杆菌中发现的天然存在的Ti质粒产生的人工载体。在一些方面,将表达文库从根癌农杆菌转移至植物。
[0159] 术语“编辑”或“基因编辑”或“基因组编辑”在下文中是指任何常规或已知的基因组编辑系统或方法,包括使用选自由以下所组成的组的工程化核酸酶的系统:大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)、成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统及其任意组合。在本发明的上下文中,根据从通过本发明的方法鉴定的转基因获得的信息,使用上述基因编辑技术来编辑期望作物植物中的靶基因。
[0160] 术语“与序列相对应”在下文中指序列同源性或序列相似性。这些术语涉及两个或更多个核酸或蛋白质序列,其在用于最大对应性的比较和比对时是相同的或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸,如使用一种可用的序列比较算法或通过目视检查测定的。
[0161] 根据本发明的另一些方面,术语“与核苷酸序列相对应”是指所指示的核苷酸序列的变体、同源物和片段,其具有或执行相同的生物学功能或者与所指示核苷酸序列的相同表型特征相关。
[0162] 两个核酸序列基本上相似或序列“与核苷酸序列相对应”的另一种指示是,两个分子在严格条件下彼此杂交。高严格条件(例如高杂交温度和杂交缓冲液中的低盐)仅允许高度相似的核酸序列之间的杂交,而低严格条件(例如较低温度和高盐条件)则允许当序列不太相似时进行杂交。
[0163] 术语“相似性”或“序列相似性”在下文中是指当比较时两个序列之间的相似程度。这取决于它们的同一性,并且显示了残基被比对上的程度。序列相似性是指最佳匹配问题(即用于序列比对)。最佳匹配算法找到最少数量的编辑操作(插入、缺失和替换),以便对一个序列与另一个序列进行比对。序列相似性检索可以通过检测过量相似性(即反映共同祖先的统计学上显著的相似性)来识别“同源”蛋白质或基因。
[0164] 在本发明的范围内,相似性检索是用于鉴定同源物(即,具有共同的进化祖先的序列)的有效且可靠的策略或工具。相似性检索程序的非限制性实例包括BLAST(例如Altschul等人,1997);3.3和3.4单元)、PSI-BLAST(例如Altschul等人,1997)、SSEARCH(例如Smith和Waterman,1981);Pearson,1991,单元3.10)、FASTA(例如Pearson和Lipman,1988,单元3.9)和HMMER3(例如Johnson等人,2010)。这样的程序产生准确的统计学估计,并且可以确保具有显著相似性的蛋白质或核酸序列也可以具有相似的结构。相似性检索是有效且可靠的,因为可以推断出具有显著相似性的序列是同源的;即具有共同的祖先。
[0165] 在本发明的范围内,相似性应理解为是指至少60%序列相似性,特别是至少70%,优选大于80%,更优选大于90%的相似性。术语“基本上相似”是指当比较整个ORF(开放阅读框)时与参考序列至少50%相同的核酸,其中序列相似性优选为至少70%,更优选至少80%,还更优选至少85%,特别是大于约90%,最优选95%或更大,特别是98%或更大。
[0166] 在本发明的一些实施例中,这样的基本相似的序列是指与指示的多核苷酸或氨基酸序列具有至少约60%相似性,优选地至少约80%相似性,或者约90%、95%、96%、97%、98%或99%相似性的多核苷酸或氨基酸序列。
[0167] 本发明涵盖与通过本发明的方法鉴定的多核苷酸序列或与参考序列具有至少60%相似性,优选70%,更优选80%,甚至更优选90%并且特别更优选95%相似性的核苷酸序列。
[0168] 本发明还涵盖与通过本发明的方法鉴定的多肽序列或与参考序列具有至少60%相似性,优选70%,更优选80%,甚至更优选90%并且特别更优选95%相似性的氨基酸序列。
[0169] 如本文所用,“参考序列”是用作序列比较的基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体;例如,作为全长cDNA或基因序列的片段,或完整的cDNA或基因或蛋白质序列。
[0170] 如本文所用,在两个核酸或多肽序列情况下的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定比较窗口内进行最大对应性比对时两个序列中相同的残基。当使用序列同一性百分比来表示蛋白质时,认识到不相同的残基位置通常会因保守的氨基酸取代而有所不同,其中氨基酸残基被具有类似化学性质(例如,电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代,因此不会改变分子的功能特性。
[0171] 术语“同一性”或“序列同一性”在下文中还指在两个不同序列之间精确匹配的特征的量。因此,不计算缺口(gap),并且测量与两个序列中较短的一个有关。
[0172] 换句话说,如果相互比较的两个序列的长度不同,则序列同一性优选地涉及较短序列中与较长序列的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。如本文所用,在考虑需要被引入以用于两个序列最佳比对的缺口的数目和每个缺口的长度的情况下,两个序列之间的同一性百分比是两个序列具有的相同位置的数目的百分比。可以使用相关领域中已知的数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。
[0173] 进一步在范围内,术语“相似性”和“同一性”还指局部同源性,鉴定了同源或相似(在核苷酸和/或氨基酸序列中)的结构域。公认的是,诸如BLAST、SSEARCH、FASTA和HMMER的生物信息学工具计算局部序列比对,其鉴定两个序列之间最相似的区域。对于在不同蛋白质中不同序列背景下发现的结构域,比对应限于同源结构域,因为结构域同源性提供了得分中捕获的序列相似性。根据一些方面,术语相似性或同一性还包括序列基序,其是广泛的并且具有或被认为具有生物学意义的核苷酸或氨基酸序列模式。蛋白质可以具有序列基序和/或结构基序,该基序是由可能不相邻的氨基酸的三维排列形成的。
[0174] 根据另一些实施例,通过本发明的方法鉴定了具有特定位置或结构域序列相似性的蛋白质或多核苷酸序列。当比较无保守性的残基时,低相似性是没有意义的,因此在保守区域中具有较高保守性的较低总体相似性序列在给定范围在被认为是相似的,例如在基于hmm的搜索算法(例如HMMER3)可以发现的>60%(即,与最接近的同源序列显示约37%的低相似性但是具有特定蛋白家族的所有保守底物结合残基的序列)。
[0175] 术语“保守结构域数据库(CDD)”是指代表蛋白质结构域的序列比对和谱的集合。其还包括结构域与数据库(即分子模型数据库(MMDB))中已知的3维蛋白质结构进行比对。
[0176] 在本发明的一些实施例中,这样的基本相同的序列是指与指定的多核苷酸或氨基酸序列具有至少约60%同一性,优选至少约80%的同一性,或者约90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的多核苷酸或氨基酸序列。
