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湿加松体细胞胚拯救的方法

阅读:376发布:2021-04-12

专利汇可以提供湿加松体细胞胚拯救的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种湿加松 体细胞 胚拯救的方法,包括(1)采集湿加松球果、获取外植体;(2)诱导产生胚性愈伤组织;(3)胚性愈伤组织的增殖;(4)熟化培养获得具有萌发潜 力 的子叶胚;(5)萌发培养获得萌发苗的步骤;所述采集湿加松球果的时间为6月20日‑7月2日;所述诱导培养基中的 激素 组分包括:2‑2.4μM的6‑苄 氨 基嘌呤、0.008‑0.012μM的芸苔素内酯、7‑7.4μM的2,4‑D丁酯。该方法具有较高的胚性愈伤组织的诱导率、体胚成熟率以及萌发率。,下面是湿加松体细胞胚拯救的方法专利的具体信息内容。

1.一种湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)获取外植体:采集湿加松球果,剥出种子,将种子消毒后分离出包含合子胚和胚乳的外植体;所述采集湿加松球果的时间为6月20日-7月2日;
(2)诱导:将所述外植体转移到装有诱导培养基的培养器皿中进行诱导培养,获得胚性愈伤组织;
(3)增殖:将步骤(2)所获得的胚性愈伤组织转移到装有增殖培养基的培养器皿中进行增殖培养,获得增殖胚;
(4)熟化:将步骤(3)所获得的增殖胚转移到装有熟化培养基的培养器皿中进行熟化培养,获得具有萌发潜的子叶胚;
(5)萌发:将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到装有萌发培养基的培养器皿中进行萌发培养,获得萌发苗;
所述诱导培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二合氯化、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸
0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-
2.4 μM 的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述增殖培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-
0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM的 6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述熟化培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、175-175.4mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、
0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-
2.4 μM的 6-苄氨基嘌呤、18.7-19.1μM的脱落酸、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、4.8-5.2g/L的植物凝胶;
所述萌发培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、
0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、
4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
2.根据权利要求1所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述诱导培养基包括以下组分:4.8mM的硝酸铵、9.5mM的硝酸钾、1.3mM的磷酸二氢钾、0.07mM的二水合氯化钙、3.8mM的七水合硫酸镁、3.1mM的L-谷氨酰胺、58.4mM的蔗糖、0.56mM的肌醇、501.6μM的硼酸、124.3μM的一水合硫酸锰、149.5μM的七水合硫酸锌、25.0μM的碘化钾、2.0μM的五水硫酸酮、0.5μM的六水合氯化钴、5μM的二水合钼酸钠、40μM的七水合硫酸亚铁、40.1μM的EDTA-二钠、0.3μM的盐酸硫胺素、0.5μM的盐酸吡哆醇、4.1μM的烟酸、2.2 μM 的6-苄氨基嘌呤、
0.01μM的芸苔素内酯、7.2μM的2,4-D丁酯、1g/L的水解酪蛋白、2g/L的植物凝胶。
3.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述采集湿加松球果的时间为6月22日-6月27日。
4.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述诱导培养的条件包括:培养温度为24±1℃、暗条件下诱导培养20~40天。
5.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述增殖培养的条件包括:暗培养,培养温度为24±1℃、每隔14~20天继代一次。
6.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述熟化的步骤包括:按照所述熟化培养基的配方,减去其中的植物凝胶和脱落酸,配制悬浮液中间液;将步骤(3)所获得的胚性愈伤组织悬浮于所述悬浮液中间液中,震荡以形成良好的悬浮体系,得熟化悬浮液;吸取所述熟化悬浮液于定性滤纸上进行抽滤,得到吸附有一层胚团的滤纸,将所述吸附有一层胚团的滤纸放在所述熟化培养基上进行熟化培养;所述熟化培养的条件包括:培养温度为24±1℃,每天光照14-18小时,光照条件为冷荧光光源52-60W,5μmol m-2s-1。
7.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述萌发的步骤包括:将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到萌发培养基中进行萌发培养,先在1.2-2.0μmolm-2s-1的光强下培养12-16天,再转到45-50μmol m-2s-1的光强下培养6-
8周,每天光照的时间为14-18小时,培养的温度为24±1℃;再将萌发出子叶与根的胚插入新鲜的所述萌发培养基中,继续培养24-32天,培养温度为24±1℃,光强为45-50μmol m-2s-1,每天光照的时间为14-18小时,获得萌发苗。
8.根据权利要求1-2任一项所述的湿加松体细胞胚拯救的方法,其特征在于,所述湿加松体细胞胚拯救的方法还包括以下步骤:将所述萌发苗转移到质量比为2.5-3.5:1的泥炭和蛭石的混合基质中炼苗6-8天,炼苗条件包括:光强为165-175μmol m-2s-1,每天光照的时间为14-18小时,温度为25±1℃,湿度为75-85%。
9.用于湿加松体细胞胚拯救的培养基,其特征在于,所述培养基包括诱导培养基,所述导培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-
59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、
149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM 的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述培养基包括增殖培养基,所述增殖培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、
9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、
1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM 的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;
所述培养基包括熟化培养基,所述熟化培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、
9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、175-175.4mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-
501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-
41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4 μM的 6-苄氨基嘌呤、18.7-19.1μM的脱落酸、0.9-
1.1g/L的水解酪蛋白、4.8-5.2g/L的植物凝胶;
所述培养基包括萌发培养基,所述萌发培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、
9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-
40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2.8-3.2g/L的植物凝胶。

