烟草蛋白NtVHA-a1及其应用
阅读：3发布：2020-05-15
专利汇可以提供烟草蛋白NtVHA-a1及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 烟草 基因工程领域，具体涉及一个烟草蛋白NtVHA-a1及其应用 专利 申请 。该基因由2454个 碱 基构成，其中特异性核酸 片段 为1042-1371位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。烟草蛋白NtVHA-a1 氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由817个氨基酸残基组成。在对烟草中 生物 胺类物质含量相关调控基因的研究过程中， 发明人 通过对特定烟草蛋白NtVHA-a1的研究，发现其与烟草生物胺类物质、尤其是精胺含量高度相关。进一步基因功能验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中精胺含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术 基础 和提供一定参考借鉴。，下面是烟草蛋白NtVHA-a1及其应用专利的具体信息内容。
1.烟草蛋白NtVHA-a1的编码基因NtVHA-a1，其特征在于，该基因由2454个碱基构成，其中特异性核酸片段为1042-1371位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述编码基因NtVHA-a1在叶片生物胺类物质调控中的应用，其特征在于，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtVHA-a1基因表达量，来调节控制烟叶中生物胺类物质含量情况，所述生物胺类物质为精胺。
3.权利要求1所述编码基因NtVHA-a1的PCR扩增制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取基因组，并反转录为cDNA备用；
（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：
NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，
NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’。
4.如权利要求3所述编码基因NtVHA-a1的PCR扩增制备方法，其特征在于，步骤（1）中，提取基因组时，以烟草K326叶片为样品。
5.权利要求1所述编码基因NtVHA-a1所编码的烟草蛋白NtVHA-a1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由817个氨基酸残基组成。
6.权利要求5所述烟草蛋白NtVHA-a1在叶片生物胺类物质含量调控中的应用，其特征在于，该蛋白与植物叶片中生物胺类物质含量相关，降低该蛋白表达含量后，叶片中精胺含量显著降低。
7.利用权利要求1所述编码基因NtVHA-a1的烟草新品种培育方法，其特征在于，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtVHA-a1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得精胺含量变化的烟草新品种。
烟草蛋白NtVHA-a1及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 烟草（Nicotiana tabacum L.）属于茄科（Solanaceae）烟草属（Nicotiana），一年生草本植物。烟草原产于美洲，经多条路线传入我国后，凭借我国优越的地理环境条件，使得我国成为烟草种植面积最大、产量最高的国家。而我国也是世界上最大的烟草生产国和消费国，产销量占世界的三分之一，由此也使得烟草的种植与产品加工业在国民经济的发展中占有十分重要的地位。
[0003] 生物胺是一类具有生物活性的含氮的低分子量碱性有机化合物的总称，它们是生物体自身合成荷尔蒙、核苷酸和蛋白质的前体，可以看做是氨分子中1-3个氢原子被烷基或芳基取代后形成的低分子量生物碱。精胺（Spermine），是含有两个氨基和两个亚氨基的一种多胺类物质，在植物体内由丁二胺和S-腺苷蛋氨酸经一系列酶促反应后生成。作为生物胺中一种纯天然植物活性物质，精胺广泛存在于植物界，具有调节植物的生长发育和延缓植物细胞衰老等生理功能。当植物遭遇逆境胁迫时，植物体内多胺不仅可以通过双歧化反应直接清除活性氧，而且还可以通过提高抗氧化酶活性来减少活性氧的积累。
[0004] 鉴于生物胺类物质对烟叶生长的重要作用，对其代谢途径进行深入分析显然具有十分重要的技术意义。而随着烟草基因工程深入，对于与烟草中生物胺类物质相关编码基因的深入研究和开发，则可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定良好的技术基础。
发明内容
[0005] 基于烟草中生物胺类物质含量相关调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草蛋白NtVHA-a1基因及其在烟草生物胺类物质含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草抗性研究、新品种培育等工作开展奠定一定基础。
[0006] 本申请所采取的技术方案详述如下。
[0007] 烟草蛋白NtVHA-a1的编码基因NtVHA-a1，由2454个碱基构成，其中特异性核酸片段为1042-1371位碱基，具体碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008] 所述编码基因NtVHA-a1在叶片生物胺类物质调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节烟草NtVHA-a1基因表达量，来调节控制烟叶中生物胺类物质含量情况，所述生物胺类物质主要为精胺。
[0009] 所述编码基因NtVHA-a1的PCR扩增制备方法，包括如下步骤：（1）提取（具体例如以烟草K326叶片为样品）基因组，并反转录为cDNA备用；
（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：
NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，
NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’。