[0177] 在本发明范围内的多肽与通过本发明方法鉴定的蛋白质具有至少50%同一性;或者与通过本发明方法鉴定的蛋白质或与参考序列具有至少55%同一性、或至少60%同一性、或至少65%同一性、或至少70%同一性、或至少75%同一性、或至少80%同一性、或至少85%同一性或至少90%同一性或至少90%同一性。
[0178] 如本文所用,“序列同一性百分比”是指通过比较在比较窗口中最佳比对的两个序列而确定的值,其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比,比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即缺口),以用于两个序列的最佳比对。如下计算百分比:确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目,用匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目,并且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。
[0179] 术语多核苷酸序列的“基本同一性”是指使用标准参数描述的比对程序之一,多核苷酸序列包含与参考序列相比包含至少80%序列同一性,优选至少85%、更优选至少90%、最优选至少95%序列同一性。本领域技术人员将认识到,通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等,可以适当地调节这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。为了这些目的,氨基酸序列的基本同一性通常是指至少80%,优选至少85%,更优选至少90%,最优选至少95%的序列同一性。优选地,使用Needleman等人的同源性比对算法进行最佳比对(1970.J.Mol.Biol.48:443)。
[0180] 如本文所用,术语“同源物”是指在共有的氨基酸或核苷酸序列方面具有一定程度的序列相似性的DNA或氨基酸序列。可能存在部分相似性或完全相似性(即同一性)。对于蛋白质序列,可以使用氨基酸相似性矩阵,这在不同的生物信息学程序中是已知的(例如BLAST、FASTA,Bestfit program-Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive Madison,WI 53711,Smith Waterman)。当利用不同的矩阵执行特定检索时,可能获得不同的结果。如本领域所公知的,核苷酸序列的相似性程度是基于同一性匹配,其中具有对优化比对所需的缺口或插入所作出的罚分(例如,Altschul S.F.等人,1990,J Mol Biol 215(3):403-10;Altschul S.F.等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。可以使用本领域周知的计算机程序(例如DNASTAR软件)找到确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不丧失生物学或活性的指南。
[0181] 在本发明的范围内,术语“多态性”应理解为是指群体中存在两种或更多种不同形式的基因、遗传标志物或遗传性状或基因产物,其可例如通过选择性剪接、DNA甲基化等获得。
[0182] 本发明涵盖“高通量筛选”或“HTS”技术,其在本文中是指快速鉴定调节特定生物分子途径或功能的基因的方法。其包括宏转录组学和宏基因组学基因表达。
[0183] 本发明概述了由从生态生态位中分离的遗传物质产生表达文库的方法,所述表达文库可以转化到靶植物中以用于筛选期望性状,例如对生物或非生物胁迫的耐受性或抗性以及提高产量或生物质生产。
[0184] 根据一个实施例,本发明提供了一种用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:(a)从预定环境生态位的采样获得遗传物质;和(b)从所述遗传物质构建表达文库。根据核心实施例,本发明还包括以下步骤:(c)产生用表达文库转化的植物,效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因,从而在植物或种子中产生表达文库;(d)筛选表达期望性状的转化植物;和(e)鉴定转化植物的表达期望性状的转基因。
[0185] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中步骤(a)还包括通过在富培养基或选择性培养基上生长来富集遗传物质的步骤。
[0186] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中步骤(a)还包括通过在针对期望性状的选择性培养基上培养遗传物质来增强期望性状的表达的步骤。
[0187] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中步骤(b)包括产生原核cDNA文库或真核cDNA文库或两者的步骤。
[0188] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中步骤(b)还包括将cDNA文库克隆到至少一种双元载体中的步骤。
[0189] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中所述双元载体包含组成型启动子或胁迫诱导型启动子。
[0190] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中所述双元载体包含细菌选择标志物和植物转化选择标志物。
[0191] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中细菌选择标志物是卡那霉素抗性或任何其它抗生素抗性赋予基因,而植物转化选择标志物是赋予对包含草丁膦的除草剂(例如Basta除草剂)的抗性的bar基因。
[0192] 现在提及草铵膦(也称为草丁膦,通常是铵盐)是由链霉菌属土壤细菌的多个物种产生的天然存在的广谱内吸性除草剂。草铵膦是一种用于控制杂草的广谱除草剂。其以包括Basta、Rely、Finale、Challenge和Liberty的品牌的制剂出售。bar基因赋予对除草剂Basta(含草丁膦)的抗性。
[0193] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括将克隆的双元载体转化到宿主细胞中的步骤。
[0194] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括将克隆的双元载体转化到根癌农杆菌中的步骤。
[0195] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括将转化的根癌农杆菌引入到以下至少一种中的步骤:整株植物、植物组织和植物细胞。
[0196] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,包括通过向植物喷洒包含转化的农杆菌的接种物来引入转化的根癌农杆菌的步骤。
