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癌症治疗

阅读：449发布：2020-05-11

专利汇可以提供癌症治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于 癌症 治疗 的噬菌粒载体和相关的噬菌粒颗粒，并且具体地说，涉及新颖噬菌粒颗粒和相关表达系统的用途，其用于治疗、 预防 、改善或管理癌症。具体地说，本发明涉及噬菌粒颗粒和表达系统的用途，其用于递送对细胞因子进行编码的转基因以治疗、预防、改善或管理癌症。本发明还扩展到噬菌粒颗粒和表达系统的用途，其用于递送转基因并用于将这种治疗与过继转移的T细胞的使用进行组合以治疗、预防、改善或管理癌症。，下面是癌症治疗专利的具体信息内容。

1.一种在用于治疗、预防或改善癌症的方法中使用的用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达转基因的重组噬菌粒颗粒，其中所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述方法包括将所述核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得一个或多个细胞因子被表达。
2.根据权利要求1所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述转基因表达盒对细胞因子进行编码，所述细胞因子具有以下效果：在所述肿瘤细胞中进行凋亡诱导、改变所述肿瘤细胞以促进内源性抗肿瘤应答、改变所述肿瘤细胞以促进其它治疗或改变肿瘤微环境以促进治疗。
3.根据权利要求1或2所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述细胞因子为IL-4、IL-
12、IL-15、TNFα、TRAIL、IFN-γ或其任何组合，任选地，其中所述细胞因子为IL-15。
4.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述细胞因子为包括非内源性信号肽的杂合细胞因子，所述非内源性信号肽被配置成增加所述细胞因子的表达和/或分泌。
5.根据权利要求4所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述非内源性信号肽是IL-2信号肽。
6.根据权利要求5所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述杂合细胞因子为包括IL-
2信号肽的杂合TNFα，所述IL-2信号肽被配置成增加TNFα的表达和/或分泌。
7.根据权利要求6所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述杂合TNFα包括基本上如SEQ ID No:22所述的氨基酸序列或其片段或变体。
8.根据权利要求6或7所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述杂合TNFα由包括SEQ ID No:23的核酸序列或其片段或变体进行编码。
9.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的重组噬菌粒颗粒，其用于治疗、预防或改善小儿脑肿瘤，任选地弥漫性内脑桥脑胶质瘤(DIPG)或成神经管细胞瘤。
10.一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的系统，所述系统包括：-
(i)第一载体，所述第一载体被配置成在原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；以及
(ii)第二载体，所述第二载体包括核酸，所述核酸对包装所述单链DNA所需的结构蛋白进行编码，从而导致从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒。
11.一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的方法，所述方法包括：-
i)将第一载体引入到原核宿主细胞中，所述第一载体被配置成在所述原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；
ii)将辅助噬菌体引入到所述宿主中，所述辅助噬菌体包括对噬菌体结构蛋白进行编码的核酸；以及
iii)在导致所述单链DNA被所述结构蛋白包装以从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒的条件下培养所述宿主。
12.一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的方法，所述方法包括：-
i)将以下引入到原核宿主细胞中：(a)第一载体，所述第一载体被配置成在所述原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；和(b)第二载体，所述第二载体包括对包装所述单链DNA所需的结构蛋白进行编码的核酸；以及
ii)在导致所述单链DNA被所述结构蛋白包装以从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒的条件下培养所述宿主。
13.一种药物组合物，其包括由根据权利要求10所述的系统产生的或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的重组噬菌粒病毒颗粒以及药学上可接受的媒剂。
14.一种用于制备根据权利要求13所述的药物组合物的方法，所述方法包括使治疗有效量的由根据权利要求10所述的系统产生的或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的重组噬菌粒颗粒与药学上可接受的媒剂接触。
15.一种用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达转基因的重组噬菌粒颗粒，其中所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述颗粒在使用时被配置成将所述核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得一个或多个细胞因子被表达，并且其中所述细胞因子为IL-4、IL-12、IL-15、TRAIL、IFN-γ、杂合TNFα或其任意组合中的任何一种，任选地，其中所述细胞因子为IL-15。
16.根据权利要求15所述的重组噬菌粒颗粒，其在治疗或诊断中使用。
17.一种用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达至少一个抗原的重组噬菌粒颗粒，所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子的核酸序列进行编码的转基因表达盒并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述颗粒在使用时被配置成将核酸序列递送到至少邻近所述靶肿瘤细胞，使得所述一个或多个细胞因子被表达。
18.根据权利要求17所述的重组噬菌粒颗粒，其在治疗或诊断中使用。
19.根据权利要求17所述的重组噬菌粒颗粒，其用于治疗、预防或改善癌症。
20.一种包括对病毒载体结构蛋白进行编码的核酸的辅助噬菌体的用途，其用于从原核宿主产生根据权利要求17所述的重组噬菌粒颗粒。
21.根据权利要求17所述的、由根据权利要求10所述的系统产生的、通过根据权利要求
11或12所述的方法产生的或根据权利要求20所述的用途产生的重组噬菌粒病毒颗粒，其中，所述重组噬菌粒颗粒用于产生包括或源自所述噬菌粒颗粒的基因组内的病毒基因组的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体用于将对一个或多个抗原进行编码的核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得一个或多个细胞因子被表达。
22.一种重组载体，其包括rAAV、rep-cap、adenohelper基因以及对一个或多个抗原或细胞因子进行编码的核酸序列，所述重组载体用于治疗、预防或改善癌症。
23.一种重组噬菌粒颗粒，其包括根据权利要求22所述的载体，所述重组噬菌粒颗粒在用于治疗、预防或改善癌症的方法中使用。
