技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，尤其涉及一种花粉管尖端超薄切片的方法。
背景技术
[0002] 自十七世纪，Robert Hooke利用
显微镜观察
植物木栓细胞以来，数百年的时间，显微镜已经成为研究细胞的细节和现象的强有
力的工具。过去常用作记录从细胞简单的行为如
细胞质流到复杂的细胞活动，如在细胞周期中细胞骨架动态作用。
[0003] 然而近十年来，研究人员逐渐远离使用显微镜来研究细胞过程，取而代之的是分子生物学方法，用该方法研究细胞生物学，基因功能和结构。已经花费了大量的精力用于研究模式植物及具有重要经济价值的基因组。我们希望让研究人员重新回到细胞
水平上，研究这些基因产物的功能。这样就需要非常精细的细节，然而
光学显微镜只能提供有限的
分辨率，因此20世纪
电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥秘。在20世纪60年代以来，TEM广泛用于工农业生产、材料学、考古学、生物学、
组织学、病毒学、病理学和分子生物学等研究领域中。
[0004] 细胞极性和非对称生长是细胞生长中特殊形式，是真核细胞关键发育过程，如
酵母，胚，神经细胞，花粉管，根毛细胞，
真菌菌丝及藻类的假根。花粉管是生长速度最快的细胞之一，提供一个非常好的单细胞生长模型，用于研究调节，极性和周期性生长的机理。在观察所有的植物中，花粉管生长都集中在尖端,生长过程中的花粉管尖端含有大量的转运囊泡，细胞内胞吞和胞吐都高度活跃，以满足旺盛快速的细胞膜扩张和细胞壁合成的需要。采用透射电镜观察花粉尖端的超微结构，但是利用透射电镜观察花粉尖端有一个最大难点就是花粉管比较小，在体外培养时，花粉管生长方向极其混乱，在超薄切片时，极难保证切到花粉管尖端。到目前为止，国内外还没有一种方法在超薄切片时可以高效率地获得花粉管尖端切片。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种花粉管尖端超薄切片的方法，其操作简单，可有效的得到花粉管尖端切片，具有可靠的
稳定性。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种花粉管尖端超薄切片的方法，包括以下步骤：
[0007] A、花粉培养：将花粉加入液体培养基中，每毫升液体培养基中含有花粉1×105个，并在黑暗条件下进行培养，得到萌发的花粉管；
[0008] B、花粉管固定、洗涤：将步骤A中得到的萌发的花粉管用浓度为0.025g/ml的戊二
醛浸泡进行固定4h，然后用
磷酸缓冲液洗涤后，再加入浓度为0.01g/ml的锇酸在4℃条件下浸泡12h，最后用磷酸缓冲液洗涤后，得到花粉管样品；
[0009] C、花粉管样品切割：将步骤B中得到的花粉管样品平铺于激光显微切割机专用膜片上，然后把载有花粉管样品的激光显微切割专用膜片置于显微镜下，通过电脑操控系统，对花粉管样品的尖端部位进行切割，并将切割得到的花粉管尖端与专用膜片加入离心管中；激光显微切割机专用膜片，型号是Leica,No.11505188,0.9μm,POL-Membrane，该膜是Leica公司生产专用于激光共聚焦扫描显微镜(LEICA TCS SP5)的切割，该电脑
操作系统的
软件名为Leica Laser Miicrodissection，点击工具栏中的“Select”，再点击“Draw”，
选定花粉管尖端部位进行切割；
[0010] D、花粉管尖端的离心、
凝固：在步骤C中的离心管中加入浓度为0.01g/ml的低熔点琼脂糖，再将离心管加入高速离心机中进行离心分散后，离心管底部为花粉管尖端，最后琼脂糖凝固，得到琼脂糖凝固花粉管尖端样品，低熔点琼脂糖，低溶点是指在
温度40度时，琼脂糖能溶化；
[0011] E、琼脂凝固花粉管尖端样品
块的洗涤：在步骤D中得到的琼脂糖凝固花粉管尖端样品进行切割，得到长宽高为2mm×1mm×1mm的琼脂糖凝固花粉管尖端样品块，再依次加入体积浓度为30％、50％、70％、80％、90％的丙
酮中进行脱水，每次10min，再加入100％的丙酮中脱水2次，每次30min，得到脱水后的花粉管尖端样品；
[0012] F、
包埋剂配置：将Spon 812环
氧树脂：DDSA：NMA：DMP-30按
质量比5:2:3:0.22进行混合，得到包埋剂；Spon 812
环氧树脂是一种树脂，它是一种长链的脂肪族环氧化合物，环氧树脂是一类具有末端环氧基的甘油多聚酯，它的分子中有两种反应基团，即环氧基团(epoxide group)和氢氧基团(hydroxyl group)；DDSA是十二烷基
