技术领域
[0001] 本
发明属于微生物技术领域，具体涉及3种卷烟赋香菌株及复配的卷烟赋香微生物制剂，其中包括2株芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)和1株
酵母菌(Saccharomyces sp.)，该卷烟赋香微生物制剂能够用于卷烟
发酵，替代传统的加香，经发酵处理的卷烟理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准。
背景技术
[0002] 卷烟工业中，根据不同卷烟叶组中的烟叶品种、烟叶产地、烟叶等级、烟叶年份和烟叶配比等，通过加料加香，赋予卷烟产品特定产品
风格，提供给消费者特定的感官体验。通过加料，可以改善卷烟的吸食品质、改善烟丝的物理性状、改善烟丝的燃烧性和防止烟丝霉变等；通过加香，在不损害烟叶原有香气的情况下，衬托烟香，同时掩盖杂气，达到增香赋香、改善吃味和协调
香味的作用，进而最终形成卷烟产品风格。按照来源不同，
烟草香料包括天然香料和合成香料2大类。然而，世界卫生组织(WHO)在《烟草控制
框架公约》中建议各国限制或禁止在烟草中使用香料等添加剂，包括
葡萄糖、蜂蜜、香草
醛和中草药等天然或合成烟香香料都在范围内。我国已于2005年正式批准《烟草控制框架公约》，减少和限制天然和合成香料的使用是大势所趋。
[0003] 采用烟叶表面微生物来达到替代传统加料加香的目的，以期形成新的卷烟的卷烟产品。本领域技术人员也做了大量的工作，实际上，微生物发酵已被证明可改善烟叶可用性，是烟叶吸食品质形成的重要环节，根据发酵方式的不同，可分为人工发酵和自然发酵，国内外学者针对烟叶的人工发酵进行了大量的研究和实践。然而，但还未有仅使用复配微生物制剂用于卷烟产品风格形成的报道。
发明内容
[0004] 针对卷烟工业发展的需求，本发明目的在于，通过分离、筛选、培养得到了3株卷烟赋香菌株，经复配可以用于卷烟叶组的赋香，替代传统加料加香工艺。经实验证明，采用该复配菌株制剂用于卷烟发酵后，卷烟的理化指标和评吸结果均达到商品化卷烟标准。
[0005] 为了实现上述任务，本发明的方法通过以下技术方案得以实现：
[0006] 一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007，保藏号为CGMCC No.5332。
[0007] 一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013，保藏号为CGMCC No.5333。
[0008] 一种卷烟赋香菌株，其特征在于，该卷烟赋香菌株命名为酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038，保藏号为CGMCC No.5334。
[0009] 一种卷烟赋香微生物复配制剂，其特征在于，该卷烟赋香微生物复配制剂含有芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038，且芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007∶芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013∶酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038＝(0.001～1)∶(0.001～1.5)∶(0.005～15)。
[0010] 上述芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013的分离筛选方法，其特征在于，该方法先用无菌生理盐
水与1g醇化烟叶混合后，-1用无菌取样的方法取1mL
混合液加入到9mL灭菌生理盐水中制成10 菌悬液，然后逐级稀-2 -3 -4 -5 -6 -7
释，取10 、10 、10 、10 、10 、10 六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到LB培养基上，37℃恒温培养24h，挑取长势良好，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；
[0011] LB培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1％，酵母提取物：0.5％，NaCl：1％；酵母提取物(yeast extract)，也称酵母膏，市售。
[0012] 镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃
冰箱；
[0013] LB斜面固体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1％，酵母提取物：0.5％，NaCl：1％；琼脂：2％；
[0014] 镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
[0015] 对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
[0016] 上述酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038的分离筛选方法，其特征在于，该方法先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7菌生理盐水中制成10 菌悬液，然后逐级稀释，取10 、10 、10 、10 、10 、10 六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到YPD培养基上，32℃恒温培养24h，挑取长势良好，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；
[0017] YPD培养基主要成分为：酵母膏：1％，蛋白胨：2％，葡萄糖：2％；
[0018] 镜检若为纯培养单一菌株，则接种于YPD斜面固体培养基，32℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
[0019] YPD斜面固体培养基主要成分为：酵母膏：1％，蛋白胨：2％，葡萄糖：2％；琼脂：2％；
[0020] 镜检若为混合菌株，则再次在YPD培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，32℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
[0021] 对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
[0022] 上述芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013的培养方法，其特征在于，将保藏的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中，于27℃～37℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养12h～36h，得到芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007发酵液；其中，LB液体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1％，酵母提取物：0.5％，NaCl：1％；琼脂：2％，pH自然；
[0023] 所得到的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007发酵液在4℃条件下，以8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。
[0024] 上述酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038的培养方法，其特征在于，将保藏的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038从斜面接种2环至100mL的YPD液体培养基中，于27℃～37℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养12h～36h，得到酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液；其中，YPD液体培养基主要成分为：酵母膏：1％，蛋白胨：2％，葡萄糖：2％，琼脂：2％，pH自然；