说明书全文

湿加松体细胞胚拯救的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域,特别是涉及一种湿加松体细胞胚拯救的方法。

背景技术

[0002] 湿地松(Pinus elliottii Engelmann)原产于美国东南部暖热潮湿的低海拔地区,上世纪三十年代引进至我国来,表现出适应性强、抗旱耐瘠薄、造林成活率高、松脂产量高、质量好,具有较高的经济价值的优点,是我国南方主要的松脂原料栽培树种之一。加勒比松(Pinus caribaea Morelet)世界上重要的人工造林树种,上世纪六十年代引进至我国,表现出速生丰产、产脂高、耐旱耐瘠、适应性强、树干较通直、抗较强等优良特性,成为热带和南亚热带地区主要的用材、长纤维纸浆材、生产松脂的树种之一。以湿地松为母本,加勒比松为父本的杂交后代湿加松(P.elliottii×P.caribaea)综合了双亲的优势,干型圆满通直,产脂量高,是经济效益较高的工业原料林树种之一,适合于我国南方省份推广种植。但湿地松与加勒比松的杂交亲和力较低,杂交种子产量不高,具体表现在种子结实率低,种子不饱满,成苗率低等,从而,湿加松种子产量与质量受到影响。
[0003] 胚拯救技术是基于组织培养技术发展而来的,主要针对由于遗传、生理或营养原因,造成难以播种成苗或在发育早期阶段就败育或退化的胚进行早期离体培养。目前,胚拯救技术主要有三种方法:①胚的活体转移;②胚的活体培养;③胚的离体培养。胚拯救作为一种辅助传统育种方式的技术,在缩短育种周期、选育核果类早熟品种及特早熟品种、园艺花卉育种等许多应用方面均获得了显著的成果,但在林木方面研究资料较少。林木种间杂交的主要障碍是杂交亲本的不亲和性及杂种的不育性。其中,受精前的杂交不亲和性,可以通过选择合适的杂交亲本及人工授粉方式等方法克服;而受精后的幼胚不发育或中途停止发育,是远缘杂交育种工作的瓶颈。而胚拯救的胚早期离体培养技术,利用离体胚在培养基上的再次培养获得适宜的生长条件及营养成分,使不发育或中途停止发育的幼胚得以二次生长,分化成健康的植株。
[0004] 但是,关于湿加松胚拯救的方法鲜有报道,因此,有必要研究一种湿加松胚拯救的方法,以促进湿加松林木的大量繁殖。

