重组载体及其构建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制备方法和应用
阅读：543发布：2023-02-05
专利汇可以提供重组载体及其构建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种重组载体及其构建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制备方法和应用，重组载体包括pGEX‑3x表达载体和降解甲氰菊酯酯酶基因est3385；降解甲氰菊酯酯酶基因est3385为SEQ ID NO.1所示的序列；降解甲氰菊酯酯酶基因est3385位于pGEX‑3x表达载体的Bam H I和EcoRⅠ两限制性内切酶位点之间，其构建方法包括：抽提基因组DNA、设计引物、PCR扩增、酶切、连接等步骤。本发明还包括含有上述重组载体得到工程菌，由上述重组载体经热激转化至感受态细胞得到。该工程菌产量高，工艺简单，对环境友好，满足工业化生产的要求，可应用于降解甲氰菊酯。，下面是重组载体及其构建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌在降解甲氰菊酯中的应用，
降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌由包括pGEX-3x表达载体和降解甲氰菊酯酯酶基因est3385的重组载体热激转化至大肠杆菌感受态细胞中得到；
所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385的DNA序列为SEQ ID NO.1所示的序列；所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385位于所述pGEX-3x表达载体的Bam H I和EcoR Ⅰ两限制性内切酶位点之间；
所述应用的方法为：将所述降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌在培养基中培养至OD600为0.6～0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷继续培养得到菌液；将所述菌液与磷酸缓冲液、甲氰菊酯溶液混合、孵育，完成对甲氰菊酯的降解；
所述培养基为LB培养基；所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.5mM/L；加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷继续培养的时间为6～12h；所述孵育的温度为15～65℃；所述孵育的pH为5.0～9.0。
重组载体及其构建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌
及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组载体及其构建方法、降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及制备方法和应用。
背景技术
[0002] 甲氰菊酯是菊酯类农药品种之一，在我国广泛用于控制谷物、马铃薯、烟草、棉花和水果等主要农作物的害虫。自上世纪八十年代商业化生产以后，因其具有高效、低剂量、以及对哺乳动物低毒等优点，菊酯类农药成为一些剧毒农药（有机氯类和有机磷类农药）理想的替代品；甲氰菊酯等菊酯类农药的使用量需求不断增长。然而随着大量甲氰菊酯等菊酯类农药投入到农业生产中，农业生态系统中菊酯类农药的残留不断累积，其对非靶标及生态环境安全的影响，逐步显现。研究表明，甲氰菊酯等菊酯类农药对大量非靶标生物如天敌瓢虫有剧毒（Michaud JP. Relative toxicity of six insecticides to Cycloneda sanguinea and Harmonia axyridis.），此外，菊酯类农药对水生生态系统中几乎所有的非靶标（节肢动物、脊椎动物）均有剧毒（Solomon KR, Giddings JM, Maund SJ. Probabilistic risk assessment of cotton pyrethroids: I. Distributional analyses of laboratory aquatic toxicity data.）。更为严重的是，一些拟菊酯农药品种具有引发神经毒性、生殖毒性、细胞毒性等慢性毒性，其中少量菊酯类农药品种具有致畸性和致癌性，因此，美国环保署（EPA）将一些菊酯类农药品种列为可能的致癌物质。目前，为保障我国农业稳产增产，菊酯类农药依然将会在一段时期内大量使用，因此，残留于农田生态系统中的菊酯类农药，已经成为生态环境乃至人类自身安全的潜在威胁，因此，迫切需要研发有效的方法清除农田生态系统中甲氰菊酯等菊酯类农药残留。