24.根据权利要求15或17所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的重组噬菌粒颗粒，其中所述噬菌粒颗粒被配置成将所述转基因表达盒递送到所述靶肿瘤细胞。
25.根据权利要求15、17或24所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求
14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述重组噬菌粒颗粒的所述基因组包括用于使所述噬菌粒基因组能够复制到单链DNA中的包装信号，所述单链DNA随后可以被包装到原核宿主内的所述噬菌粒颗粒中，任选地，其中所述包装信号包括复制起点，任选地F1 ori。
26.根据权利要求15、17、24或25所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述重组噬菌粒颗粒的所述基因组包括用于使双链载体能够在原核宿主内复制的复制起点，任选地pUC ori。
27.根据权利要求15、17、24到26中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述重组噬菌粒颗粒的所述基因组包括一个或多个有利于靶向整合到宿主基因组中的DNA序列。
28.根据权利要求15、17、24到27中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述至少一个转基因表达盒包括病毒转基因表达盒。
29.根据权利要求15、17、24到28中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其包括多个转基因表达盒。
30.根据权利要求15、17、24到29中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述至少一个转基因表达盒包括哺乳动物病毒转基因表达盒。
31.根据权利要求15、17、24到30中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述转基因表达盒包括在靶细胞中表达所述核酸所需的一个或多个功能元件，所述一个或多个功能元件选自由以下组成的组：启动子、用于对能够附着于经过表达的药剂的polyA尾进行编码的核酸以及左和/或右反向末端重复序列(ITR)或左和/或右长末端重复序列(LTR)。
32.根据权利要求15、17、24到31中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述至少一个转基因表达盒包括慢病毒转基因表达盒。
33.根据权利要求15、17、24到32中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述至少一个转基因表达盒包括腺相关病毒(AAV)转基因表达盒。
34.根据权利要求15、17、24到33中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的、供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述转基因表达盒进一步包括对在所述靶细胞或组织中具有治疗性或工业实用性的药剂进行编码的核酸，任选地，其中由所述核酸进行编码的所述药剂是多肽或蛋白质。
35.根据权利要求15、17、24到34中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述重组噬菌粒颗粒包括一个或多个衣壳次要外壳蛋白，任选地，其中所述重组噬菌粒颗粒包括pIII衣壳次要外壳蛋白，所述pIII衣壳次要外壳蛋白被配置成显示用于使所述颗粒能够递送到所述靶肿瘤细胞的细胞靶向性配体。
36.根据权利要求15、17、24到35中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述重组噬菌粒颗粒包括一个或多个衣壳主要外壳蛋白，任选地，其中所述重组噬菌粒颗粒包括至少一个pVIII衣壳主要外壳蛋白，所述pVIII衣壳主要外壳蛋白被配置成显示其上的外源肽。
37.根据权利要求15、17、24到36中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中所述重组噬菌粒颗粒与阳离子聚合物组合以形成具有净正电荷的复合物，任选地，其中所述阳离子聚合物选自由以下组成的组：壳聚糖；聚-D-赖氨酸(PDL)；二乙基氨基乙基(DEAE)；二乙基氨基乙基-葡聚糖(DEAE.DEX)；聚乙烯亚胺(PEI)；凝聚胺；硫酸鱼精蛋白；5和阳离子脂质。
38.根据权利要求15、17、24到37中任一项所述的、或由根据权利要求10所述的系统产生的、或通过根据权利要求11或12所述的方法产生的、或根据权利要求20或21所述的用途产生的或供根据权利要求1到9和22到23中任一项、或根据权利要求13所述的药物组合物、或根据权利要求14所述的用于制备药物组合物的方法使用的颗粒，其中：
a.所述重组噬菌粒颗粒的所述基因组缺少所源自的噬菌体基因组的至少60％、70％或至少80％；
b.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述重组噬菌粒颗粒的所述基因组缺少所源自的噬菌体基因组的至少90％、95％或至少99％；或
c.根据前述权利要求中任一项所述的颗粒，其中所述噬菌粒颗粒在其基因组中缺少从原核宿主形成、包装或挤出颗粒所需的噬菌体结构基因，优选地对所述衣壳蛋白进行编码的结构基因。

说明书全文

癌症治疗

[0001] 本发明涉及癌症治疗，并且具体地说，涉及新颖噬菌粒颗粒和相关表达系统的用途，其用于治疗、预防、改善或管理癌症。具体地说，本发明涉及噬菌粒颗粒和表达系统的用途，其用于递送对细胞因子进行编码的转基因以治疗、预防、改善或管理癌症。本发明还扩展到噬菌粒颗粒和表达系统的用途，其用于递送转基因并用于将这种治疗与过继转移的T细胞的使用进行组合以治疗、预防、改善或管理癌症。
[0002] 小儿高级别胶质瘤是一组异质性肿瘤，其占儿童的所有小儿中枢神经系统(CNS)肿瘤的15％-20％。肿瘤可以源自CNS内的任何位点。当肿瘤从脑干(具体地说，脑桥)产生时，其被称为DIPG。诊断基于成像和组织学外观。尽管进行了许多临床试验，但预后仍然很差，2年生存率低于10％，这使肿瘤成为儿童脑癌相关死亡的主要原因之一。鉴于肿瘤的位置，肿瘤是不可操作的，并且常规分次放射仍然是提供临时益处的主要治疗方法，没有其它治疗显示出任何优于常规放射治疗的功效。因此，在DIPG中对常规治疗的不良反应需要创新的治疗方法。
[0003] 近年来，已经致力于研究作为特异性地靶向肿瘤细胞并引起抗肿瘤活性的基于生物机制的技术的基因疗法。传统上一直设想基因疗法用于治疗先天性疾病，但是基因疗法越来越多地用于癌症治疗以提高共同施用治疗(如化学疗法和放射疗法)的效率，并且直接诱导肿瘤细胞中的死亡。考虑到缺乏对健康组织和肿瘤组织之间进行区分的常规癌症治疗产生的许多副作用，通过靶向载体递送治疗基因提供了更多的特异性和安全性。
[0004] 癌症免疫基因治疗中适用各种细胞因子基因，如白细胞介素(IL-4、IL-12和IL-15)和肿瘤坏死因子α(TNFα)和TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。TRAIL是TNF家族的成员，其在各种癌细胞系中诱导细胞凋亡，对正常组织具有高耐受性和最小毒性。局部和全身注射TRAIL蛋白均对小鼠的人肿瘤异种移植发挥抗肿瘤作用。然而，全身施用后TRAIL的快速清除和实现肿瘤消退所需的大剂量限制了患者的TRAIL有效性。本发明公开的颗粒对于TRAIL基因在癌症中的有效递送和持续表达是理想的且成本有效的。在小鼠癌症模型中，IL-4在诱导抗肿瘤作用方面是有效的。此外，当通过对流增强递送(CED)进行肿瘤内注射时，启动I期临床试验以确定IL-4在复发性人恶性胶质瘤中的安全性和耐受性。在任何患者中均未发现对正常大脑具有神经毒性的组织学证据，并且在任何受治疗的患者中均未发现与药物相关的全身性毒性。9名患者中有6名患者出现胶质瘤坏死，并且1名患者在手术后超过18个月仍然为患疾病。然而，再次，实现功效所需的大蛋白质剂量和成本以及颅内递送的侵入性具有重要的局限性。