发明内容

[0005] 基于此,本发明提供了一种湿加松体细胞胚拯救的方法。
[0006] 具体技术方案如下:
[0007] 一种湿加松体细胞胚拯救的方法,包括以下步骤:
[0008] (1)获取外植体:采集湿加松球果,剥出种子,将种子消毒后分离出包含合子胚和胚乳的外植体;所述采集湿加松球果的时间为6月20日-7月2日;
[0009] (2)诱导:将所述外植体转移到装有诱导培养基的培养器皿中进行诱导培养,获得胚性愈伤组织;
[0010] (3)增殖:将步骤(2)所获得的胚性愈伤组织转移到装有增殖培养基的培养器皿中进行增殖培养,获得增殖胚;
[0011] (4)熟化:将步骤(3)所获得的增殖胚转移到装有熟化培养基的培养器皿中进行熟化培养,获得具有萌发潜力的子叶胚;
[0012] (5)萌发:将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到装有萌发培养基的培养器皿中进行萌发培养,获得萌发苗;
[0013] 所述诱导培养基中的激素组分包括:2-2.4μM的6-苄基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯。
[0014] 在其中一些实施例中,所述诱导培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二合氯化、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、
1.8-2.2μM的五水硫酸、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4μM的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的
2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶。
[0015] 在其中一些实施例中,所述增殖培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、
1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4μM的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的
2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白,1.8-2.2g/L的植物凝胶。
[0016] 在其中一些实施例中,所述熟化培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、175-175.4mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4μM的6-苄氨基嘌呤、18.7-19.1μM的脱落酸、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、4.8-5.2g/L的植物凝胶。
[0017] 在其中一些实施例中,所述萌发培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、
0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、
2.8-3.2g/L的植物凝胶。
[0018] 在其中一些实施例中,所述采集湿加松球果的时间为6月22日-6月27日。
[0019] 在其中一些实施例中,所述诱导培养的条件包括:培养温度为24±1℃、暗条件下诱导培养20~40天。
[0020] 在其中一些实施例中,所述增殖培养的条件包括:培养温度为24±1℃、每隔14~20天继代一次。
[0021] 在其中一些实施例中,所述熟化的步骤包括:按照所述熟化培养基的配方,减去其中的植物凝胶和脱落酸,配制悬浮液中间液;将步骤(3)所获得的胚性愈伤组织悬浮于所述悬浮液中间液中,震荡以形成良好的悬浮体系,得熟化悬浮液;吸取所述熟化悬浮液于定性滤纸上进行抽滤,得到吸附有一层胚团的滤纸,将所述吸附有一层胚团的滤纸放在所述熟化培养基上进行熟化培养;所述熟化培养的条件包括:培养温度为24±1℃,每天光照14-18小时,光照条件为冷荧光光源52-60W,5μmol m-2s-1。
[0022] 在其中一些实施例中,所述萌发的步骤包括:将步骤(4)所获得的具有萌发潜力的子叶胚接种到萌发培养基中进行萌发培养,先在1.2-2.0μmol m-2s-1的光强下培养12-16天,再转到45-50μmol m-2s-1的光强下培养6-8周,每天光照的时间为14-18小时,培养的温度为24±1℃;再将萌发出子叶与根的胚插入新鲜的所述萌发培养基中,继续培养24-32天,-2 -1培养温度为24±1℃,光强为45-50μmol m s ,每天光照的时间为14-18小时,获得萌发苗。