[0003] 甲氰菊酯等菊酯类农药可以通过生物和非生物的方法降解，目前，生物降解被认为是一种安全、高效和廉价的消除甲氰菊酯等菊酯类农药残留的方法。在生物降解中，微生物降解是重要的组成部分，许多性能优异的降解菌资源及其相应的降解基因和降解酶被分离和克隆鉴定（Yang CR, Jian JZ (2010) Recent advance in biodegradation in China: New microorganism and pathway, biodegradation engineering, and bioenergy from pollutant biodegradation.），但是，在实际应用过程中，受自然环境条件的影响，其清除菊酯类农药残留的效果，确远远低于实验室；此外，降解菌资源和降解酶的大规模工业化生产，依然是制约微生物及相关酶制剂应用于菊酯类农药残留治理和修复的关键技术瓶颈之一。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种重组载体及其构建方法，还提供了一种降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌及工程菌的制备方法，该工程菌可大量生产甲氰菊酯降解酯酶est3385，不仅产量高，而且工艺简单，对环境友好，满足工业化生产的要求，可应用于降解甲氰菊酯。
[0006] 为解决上述技术问题，提供了一种重组载体，所述重组载体包括pGEX-3x表达载体和降解甲氰菊酯酯酶基因est3385；所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385的DNA序列为SEQ ID NO.1所示的序列；所述降解甲氰菊酯酯酶基因est3385位于所述pGEX-3x表达载体的Bam H I和EcoRⅠ两限制性内切酶位点之间。
[0007] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
[0008] S1、抽提沼泽红假单胞菌的基因组DNA；
[0009] S2、根据所述步骤S1的基因组DNA设计扩增引物；
[0010] S3、以所述S1的基因组DNA为模板，以步骤S2的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物；
[0011] S4、酶切所述扩增产物和原始载体得到酶切后的扩增产物和酶切后的原始载体；
[0012] S5、将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的原始载体上得到重组载体。
[0013] 上述的构建方法，优选的，所述步骤S2中所述扩增引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的序列；所述下游引物的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的序列。
[0014] 上述的构建方法，优选的，所述步骤S3中所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，61℃复性30 s，72℃延伸60 s，35个循环，最后延伸10 min。
[0015] 上述的构建方法，优选的，所述步骤S4中，采用限制性内切酶Bam H I和EcoRⅠ双酶切所述扩增产物和原始载体。
[0016] 上述的构建方法，优选的，所述步骤S5具体为：将所述酶切后的扩增产物用T4 DNA连接酶连接到所述酶切后的原始载体上得到重组载体。
[0017] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌，所述降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌含有上述的重组载体。
[0018] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌的制备方法，包括以下步骤：将重组载体热激转化至感受态细胞中得到降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌。优选的，所述热激转化的温度为42 ℃，热激转化时间为50 S。
[0019] 上述的制备方法，优选的，所述感受态细胞为E. coli感受态细胞BL21。
[0020] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌或上述制备方法制备得到的工程菌在降解甲氰菊酯中的应用。
[0021] 上述的应用，优选的，所述应用方法为：将所述工程菌在培养基中培养至OD600为0.6～0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷继续培养得到菌液；将所述菌液与磷酸缓冲液、甲氰菊酯溶液混合、孵育，完成对甲氰菊酯的降解。
[0022] 上述的应用，优选的，所述培养基为LB培养基。
[0023] 上述的应用，优选的，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.5 mM。
[0024] 上述的应用，优选的，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷继续培养的时间为6～12 h。
[0025] 上述的应用，优选的，所述孵育的温度为15～65℃。
[0026] 上述的应用，优选的，所述孵育的pH为5.0～9.0。
[0027] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0028] （1）本发明提供了一种降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌，将沼泽红假单胞菌酯水解酶的全长序列与表达载体连接，转化大肠杆菌，获得含有降解甲氰菊酯酯酶基因est3385的工程菌；利用大肠杆菌工程菌大量生产降解甲氰菊酯酯酶est3385，为工业化生产提供一种高产的工程菌。