[0005] 在过去的二十年中，IL-12已成为各种临床前模型中介导抗肿瘤活性的最有效细胞因子之一。通过对形成肿瘤微环境的不同免疫细胞的多效性，IL-12在先天性免疫和适应性免疫之间建立了联系，其涉及不同的免疫效应细胞和细胞因子，这取决于肿瘤的类型或受影响的组织。尽管IL-12对肿瘤细胞没有直接作用，但其改善了介导肿瘤溶解的细胞毒性T和NK效应细胞的活化。此外，IL-12改善Th1细胞应答，诱导包含IFN-γ在内的一组细胞因子，并显示出抗血管生成作用。在小鼠中，安全地完成IL-12基因的局部瘤内腺病毒载体递送，其显著延长动物存活并诱导肿瘤大小的显著消退。
[0006] 最近，颅内注射对IL-12进行编码的重组rAAV载体被用于大鼠模型中的脑肿瘤基因治疗，并导致与活化的小胶质细胞的诱导增加相关的抗肿瘤作用。最后，TNFα直接通过细胞凋亡或间接通过免疫调节活动显示出强大的抗肿瘤细胞作用；其还靶向并破坏肿瘤新生血管形成。
[0007] 白细胞介素15参与重要的免疫抗肿瘤机制的发展。其它激活CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NK T细胞，并且可以促进抗肿瘤抗体的形成。IL-15还可以保护T效应细胞免受T调节细胞的作用和对肿瘤相关抗原的逆转耐受性。
[0008] IL-15在肿瘤免疫治疗中的优势源于其独特的激活重要的抗肿瘤免疫机制的能力，包含NK细胞和CD8+T细胞的发育和活性，以及通过其对记忆T细胞的作用促进持久的免疫应答。而且，与IL-2相比，IL-15在诱导Treg细胞活性方面毒性较低且功效较低，并且在某些情况下其甚至可以保护人效应T细胞免受Treg细胞的作用。IL-15在国家癌症研究所的肿瘤免疫治疗中具有最大潜在用途的药剂名单中名列前茅，并且重组人IL-15在患有难治性转移性黑素瘤和转移性肾细胞癌的成人中的首次临床研究目前正在招募患者(http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01021059)。
[0009] 通过用IL-15处理显著改善了结肠癌小鼠的存活率，并通过程序性死亡配体1(PD-L1)阻断进一步改善了这一存活率。尽管如此，基于IL-15的应用以及PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的阻断的组合形式治疗已经实现了最大的治疗效果。
[0010] 不幸的是，尽管抱有很高的期望，虽然IL-15显示出治疗转移性恶性肿瘤的功效，但其缺乏体内生化稳定性是一个关键的限制性问题。临床试验中的全身性rhIL-15细胞因子具有非常短的血浆半衰期(<1小时)和快速肾清除，这容易导致功效阻抗。此外，全身施用rhIL15有可能引起毒副作用，包含诱导自身免疫。
[0011] 对于降低毒性和增加功效而言理想的是将IL-15直接递送到肿瘤中而不是全身施用。然而，难以实施直接注射到肿瘤块中或在过继细胞转移中掺入IL-15作为转基因。多个转移位点的存在或转导细胞的过度生长和潜在的白血病转化实际上可能限制治疗相关性。
[0012] 在基因治疗方法中发现了延长IL-15生物利用度时间窗的另一种解决方案。基因治疗的优势包含局部区域生产、产生融合构建的能力以及组合策略的多功能性。不幸的是，由于肝脏和网状内皮系统的不期望的摄取、插入诱变、与补体系统或预先存在的抗体的反应产生的免疫原性以及哺乳动物细胞的广泛趋向性，使用真核病毒的全身递送取得了有限的成功。可以通过将组织特异性配体添加到病毒衣壳蛋白中以介导靶组织上的配体-受体相互作用来修饰病毒趋向性。然而，将这些配体添加到真核病毒中可以改变病毒衣壳的结构，这可以降低功效并降低肽本身的靶向特性。
[0013] 因此，虽然上述细胞因子适用于癌症免疫治疗，但大多数涉及细胞因子的临床试验由于缺乏导致全身毒性的肿瘤选择性而未能显示持续的抗肿瘤反应。
[0014] 因此，需要用于在免疫肿瘤治疗中递送细胞因子的改进方法。
[0015] 在第一方面，提供了一种在用于治疗、预防或改善癌症的方法中使用的用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达转基因的重组噬菌粒颗粒，其中所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述方法包括将所述核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得一个或多个细胞因子被表达。
[0016] 在优选的实施例中，所述转基因表达盒可以对细胞因子进行编码，所述细胞因子可以具有以下效果：在所述肿瘤细胞中进行凋亡诱导、改变所述肿瘤细胞以促进内源性抗肿瘤应答、改变所述肿瘤细胞以促进其它治疗或改变肿瘤微环境以促进治疗。
[0017] 在特别优选的实施例中，所述细胞因子可以为IL-4、IL-12、IL-15、TNFα、TRAIL、IFN-γ或其任何组合。优选地，所述细胞因子为IL-15，优选地，所述细胞因子为IL-4。优选地，所述细胞因子为IL-12。优选地，所述细胞因子为TRAIL。优选地，所述细胞因子为IFN-γ。在一个优选的实施例中，所述细胞因子不是TNFα。
[0018] 然而，在另一个优选的实施例中，所述细胞因子为TNFα。优选地，所述细胞因子为包括非内源性信号肽的杂合TNFα，所述非内源性信号肽被配置成增加TNFα的表达和/或分泌。优选地，所述信号肽为除TNFα信号肽之外的细胞因子信号肽。例如，所述信号肽优选为IL-2信号肽。
[0019] 因此，在一个实施例中，TNFα的跨膜结构域被除TNFα信号肽之外的细胞因子信号肽(优选为IL-2信号肽)替换。在另一个实施例中，将不同于本发明的任何其它细胞因子的信号肽(优选IL-2信号肽)与本发明的任何其它细胞因子组合，使得所得杂合细胞因子的表达和/或分泌增加。具体地说，所述杂合细胞因子可以为杂合IL-4、IL-12、IL-15、TRAIL或IFN-γ中的任何一种。
[0020] 杂合IL-2-TNFα序列涉及替换TNFα的跨膜结构域，使对分泌形式的TNFα进行编码的序列与IL-2的信号肽保持一致，从而产生显示出更多表达和/或分泌型杂合TNFα。
[0021] 技术人员将理解的是，“信号肽序列”可以涉及N端序列，所述N端序列用于指导将蛋白质易位到细胞膜并且调节蛋白质的分泌。
[0022] 具体地说，技术人员将理解的是，“非内源性信号肽序列”可以涉及细胞因子信号肽(如白细胞介素)，其不同于所表达的细胞因子的信号肽。
[0023] 技术人员将理解的是，“杂合细胞因子”可以涉及包括非内源性信号肽序列的细胞因子。
[0024] 在一个实施例中，包括跨膜结构域的全长TNFα具有本文提供为SEQ ID No:12的氨基酸序列，如下：
[0025] 5′
[0026] MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL 3′
[0027]                                      [SEQ ID No:12]
[0028] 对包括跨膜结构域的全长TNFα进行编码的核酸序列可在本文中表示如下：
[0029] 5′
[0030] ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAGACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA 3′
[0031]                                   [SEQ ID No:13]
[0032] 在一个实施例中，分泌形式的TNFα具有本文提供为SEQ ID No:18的氨基酸序列，如下：
[0033] VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
[0034]                                    [SEQ ID No:18]
[0035] 在一个实施例中，对分泌形式的TNFα进行编码的核酸序列可在本文中表示如下：
[0036] 5′
[0037] GTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA 3′
[0038]                                   [SEQ ID No:19]
[0039] 在一个实施例中，IL-2信号肽具有本文提供为SEQ ID No:20的氨基酸序列，如下：
[0040] MYRMQLLSCIALSLALVTNS
[0041]                                  [SEQ ID No:20]
[0042] 在一个实施例中，对IL-2信号肽进行编码的核酸序列可在本文中表示为SEQ ID No:21，如下：