琥珀酸酐(Dodecenylsuccinic anhydride)的简称，它是一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子；MNA是甲基内次甲基二
甲酸酐(Methyl Nadic anhydride)的简称，又称六甲酸酐，它有两个
链环，能获得较硬的包埋块；DMP-30是2，4，6-三(二甲基
氨基甲基)
苯酚(2，4，6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)的简称，它能
加速固化过程；
[0013] G、浸泡液配置：将体积浓度为100％的丙酮与步骤F中得到的包埋剂依次按照体积比为2:1、1:1、1:2进行混合分别得到第一浸泡液、第二浸泡液与第三浸泡液。
[0014] H、浸透：将步骤E中得到的花粉管尖端样品依次加入步骤G中得到的第一浸泡液、第二浸泡液与第三浸泡液中，浸泡液要淹没花粉管尖端样品，分别在4℃温度条件下浸泡2h，最后移除浸泡液再加入Spon 812环氧树脂浸泡2h，得到浸透后的花粉管尖端样品；
[0015] I、包埋、聚合：在37℃条件下，将Spon 812环氧树脂分别加入包埋模具的穴孔中，加入的量正好填满穴孔，再将步骤H中浸透后的花粉管尖端样品分别加入穴孔中，并依次在37℃聚合12h，45℃聚合12h，60℃聚合48h，70℃聚合过夜，得到花粉管尖端树脂
聚合物；
[0016] J、切片处理：利用锉刀或
铁沙皮对步骤I中得到的花粉管尖端树脂聚合物进行打磨，其树脂较厚的一端先用刀片进行
切除，再进行打磨，使花粉管尖端暴露出聚合物，使待切部位呈方形或长方形，最后用刀片将花粉管尖端树脂聚合物的磨面切平，再通过切片机切割，得到切片厚度为50-70nm的薄切片。
[0017] 作为本发明进一步优选，在步骤A中，所述液体培养基的配置方法：以双蒸馏水为
溶剂，依次加入0.5mmol/LCa(NO3)2,1.6mmol/LH3BO3,1.6mmol/LMgSO4,1mmol/LKNO3,440mmol/L
蔗糖混合均匀即可,其pH值控制在6.0-6.2。
[0018] 作为本发明进一步优选，在步骤A中，所述培养温度为25℃，培养时间为3h。
[0019] 作为本发明进一步优选，在步骤B中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/L。
[0020] 作为本发明进一步优选，在步骤D中，所述高速离心机的转速控制在12000r/min，
温度控制在40℃，离心时间控制在20min。
[0021] 本发明的有益效果是：本发明方法其操作简单，可有效的得到花粉管尖端切片，其操作效率高，得到的花粉管尖端切片经过
染色观察呈三
角形排列，可见明显的线粒体，可表明切割得到的切片为正在生长的花粉管尖端，具有可靠的稳定性。
附图说明
[0022] 图1为通过本发明方法切割得到的花粉管尖端切片染色后透射电镜图。
[0023] 附图中，各标号所代表的部件列表如下：
[0024] 1、囊泡，2、线粒体。
具体实施方式
[0025] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0027] A、花粉培养：将花粉加入液体培养基中，每毫升液体培养基中含有花粉1×105个，并在黑暗条件下进行培养，培养温度为25℃，培养时间为3h，得到萌发的花粉管；所述液体培养基的配置方法：以双蒸馏水为溶剂，依次加入0.5mmol/LCa(NO3)2,1.6mmol/LH3BO3,1.6mmol/LMgSO4,1mmol/LKNO3,440mmol/L蔗糖混合均匀即可,其pH值控制在6.0-6.2；
[0028] B、花粉管固定、洗涤：将步骤A中得到的萌发的花粉管用浓度为0.025g/ml的戊二醛浸泡进行固定4h，然后用0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤后，再加入浓度为0.01g/ml的锇酸在4℃条件下浸泡12h，最后用0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤后，得到花粉管样品；
[0029] C、花粉管样品切割：将步骤B中得到的花粉管样品平铺于激光显微切割机专用膜片上，然后把载有花粉管样品的激光显微切割专用膜片置于显微镜下，通过电脑操控系统，对花粉管样品的尖端部位进行切割，并将切割得到的花粉管尖端与专用膜片加入离心管中；激光显微切割机专用膜片，型号是Leica,No.11505188,0.9μm,POL-Membrane，该膜是Leica公司生产专用于激光共聚焦扫描显微镜(LEICA TCS SP5)的切割，该电脑操作系统的软件名为Leica Laser Miicrodissection，点击工具栏中的“Select”，再点击“Draw”，选定花粉管尖端部位进行切割；