[0029] （2）本发明提供了一种降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌的应用，利用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导条件，降解酯酶est3385的产量达到最大值，可生产浓度大于1.3 g/L的降解甲氰菊酯酯酶est3385。
[0031] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0032] 图1为重组质粒pGEX-3X-3385的构建过程。
[0033] 图2为重组蛋白诱导表达条件优化图。
[0034] 图3为纯化蛋白Western blotting。
[0035] 图4为不同孵育温度对酶液的处理效果影响结果。
[0036] 图5为不同pH对酶液的处理效果的影响结果。
[0037] 图6为降解酯酶的底物特异性分析结果结果。
[0038] 图7为金属离子和化学药物对酶活的影响结果。
具体实施方式
[0040] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0041] 实施例1：
[0042] 一种本发明的降解甲氰菊酯酯酶est3385的工程菌，其构建方法包括以下步骤：
[0043] 1、沼泽红假单胞菌基因组DNA的抽提：将液体培养的沼泽红假单胞菌经离心收集后采用CTAB法进行DNA抽提，琼脂糖检测DNA的浓度与完整性。具体操作如下：
[0044] 1.1、将沼泽红假单胞菌PSB-S菌株按照接种量为0.5 %（v/v）接种至液体培养基中（培养基充满培养瓶后密封），在30 ℃，光照强度为2000 Lx的光照条件下培养7 d。该液体培养基成分为：0.2 g/L K2HPO4，0.8 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4，0.1 g/L CaSO4·2H2O，0.0033 g/L NaMoO4·2H2O，0.005 g/L FeSO4·7H2O，1.5 g/L 酵母提取物；pH 7.2。
[0045] 1.2、将2 mL对数生长期的沼泽红假单胞菌菌液在10000 rpm转速下离心2 min收集菌体。
[0046] 1.3、将步骤（2）中收集得到的菌体用500 μL TE缓冲液溶解后，加30 μL、浓度为10 %（w/v）的 SDS，3 mL 蛋白酶K，混匀；于37 ℃下培养1 h得到培养液。
[0047] 1.4、在步骤（3）的培养液中加入100 μL浓度为5 M 的NaCl，混匀后加入80 μL的10 %的CTAB/NaCl溶液（CTAB/NaCl溶液中NaCl 的浓度为0.7 M，CTAB的浓度为10 g/L），混匀得到混合液。
[0048] 1.5、在步骤（4）的混合溶液中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液（酚/氯仿/异戊醇混合液中酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1），混匀，于12000 rpm下离心5 min，取离心后的上清液。
[0049] 1.6、在步骤（5）的上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇（氯仿/异戊醇中氯仿和异戊醇的体积比为24∶1），混匀，于12000 rpm下离心5 min，取离心后的上清液。
[0050] 1.7、在步骤（6）的上清液中加入3/5体积的异丙醇（异丙醇还可替换为无水乙醇，无水乙醇的体积为300～400 μL）沉淀DNA，沉淀完成后于10000 rpm下离心10 min。
[0051] 1.8、将沉淀用70 %（v/v）乙醇洗涤2次，室温干燥后加TE溶解。
[0052] 1.9、在37 ℃下用RNase消化1小时，即得到基因组DNA。
[0053] 2、降解酯酶基因est3385的克隆
[0054] 2.1、根据序列信息设计沼泽红假单胞菌降解酯酶基因est3385特异PCR扩增引物，引物两端引入酶切位点。引物序列如下：
[0055] F：CGCGGATCCGCATGAAGGACGTGGCG（SEQ ID NO.2）；
[0056] R：CCGGAATTCCGCATCGGCCG GTAGGT（SEQ ID NO.3）。
[0057] 下划线部分为引入的酶切位点。
[0058] 2.2、利用上述引物对沼泽红假单胞菌基因组DNA进行PCR扩增，得到完整的降解酯酶基因est3385的扩增产物。
[0059] 具体的扩增体系为：10×PCR buffer：5 μL； dNTP（10 mM）：1 μL；上游引物/下游引物（10 μM）各1 μL；ddH2O 12 μL；总体积为20 μL。
[0060] 扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，61 ℃复性30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
[0061] 将扩增产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测，显示在750 bp有单一条带，与预期序列大小一致。