[0043] 5′ATGTACAGAATGCAACTCCTGTCTTGTATTGCACTAAGTCTCGCACTTGTCACAAACAGT 3′[0044]                                 [SEQ ID No:21]
[0045] 因此，在一个实施例中，杂合IL-2-TNFα具有本文提供为SEQ ID No:22的氨基酸序列，如下：
[0046] MYRMQLLSCIALSLALVTNSESVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
[0047]                                [SEQ ID No:22]
[0048] 因此，在一个实施例中，对杂合IL-2-TNFα进行编码的核酸序列可在本文中表示为SEQ ID No:23，如下：
[0049] 5′
[0050] ATGTACAGAATGCAACTCCTGTCTTGTATTGCACTAAGTCTCGCACTTGTCACAAACAGTGAATTCGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGCCCTGTGA 3′
[0051]                                        [SEQ ID No:23]
[0052] 因此，在一个实施例中，所述一个或多个细胞因子包括SEQ ID No:12、18、20和22中任一个的氨基酸序列或其片段或变体。
[0053] 优选地，所述一个或多个细胞因子包括基本上如SEQ ID No:22所阐述的氨基酸序列或其片段或变体。
[0054] 因此，在一个实施例中，对所述一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列包括SEQ ID No:13、19、21和23中的任一个或其片段或变体。
[0055] 优选地，对所述一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列包括SEQ ID No:23或其片段或变体。
[0056] 在第二方面，提供了一种治疗、预防或改善受试者的癌症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一方面所述的重组噬菌粒颗粒。
[0057] 根据第二方面所述的方法可以用于控制受试者的癌症。
[0058] 在一个实施例中，所述重组噬菌粒颗粒用于治疗、预防或改善小儿脑肿瘤。在其它实施例中，所述重组噬菌粒颗粒用于治疗、预防或改善弥漫性内源性脑桥胶质瘤(DIPG)或成神经管细胞瘤。
[0059] 在第三方面，提供了一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的系统，所述系统包括：-
[0060] (i)第一载体，所述第一载体被配置成在原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；以及
[0061] (ii)第二载体，所述第二载体包括核酸，所述核酸对包装所述单链DNA所需的结构蛋白进行编码，从而导致从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒。
[0062] 在第四方面，提供了一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的方法，所述方法包括：-
[0063] (i)将第一载体引入到原核宿主细胞中，所述第一载体被配置成在所述原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；
[0064] (ii)将辅助噬菌体引入到所述宿主中，所述辅助噬菌体包括对噬菌体结构蛋白进行编码的核酸；以及
[0065] (iii)在导致所述单链DNA被所述结构蛋白包装以从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒的条件下培养所述宿主。
[0066] 在第五方面，提供了一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的方法，所述方法包括：-
[0067] (i)将以下引入到原核宿主细胞中：(a)第一载体，所述第一载体被配置成在所述原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；和(b)第二载体，所述第二载体包括对包装所述单链DNA所需的结构蛋白进行编码的核酸；以及
[0068] (ii)在导致所述单链DNA被所述结构蛋白包装以从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒的条件下培养所述宿主。
[0069] 在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，其包括由根据第三方面所述的系统产生的或通过第四或第五方面的方法产生的重组噬菌粒病毒颗粒以及药学上可接受的媒剂。
[0070] 在第七方面，本发明还提供了一种用于制备根据第六方面所述的药物组合物的过程，所述过程包括使治疗有效量的由根据第三方面所述的系统产生或通过根据第四或第五方面所述的方法产生的重组噬菌粒颗粒与药学上可接受的媒剂接触。
[0071] 在本发明的另一个方面，提供了一种用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达转基因的重组噬菌粒颗粒，其中所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒，并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述颗粒在使用时被配置成将所述核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得一个或多个细胞因子被表达，并且其中所述细胞因子为IL-4、IL-12、IL-15、TRAIL、IFN-γ、杂合TNFα或其任意组合中的任何一种。
[0072] 优选地，所述细胞因子为IL-15，优选地，所述细胞因子为IL-4。优选地，所述细胞因子为IL-12。优选地，所述细胞因子为TRAIL。优选地，所述细胞因子为IFN-γ。
[0073] 优选地，所述细胞因子为包括非内源性信号肽的杂合TNFα，所述非内源性信号肽被配置成增加TNFα的表达和/或分泌。优选地，所述信号肽为除TNFα信号肽之外的细胞因子信号肽。例如，所述信号肽优选为IL-2信号肽。
[0074] 在另一个实施例中，将不同于本发明的任何其它细胞因子的信号肽(优选IL-2信号肽)与本发明的任何其它细胞因子组合，使得所得杂合细胞因子的表达和/或分泌增加。具体地说，所述杂合细胞因子可以为杂合IL-4、IL-12、IL-15、TRAIL或IFN-γ中的任何一种。
[0075] 在优选的实施例中，所述转基因表达盒可以对细胞因子进行编码，所述细胞因子可以具有以下效果：在所述肿瘤细胞中进行凋亡诱导、改变所述肿瘤细胞以促进内源性抗肿瘤应答、改变肿瘤细胞以促进其它治疗或改变肿瘤微环境以促进治疗。
[0076] 在另一方面，提供了一种在治疗或诊断中使用的用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达转基因的重组噬菌粒颗粒，其中所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒，并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述颗粒在使用时被配置成将所述核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得一个或多个细胞因子被表达，并且其中所述细胞因子为IL-4、IL-12、IL-15、TRAIL、IFN-γ、杂合TNFα或其任意组合中的任何一种。
[0077] 优选地，所述细胞因子为IL-15，优选地，所述细胞因子为IL-4。优选地，所述细胞因子为IL-12。优选地，所述细胞因子为TRAIL。优选地，所述细胞因子为IFN-γ。
[0078] 优选地，所述细胞因子为包括非内源性信号肽的杂合TNFα，所述非内源性信号肽被配置成增加TNFα的表达和/或分泌。优选地，所述信号肽为除TNFα信号肽之外的细胞因子信号肽。例如，所述信号肽优选为IL-2信号肽。