[0197] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中步骤(d)包括在对期望形状具有选择性的条件下培养转化植物。
[0198] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括以下步骤:
[0199] f.从步骤(d)的转化植物收集T1种子;
[0200] g.通过计算草丁膦抗性植物与植物总数的比率,确定T1种子的种子文库效率;
[0201] h.在允许筛选和选择表达期望性状的转化植物的选择性条件下播种步骤(e)的T1种子;
[0202] i.测试步骤(g)选择的的表达期望性状的植物中转基因的存在;和
[0203] j.对步骤(h)的对于转基因阳性测试的选择的转化植物的转基因进行分离和测序。
[0204] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括以下步骤:
[0205] k.从(h)的发现对于转基因的存在为阳性的植物收集T2种子;
[0206] l.与用赋予期望性状的已知基因转化的对照植物相比,在允许筛选和选择表达期望性状的转化植物的选择性条件下生长T2种子的植物;和
[0207] m.任选地,对步骤j的选择的植物的转基因进行分离和测序。
[0208] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括以下步骤:
[0209] a.对步骤(i)和/或(l)的分离的转基因进行重克隆和测序;
[0210] b.将重克隆的转基因转化到植物中;
[0211] c.筛选步骤(b)的转化植物以选择表达期望性状的转化植物;
[0212] d.从步骤(c)的选择的植物中分离转基因;和
[0213] e.任选地,重复步骤(a)至(d)。
[0214] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中环境生态位包括来源于生态生态位、来源、种群、生境、基因库、原核培养物、真核培养物及其任何组合的样品。
[0215] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中环境生态位采样包括微生物组、微生物群或微生物培养物、植物、酵母、藻类、线虫或任何其它生物或其组合。
[0216] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中根据生物因子、非生物因子及其组合来限定环境生态位。
[0217] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中环境生态位采样包括土壤样品、水样品、有机物样品、任何活生物体(例如植物、酵母、细菌、微生物、藻类、线虫)及其任意组合。
[0218] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中所述期望性状选自由以下所组成的组:对至少一种生物胁迫的抗性或耐受性、对至少一种非生物胁迫的抗性或耐受性、提高的产量或生物量、提高的谷物产量、提高的肥料吸收和提高的使用效率及其组合。
[0219] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中非生物胁迫选自由以下所组成的组:干旱、盐分、热、冷、肥料吸收、肥料利用效率及其任意组合。
[0220] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中生物胁迫选自由以下所组成的组:病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益和有害昆虫、杂草和栽培的或天然的植物或其任意组合。
[0221] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中所述方法包括从预定环境生态位的采样中提取RNA的步骤。
[0222] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中RNA提取根据标准商业试剂盒或根据任何其它用于从环境采样中提取RNA的方案进行。
[0223] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中用于从环境采样中提取RNA的方案包括以下步骤:
[0224] a.获得土壤样品;
[0225] b.将土壤样品与提取缓冲液混合,所述提取缓冲液包含500mM pH 8的磷酸盐缓冲液和5%w/v的鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)以及比率为25:24:1的苯酚(pH 8)/氯仿/IAA;
[0226] c.使步骤(b)的混合物经受37℃下振摇15分钟或珠打浆机1分钟;
[0227] d.在室温下将步骤(c)的混合物在2500g下离心约10分钟以获得水相;
[0228] e.将水相转移到新管中;
[0229] f.向步骤(e)的管内的水相中添加等量的补充有20mg/ml的结晶紫溶液的异丙醇,以获得紫色染色溶液;
[0230] g.通过倒转步骤(f)的管来混合所述溶液,然后将管在室温下孵育约30分钟;
[0231] h.在室温下将步骤(g)的管在2500g下离心约30分钟,以获得紫色染色层;
[0232] i.紫色染色层转移到新管中,并将管以最大速度离心约5min,以获得沉淀和上清液;
[0233] j.用80%v/v冰冷的乙醇洗涤所述沉淀并且再离心5分钟,以获得沉淀和上清液;
[0234] k.除去步骤(j)的上清液并使沉淀干燥;和
[0235] l.将干燥的沉淀以100μl水比2克步骤(a)的土壤的比例混悬在水中。
[0236] 范围内还公开了可通过如以上所限定的方法获得的多核苷酸序列。
[0237] 范围内还公开了如以上所限定的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含与选自由SEQ IDNO:1-148及其任意组合所组成的组的多核苷酸序列中所示的序列相对应的核苷酸序列。
[0238] 范围内还公开了与可通过如以上所限定的方法获得的多核苷酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列相似性的多核苷酸序列。
[0239] 范围内还公开了可通过如以上所限定的方法获得的多肽序列。
[0240] 范围内还公开了如以上所限定的多肽序列,其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:149-321及其任意组合所组成的组的多肽序列中所示的序列相对应的氨基酸序列。
[0241] 范围内还公开了与可通过如以上所限定的方法获得的氨基酸具有至少60%、70%、80%或90%序列相似性的氨基酸序列。
[0242] 范围内还公开了如以上所限定的方法在用于鉴定赋予对非生物或生物胁迫的抗性或耐受性的基因中的用途。
[0243] 范围内还公开了如以上所限定的方法在用于鉴定在暴露或不暴露于胁迫条件下赋予植物提高的产量和生物量(即提高的谷物产量,例如通过增强生长)的基因中的用途。
[0244] 范围内还公开了如以上所限定的方法在用于鉴定赋予提高的产量的基因中的用途。