[0062] 3、降解酯酶基因est3385原核表达载体的构建，如图1所示，重组质粒的构建按以下步骤进行：
[0063] 3.1、将PCR扩增片段利用限制性内切酶Bam H I和EcoRⅠ双酶切，酶切位点位于est3385基因的首尾，并同时酶切pGEX-3x表达载体。
[0064] 3.2、将酶切后的PCR产物和载体，进行琼脂糖电泳，回收降解甲氰菊酯酯酶est3385基因及酶切载体。酶切得到的降解甲氰菊酯酯酶est3385序列见Genbank登陆号：KU377526（www.ncbi.nlm.nih.gov）。
[0065] est3385基因序列（SEQ ID NO.1）：
[0066] GTGGGCAAGGCCGCGGGCCTTGCGGCAATTCTGGCGGTGACGGGCTGTGC
[0067] GGTTGGAGCGGCGCCTTCGGCTCAGGCGCAGACTGCCCAGGCGGCGCCAT
[0068] CGAGTGCCTTCGCCGCCGTTCAGCCCTCGGGCAGCGGTTCGGTTGACGAC
[0069] GCACAATCGGCGCAGCGCGAACGCAATCTCGCCGGCCGCGCGGTCGATAA
[0070] GATGAAGGACGTGGCGCGGCAGGCGGGCGACATTTTTAGCCGGGTGCCGT
[0071] GTTTGCCGCCCAAGGGCGGGGTTCGTCCGCTCGGCTCGCTGCCCCATGTC
[0072] GCGAGCAAGCTGATCGCCGGCGATCCGGTGGTGATCGTGGCGTTCGGCTC
[0073] GTCTTCCACCCAGGGCCATGGCAGCTCGTCGCCGGCCTTCAATTATCCGA
[0074] ACCGGCTGGCCGCCCAGCTGCGCCGCCAATATCCGACCGCGGAAATCTCG
[0075] GTGATCAATCGCGGCAAGGGCGGCGAGGACGCGCCGGAAATGTTGGCGCG
[0076] GCTGAAAAGTTCAGTGCTCGATCTCAAGCCGGACCTGGTGATCTGGCAGG
[0077] TTGGCACCAATGCGATCTTGCGTGATCTCGATCCGGCCGACACCGCCAAA
[0078] ATGGTCGAAGAGGGCATTTCGGCGATCCAGGCCGCCGGCGCCGATCTGGT
[0079] GCTGGTCGATCCGCAATATGCGCCGCGCGTCAATGAGCGCGCCGAAAACG
[0080] CCGGGCGGATGATGAAGCTGCTCAACAAGGTCGCGGAAATCCGCCATGTC
[0081] GGCCTGTTCCCGCGCTTTGAAGTGATGCGTGATTGGCACGAGCGGCAATC
[0082] GGTGCCGATCGACAATTTCATCACTCCGGACGGGCTGCATATGAACGATT
[0083] GGGGCTATGCCTGCTTCGCCCAGCTGCTTGGCGACGACATCATTCGTTCG
[0084] GTCGGCCAGATCAAGCTCGGCATCCACGTGCCGTCCGACGTGCACACCTA
[0085] CCGGCCGATGTAA。
[0086] 3.3、将回收后的降解甲氰菊酯酯酶est3385基因和酶切载体用T4 DNA连接酶在16 ℃连接过夜得到重组载体。
[0087] 4、制备工程菌：
[0088] 4.1、在42 ℃热激50 S，使重组载体转化至E. coli感受态细胞BL21(DE3)得到转化产物（转化方法参照[美]J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002）。
[0089] 4.2、将步骤4.2得到的转化产物涂布于含100 mg/L的氨苄青霉素的LB平板，37 ℃过夜培养。
[0091] 4.4、将提取后的质粒利用PCR以及Bam H I和EcoRⅠ双酶切鉴定出有正确插入的克隆（即重组子），进一步测序确证，测序获得的序列已经登录NCBI，登录号为KU377526（www.ncbi.nlm.nih.gov）。将这种表达载体命名为pGEX-3x-3385，而含有这种表达载体的工程菌命名为Rosetta-pGEX-3x-3385，即为本发明的生产降解酯酶est3385的工程菌。
[0092] 5、降解酯酶est3385的诱导表达及蛋白的纯化与检测：
[0093] 5.1、含有pGEX-3x-3385重组子的工程菌Rosetta-pGEX-3x-3385在含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37 ℃培养过夜的得到培养液。
[0094] 5.2、将步骤5.1的培养液以1∶100体积比接种于20 mL的LB培养基中培养至OD600为0.6～0.7（培养时间一般为2～4 h），加入诱导剂异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5 mM，于37 ℃继续培养，并在培养时间为6～12 h内取菌液检测。取1 mL菌液，离心收集菌体。在诱导前取1 mL菌液作为对照。
[0095] 5.3、分别在经过诱导的菌体和对照组的菌体中加入400 μL裂解液（裂解液的组分为：50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mM imidazol （pH8.0）、10 μg/ml溶菌酶），煮沸10 min，然后以12000 rpm离心5 min，分别收集上清。