[0030] D、花粉管尖端的离心、凝固：在步骤C中的离心管中加入浓度为0.01g/ml的低熔点琼脂糖，再将离心管加入高速离心机中进行离心分散后，离心管底部为花粉管尖端，最后琼脂糖凝固，得到琼脂糖凝固花粉管尖端样品；高速离心机的转速控制在12000r/min，温度控制在40℃，离心时间控制在20min；
[0031] E、琼脂糖凝固花粉管尖端样品块的洗涤：在步骤D中得到的琼脂糖凝固花粉管尖端样品进行切割，得到长宽高为2mm×1mm×1mm的琼脂糖凝固花粉管尖端样品块，再依次加入体积浓度为30％、50％、70％、80％、90％的丙酮中进行脱水，每次10min，再加入100％的丙酮中脱水2次，每次30min，得到脱水后的花粉管尖端样品；
[0032] F、包埋剂配置：将Spon 812环氧树脂：DDSA：NMA：DMP-30按质量比5:2:3:0.22进行混合，得到包埋剂；Spon 812环氧树脂是一种树脂，它是一种长链的脂肪族环氧化合物，环氧树脂是一类具有末端环氧基的甘油多聚酯，它的分子中有两种反应基团，即环氧基团(epoxide group)和氢氧基团(hydroxyl group)；DDSA是十二烷基琥珀酸酐(Dodecenylsuccinic anhydride)的简称，它是一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子；MNA是甲基内次甲基二甲酸酐(Methyl Nadic anhydride)的简称，又称六甲酸酐，它有两个链环，能获得较硬的包埋块；DMP-30是2，4，6-三(二甲基氨基甲基)苯酚(2，4，6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)的简称，它能加速固化过程；
[0033] G、浸泡液配置：将体积浓度为100％的丙酮与步骤F中得到的包埋剂依次按照体积比为2:1、1:1、1:2进行混合分别得到第一浸泡液、第二浸泡液与第三浸泡液。
[0034] H、浸透：将步骤E中得到的花粉管尖端样品依次加入步骤G中得到的第一浸泡液、第二浸泡液与第三浸泡液中，浸泡液要淹没花粉管尖端样品，分别在4℃温度条件下浸泡2h，最后移除浸泡液再加入Spon 812环氧树脂浸泡2h，得到浸透后的花粉管尖端样品；
[0035] I、包埋、聚合：在37℃条件下，将Spon 812环氧树脂分别加入包埋模具的穴孔中，再将步骤H中浸透后的花粉管尖端样品分别加入穴孔中，加入的量正好填满穴孔，并依次在37℃聚合12h，45℃聚合12h，60℃聚合48h，70℃聚合过夜，得到花粉管尖端树脂聚合物；
[0036] J、切片处理：利用锉刀或铁沙皮对步骤I中得到的花粉管尖端树脂聚合物进行打磨，其树脂较厚的一端先用刀片进行切除，再进行打磨，使花粉管尖端暴露出聚合物，使待切部位呈方形或长方形，最后用刀片将花粉管尖端树脂聚合物的磨面切平，再通过切片机切割，得到切片厚度为50-70nm的薄切片。
[0037] 染色及透射电镜观察
[0039] 将100μL
醋酸双氧铀50％
乙醇饱和溶(V/V％：体积mL/体积mL)滴于蜡盘中，将实施例中步骤J中得到的薄切片放置于
铜网上，将铜网(有切片面)朝下漂浮在染液液滴上，避光染色15-30分钟。用
镊子夹持铜网依次在3个盛有双蒸水的小烧杯中作上下运动以进行清洗。每回清洗3次，再用
滤纸尖吸去水分。
[0040] (2)铅染
[0041] 另一蜡盘中加入
硝酸铅Pb(NO3)2l.33g，
柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O 1.76g，双蒸水30ml，上述成分充分混匀后再加入1当量的氢氧化钠水溶液8ml,使溶液透明，然后再用双蒸水加至50m1得到染液，将铀染后的铜网切片面朝下漂浮在另一蜡盘染液液滴上，避光，染色
10-20min，在另外3杯双蒸水中清洗后吸干备用。
[0042] (3)透射电镜观察
[0043] 把上述染色处理得到的切片样品拿至透射电子显微镜下进行观察，在清晰的
视野下对样品采集照片。
[0044] 结果
[0045] 根据附图1所示：其白色的斑点，即为囊泡1，主要集中在花粉管尖端部位，而且主要位于两条白线之内，呈三角形排列，这是正在生长的花粉管尖端囊泡1典型的排列方式。图中在亚尖端
位置即花粉管尖端靠后的位置上，有很多线粒体2。这些特征都是正在生长的花粉管尖端的特征。因此这种方法可有效的切到花粉管尖端。
[0046] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