[0245] 范围内还公开了如以上任一者所限定的用途,其中所述非生物胁迫选自由以下所组成的组:干旱、盐分、热、冷、肥料利用、肥料吸收及其任意组合。
[0246] 范围内还公开了如以上任一者所限定的用途,其中生物胁迫选自由以下所组成的组:病原体、细菌、病毒、真菌、寄生虫、有益和有害昆虫、杂草和栽培的或天然的植物或其任意组合。
[0247] 范围内还公开了用于筛选和鉴定植物中的干旱抗性或耐受性改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:(a)获得来源于低水分或高盐分环境生态位样品的遗传物质;和(b)从所述遗传物质构建表达文库。根据核心实施例,所述方法还包括以下步骤:(c)产生用所述表达文库转化的植物,效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;(d)筛选在预定干旱条件下存活的转化植物;和(e)鉴定步骤(d)的干旱存活的转化植物的转基因。
[0248] 范围内还公开了如以上所限定的方法,其中步骤(b)还包括将表达文库克隆到至少一种双元载体中的步骤。
[0249] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括以下步骤:
[0250] f.从步骤(c)的转化植物收集T1种子;
[0251] g.将所述T1种子播种在对转化植物有选择性的水含量为约100%容量的土壤中;
[0252] h.在干旱条件和/或不灌溉的情况下生长T1种子的植物,直到大部分植物死亡,以产生在干旱条件下存活的转化植物;
[0253] i.使干旱存活的转化植物生长以产生T2种子;
[0254] j.筛选步骤(i)的干旱存活的转化植物中转基因的存在;
[0255] k.从步骤(j)的阳性筛选植物分离转基因并且测序。
[0256] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,还包括以下步骤:
[0257] l.从步骤(j)的每一个含转基因的阳性筛选的干旱存活转化植物收集T2种子;
[0258] m.与用赋予干旱耐受性或干旱抗性的已知基因转化的对照植物相比,在预定的干旱条件下从步骤(l)的每一个含转基因的T2种子生长T2植物;
[0259] n.与对照植物相比,对每一个含转基因的T2植物进行干旱耐受性或抗性筛选测量,其选自由以下所组成的:膨压测量、植物死亡数、植物状态及其任意组合;
[0260] o.从步骤(n)的筛选的干旱抗性性能T2植物分离转基因;
[0261] p.任选地,将转基因重克隆到双元载体中;
[0262] q.任选地,将克隆的双元载体转化到植物中,并且在预定干旱条件下生长转化植物;和
[0263] r.任选地,重复步骤(l)至(q)。
[0264] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中生长T2植物的步骤包括以下步骤:(a)将T2种子播种在对转化植物有选择性的水含量为约100%容量的土壤中;和(b)当土壤中的水含量达到约5-10%时,灌溉所述植物。
[0265] 范围内还公开了如以上任一者所限定的方法,其中预定干旱条件选自低水分、高盐分、干燥土壤和热。
[0266] 范围内还公开了可通过如以上任一者所限定的方法获得的多核苷酸序列。
[0267] 范围内还公开了如以上所限定的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含与选自由SEQ IDNO:1-148及其任意组合所组成的组的多核苷酸序列中所示的序列相对应的核苷酸序列。
[0268] 范围内还公开了与可通过如以上任一者所限定的方法获得的多核苷酸序列具有至少80%、85%、90%或95%序列相似性的多核苷酸序列。
[0269] 范围内还公开了可通过如以上任一者所限定的方法获得的多肽序列。
[0270] 范围内还公开了如以上所限定的多肽序列,其中所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:149-321及其任意组合所组成的组的多肽序列中所示的序列相对应的氨基酸序列。
[0271] 范围内还公开了与可通过如以上任一者所限定的方法获得的氨基酸序列具有至少60%、70%、80%或90%序列相似性的多肽序列。
[0272] 本发明的范围内还公开了用于从土壤样品中提取RNA的方法,包括以下步骤:
[0273] m.获得土壤样品;
[0274] n.将所述土壤样品与提取缓冲液混合,所述提取缓冲液包含500mM pH 8的磷酸盐缓冲液和5%w/v的鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)以及比率为25:24:1的苯酚(pH 8)/氯仿/IAA;
[0275] o.使步骤(b)的所述混合物经受37℃下振摇15分钟或珠打浆机1分钟;
[0276] p.在室温下将步骤(c)的所述混合物在2500g下离心约10分钟以获得水相;
[0277] q.将所述水相转移到新管中;
[0278] r.向步骤(e)的所述管内的所述水相添加等量的补充有20mg/ml的结晶紫溶液的异丙醇,以获得紫色染色溶液;
[0279] s.通过倒转步骤(f)的所述管来混合所述溶液,然后将所述管在室温下孵育约30分钟;
[0280] t.在室温下将步骤(g)的所述管在2500g下离心约30分钟,以获得紫色染色层;
[0281] u.将步骤(h)的所述紫色染色层转移到新管中,并将所述管以最大速度离心约5min,以获得沉淀和上清液;
[0282] v.用80%v/v冰冷的乙醇洗涤所述沉淀并且再离心5分钟,以获得沉淀和上清液;
[0283] w.除去步骤(j)的所述上清液并使所述沉淀干燥;和
[0284] x.将所述干燥的沉淀以100μl水比2克步骤(a)的土壤的比例混悬在水中。
[0285] 本发明的范围内还公开了用于筛选和鉴定期望的植物改良性状的方法,所述方法包括以下步骤:
[0286] y.获得预定义环境生态位的采样;
[0287] z.根据如上文所限定的用于从土壤样品中提取RNA的方法从采样中提取RNA;
[0288] aa.从步骤(b)的RNA构建表达文库;
[0289] 所述方法还包括以下步骤:
[0290] bb.产生用所述表达文库转化的植物,效率为至少0.05%至30%,代表至少102-1010个转基因;
[0291] cc.筛选表达期望性状的转化植物;和
[0292] dd.鉴定表达期望性状的转化植物的转基因。
[0293] 本发明的范围内还公开了分离的多核苷酸,该分离的多核苷酸具有与选自由SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:148及其任意组合所组成的组的多核苷酸序列中所示的序列相对应的核苷酸序列。
[0294] 本发明的范围内还公开了分离的多肽,该分离的多肽具有与选自由SEQ.ID No:149-321及其任意组合所组成的组的多肽序列中所示的序列相对应的氨基酸序列。
[0295] 为了理解本发明并且看到其如何在实践中实现,现在将仅通过非限制性实例的方式,参考以下实来描述多个优选实施例。
[0296] 实例1
[0297] 通过将来自生态生态位的表达文库转化到植物中并且筛选期望性状来改良植物性状的方法