[0079] 在另一个实施例中，将不同于本发明的任何其它细胞因子的信号肽(优选IL-2信号肽)与本发明的任何其它细胞因子组合，使得所得杂合细胞因子的表达和/或分泌增加。具体地说，所述杂合细胞因子可以为杂合IL-4、IL-12、IL-15、TRAIL或IFN-γ中的任何一种。
[0080] 还需要用于治疗癌症的改进方法，以便与过继转移疗法(如CAR T细胞疗法)一起使用。发明人已经在实施例中显示，可以使用本文所述的颗粒通过CAR T细胞可识别的抗原等装饰或标记肿瘤细胞。
[0081] 因此，根据本发明的第八方面，提供了一种用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达至少一个抗原的重组噬菌粒颗粒，所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对由一个或多个过继转移的T细胞识别的一个或多个抗原进行编码的核酸序列的转基因表达盒，并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述颗粒在使用时被配置成将所述核酸序列递送到至少邻近所述靶肿瘤细胞，使得所述一个或多个抗原被表达并被一个或多个过继转移的T细胞识别。
[0082] 在第九方面，提供了根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒，其在治疗或诊断中使用。
[0083] 在第十方面，提供了根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒，其用于治疗、预防或改善癌症。
[0084] 有利地，使用本发明的颗粒靶向细胞因子和抗原到肿瘤细胞的递送和表达导致更大的肿瘤杀伤效力，并降低与常规疗法相关的脱靶效应。
[0085] 发明人开发了特别有利于将抗原或细胞因子递送到肿瘤细胞的新的载体和系统(所谓的“杂合噬菌粒病毒载体系统”)。提供了一种所谓的噬菌粒颗粒，其被称为噬菌粒/腺相关病毒体(即PAAV)。发明人对他们创造的新载体使用的另一个名称是“噬菌粒”。本文提供了一种噬菌体引导的细胞因子疗法。本文还提供了一种噬菌体引导的CAR T细胞疗法。
[0086] 与由插入到丝状噬菌体基因组中的rAAV盒组成的现有技术的AAVP基因组(《自然实验手册(Nature protocols)》2,523-531(2007)；《细胞(Cell)》125,385-398(2006))不同，本发明的PAAV基因组不具有含有任何结构噬菌体(噬菌体)基因，并因此需要原核辅助噬菌体病毒来促进宿主中的载体组装。这是有利的，因为AAVP仍具有噬菌体的某些固有限制，并因此总体上为AAVP或噬菌体载体的显著改善留下空间。例如，AAVP是两种病毒种类(即，噬菌体和AAV)之间的杂合体，AAVP载体含有真核病毒和原核病毒两者的基因组。尽管原核基因组对于AAVP病毒繁殖是必需的，但原核基因组在功能上或治疗上是无关紧要的。因此，包含噬菌体病毒基因组有害地影响载体效率和生产方法，并且最终导致与哺乳动物病毒相比，AAVP的基因转导效力相对较低。
[0087] 有利地，将杂合病毒载体(例如AAV或慢病毒)重新改造到根据第八或任何上述方面所述的噬菌粒颗粒中显著增强了所得载体(即噬菌粒颗粒)的功能特性，所述噬菌粒颗粒基本上缺乏衍生颗粒的噬菌体基因组。将病毒表达系统更改为根据本发明的基于噬菌粒的系统扩展了在更广泛的背景下应用噬菌粒病毒载体的可能性。通过从颗粒的基因组中消除至少50％的噬菌体基因组(其构成基因组大小的50％以上)，所得到的噬菌粒颗粒的粒径显著降低。
[0088] 术语“噬菌粒颗粒”可以指代被噬菌体衍生的外壳蛋白包封的杂合噬菌粒基因组。杂合噬菌粒基因组是“噬菌粒基因组”(即含有两个复制起点的基因构建体——一个来自噬菌体(例如F1)，一个来自细菌(例如pUC1))。在一个实施例中，噬菌粒基因组可以含有掺入的“来自AAV的重组转基因盒”(rAAV)，并且因此所述噬菌粒基因组是杂合体而不是具有正常(即通用类非病毒)重组转基因表达盒的常规噬菌粒基因组。噬菌粒颗粒可以指代已经被源自反式作用剂的噬菌体蛋白(如辅助噬菌体)包封的杂合噬菌粒基因组(即本发明)。
[0089] 在允许能够结合非常大或多个转基因盒的同时，这些较小的噬菌粒颗粒还在增强基因转移、生产产率、生物分布和逃避真核细胞屏障方面显示出额外的优势。使用本发明的噬菌粒颗粒的另一个显著优点是，噬菌粒颗粒具有容纳极大和众多转基因盒或基因插入物的能力，如用于通过转染产生重组病毒(例如rAAV或慢病毒)的三种质粒的基因，如下所述。因此，通过在单个或多个噬菌粒载体中组合用于病毒生产的基因组分，已经设计了有效的商业化规模的病毒生产基因递送系统。因此，优选地，颗粒包括多个转基因盒。
[0090] 在一个实施例中，重组噬菌粒颗粒用于治疗未暴露于递送的一个或多个抗原的受试者，例如通过预先接种疫苗。
[0091] 在一个实施例中，噬菌粒颗粒被优选地配置成将转基因表达盒递送到与靶肿瘤细胞相邻的细胞，使得核酸序列被表达，由此产生所述或每个抗原或细胞因子，然后抗原可以与靶肿瘤细胞结合或附着于肿瘤细胞。
[0092] 然而，在优选的实施例中，噬菌粒颗粒被配置成将转基因表达盒递送到靶肿瘤细胞。优选地，所述或每个抗原是在靶肿瘤细胞的细胞表面上表达的肽或蛋白质。优选地，所述或每个抗原是肽或蛋白质，当由肿瘤细胞表达时，所述肽或蛋白质可以被CAR T细胞接近。肽或蛋白质可能是这样的，当由肿瘤细胞表达时，其在细胞表面处或细胞表面上作为折叠的肽蛋白存在。
[0093] 在本发明的第十一方面，提供了一种用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达至少一个抗原的重组噬菌粒颗粒，所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码的核酸序列的转基因表达盒，并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述颗粒在使用时被配置成将所述核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得所述一个或多个细胞因子被表达。
[0094] 在第十二方面，提供了根据第十一方面所述的重组噬菌粒颗粒，其在治疗或诊断中使用。
[0095] 在第十三方面，提供了根据第十一方面所述的重组噬菌粒颗粒，其用于治疗、预防或改善癌症。
[0096] 在第十四方面，提供了一种治疗、预防或改善受试者的癌症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据第十一方面所述的重组噬菌粒颗粒。
[0097] 在第十五方面，提供了一种包括对病毒载体结构蛋白进行编码的核酸的辅助噬菌体的用途，其用于从原核宿主产生根据第十一方面所述的重组噬菌粒颗粒。
[0098] 在第十六方面，提供了根据第十一方面所述的重组噬菌粒病毒颗粒，其由根据第三方面所述的系统产生、通过根据第四或第五方面所述的方法产生或根据第十五方面所述的用途产生，其中所述重组噬菌粒颗粒用于产生包括或源自所述噬菌粒颗粒的基因组内的病毒基因组的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体用于将对一个或多个抗原进行编码的核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，使得一个或多个细胞因子被表达。
[0099] 在第十七方面，提供了一种重组载体，其包括rAAV、rep-cap、adenohelper基因以及对一个或多个抗原或细胞因子进行编码的核酸序列，所述重组载体用于治疗、预防或改善癌症。
[0100] 在第十八方面，提供了一种包括根据第十七方面所述的载体的重组噬菌粒颗粒，其在用于治疗、预防或改善癌症的方法中使用。
[0101] 所述或每个抗原可以是适用于人类的现有CAR T细胞的已知靶标。例如，所述或每个抗原可以选自由以下组成的组：MUC1；PSMA；CD19；CD20；雌激素相关受体β2型(ErRB2)；或其任何组合。所述或每个抗原可以为MUC1或PSMA。
[0102] 在一个实施例中，对合适抗原(例如MUC1.CD28.IL4)进行编码的核酸序列可在本文中表示如下：