[0023] 在其中一些实施例中,所述湿加松体细胞胚拯救的方法还包括以下步骤:将所述萌发苗转移到质量比为2.5-3.5:1的泥炭和蛭石的混合基质中炼苗6-8天,炼苗条件包括:光强为165-175μmol m-2s-1,每天光照的时间为14-18小时,温度为25±1℃,湿度为75-
85%。
[0024] 本发明还提供了用于湿加松体细胞胚拯救的培养基。
[0025] 具体技术方案如下:
[0026] 用于湿加松体细胞胚拯救的培养基,所述培养基包括诱导培养基,所述诱导培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-
150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、
0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4μM的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-
2.2g/L的植物凝胶;及/或,
[0027] 所述培养基包括增殖培养基,所述增殖培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、
501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-
25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、
0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4μM的6-苄氨基嘌呤、0.008-0.012μM的芸苔素内酯、7-7.4μM的2,4-D丁酯、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、1.8-2.2g/L的植物凝胶;及/或,
[0028] 所述培养基包括熟化培养基,所述熟化培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、3-3.2mM的L-谷氨酰胺、175-175.4mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、
501.4-501.8μM的硼酸、124-124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-
25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、
0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2-2.4μM的6-苄氨基嘌呤、18.7-19.1μM的脱落酸、0.9-1.1g/L的水解酪蛋白、4.8-5.2g/L的植物凝胶;及/或,
[0029] 所述培养基包括萌发培养基,所述萌发培养基包括以下组分:4.4-5.2mM的硝酸铵、9.2-9.8mM的硝酸钾、1.1-1.5mM的磷酸二氢钾、0.05-0.09mM的二水合氯化钙、3.6-4.0mM的七水合硫酸镁、58-59mM的蔗糖、0.54-0.58mM的肌醇、501.4-501.8μM的硼酸、124-
124.6μM的一水合硫酸锰、149-150μM的七水合硫酸锌、24.8-25.2μM的碘化钾、1.8-2.2μM的五水硫酸酮、0.4-0.6μM的六水合氯化钴、4-6μM的二水合钼酸钠、39-41μM的七水合硫酸亚铁、39.8-40.3μM的EDTA-二钠、0.2-0.4μM的盐酸硫胺素、0.4-0.6μM的盐酸吡哆醇、3.9-4.3μM的烟酸、2.8-3.2g/L的植物凝胶。
[0030] 本发明的湿加松体细胞胚拯救的方法具有以下优点和有益效果:
[0031] 本发明的发明人经过大量创造性实验研究获得一种湿加松体细胞胚拯救的方法,本发明的方法通过选择合适发育阶段的合子胚作为胚拯救的诱导培养对象,再通过对诱导培养基进行改进,使该胚拯救方法能够明显提高胚性愈伤组织的诱导率,进而有利于后续步骤中胚性愈伤组织的增殖与熟化等。从而使本发明的方法具有较高的胚性愈伤组织的诱导率、体胚成熟率以及萌发率。
[0032] 本发明的发明人进一步针对增殖、熟化及萌发步骤中愈伤组织增殖生长的特性以及对营养素的特异性需要,对增殖、熟化及萌发培养基都进行了进一步的优化,同时优化了各步骤的具体操作和条件,进一步提高了胚诱导率、成熟率以及萌发率。附图说明
[0033] 图1为湿加松胚拯救的理想球果种子的胚发育阶段;图中标记:1.2.3胚龄适中,是较为理想的胚拯救发育阶段。
[0034] 图2为湿加松胚拯救的过程图;图中标记:4.湿加松包含合子胚及胚乳的外植体接种至诱导培养基,产生愈伤组织;5.胚性愈伤组织的增殖;6.胚性愈伤组织的熟化起始;7.胚性愈伤组织的熟化生长;8.胚性愈伤组织的熟化产生子叶张开的胚;9.子叶张开的胚接种至萌发培养基生长。
[0035] 图3为用不同配方的诱导培养基对湿加松进行胚拯救诱导的诱导率结果图。