[0298] 1.样品采集与处理
[0299] 第一步,已分离了来自多种环境样品和来源(例如来自不同生境的土壤、水或有机物)的遗传库。根据特定的期望目标性状选择来源。例如,当筛选干旱或盐分抗性基因时,将使用干旱土地,例如沙漠土地或高盐分土地或其它实施,但不是必须的。
[0300] 每个样品中发现的微生物组可任选地通过在富培养基上生长或通过用抗生素选择性生长来富集。为了增强潜在期望基因的表达,使培养物在类似于、与目标性状相关或影响目标性状的胁迫条件或培养基中生长,例如对于干旱或盐分抗性性状的富含盐或PEG的培养基。
[0301] 在振动培养箱中于28℃-37℃下,在富生长培养基(例如YPD)上进行样品富集数天。如果制备真核文库,则添加抗细菌抗生素,例如青霉素-链霉素和壮观霉素。
[0302] 为了诱导胁迫抗性基因,使样品在任何期望的环境胁迫条件下生长。例如,为了诱导干旱抗性基因,通过在生长培养基中添加PEG(10%-30%w/v)使样品在高渗透压下生长。高盐浓度培养基例如NaCl(5%-10%w/v)用于诱导高盐分胁迫。此外,使样品暴露于不同的氮浓度(补充有6mM KH2PO4和微量元素的水中的0-100mM KNO3,参见表1,制造商建议http://www.gatfertilizers.com/properties-of-solid-and-liquid-fertilizers/)、极端温度(50-60℃)和任何期望的环境胁迫。
[0303] 表1:
[0304]
[0305]
[0306] 2.RNA提取
[0307] 已经根据标准商业试剂盒例如RNeasy PowerSoil Total RNA Kit(Qiagen)和Quick-RNA(Zymo research)进行了总RNA提取。另外,如下所示将独特方案用于从土壤样品中提取RNA:
[0308] 在7ml的管中,用提取缓冲液(500mM pH8的磷酸盐缓冲液和5%w/v CTAB以及苯酚(pH 8)、氯仿、IAA(25:24:1))瓦解2g土壤。使管经受37℃下振摇15分钟或珠打浆机1分钟。然后将管在室温下以2500g离心10分钟。将水相转移到新管中,并添加等量的补充5ul结晶紫溶液(20mg/ml)异丙醇。通过颠倒将管混合,在室温下静置30分钟,然后在室温下以2500g离心30分钟。将紫色染色层转移到新的1.5ml管中,并以最大速度离心5分钟。将沉淀用500μl 80%v/v冰冷的乙醇洗涤并且再离心5分钟。离心之后,除去液体,并将沉淀干燥。将干燥的沉淀物混悬在100μl水中
[0309] 3.cDNA文库的构建
[0310] 3.1.真核cDNA文库
[0311] 基于模板切换——poly-A mRNA的逆转录(SMART)或cDNA末端的低封端快速扩增(5'-RACE)方法,构建了来自总RNA和mRNA的真核cDNA文库。所用的poly-A mRNA逆转录引物为5’-ATTCTAGAGCGATCGCACATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(称为SEQ.ID NO:321)和5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCGCGCCrGrGG-3’(称为SEQ.ID NO:322)。cDNA末端的低封端快速扩增引物为5’-ATTCTAGAGCGATCGCACATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(称为SEQ ID NO:321)和5’-InvddT(5'反向二脱-T)-r(AAGCAGUGGUAUCAACGCAGAGUGGCGCGCCG)-3’(称为SEQ ID NO:323)。将扩增的cDNA在启动子(35S、KINl、erdlO和/或CBF3)和HSP或NOS终止子之间插入双元载体(见图1-4)中。图1A示出了pPA-35H载体,其具有组成型CaMV 35S启动子,其中GFP基因作为示例克隆在启动子和终止子之间。图1B-D示出了含有拟南芥(Arabidopsis thaliana)的胁迫诱导型启动子的载体:具有CBF3启动子的pPA-CH,其具有如SEQ.ID NO:330中所示的核苷酸序列(图1B),具有ErdlO启动子的pPA-EH,其具有如SEQ.ID NO:331中所示的核苷酸序列(图1C)和具有Kinl启动子的pPA-KH,其具有如SEQ.ID NO:332中所示的核苷酸序列(图1D),其中GFP基因作为示例克隆在启动子和终止子之间(Plant Physiol.1997Oct;115(2):327–334.,Plant Journal(2004)38,982-993,通过引用并入本文)。
[0312] 这些载体包含卡那霉素作为细菌选择和bar基因作为赋予对草丁膦除草剂的抗性的转基因植物选择。使用吉布森组装(Gibson assembly)、限制性连接、无限制性或融合法中的至少一种非限制性实例,然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中以在卡那霉素的选择下生长。文库的大小通过LB培养皿上接种的转化细菌的活菌计数来估计(通常为10^5–10^7)(图5)。使用标准微型制备试剂盒从大肠杆菌中纯化cDNA文库的载体,并且转化到电感受态(electrocompetent)根癌农杆菌GV3101细胞中。转化的农杆菌在LB培养基上在卡那霉素和利福平选择(每种50μg/ml)下于28℃生长过夜(每1m2目标植物生长面积250ml)。
在冰上使生长停止至少30分钟,然后在4℃下以8000rpm离心10分钟。将沉淀的农杆菌混悬于混悬缓冲液(5%蔗糖和0.03%L-77Silwet,Momentive,US)中。
[0313] 3.2.原核生物cDNA文库
[0314] 使用ScriptSeqTMComplete Kit(epicenter)基于标准5’和3’RNA修饰构建来自总RNA的原核生物cDNA文库。使用的引物为5’-ATTCTAGAGCGATCGCACATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(称为SEQ.ID NO:321)和5’-InvddT(5'反向二脱氧-T)-r(AAGCAGUGGUAUCAACGCAGAGUGGCGCGCCG)-3’(称为SEQ ID NO:324)。将经扩增的cDNA插入具有卡那霉素和草丁膦抗性的运载载体中,然后转化到大肠杆菌感受态细胞中,以在卡那霉素选择(50μg/ml)下生长。文库大小通过转化宿主的活体计数来估计(通常为10^5–10^7)。使用标准微型制备试剂盒(50μl)从宿主细胞中纯化cDNA文库的载体,并且转化到电感受态农杆菌GV3103细胞(100μl)中。转化的农杆菌在LB培养基上在卡那霉素和利福平选择(50μg/ml)下2
于28℃生长过夜(每1m目标植物生长面积100ml)。在冰上使生长停止至少30分钟,然后在4℃下以8000rpm离心10分钟。将沉淀的农杆菌混悬于混悬缓冲液(5%蔗糖和0.03%L-
77Silwet)中。
[0315] 4.植物的生长和转化
[0316] 4.1.拟南芥植物