[0025] 所得到的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液在4℃条件下，以8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。
[0026] 上述卷烟赋香微生物复配制剂的配制方法，其特征在于，将各菌株发酵液、粉剂或冻干粉在4℃条件下，于8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，称量，然后以芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007∶芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013∶酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038＝(0.001～1)∶(0.001～1.5)∶(0.005～15)的比例复配。
[0027] 将上述烟赋香微生物复配制剂用于卷烟叶组发酵的应用，将卷烟赋香复配菌株制剂按照0.0001wt％～10wt％
质量比例喷施于切后烟丝/叶组或烘后烟丝/叶组的表面进行发酵。
[0028] 本发明得到的3株卷烟赋香菌株，并配制成卷烟叶组赋香复配微生物制剂，具有易培养、增香效果好、发酵速度快、降害效果明显等，是一种新的卷烟赋香复配微生物制剂。
具体实施方式
[0029] 为了获得卷烟叶组赋香菌株，
申请人从烟叶表面分离、筛选可使卷烟叶组赋香的一组微生物菌株，即芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007、芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013和酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038，于2011年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并配制成卷烟叶组复配赋香微生物，该复配微生物制剂其可实现卷烟叶组的增香和降害。在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号分别为CGMCC No.5332、CGMCC No.5333和CGMCC No.5334。
[0031] 1)芽 孢 杆菌 (Bacillaceae.sp)LBT1.0007或 芽 孢杆 菌 (Bacillaceae.sp)LBT1.0013的分离与筛选：
[0032] 从自然醇化3年以上的烟叶表面分离卷烟叶组赋香菌菌株，其分离方法是：先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取1mL混合液加入到9mL灭菌生理-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7盐水中制成10 菌悬液，然后逐级稀释，取10 、10 、10 、10 、10 、10 六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到LB培养基上，37℃恒温培养24h，挑取长势良好，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检。
[0033] 镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
[0034] 镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱。
[0035] LB培养基主要成分为：胰化蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％；pH自然，[0036] LB斜面固体培养基是在LB培养基的
基础上加入2％琼脂成为LB斜面固体培养基；pH自然。
[0037] 镜检若为纯培养单一菌株，则接种于LB斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
[0038] 镜检若为混合菌株，则再次在LB培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
[0039] 对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
[0040] 2)酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038的分离与筛选：
[0041] 从自然醇化3年以上的烟叶表面分离卷烟叶组赋香菌菌株，其分离方法是：
[0042] 该方法先用无菌生理盐水与1g醇化烟叶混合后，用无菌取样的方法取1mL混合液-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7加入到9mL灭菌生理盐水中制成10 菌悬液，然后逐级稀释，取10 、10 、10 、10 、10 、10六个稀释度的菌悬液0.2mL涂布到YPD培养基上，32℃恒温培养24h，挑取长势良好，菌落饱满均匀，且稀释度适宜的平板的单菌落，镜检；
[0043] YPD培养基主要成分为：酵母膏：1％，蛋白胨：2％，葡萄糖：2％；
[0044] YPD斜面固体培养基是在YPD培养基加入2％琼脂成为YPD斜面固体培养基；pH自然。
[0045] 镜检若为纯培养单一菌株，则接种于YPD斜面固体培养基，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
[0046] 镜检若为混合菌株，则再次在YPD培养基平板上进行划线分离，直至镜检为菌株纯培养物后，接种斜面试管，37℃恒温培养24h后保藏于4℃冰箱；
[0047] 对筛选所得的所有纯培养菌株用于烟叶发酵，并根据烟叶理化性质和评吸结果，最终筛选和确定卷烟赋香菌株。
[0048] 将所得的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0007或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013进行培养，其方法是，将保藏的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007从斜面接种2环至100mL的LB液体培养基中，于27℃～37℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养12h～36h，得到芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007新鲜发酵液；其中，LB液体培养基主要成分为：胰化蛋白胨：1％，酵母提取物：0.5％，NaCl：1％；琼脂：2％，pH自然；
[0049] 所得到的芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT1.0013或芽孢杆菌(Bacillaceae.sp)LBT 1.0007发酵液在4℃条件下，以8500r/min～11000r/min离心5min～15min，弃上清液得到湿菌体，进一步得到粉剂或冻干粉，保藏于4℃冰箱备用。
[0050] 将所得的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038进行培养，其方法是，将保藏的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038从斜面接种2环至100mL的YPD液体培养基中，于27℃～37℃，100rpm～180rpm恒温摇床振荡培养12h～36h，得到酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038新鲜发酵液；其中，YPD液体培养基主要成分为：酵母膏：1％，蛋白胨：2％，葡萄糖：2％，琼脂：2％，pH自然；
[0051] 所得到的酵母菌(Saccharomyces sp.)LBT1.0038发酵液在4℃条件下，以8500r/
