专利汇可以提供湿加松体细胞胚拯救的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种湿加松 体细胞 胚拯救的方法,包括(1)采集湿加松球果、获取外植体;(2)诱导产生胚性愈伤组织;(3)胚性愈伤组织的增殖;(4)熟化培养获得具有萌发潜 力 的子叶胚;(5)萌发培养获得萌发苗的步骤;所述采集湿加松球果的时间为6月20日‑7月2日;所述诱导培养基中的 激素 组分包括:2‑2.4μM的6‑苄 氨 基嘌呤、0.008‑0.012μM的芸苔素内酯、7‑7.4μM的2,4‑D丁酯。该方法具有较高的胚性愈伤组织的诱导率、体胚成熟率以及萌发率。,下面是湿加松体细胞胚拯救的方法专利的具体信息内容。
1.一种湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)获取外植体:采集湿加松球果,剥出种子,将种子消毒后分离出包含合子胚和胚乳的外植体;所述采集湿加松球果的时间为6月20日-7月2日;
(2)诱导:将所述外植体转移到装有诱导培养基的培养器皿中进行诱导培养,获得胚性愈伤组织;
(3)增殖:将步骤(2)所获得的胚性愈伤组织转移到装有增殖培养基的培养器皿中进行增殖培养,获得增殖胚;
(4)熟化:将步骤(3)所获得的增殖胚转移到装有熟化培养基的培养器皿中进行熟化培养,获得具有萌发潜力的子叶胚;
(5)萌发:将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到装有萌发培养基的培养器皿中进行萌发培养,获得萌发苗;
所述诱导培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、
0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-
2.4 μM 的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述增殖培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-
0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM的 6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述熟化培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、175-175.4mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、
0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-
2.4 μM的 6-苄氨基嘌呤、18.7-19.1μM的脱落酸、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、4.8-5.2g/L的植物凝胶;
所述萌发培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、
0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、
4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
2.根据权利要求1所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述诱导培养基包括以下组分:4.8mM的硝酸铵、9.5mM的硝酸钾、1.3mM的磷酸二氢钾、0.07mM的二水合氯化钙、3.8mM的七水合硫酸镁、3.1mM的L-谷氨酰胺、58.4mM的蔗糖、0.56mM的肌醇、501.6μM的硼酸、124.3μM的一水合硫酸锰、149.5μM的七水合硫酸锌、25.0μM的碘化钾、2.0μM的五水硫酸酮、0.5μM的六水合氯化钴、5μM的二水合钼酸钠、40μM的七水合硫酸亚铁、40.1μM的EDTA-二钠、0.3μM的盐酸硫胺素、0.5μM的盐酸吡哆醇、4.1μM的烟酸、2.2 μM 的6-苄氨基嘌呤、
0.01μM的芸苔素内酯、7.2μM的2,4-D丁酯、1g/L的水解酪蛋白、2g/L的植物凝胶。
3.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述采集湿加松球果的时间为6月22日-6月27日。
4.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述诱导培养的条件包括:培养温度为24±1℃、暗条件下诱导培养20~40天。
5.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述增殖培养的条件包括:暗培养,培养温度为24±1℃、每隔14~20天继代一次。
6.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述熟化的步骤包括:按照所述熟化培养基的配方,减去其中的植物凝胶和脱落酸,配制悬浮液中间液;将步骤(3)所获得的胚性愈伤组织悬浮于所述悬浮液中间液中,震荡以形成良好的悬浮体系,得熟化悬浮液;吸取所述熟化悬浮液于定性滤纸上进行抽滤,得到吸附有一层胚团的滤纸,将所述吸附有一层胚团的滤纸放在所述熟化培养基上进行熟化培养;所述熟化培养的条件包括:培养温度为24±1℃,每天光照14-18小时,光照条件为冷荧光光源52-60W,5μmol m-2s-1。
7.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述萌发的步骤包括:将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到萌发培养基中进行萌发培养,先在1.2-2.0μmolm-2s-1的光强下培养12-16天,再转到45-50μmol m-2s-1的光强下培养6-
8周,每天光照的时间为14-18小时,培养的温度为24±1℃;再将萌发出子叶与根的胚插入新鲜的所述萌发培养基中,继续培养24-32天,培养温度为24±1℃,光强为45-50μmol m-2s-1,每天光照的时间为14-18小时,获得萌发苗。
8.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述湿加松体细胞胚拯救的方法还包括以下步骤:将所述萌发苗转移到质量比为2.5-3.5:1的泥炭和蛭石的混合基质中炼苗6-8天,炼苗条件包括:光强为165-175μmol m-2s-1,每天光照的时间为14-18小时,温度为25±1℃,湿度为75-85%。
9.用于湿加松体细胞胚拯救的培养基,其特征在于,所述培养基包括诱导培养基,所述导培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-
59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、
149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM 的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述培养基包括增殖培养基,所述增殖培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、
9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、
1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM 的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述培养基包括熟化培养基,所述熟化培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、
9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、175-175.4mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-
501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-
41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM的 6-苄氨基嘌呤、18.7-19.1μM的脱落酸、0.9-
1.1g/L的水解酪蛋白、4.8-5.2g/L的植物凝胶;
所述培养基包括萌发培养基,所述萌发培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、
9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-
40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
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