[0317] 使植物生长在受控温室中作为转化的准备。使植物生长在由75%的泥炭、25%的珍珠岩组成的土壤中,并且需要时根据制造商说明定期用补充有肥料(例如,Shefer 5.3.8,ICL Israel)的水灌溉。植物在3-4周之后开始开花,然后可以进行转化。使利用表达文库的转化农杆菌如上所述生长,并混悬在混悬缓冲液(5%蔗糖和0.03%L-77Silwet)中,并用2升喷雾器(例如Solo,German)喷在花上。在植物持续生长5-6周后变干时,收集种子并将其在阴凉干燥的地方放置2周或直到使用。
[0318] 4.2.烟草植物
[0319] 将烟叶切成1-2cm2的片,并用70%乙醇然后用0.3%漂白剂处理5分钟来灭菌。将叶片与文库转化的农杆菌(或与表4中SEQ ID 1-148的任一已鉴定基因)混合,混悬在补充有MS的液体再生培养基(RM)中30分钟,所述培养基包含Gamborg B5维生素、3%蔗糖、2mg/L BAP(6-苄基氨基嘌呤)和0.2mg/L NAA(乙酸)(例如,Duchefa,Netherland)。然后将细菌洗涤,并将叶片在黑暗中置于RM植物琼脂板上一天。将叶片转移到新的选择RM植物琼脂板上,其补充有300μg/ml的特美汀抗生素以杀死农杆菌和1.5μg/ml的磷酸肌醇(例如,Duchefa,Netherland)以选择转基因植物。图3A-B示出了用文库转化的烟草组织培养物的照片:转化后7天(图3A)和转化后40天(图3B)。6-8周后,小植株开始出现,并转移到包含相同选择RM植物琼脂但排除BAP的新容器中(见图3C)。生根后,将植物转移到温室的土壤中。
[0320] 实例2
[0321] 用于鉴定植物中的干旱抗性性状的方法
[0322] A.筛选干旱和/或盐分抗性植物/基因
[0323] 将具有期望表达文库的拟南芥T1种子用于筛选。在第一阶段,确定特定种子文库的转化效率。根据制造商的说明,将1ml种子(约50,000粒种子)播种在用补充有Basta(例如,Bayer,Germany)的水灌溉的土壤上。播种后7天,对草丁膦抗性植物的数目进行计数并与对草丁膦易感性植物进行比较(图4)。如图4所示,较大的植物对草丁膦具有抗性,而较小的植物不存在转基因,因此是易感的并将死亡。种子库效率由抗性植物数目与总植物数目之比表示。
[0324] 然后根据打算在具体实验中表现的最能代表文库大小的植物期望数目来播种文4
库。例如,如果表达文库由5X10 个基因组成,且转化效率为1%,则应播种>500万种子。在这种情况下,在约20m2的土壤中,将种植50,000个Basta抗性植物进行实验。
[0325] 在种子播种时,应根据制造商的说明用补充有草丁膦和肥料(例如Shefer 5.3.8,ICL Israel)的水将土壤灌溉一次,并且土壤水含量达到100%容量。使植物在装有空调的温室中生长,并且不灌溉植物直到大多数植物因缺水而死亡。通过灌溉挽救存活的植物(初始草丁膦抗性植物的0.1%),直到其产生种子,收集种子用于T2实验。在其生长过程中,通过从其一片叶的gDNA提取以及使用基因特异启动子(CaMV 35S、CBF3、ErdlO和Kinl)和终止子(NOS、HSP)的引物(参见表2)进行PCR来测试存活植物的转基因。对PCR产物进行测序,并将所得序列与序列数据库(如NCBI)进行比对,以进行DNA比较(即BLASTn)和氨基酸序列比较(即BLASTx)。
[0326] 现在参考表2,其示出了用于本发明的引物和启动子序列的SEQ ID NO
[0327] 表2:引物序列的SEQ ID NO
[0328]SEQ ID NO. 描述
SEQ ID NO:321 用于poly-A mRNA转录的反向引物
SEQ ID NO:322 用于poly-A mRNA转录正向引物
SEQ ID NO:323 用于cDNA末端的低封端扩增的正向引物
SEQ ID NO:324 用于扩增原核生物cDNA文库的正向引物(例如来自总RNA)
SEQ ID NO:325 CaMV 35S启动子的正向引物
SEQ ID NO:326 CBF3启动子的正向引物
SEQ ID NO:327 Erd10启动子的正向引物
SEQ ID NO:328 Kin1启动子的正向引物
SEQ ID NO:329 NOS/HSP终止子的反向引物
SEQ ID NO:330 CBF3启动子
SEQ ID NO:331 Erd10启动子
SEQ ID NO:332 Kin1启动子
[0329] B.后续世代(T2,T3)实验
[0330] 将从干旱存活植物中收集的种子在包括重复和对照的另外的实验中再次进行测试,以测试其对干旱的抗性/耐受性(见图5)。
[0331] 选择了多种基因作为干旱实验中的对照:
[0332] 1)EGFP-水母绿色荧光蛋白,在多种使用的启动子和HSP终止子的控制下克隆(见图1A-D的载体图),用作干旱的阴性对照,因为其未表现出与改良植物对干旱的抗性相关(Yang T-T等人,1996)。
[0333] 2)mtlD-来自自大肠杆菌的甘露醇-1-磷酸脱氢酶,在多种使用的启动子和HSP终止子的控制下克隆(见图1A-D的载体图),用作阳性对照,因为其表现出与改良植物对干旱和盐分的抗性相关(Hema R.等人,2014)。
[0334] 3)HRD-来自拟南芥的HARDY基因,在多种使用的启动子和HSP终止子的控制下克隆(见图1A-D的载体图),用作阳性对照,因为其表现出与改良植物对干旱和盐分的抗性相关(Karaba A等人,2007)
[0335] 将在筛选实验中被鉴定为表达独特基因的植物(包括所有对照)播种在38x28 cm的托盘中,每个托盘中有16个塑料插入物(例如,Desch Plantpak,Netherland),并如上所述用补充有肥料和草丁膦的土壤填充。在每个插入物中播种数粒种子,并且在10天后保留一株草丁膦抗性植物用于进一步的实验。每个实验包含代表了表达的独特基因的每种植物的20-40个重复,随机分布在温室桌上。土壤的灌溉与筛选试验类似。在种子播种时进行灌溉,只是当土壤完全干燥且重量达到低于灌溉前的土壤初始重量(水含量的5%-10%)时,再次灌溉植物以检查其恢复性能。
[0336] 现在参考图6,其显示了筛选在上述条件下生长的对干旱具有抗性的转基因植物的照片结果。该图显示了携带干旱抗性基因10、20和30的转基因植物在严峻的干旱条件下存活,而其它没有干旱抗性赋予基因的转基因植物不能在胁迫条件下生存。值得注意的是,在该图所示的小区域(约15x25厘米)内,筛选了约300株植物,其中3株在干旱条件下存活。
[0337] 当干旱条件开始发展时,将进行如表3所示的多种测量:
[0338] 1)膨压观察,用1-10的量表测量,其中1为高膨压,而10为完全失去膨压(见图7)。
[0339] 2)植物和盆的重量,以克为单位。
[0340] 3)植物死亡观察,10=死亡,1=存活(见图8)。
[0341] 4)植物状态观察,1-10的量表,其中1为良好状态,而10为差。
[0342] 表3:干旱实验中的测量
[0343]
[0344] 现在参考图7,其显示了在停止灌溉后的数天中表达用作对照的基因的植物相对于土壤含水量的膨压损失(深灰色)。该图显示了表达不同基因(指示的)的拟南芥属植物的曲线,作为对干旱条件下生长的响应。深色线表示土壤水含量从停止水灌溉后第15天的40%到停止水灌溉后第22天的接近0%。阴性对照GFP植物膨压损失响应类似于表达HRD的植物膨压,而表达mtlD的植物膨压似乎很少受干旱的影响,直到停止水灌溉后20天。