[0103] ATGGCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAACCGCCCCTCCAGCCCACGGAGTGACCAGCGCCCCTGACACCCGGCCTGCTCCTGGAAGCACAGCTCCACCTGCCCACGGCGTTACCTCTGCACCAGATACTAGGCCTGCTCCAGGCTCCATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGCGGAGCAAGAGGAGAAAGCGCAGCGGTTCCGGCGAGGGCCGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCTATGGGCCTGACCAGCCAGCTTCTGCCCCCCCTGTTCTTCCTGCTGGCCTGCGCCGGCAACTTCGTGCACGGCCACAAGTGCGACATCACCCTGCAGGAGATCATCAAGACCCTGAACAGCCTGACCGAGCAGAAGACCCTGTGCACCGAGCTGACCGTGACCGACATCTTCGCCGCCAGCAAGAACACCACCGAGAAGGAGACCTTCTGCCGGGCCGCCACCGTGCTGCGGCAGTTCTACAGCCACCACGAGAAGGACACCCGGTGCCTGGGCGCCACCGCCCAGCAGTTCCACCGGCACAAGCAACTGATCCGGTTCCTGAAGCGGCTGGACCGGAACCTGTGGGGCCTGGCCGGCCTGAACAGTTGCCCCGTGAAGGAGGCCAACCAGAGCACCCTGGAGAACTTCCTGGAGCGGCTGAAGACCATCATGCGGGAGAAGTACAGCAAGTGCAGCAGCTAG
[0104]                                               [SEQ ID NO:14]
[0105] 在另一个实施例中，对抗原(例如MUC1.GPI.IL4)进行编码的核酸序列可在本文中表示如下：
[0106] ATGGCTCTCCCAGTGACTGCCCTACTGCTTCCCCTAGCGCTTCTCCTGCATGCAACCGCCCCTCCAGCCCACGGAGTGACCAGCGCCCCTGACACCCGGCCTGCTCCTGGAAGCACAGCTCCACCTGCCCACGGCGTTACCTCTGCACCAGATACTAGGCCTGCTCCAGGCTCCCCCAACAAGGGCAGCGGCACAACCAGCGGAACCACCAGGCTGTTGAGCGGCCACACCTGCTTCACCCTGACAGGCCTGCTGGGCACCCTGGTGACAATGGGCCTGCTGACCAGGAGAAAGCGCAGCGGTTCCGGCGAGGGCCGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCTATGGGCCTGACCAGCCAGCTTCTGCCCCCCCTGTTCTTCCTGCTGGCCTGCGCCGGCAACTTCGTGCACGGCCACAAGTGCGACATCACCCTGCAGGAGATCATCAAGACCCTGAACAGCCTGACCGAGCAGAAGACCCTGTGCACCGAGCTGACCGTGACCGACATCTTCGCCGCCAGCAAGAACACCACCGAGAAGGAGACCTTCTGCCGGGCCGCCACCGTGCTGCGGCAGTTCTACAGCCACCACGAGAAGGACACCCGGTGCCTGGGCGCCACCGCCCAGCAGTTCCACCGGCACAAGCAACTGATCCGGTTCCTGAAGCGGCTGGACCGGAACCTGTGGGGCCTGGCCGGCCTGAACAGTTGCCCCGTGAAGGAGGCCAACCAGAGCACCCTGGAGAACTTCCTGGAGCGGCTGAAGACCATCATGCGGGAGAAGTACAGCAAGTGCAGCAGCTAG
[0107]                                               [SEQ ID NO:15]
[0108] 在又另一个实施例中，对抗原(例如PSMA)进行编码的核酸序列可在本文中表示如下：
[0109] ATGTGGAACCTGCTGCACGAGACTGACAGCGCCGTGGCAACCGCACGGAGACCCCGGTGGCTGTGCGCTGGCGCACTGGTGCTGGCCGGCGGGTTCTTTCTGCTGGGGTTCCTGTTTGGATGGTTTATCAAAAGCTCCAACGAGGCCACCAATATTACACCTAAGCACAATATGAAAGCATTCCTGGATGAACTGAAGGCCGAGAACATCAAGAAATTCCTGTACAACTTTACTCAGATTCCACATCTGGCTGGCACCGAGCAGAACTTTCAGCTGGCAAAACAGATCCAGAGCCAGTGGAAGGAATTCGGGCTGGACTCCGTGGAGCTGGCCCACTACGATGTCCTGCTGAGTTATCCAAATAAGACACATCCCAACTATATCTCAATCATTAACGAAGACGGAAATGAGATTTTCAACACTTCACTGTTTGAACCCCCTCCACCCGGCTACGAGAACGTGAGCGACATCGTCCCTCCATTCTCAGCCTTTAGCCCACAGGGAATGCCTGAGGGGGATCTGGTGTACGTCAATTATGCTCGCACCGAAGACTTCTTTAAGCTGGAGCGAGATATGAAAATCAACTGTAGCGGCAAGATCGTGATTGCCAGATACGGCAAAGTGTTTCGCGGGAATAAGGTCAAAAACGCTCAGCTGGCCGGGGCTAAGGGAGTGATTCTGTACTCTGACCCCGCTGATTATTTCGCACCTGGAGTGAAGAGTTATCCAGACGGATGGAATCTGCCAGGAGGAGGAGTGCAGCGAGGAAACATCCTGAACCTGAATGGGGCCGGAGATCCTCTGACCCCAGGATACCCCGCCAACGAATACGCTTATAGGCGAGGAATTGCAGAGGCAGTGGGACTGCCTTCCATCCCAGTCCACCCCATTGGCTACTATGACGCCCAGAAGCTGCTGGAGAAAATGGGAGGCTCTGCTCCCCCTGATTCTAGTTGGAGAGGCAGTCTGAAGGTGCCTTACAATGTCGGCCCAGGGTTCACAGGGAACTTTTCAACTCAGAAGGTGAAAATGCACATCCATAGCACTAATGAAGTGACCAGGATCTATAACGTCATTGGAACTCTGCGAGGCGCCGTGGAGCCTGACAGATACGTCATTCTGGGGGGACACCGCGACTCCTGGGTGTTTGGCGGGATCGATCCACAGTCTGGCGCCGCTGTGGTCCATGAAATTGTGCGGTCTTTCGGCACACTGAAGAAAGAGGGGTGGAGACCCCGACGGACTATCCTGTTTGCAAGTTGGGATGCCGAGGAATTCGGCCTGCTGGGGAGTACAGAATGGGCCGAGGAAAATTCACGGCTGCTGCAGGAGAGAGGGGTGGCTTACATCAATGCAGACTCAAGCATTGAAGGAAACTATACACTGCGGGTGGATTGCACTCCCCTGATGTACAGCCTGGTCCACAACCTGACCAAGGAGCTGAAATCCCCTGACGAGGGATTCGAAGGCAAAAGCCTGTATGAATCCTGGACAAAGAAAAGTCCATCACCCGAGTTTAGCGGAATGCCTCGAATCTCTAAGCTGGGAAGTGGCAATGATTTCGAAGTGTTCTTTCAGAGACTGGGGATTGCCTCCGGAAGAGCTAGGTACACCAAAAATTGGGAGACAAACAAGTTCTCCGGCTACCCACTGTATCACAGCGTGTACGAGACTTATGAACTGGTCGAGAAATTCTACGACCCCATGTTTAAGTATCATCTGACCGTGGCACAGGTCAGGGGAGGCATGGTGTTTGAGCTGGCCAATTCCATCGTCCTGCCATTCGACTGTAGAGATTATGCTGTGGTCCTGAGGAAGTACGCAGACAAAATCTATAGCATTTCCATGAAACATCCCCAGGAGATGAAGACCTACTCTGTGAGTTTCGATTCCCTGTTTTCTGCCGTCAAAAACTTCACAGAAATCGCTAGTAAGTTTTCAGAGCGCCTGCAGGACTTCGATAAGTCTAATCCCATTGTGCTGAGGATGATGAACGACCAGCTGATGTTCCTGGAACGCGCCTTTATCGACCCTCTGGGGCTGCCTGATCGCCCCTTCTACCGACACGTGATCTACGCACCTTCCTCTCATAACAAGTACGCCGGAGAGTCTTTTCCAGGCATCTATGACGCTCTGTTCGATATTGAATCAAAGGTCGATCCCAGCAAAGCATGGGGCGAGGTCAAGAGACAGATCTACGTGGCAGCCTTCACCGTCCAGGCTGCAGCCGAAACACTGAGCGAGGTGGCCTGA