具体实施方式

[0036] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0037] 实施例1:用于湿加松体细胞胚拯救的合子胚的最佳发育阶段的确定[0038] 本实施例以广东省台山市红岭种子园生长良好,健康,无虫害的8棵湿加松为取材资源,分别于2016年6月16日,23日,26日,30日及7月7日采集球果,每次每棵树采集3~9个球果,将当天采集的球果在盒中低温保存带回实验室,之后放在4℃的冰箱里冷藏,用于胚成熟度观测,步骤如下:
[0039] (1)剥球果,分离出合子胚:将采集的球果对半切开后,逆种鳞拨开,把种子挑出来,除去外种皮,得到包含合子胚及胚乳的外植体。
[0040] (2)将步骤(1)中得到的外植体移至体视镜下,剥离胚乳,在20×倍数下观察合子胚的形态,记录幼胚发育阶段,胚龄过小或过大,均不适宜于胚拯救诱导;图1中1,2,3所示胚龄适中,为较为理想的胚拯救发育阶段。结果统计如表1所示。
[0041] (3)对各时期采集到的球果中的外植体进行胚拯救的诱导培养
[0042] 将按照步骤(1)的方法获得的种子转移至超净工作台,使用75wt%的乙醇水溶液配合0.1wt%的氯化汞水溶液对种子进行消毒,再用无菌水润洗。再将消毒后的种子,每次取10粒到灭菌的碟子上,剥离内外种皮后,得到所述外植体,不再除去胚乳,直接转移到装有诱导培养基(按表2中的YP配方)的诱导培养皿中进行诱导培养。贴标签,记录家系号,球果采摘时间,诱导时间。控制诱导培养的温度为24±1℃、暗条件下进行诱导培养30天,生成胚性愈伤组织,如图2中的4所示。统计不同球果采集时间获得的外植体进行诱导培养的诱导率(诱导率=诱导出胚性愈伤组织的外植体(接种种子)数量/总的参与诱导的外植体(接种种子)数量)。结果如表1所示。由表1结果可见,球果采集的最佳时间为6月23日-6月26日,该时期内采集的球果,其胚拯救诱导率最高。
[0043] 表1不同球果采样时期胚拯救诱导率情况
[0044]
[0045]
[0046] 实施例2:湿加松体细胞胚拯救
[0047] (1)按表2所示配方配置4种诱导培养基,备用;按表3所示配方配置增殖培养基、熟化培养基以及萌发培养基,待用。
[0048] 表2四种胚拯救诱导培养基配方
[0049]
[0050]
[0051] 注:表中“—”表示未添加该组分,按表2所述组分添加后,YP配方中加入水解酪蛋白(Casein Hydrolysate)1g/L,P6改良、LP、DCR配方中各加入CaseinHydrolysate 0.5g/L;YP、P6改良配方中各加入植物凝胶(Phytagel)2g/L;LP、DCR配方各加入Phytagel 1.8g/L;
用1M的HCl或NaOH调整培养基的pH值到5.70-5.80之间。
[0052] 表3增殖、熟化及萌发培养基配方
[0053]
[0054]
[0055] 注:表中“—”表示未添加该组分,按表3配方组分添加完后,增殖,熟化配方需各加入水解酪蛋白(Casein Hydrolysate)1g/L;增殖培养基加入Phytagel2g/L;熟化配方加入Phytagel 5g/L得固体熟化培养基,不加Phytagel与ABA为液体的熟化培养基(即步骤(6)中的悬浮液中间液);萌发培养基加入Phytagel3g/L;用1M的HCl或NaOH调整培养基的pH值到5.70-5.80之间。
[0056] (2)球果采集
[0057] 根据实施例1胚成熟情况观察和诱导率结果确定的最佳球果采集时间,大量采集球果,用于胚拯救诱导。
[0058] (3)剥球果及种子消毒