[0345] 在该图中证明,表达阳性对照基因mtlD和HRD的植物通过表现出显著降低的膨压损失效应而表现出提高的干旱抗性,而表达阴性对照GFP基因的转基因植物在暴露于相同的水含量损失时表现出提高的膨压损失效应。
[0346] 现在参考图8,其显示与表达GFP的植物相比表达阳性对照的转基因植物的归一化死亡规模。可以看出,与表达阴性对照的GFP植物相比,表达干旱抗性阳性对照基因HRD和mtlD的植物显示出明显降低的死亡率。
[0347] 现在参考图9,其图示了通过本发明的方法鉴定的多种干旱抗性基因的结果。
[0348] 该图显示了在严重干旱条件下多种鉴定的基因的膨压(Tu)和死亡率(Dr)的平均结果(参见表4)。死亡和膨压损失的量表为1-10,其中10分别被认为干燥-褐色和死亡植物,或者膨压完全丧失。图中的结果表示播种后的第23天(1)、第28天(6)和第30天(8)。每个不同表达基因的每一个柱代表5个重复的平均值,每个重复具有4株植物。表达GFP的植物用作阴性对照,而表达HRD的用作阳性对照。可以看出,与表达阴性对照GFP基因的植物相比,通过本发明方法鉴定的所有测试基因均显示出显著降低的膨压损失(播种约23天后至少2倍)和降低了死亡率(播种30天后为9至2倍)。而且,与表达阳性对照HRD的植物相比,表达新发现的基因的植物(参见表4)显示出显著降低的死亡率。这些结果表明通过本发明的方法,鉴定了新的干旱抗性基因,其赋予植物改良的干旱耐受性。
[0349] 用于评估植物在干旱条件下的性能的另一种方法是在干旱条件变得突出时,在生长阶段测量其叶面积。在播种植物后约10-14天,每2-3天拍摄植物图像,总共50mm2白色表面。对从干旱实验拍摄的照片进行图像分析,并计算叶面积。将表达在重克隆后鉴定为赋予干旱抗性的基因的多个植物品系的叶面积与阳性和阴性对照进行比较(见表5和图10)。
[0350] 图10的图显示了转化植物品系的叶面积的图像分析。具有SEQ ID NO:16的经鉴定基因的两个独立的转化事件(图10A)和具有SEQ ID NO:25的经鉴定基因的两个独立的转化事件(图10B)以黑线示出在图10A和10B各自的顶部。将这些转基因植物与在图10A和10B各自的底部以浅灰色线表示的表达GFP的阴性对照植物和表达mtlD的阳性对照植物进行比较。干旱条件下改良的性能显示为在指示的测量时间点(TP)处相对于对照植物的百分比(图中箭头和百分比)。
[0351] 从该图中可以看出,相对于表达阴性对照基因的植物,表达新鉴定的测试基因的植物的总叶面积增加了约10%至约82%(例如约45%)。
[0352] 总而言之,本发明提供了新鉴定的基因,其被证明在植物中赋予对干旱条件的耐受性。
[0353] C.将所选基因重克隆并重转化到植物中
[0354] 将来自B部分的选择的基因重克隆到如上所述的双元载体(即图1A-D),并进行测序以确认其具有与来自T1和T2实验的原始基因相同的序列。用重克隆的基因转化植物,并收集种子。如B中一样重复实验,只是测试每个基因的3-5个具有不同无关转化事件的个体转基因植物。在实验中,每个单独的转基因植物/事件都要进行5-10次重复,因此,对于每个事件,每个基因测试20-40株植物,并且对于每个不同的基因,测试60-200株植物。
[0355] 实例3
[0356] 鉴定为在植物中改良干旱和/或盐分抗性的多核苷酸序列
[0357] 筛选T1转基因种子的上述方法揭示了约1000个转基因作为候选多核苷酸序列,用于改良植物的干旱抗性。在这些候选物中,对T2种子的筛选揭示了约140个性能最佳的转基因,其可能改善植物中的干旱抗性或耐受性。对这些转基因序列进行进一步的验证测试。
[0358] 现在参考表4,其给出了通过本发明的方法发现的新和独特的多核苷酸序列和由这些序列编码的多肽的实例。这些序列是从环境挑战生态位中纯化的宏转录组,[0359] SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:148代表通过本发明的方法发现作为改善植物干旱抗性的候选物的多核苷酸序列(表4)。
[0360] SEQ ID NO:149至SEQ ID NO:321代表由通过本发明的方法发现作为改善植物干旱抗性的候选物的相应多核苷酸序列编码的多肽序列(参见表4)。
[0361] 应注意,以下DNA序列根据不同的起始密码子编码多于一个开放阅读框(ORF)(称为SEQ ID NO X.1p和X.2p等):SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:
120、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141。
[0362] 表4:多核苷酸和多肽序列的SEQ ID No
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368] 现在参考表5,其示出了多种鉴定的基因在干旱耐受性实验中的表型结果。使植物在受控温室中的土壤中生长,并在上述条件下测试其干旱耐受性。在其生长过程中,进行测量和拍摄图像(参见表3),并进行图像分析,将图像转换为每株植物的叶面积。结果显示为在干旱阶段用作阴性对照的表达GFP植物测量值的百分比。
[0369] 表5:用T2拟南芥植物进行的干旱实验的结果
[0370]
[0371]
[0372] DR-干旱下的性能(叶面积),以表达GFP的植物的百分比表示
[0373] SD-显示的值±标准偏差
[0374] 如表5所示,与表达阴性对照基因(GFP)的植物相比,在干旱条件下,所有表达通过本发明方法鉴定的测试基因的植物显示叶面积增加了约15%至约90%。这些结果证明,本发明的方法提供赋予植物改良的干旱耐受性的新基因。
[0375] 现在参考表6,其示出了用相关Seq.ID重克隆的T2拟南芥植物进行的干旱实验的结果。将不同Seq.ID重克隆并再转化到拟南芥植物中,产生多个独立的事件(表6中的E1-3表示)。使植物在受控温室中的土壤中生长,并在上述条件下测试其干旱耐受性。在它们的生长期间,拍摄图像并进行图像分析,将图像转换为每株植物的叶面积。结果示于表6中,作为在干旱阶段用作阴性对照的GFP表达植物的百分比。
[0376] 表6:用相关Seq.ID重克隆的T2拟南芥植物进行的干旱实验的结果。
[0377]
[0378]
[0379] DR-干旱下的表现(叶面积),以表达GFP的植物的百分比表示
[0380] RC E1-3-具有重克隆相关Seq.ID事件1-3的表现。
[0381] SD-显示的值±标准偏差
[0382] 如表6所示,在经受干旱条件的拟南芥植物中,与表达阴性对照基因的植物相比,表达通过本发明的方法鉴定的重新克隆的基因的植物呈现出增加的叶面积。
[0383] 现在参考表7,其显示了用T2烟草植物进行的干旱实验的结果。将通过本发明方法鉴定的不同基因重克隆并转化到烟草植物中,产生多个独立的事件(表7中的E1-3表示)。使植物在受控温室中的土壤中生长,并在上述条件下测试其干旱耐受性。在试验结束时,评估植物地上部分(shoots)鲜重、叶数、主枝长度和主枝重量。结果示于表7中,以作为阴性对照的野生型(WT)植物的百分比表示。