[0110]                                            [SEQ ID NO:16]
[0111] 因此，优选地，转基因包括基本上如SEQ ID No:14-16中任一个所阐述的核酸序列或其片段或变体。
[0112] 在又另一个实施例中，抗原可以包含括或源自基本上如SEQ ID No:17所阐述的氨基酸序列(例如MUC1，Genbank登录号：P15941)或其片段或变体：mtpgtqspff llllltvltv vtgsghasst pggeketsat qrssvpsste knavsmtssv lsshspgsgs sttqgqdvtl apatepasgs aatwgqdvts vpvtrpalgs ttppahdvts apdnkpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdtrpapgs tappahgvts apdnrpalgs tappvhnvts asgsasgsas tlvhngtsar atttpaskst pfsipshhsd tpttlashst ktdassthhs svppltssnh stspqlstgv sffflsfhis nlqfnssled pstdyyqelq rdisemflqi ykqggflgls nikfrpgsvv vqltlafreg tinvhdvetq fnqykteaas rynltisdvs vsdvpfpfsa qsgagvpgwg iallvlvcvl valaivylia lavcqcrrkn ygqldifpar dtyhpmseyp tyhthgryvp psstdrspye kvsagnggss lsytnpavaa tsanl
[0113]                                               [SEQ ID NO:17]
[0114] 在一些实施例中，将一种抗原类型或种类或细胞因子递送到至少邻近靶肿瘤细胞。在其它实施例中，将两种或更多种抗原类型或种类或细胞因子递送到至少邻近肿瘤细胞。两个或更多个抗原或细胞因子可以通过同一个重组噬菌粒颗粒递送，或者其可以通过两个或更多个重组噬菌粒颗粒单独递送。
[0115] 在一个实施例中，所述或每个抗原可以是已经开发CAR T细胞的自身抗原。自身抗原可以被视为由受试者的非肿瘤组织表达的抗原，并且这些抗原已经用作CAR T细胞的靶标并且适合用于本发明。
[0116] 然而，在优选的实施例中，所述或每个抗原可以是已经开发CAR T细胞的完全非自身抗原。非自身抗原可以包含由肿瘤新表达的新生抗原，并且这些新生抗原也已用作CAR T细胞的靶标并且也适用于本发明。非自身抗原可以包含已经开发CAR T细胞的外来抗原，所述外来抗原不由受试者的任何组织表达。此类外来抗原可能是有利的，因为所述治疗可能导致由靶向表达靶抗原的非肿瘤组织而引起的较少的“脱靶”效应。
[0117] 在一个实施例中，所述或每个抗原可以源自登革热病毒或源自黄热病病毒。
[0118] 在优选的实施例中，在进一步包括过继转移的T细胞的用途的方法中使用重组噬菌粒颗粒。过继转移的T细胞可以对由重组噬菌粒颗粒引入靶肿瘤细胞的所述或每个抗原具有特异性。优选地，过继转移一种以上类型的T细胞。优选地，所述一种以上类型的T细胞对相同抗原或不同抗原具有特异性。
[0119] 优选地，识别至少邻近靶肿瘤细胞表达的一个或多个抗原的过继转移的T细胞选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)T细胞；T细胞受体(TCR)转基因T细胞；和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TCR转基因T细胞可以对与所述或每个引入的抗原相关的表位具有特异性。TIL可以源自已知含有对已知抗原具有特异性的淋巴细胞的组织。
[0120] 然而，最优选地，过继转移的T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。CAR T细胞可以对由重组噬菌粒颗粒引入肿瘤细胞的所述或每个抗原具有特异性。
[0121] 在最优选的实施例中，重组噬菌粒颗粒用于包括以下的方法中：由重组噬菌粒颗粒特异性靶向肿瘤细胞并随后将一个或多个对一个或多个抗原或细胞因子进行编码的序列递送到肿瘤细胞以便通过肿瘤细胞进行表达，以及关于抗原，转移对一个或多个递送的抗原具有特异性的CAR T细胞并随后激活肿瘤细胞的毒性以便治疗、预防或改善癌症。
[0122] 在一个实施例中，CAR T细胞可以是双特异性CAR T细胞，其可以对由一个或多个重组噬菌粒颗粒递送的一个或多个抗原具有特异性。例如，单一类型或种类的重组噬菌粒颗粒可以递送由单一类型的双特异性CAR T细胞识别的两个或更多个抗原。
[0123] 优选地，噬菌粒颗粒包括病毒体。图3展示了重组噬菌粒颗粒的基因组的一个优选实施例，图4-6中示出了优选组分。
[0124] 优选地，重组噬菌粒颗粒的基因组包括用于使噬菌粒基因组能够复制到单链DNA中的包装信号，所述单链DNA随后可以被包装到原核宿主内的所述噬菌粒颗粒中。包装信号可以优选地包括复制起点。例如，复制起点优选地包括F1ori，更优选地来自F1噬菌体。F1ori的一个实施例的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:1，如下：
[0125] ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTT
[0126]                                                        [SEQ ID NO:1][0127] 优选地，重组噬菌粒颗粒的基因组包括用于使双链载体能够在原核宿主内复制的复制起点。优选地，复制起点使得能够在宿主内对载体进行高拷贝数复制。优选地，复制起点包括pUC ori。pUC ori的一个实施例的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:2，如下：
[0128] TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA
[0129]                                                             [SEQ ID NO:2]
[0130] 可替代地，在另一个实施例中，可设计噬菌粒颗粒使得其被整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下，设想了有利于颗粒基因组的靶向整合(例如通过同源重组)的核酸序列。因此，重组噬菌粒颗粒的基因组可以包括一个或多个有利于靶向整合到宿主基因组中的DNA序列。
[0131] 在另一个实施例中，优选地，噬菌粒颗粒可以用作用于将转基因递送到组织特异性靶标(例如肿瘤组织)的重组载体，而不管载体是否在体内全身或局部地施用于受试者。
[0132] 优选地，至少一个转基因表达盒包括病毒转基因表达盒，更优选地，哺乳动物病毒转基因表达盒。例如，在一个优选的实施例中，所述至少一个转基因表达盒可以包括慢病毒转基因表达盒。至少一个转基因表达盒优选是腺相关病毒(AAV)转基因表达盒。
[0133] 转基因表达盒可以包括对所述或每个抗原或细胞因子进行编码的任何核酸，所述核酸在靶肿瘤细胞或组织中表达。在本发明的一个实施例中，核酸可以是DNA，其可以是基因组DNA或cDNA。在一些实施例中，非天然存在的cDNA可能是优选的。在另一个实施例中，核酸可以是RNA，如反义RNA或shRNA。