（2）设计PCR扩增用引物，并进行PCR扩增，具体引物序列设计如下：
NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，
NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’。
[0010] 烟草蛋白NtVHA-a1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其由817个氨基酸残基组成。
[0011] 所述烟草蛋白NtVHA-a1在叶片生物胺类物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中生物胺类物质含量相关，降低该蛋白表达含量后，叶片中精胺含量显著降低。
[0012] 利用所述编码基因NtVHA-a1的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有NtVHA-a1基因的病毒诱导沉默载体、RNAi干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得精胺含量变化的烟草新品种；具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtVHA-a1基因的表达使其沉默，NtVHA-a1基因沉默植株中精胺含量显著降低，进而获得精胺含量降低的植物新品种。
[0013] 换言之，一种培育低生物胺含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，干扰NtVHA-a1基因的表达使其沉默，NtVHA-a1基因沉默的新烟草品种植株中生物胺、尤其是精胺含量显著下降。
[0014] 在对烟草中生物胺类物质含量相关调控基因的研究过程中，发明人通过对特定烟草蛋白NtVHA-a1的研究，发现其与烟草生物胺类物质、尤其是精胺含量高度相关。进一步基因功能验证过程中，在将该基因沉默后，烟草中精胺含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟草品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础和提供一定参考借鉴。附图说明
[0015] 图1 为与对照植株相比，NtVHA-a1基因沉默植株中该基因的相对表达量；图2 为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的精胺含量比较。
具体实施方式
[0016] 下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。
[0017] 生物材料：本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等；
下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobacco rattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；
实验试剂：
LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10 g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；
YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL
1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；
1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；
200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；
MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。
下述实施例中所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobacco rattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2（一种常用载体），其带有卡那筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamH I等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；
实验试剂：
LB液体培养基，1L含量中含有：10 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；10 g氯化钠（NaCl）；5 g酵母抽提物（yeast extract），高温高压灭菌；
YEB液体培养基，1L含量中含有：5g 牛肉浸膏（beef extract）；5 g细菌蛋白胨（bacteriological peptone）；5 g 蔗糖（sucrose）；1 g酵母抽提物（yeast extract）；2 mL
1M硫酸镁（MgSO4），高温高压灭菌；
1M 2-(N-吗啉)乙磺酸（MES）储备液：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；
200 mM乙酰丁香酮（Acetosyringone，As）储备液：二甲基亚砜（DSMO）溶解，-20℃储存备用；
MMA（100 mL）：1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M,pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As。
[0018] 实施例1本实施例就烟草NtVHA-a1基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。
[0019] （1）烟草NtVHA-a1基因克隆根据前期对于烟草基因组及相关NtVHA-a1基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：
NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，
NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’；
以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtVHA-a1基因；
PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。
NtVHA-a1-F：5’- TTTGCGAAGACCAAGATACA - 3’，
NtVHA-a1-R：5’- GCTGCCTAGTTTCTGAGAGC - 3’；
以烟草K326叶片的cDNA为模板，进行PCR扩增获得NtVHA-a1基因；
PCR扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸 5min；
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。
[0020] （2）构建重组TRV2- NtVHA-a1载体将步骤（1）中的PCR扩增产物进行EcoRI、BamHI双酶切，同时对空载体TRV2进行EcoRI、BamHI双酶切，分别回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶进行连接；
将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃过培养夜；
挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- NtVHA-a1。
将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/L Kan的LB固体培养基上，在37℃过培养夜；
挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定， 并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体TRV2- NtVHA-a1。
[0021] 需要说明的是，烟草NtVHA-a1基因，包括2454个碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体碱基序列为：ATGGAGTACATAGACAACATGCCGCCAATGGATCTGATGCGCTCGGAGAAGATGACTTTCGTTCAGCTTATTATTCCTTTTGAGTCCGCTCATCGTGCTGTCACTTACCTTGGCCAACTCGGACTTCTCCAATTCCGTGATCTAAATGCCGAAAAGAGCCCTTTCCAGAGAACATTTGTAAACCAGGTAAAAAGATGCGCCGAGATGTCAAGAAAACTACGATATTTCAAAGATCAGATACACAAAGCCGGTCTATTGCCTCCTCCTCTTCCTGCTTCCCAACCTGATATTGAATTAGAAGAATTGGAGATACAACTGGCAGAGCATGAACATGAGTTGATTGAAATGAATGCTAATAGTGAGAAATTGCGGCAATCATATAATGAGCTGCTTGAGTTTAAGATGGTATTGCAAAAGGCTAGTGGCTTCCTTGTTTCAAGTAGTCATACCACTGATCAGGAAACAGAACTGGTTGAAAATGTGTACTCCAATGATAACCATGCTGATACAGCATCATTACTTGAGCAGGAGATGCGTTCAGAACTGTCAAATCAGTCTGGAGTTAGATTTATGAGTGGCATTATCTGCAAGTCCAAGGTTGTTCAATTTGAAAGAATGCTGTTTCGTGCTACAAGGGGTAATATGCTTTTCAATCAGGCAGTTGCTGATGATGAGATACTGGATCCTTCCTCAAACGAAATGGTTGAGAAAGTAGTCTTTGTAGTATTCTTTTCAGGTGAGCAGGCGAGAACAAAAATACTGAAAATATGTGAGGCATTTGGTGCAAATTGCTATCCTGTTCCTGAAGACACGACAAAGAGAAGGCAGATAACTCAAGAAGTTTTGTTTCGGCTATCTGAATTAGAGACCACTCTGGATGCTGGACTGCGCCATAGAGATAAGGCTTTGACCTCCATAGGGTATCACCTTACAAAATGGATAAACATGGTTAAAACACAAAAGGCAGTGTATGACACGTTAAATATGCTAAATTTCGATGTTACAAAGAAGTGCCTTGTGGGTGAGGGCTGGTGTCCAATATTTGCGAAGACCAAGATACAAGAGGCTTTGCAGCGTGGAACATTTGATAGCAGTTCACAAGTGGGCATTATATTTCATGTGATGGATGCTGTGGAGTCACCTCCAACATACTTTAGGACAAACAGTTTCACAAATGCATTTCAAGAAATTGTTGATGCATATGGTGTTGCTAAATACCAGGAGGCAAATCCAGCTGTTTATACCATTGTTACATTTCCTTTCCTTTTTGCTGTGATGTTTGGGGACTGGGGTCATGGAATCTGCTTGCTGTTGGGAGCATTAGTTCTTATCGCAAGGGAAAGCAAACTTAGCTCTCAGAAACTAGGCAGCTTCATGGAGATGCTCTTTGGGGGTCGCTATGTACTCCTGTTGATGTCAATATTTTCAATTTACTGTGGCTTGATATATAATGAATTCTTCTCAGTTCCCTTTCACATATTTGGTGACTCAGCGTACAAATGCCGAGATGCTACATGCAGTGATGCACGGACAGTTGGTTTAGTAAAATACAATGATCCATATCCATTTGGTGTGGACCCAAGCTGGAGAGGCAGCCGTTCAGAGCTTCCTTTCTTGAATTCTCTTAAGATGAAGATGTCTATTTTGTTGGGTGTGGCCCAGATGAACCTCGGAATTATTTTAAGTTATTTCAATGCACGTTTCTTCAGCAGCTCAATTGATATTAAGTATCAGTTTATTCCACAAATAATCTTTCTCAACAGCCTCTTTGGATACCTTTCTCTTCTTATTCTTGTCAAATGGTGCACTGGTTCTCAAGCAGATCTATATCATGTTATGATTTATATGTTCTTAAGTCCTTTTGAGGCTCTTGGTGAAAATAGGTTGTTCTGGGGCCAGAGTGTGCTTCAGGTAATATTGCTGCTTTTGGCACTTGTTGCTGTCCCGTGGATGCTCTTCCCAAAACCTTTTATTTTGAAAAGTCTTCATATGGAGAGATTTCAAGGTCGTACATACGGGATACTTGGAACCTCCGAGATGGTTATTGACGAAGAACCAGGCTCTGCCAGTCAGCATGCTGAGGAGTTTAACTTTAGTGAGGTTTTTGTGCACCAAATGATACACTCTATTGAATTTGTTCTTGGTGCTGTTTCAAACACTGCATCGTATCTTCGGCTTTGGGCTTTGAGTTTGGCTCACTCTGAATTATCTACTGTGTTCTATGAGAAAGTTCTCCTCCTTGCCTGGGGGTATGATAACATCGTCATTCGGCTAGTGGGGCTGGCAGTTTTTGCCTTTGCGACAACTTTTATCCTACTTATGATGGAGACTCTTAGTGCATTCCTTCATGCATTGCGTCTTCATTGGGTGGAATTCCAGAACAAGTTTTATCATGGGGATGGTTATAAGTTCAAGCCATTCTCCTTTGCCTTGTTAGCAGATGATGACGATTAG。