[0096] 5.4、将上清用15 %（v/v）SDS-PAGE凝胶在100 V，25 mA的电泳条件下电泳5 h，然后用考马斯亮蓝染液（考马斯亮蓝染液的成分包括：0.1 %（w/v）考马斯亮兰，45 %（v/v）甲醇，10 %（v/v）冰醋酸、余量的ddH2O）染色15 min，最后用脱色液（脱色液的成分包括：40 v/v%甲醇，10 v/v%冰醋酸，50 v/v%无菌水脱色1 h后观察电泳结果。电泳结果参见图3。
[0097] 从图3的电泳结果中可知：在约55 kDa处有可溶蛋白表达，此大小与序列中氨基酸序列加上标签GST基因融合蛋白的氨基酸分子大小基本一致，初步认为此蛋白为融合表达降解酯酶est3385。
[0098] 5.5、采用GE公司的谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B试剂盒从总蛋白中纯化GST和est3385融合蛋白；该试剂盒能够特异性结合GST，利用该特异性结合GST特点纯化融合蛋白。表达的降解酯酶est3385蛋白含有GST标记，便于纯化，可溶形式的诱导表达蛋白纯化。纯化蛋白用15%（v/v）SDS-PAGE凝胶电泳检测，在55 kDa处可见单一条带的表达蛋白（图3），证明此蛋白为含标签GST的降解酯酶est3385。
[0099] 6、降解酯酶est3385对甲氰菊酯的降解特性分析
[0100] 6.1、温度对降解酯酶降解效率的影响：
[0101] 在5 mL离心管中加入4 mL磷酸缓冲液。在磷酸缓冲液中加入甲氰菊酯原药和酶液（酶液即为步骤5中分离得到的降解酯酶est3385）得到混合液，使得混合液中甲氰菊酯的终浓度为100 mg/L，酶液的终浓度为10 mg/L。将上述混合液pH均为7.2，温度分别为15、25、35、45、55、65℃的环境下下孵育1 h，然后煮沸10 min，每个处理重复3次，最后萃取进行气相色谱分析甲氰菊酯残留。
[0102] 图4为不同孵育温度对酶液的处理效果影响结果，从图4中可知：15℃～65℃下，甲氰菊酯的降解率均能达到60%以上，其中温度为35℃时，降解率达到96.48%。
[0103] 6.2、pH对降解酯酶est3385活性的影响：
[0104] 取6只5 mL的离心管，于离心管中加入4 mL的磷酸缓冲液。在磷酸缓冲液中均加入甲氰菊酯原药和酶液得到混合液，使得混合液中甲氰菊酯的终浓度为100 mg/L，酶液的终浓度为10 mg/L。将上述混合液在35 ℃，pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的条件下孵育1 h，然后煮沸10 min，每个处理重复3次，最后萃取进行气相色谱分析甲氰菊酯残留。
[0105] 图5为不同pH对酶液的处理效果的影响，从图5中可知：pH为4.0时，酶液对甲氰菊酯的降解率较低，当pH为5.0～9.0时，酶液对甲氰菊酯的降解率明显升高，其中pH为6.0时，酶液对甲氰菊酯的降解率最高，达到96.55%以上。
[0106] 6.3、降解酯酶的底物特异性分析：
[0107] 取4只5 mL的离心管，分别编号为1、2、3、4，于离心管1、2、3、4中均加入4 mL的磷酸缓冲液和酶液；接着于离心管1中加入甲氰菊酯，于离心管2中加入氯氰菊酯，于离心管3中加入联苯菊酯，于离心管4中加入醚菊酯，使得离心管中，甲氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、醚菊酯的终浓度均为100 mg/L；酶液的终浓度均为10 mg/L。将上述离心管于pH 7.2 ，37℃下孵育1 h，然后煮沸10 min，每个处理重复3次，最后萃取进行气相色谱分析甲氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、醚菊酯残留。
[0108] 图6为降解酯酶的底物特异性分析结果，从图6中可知：降解酯酶仅对甲氰菊酯高，对氯氰菊酯、联苯菊酯、醚菊酯的降解率均较低，具有良好的特异性。
[0109] 6.4、金属离子和化学药物对酶活的影响：
[0110] 取10只5 mL的离心管，于离心管中加入4 mL的磷酸缓冲液。在磷酸缓冲液中均加入甲氰菊酯原药和酶液得到混合液，使得混合液中甲氰菊酯的终浓度为100 mg/L，酶液的终浓度为10 mg/L。在上述混合溶液中分别加入Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+ (1 mM)、Tween-80、Tween-20 (1.0%)、SDS、EDTA (1 mM)；于pH 7.2，37℃下孵育1 h，然后煮沸10 min，每个处理重复3次，最后萃取进行气相色谱分析甲氰菊酯。
[0111] 图7为金属离子和化学药物对酶活的影响结果，从图7中可知：化学试剂吐温-80能够抑制降解酯酶est3385的降解活性，其他化学试剂SDS和EDTA对降解酯酶的降解活性没有影响；金属离子对降解酯酶est3385的降解活性具有明显的抑制作用，且随金属离子的价位升高，对降解酯酶est3385的降解活性抑制作用上升，其中，Fe3+能够抑制降解酯酶est3385高达62%的降解活性。
[0112] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
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