[0059] 剥球果:按照实施例1中剥球果的方法,把剥出来的种子转移至超净工作台。种子消毒:使用75wt%的乙醇水溶液配合0.1wt%的氯化汞水深水对种子进行消毒,再用无菌水润洗。
[0060] (4)剥种皮及诱导接种
[0061] 将步骤(3)消毒后的种子,每次取10粒到灭菌的碟子上,剥离外种皮后,得到外植体,分别转移到装有4种诱导培养基(按表2配方)的诱导培养皿中分别进行诱导培养。贴标签,记录家系号,球果采摘时间,诱导时间。控制四个诱导培养皿中进行诱导培养的温度均为24±1℃;暗条件下进行诱导培养30d,生成胚性愈伤组织,如图2中的4所示。按诱导出胚性愈伤组织的接种数量占总诱导的接种数量计算,各配方诱导培养基的诱导率结果如图3所示,其中YP配方的诱导培养基的诱导率最高,为2.36%。
[0062] (5)愈伤组织的增殖
[0063] 选取步骤(4)中产生的胚性愈伤组织,转移至固体增殖培养基(按表3增殖配方配制)中进行增殖培养,暗培养,24±1℃,每隔18天继代一次,每次继代每个板会产生0.2g愈伤组织(其中一半的愈伤组织会继续增长,为胚性愈伤组织,另一半生长缓慢,而后停止生长)。继代24次以后,胚活性逐渐降低。
[0064] (6)胚的熟化
[0065] 将步骤(5)培养基中产生的200mg胚性愈伤组织悬浮于20ml悬浮液中间液中(按表3中的液体的熟化培养基配制),用手剧烈震荡以形成良好的悬浮体系,得熟化悬浮液;再用移液器吸取3mL所述熟化悬浮液,放在装有定性滤纸的布氏漏斗上,使用真空短、低脉冲(5s,4.6kPa)真空抽滤,得到吸附有薄薄一层胚团的滤纸,将滤纸放在配制好的固体熟化培养基(按表3中的熟化配方配制)上进行熟化培养(如图2中的6所示),培养3个月后,更换一次所述固体熟化培养基继续培养3个月,培养温度为24±1℃,每天光照16小时,用冷荧光光源(Phillips F72T12/CW,56W,5μmol m-2s-1)微弱光照。所述冷荧光微弱光照培养6个月后,在本实施例条件下,平均1g所述增殖胚(步骤(5)增殖培养后的胚性愈伤组织)产生51.0个具有萌发潜力的子叶胚。
[0066] 在胚拯救的熟化阶段,将增殖所获得的胚性愈伤组织悬浮于所述熟化悬浮液中间液中,再使用真空抽滤,通过调节悬浮液的量及真空泵的脉冲,达到控制吸附在滤纸上胚团的密度含水量的目的,有利于提高熟化率。
[0067] (7)萌发及炼苗
[0068] 步骤(6)熟化培养3个月后,获得子叶开始张开、形态正常的子叶胚(如图2中的8所示),将该子叶胚接种至装有萌发培养基(按表3所示的萌发配方配制)的萌发培养皿中,先在微弱光强下(1.6μmolm-2s-1)培养2周,而后转到更高光强下(47μmol m-2s-1)继续培养,培养温度均为25±1℃,每天光照时间均为16h。强光下培养7周后萌发出子叶与根(往下长)的胚,将其插入新鲜萌发培养基(按表3所示的萌发配方配制)中继续培养,培养条件与高光强培养条件相同。4周后出现上胚轴与根系发育的植株,即为萌发,萌发率为91.5%,萌发率的计算为:接种至萌发培养基的子叶胚数量/萌发出上胚轴与根的植株数量。
[0069] 将所述植株转移到泥炭:蛭石(质量比3:1)的混合基质中炼苗,在人工气候室炼苗,光强为170μmol m-2s-1,温度为25±1℃,湿度为80%,每天光照时间为16h。
[0070] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
[0071] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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