[0022] 烟草蛋白NtVHA-a1，包括817个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体氨基酸序列为：MEYIDNMPPMDLMRSEKMTFVQLIIPFESAHRAVTYLGQLGLLQFRDLNAEKSPFQRTFVNQVKRCAEMSRKLRYFKDQIHKAGLLPPPLPASQPDIELEELEIQLAEHEHELIEMNANSEKLRQSYNELLEFKMVLQKASGFLVSSSHTTDQETELVENVYSNDNHADTASLLEQEMRSELSNQSGVRFMSGIICKSKVVQFERMLFRATRGNMLFNQAVADDEILDPSSNEMVEKVVFVVFFSGEQARTKILKICEAFGANCYPVPEDTTKRRQITQEVLFRLSELETTLDAGLRHRDKALTSIGYHLTKWINMVKTQKAVYDTLNMLNFDVTKKCLVGEGWCPIFAKTKIQEALQRGTFDSSSQVGIIFHVMDAVESPPTYFRTNSFTNAFQEIVDAYGVAKYQEANPAVYTIVTFPFLFAVMFGDWGHGICLLLGALVLIARESKLSSQKLGSFMEMLFGGRYVLLLMSIFSIYCGLIYNEFFSVPFHIFGDSAYKCRDATCSDARTVGLVKYNDPYPFGVDPSWRGSRSELPFLNSLKMKMSILLGVAQMNLGIILSYFNARFFSSSIDIKYQFIPQIIFLNSLFGYLSLLILVKWCTGSQADLYHVMIYMFLSPFEALGENRLFWGQSVLQVILLLLALVAVPWMLFPKPFILKSLHMERFQGRTYGILGTSEMVIDEEPGSASQHAEEFNFSEVFVHQMIHSIEFVLGAVSNTASYLRLWALSLAHSELSTVFYEKVLLLAWGYDNIVIRLVGLAVFAFATTFILLMMETLSAFLHALRLHWVEFQNKFYHGDGYKFKPFSFALLADDDD。
[0023] 实施例2在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，发明人进一步将所构建的重组TRV2- NtVHA-a1载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。
[0024] （1）转化农杆菌需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了TRV2-PDS重组载体作为对照，具体转化过程为：
将TRV2 （载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtVHA-a1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。
将TRV2 （载体对照）、TRV2-PDS（VIGS效率对照）及TRV2-NtVHA-a1的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan 和50mg/L Rif的YEB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。
[0025] （2）制备转染用菌液将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan 和50 mg/L Rif）中，28℃、250 rpm条件下培养过夜；
取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD600 =
1.0 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, ~
pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD600 =1.0 左右；最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。
取50uL 过夜培养物接种至50 mL的YEB液体培养基（含50 mg/L Kan）中，培养至OD600 =
1.0 1.5左右，然后4000g 离心5 min，收集菌体，再用MMA(1 mL（1 M）MgCl2；1 mL（1 M, ~
pH5.6）MES；75 μL（200 mM）As)重悬，调节OD600 =1.0 左右；最后室温放置3 h左右后，作为转染用菌液。
[0026] （3）瞬时转化以3 4 w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1 mL规格注射器，将步骤（2）中所~
制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。
制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。
[0027] 进一步通过qRT-PCR对NtVHA-a1基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，TRV2- NtVHA-a1的侵染植株中，NtVHA-a1的表达量显著降低。
[0028] 进一步地，发明人对实验组（TRV2- NtVHA-a1浸染植株）和对照组（TRV2-GFP浸染植株）中的精胺含量情况进行了检测，结果如图2所示：从图2结果可以看出，实验组中精胺含量与对照组相比均有显著降低，这进一步表明，通过沉默NtVHA-a1基因，可对烟草叶片中生物胺类成分的含量进行调控，进而可为烟叶育种、品质调控奠定一定技术基础。
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