[0384] 表7:用T2烟草植物进行的干旱实验的结果
[0385]
[0386] FW-鲜重,以克为单位
[0387] LN-叶数
[0388] BFW-枝鲜重,以克为单位
[0389] BL-主枝长度,以cm为单位
[0390] SD-显示的值+/-标准偏差,为所测性状的百分比
[0391] E1-3-不同的独立事件
[0392] 表7中显示的结果表明,与阴性对照植物相比,通过本发明鉴定的大多数基因赋予烟草植物对干旱条件的改善的耐受性,如通过测试的参数(例如鲜重、叶数、枝鲜重、枝长度)所示。
[0393] 现在参考表8,其示出了与对照WT植物相比转基因烟草植物的盐分实验的结果。使表达通过本发明的方法鉴定的各种基因的不同烟草品系(参见表4)在土壤中发芽。发芽后7天;用含有400mM NaCl的肥料水灌溉植物。用盐灌溉后14天拍摄叶片图像,并分析不同独立事件的叶片面积。结果示于表8中,以相对于WT植物的叶面积差异百分比表示。
[0394] 表8:烟草植物中盐分实验的结果
[0395]
[0396] HST-高盐分耐受性,显示为与WT相比叶面积的差异%
[0397] SD-4个独立事件的显示的值+/-标准偏差
[0398] 表8的结果清楚地表明,与WT对照植物相比,表达通过本发明鉴定的新盐分耐受性基因的植物显示出显著更高的叶面积。
[0399] 现在参考表9,其示出了在表达具有指示的Seq.ID的新基因的拟南芥植物上进行的盐分实验。每盆每个事件十株植物在受控温室的土壤中生长。发芽后,将所有装有植物的盆通过浸入100mM NaCl中进行灌溉。表9的结果代表每个Seq.ID和野生型植物(WT)的4个不同事件的平均数据。
[0400] 表9:在表达新的鉴定基因的拟南芥植物上进行的盐分实验的结果
[0401]
[0402]
[0403] FP-花和荚产量
[0404] 1-没有花
[0405] 2-很少花形成,短花梗
[0406] 3-一些花形成,几乎没有荚
[0407] 4-花和荚形成缺绿症-绿化和叶片损害
[0408] 1-完全干燥的叶
[0409] 2-干燥叶边缘
[0410] 3-黄色
[0411] 4-有些黄
[0412] 5-绿色
[0413] ±SD标准偏差
[0414] 如表9所示,与经受相同盐分胁迫条件的WT对照植物相比,表达通过本发明的方法鉴定为赋予盐分耐受性的基因的植物显示出显著更高的花和荚产量,并且显著降低了缺绿症和对叶片的损害作用。
[0415] 总而言之,上述实验结果清楚地表明,通过本发明的独特方法,可以鉴定出植物中非常有价值的胁迫耐受性(例如干旱、盐分)基因。新鉴定的基因赋予植物在各种重要参数如叶面积、膨压、气产量和品质、花和果实产量等方面提高的对预先选定胁迫的耐受性或抗性。这些结果表明本发明提供了鉴定胁迫耐受性植物基因的新的筛选方法,所述基因可以在期望和重要作物中表达,以使其在多种非生物和生物胁迫条件下生长并提高产量。
[0416] 参考文献:
[0417] Gabor,E.M.,Alkema,W.B.&Janssen,D.B.(2004)Quantifying  the accessibility  of  the  metagenome  by  random expression  cloning 
techniques.Environ Microbiol 6,879-886.
[0418] Culligan,E.P.,Sleator,R.D.,Marchesi,J.R.&Hill,C.(2014)Metagenomics and  novel  gene  discovery:promise  and  potential  for  novel therapeutics.Virulence 5,399-412
[0419] Venter,J.C.et al.Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea.Science 304,66-74.
[0420] Farooq,M.,Wahid,A.,Kobayashi,N.,Fujita,D.&Basra,S.M.A.(2009)Plant drought stress:effects,mechanisms and management.Agron.Sustain.Dev.29,185–212.
[0421] Taiz L.&Zeiger E.(2006)Plant Physiology,4th Ed.,Sinauer Associates Inc.Publishers,Massachusetts.
[0422] Nonami H.(1998)Plant water relations and control of cell elongation at low water potentials,J.Plant Res.111,373-382.
[0423] Parida,A.K.&Das,A.B.(2005)Salt tolerance and salinity effects on plants:A review.Ecotoxicology and Environmental Safety,60(3),324-349.[0424] Carillo P,Annunziata MG,Pontecorvo G,Fuggi A,&Woodrow P.2011.Salinity stress and  salt tolerance,abiotic stress in plants–mechanisms and adaptations.In:Arun Shanker,editor Tech,DOI:10.5772/22331.
[0425] Yang T-T,Cheng L&Kain SR(1996)Optimized codon usage and chromophore mutations  provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein.Nucleic Acids Res24:4592–4593Hema R,Vemanna RS,Sreeramulu S,Reddy CP,Senthil-Kumar M,&Udayakumar M(2014)Stable Expression of mtlD Gene Imparts Multiple Stress Tolerance in Finger Millet.PLoS ONE 9(6):e99110.
[0426] Karaba A,Dixit S,Greco R,Aharoni A,Trijatmiko KR,Marsch-Martinez N,Krishnan A,Nataraja KN,Udayakumar M,&Pereira A (2007)Improvement of water use efficiency in rice by expression of HARDY,an Arabidopsis drought and salt tolerance gene.Proc Natl Acad Sci USA104:5270–15275.
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