[0134] 如在说明性实例7中所示，噬菌粒可以用于将基因递送到肿瘤细胞。在这个实例中，用携带对mTOR/shRNA(RGD4C-mTOR/shRNA)进行编码的序列的RGD4C-噬菌粒进行处理可以实现肿瘤细胞(例如成神经管细胞瘤细胞)中mTOR表达的下调。实例7提供了使用噬菌粒将基因递送到肿瘤细胞的另一个说明性实例。如实例7中所示，RGD4C-噬菌粒可以以选择性方式成功地将TNFα递送到DIPG(弥漫性内源性脑桥胶质瘤)，从而导致细胞凋亡诱导。因此，RGD4C-噬菌粒具有在使用细胞因子针对DIPG的靶向治疗中使用的治疗潜力
[0135] 然而，应当理解的是，重组噬菌粒颗粒靶向的肿瘤细胞类型取决于可以在颗粒表面上表达的细胞靶向性配体的类型。下文讨论了细胞靶向性配体。
[0136] 转基因表达盒可以包括在靶肿瘤细胞中表达核酸所需的一个或多个功能元件。例如，优选地，转基因表达盒包括启动子，如CMV启动子。CMV启动子的一个实施例的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:3，如下：
[0137] ACGCGTGGAGCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGTCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCC
[0138]                                                     [SEQ ID NO:3][0139] 在另一个优选的实施例中，转基因表达盒包括仅在靶肿瘤细胞中有活性的启动子。因此，启动子可以是肿瘤激活的和/或替莫唑胺诱导的。
[0140] 在一个实施例中，启动子可以是多药抗性启动子(MDR)，其在癌细胞中高度活跃。这种启动子可以被癌症药物激活，产生P-gp和ABC转运蛋白，使药物从细胞中流出。这种启动子可以与癌症药物组合用于基因治疗。
[0141] 在另一个实施例中，启动子可以是人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子。这种启动子仅在肿瘤细胞中有活性，但在正常增殖细胞中不活跃。因此，这种启动子可以用作肿瘤特异性启动子。
[0142] 在优选的实施例中，转基因表达盒包括grp78启动子。grp78启动子的一个实施例的核酸序列在本文中表示为SEQ ID No:8，如下：
[0143] CCCGGGGGCCCAACGTGAGGGGAGGACCTGGACGGTTACCGGCGGAAACGGTTTCCAGGTGAGAGGTCACCCGAGGGACAGGCAGCTGCTCAACCAATAGGACCAGCTCTCAGGGCGGATGCTGCCTCTCATTGGCGGCCGTTAAGAATGACCAGTAGCCAATGAGTCGGCTGGGGGGCGCGTACCAGTGACGTGAGTTGCGGAGGAGGCCGCTTCGAATCGGCAGCGGCCAGCTTGGTGGCATGAACCAACCAGCGGCCTCCAACGAGTAGCGAGTTCACCAATCGGAGGCCTCCACGACGGGGCTGCGGGGAGGATATATAAGCCGAGTCGGCGACCGGCGCGCTCGATACTGGCTGTGACTACACTGACTTGGAC
[0144]                                                     [SEQ ID NO:8][0145] 优选地，转基因表达盒包括用于对能够附着于所述或每个表达的抗原或细胞因子的polyA尾巴进行编码的核酸。用于对polyA尾巴进行编码的核酸的一个实施例的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:4，如下：
[0146] ACGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTT
[0147]                                                        [SEQ ID NO:4][0148] 优选地，转基因表达盒包括左和/或右反向末端重复序列(ITR)。ITR可以特异于慢病毒血清型特异性的AAV或长末端重复序列(LTR)，并且可以是任何序列，只要其在其二级结构中形成发夹环。例如，AAV血清型可以是AAV1-9，但优选为AAV1、AAV2、AAV5、AAV6或AAV8。ITR的一个实施例(来自市售AAV质粒的左ITR)的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:5，如下：
[0149] CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
[0150]                                                          [SEQ ID NO:5]
[0151] ITR的另一个实施例(来自市售AAV质粒的右ITR)的DNA序列在本文中表示为SEQ ID No:6，如下：
[0152] AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG[0153]                                                 [SEQ ID NO:6]
[0154] 优选地，重组噬菌粒颗粒的基因组包括选择标记物，这将取决于携带载体的宿主细胞，例如用于在宿主细胞(优选为细菌)中赋予氨苄青霉素抗性。标记物在宿主细胞中产生噬菌粒颗粒期间提供选择压力。
[0155] 优选地，重组噬菌粒颗粒包括一个或多个衣壳次要外壳蛋白。重组噬菌粒颗粒可以包括pIII衣壳次要外壳蛋白，所述pIII衣壳次要外壳蛋白被配置成显示用于使所述颗粒能够递送到所述靶肿瘤细胞的细胞靶向性配体。优选地，重组噬菌粒颗粒包括一个或多个衣壳主要外壳蛋白。重组噬菌粒颗粒可以包括至少一个pVIII衣壳主要外壳蛋白，所述pVIII衣壳主要外壳蛋白被配置成显示其上的外源肽。
[0156] 重组噬菌粒颗粒可以包括例如通过处理，或化学或生物化学缀合对衣壳结构进行的修饰。合适的修饰的实例可以包含将肽残基交联到噬菌粒颗粒上。在另一个实施例中，重组噬菌粒颗粒可以包括与其衣壳连接的一个功能肽。例如，功能肽可以包括核易位信号。因此，噬菌粒颗粒可以是多功能的，并且使用WO 2014/184528中公开的特征。
[0157] 在另一个实施例中，重组噬菌粒颗粒可以与阳离子聚合物组合以形成具有净正电荷的复合物，如WO 2014/184529中所述。阳离子聚合物可以选自由以下组成的组：壳聚糖；聚-D-赖氨酸(PDL)；二乙基氨基乙基(DEAE)；二乙基氨基乙基-葡聚糖(DEAE.DEX)；聚乙烯亚胺(PEI)；凝聚胺；硫酸鱼精蛋白；和阳离子脂质。优选地，阳离子脂质选自由lipofectamine 和DOTAP(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫酸盐)组成的组。优选地，阳离子聚合物包括DEAE，更优选地包括DEAE.DEX。
[0158] 优选地，噬菌粒颗粒包括基本上缺乏衍生颗粒的噬菌体基因组的基因组。优选地，重组噬菌粒颗粒的基因组缺少所源自的噬菌体基因组的至少60％、更优选至少70％、甚至更优选80％。更优选地，重组噬菌粒颗粒的基因组缺少所源自的噬菌体基因组的至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％。优选地，重组噬菌粒颗粒的基因组缺乏衍生其的所有噬菌体基因组。然而，如上所述，在一些实施例中，噬菌粒病毒颗粒的基因组可以包括用于使所述颗粒能够复制到单链DNA中的复制噬菌体起点，即F1噬菌体起点。
[0159] 优选地，噬菌粒颗粒包括相对基因组大小小于14Kb的基因组。相对基因组大小可以小于约13Kb、小于约12Kb、小于约11Kb、小于约10Kb、小于约9Kb、小于约8Kb或小于约7Kb。相对基因组大小可以介于3Kb到9Kb之间、4Kb到8Kb之间、5Kb到7Kb之间，或优选地大约为
6Kb。
[0160] 优选地，噬菌粒颗粒在其基因组中缺乏从原核宿主形成、包装或挤出颗粒所需的噬菌体结构基因。这种结构基因对衣壳蛋白等进行编码。优选地，噬菌粒颗粒包括缺乏对衍生颗粒的次要或主要外壳蛋白进行编码的基因的基因组。优选地，噬菌粒颗粒包括缺乏pIII衣壳次要外壳蛋白的基因组，或缺乏pVIII衣壳主要外壳蛋白的基因组。最优选地，噬菌粒颗粒包括缺乏pIII衣壳次要外壳蛋白和pVIII衣壳主要外壳蛋白的基因组。
[0161] 因此，重组噬菌粒颗粒优选地包括从结构组分构建并显示结构组分的复制缺陷型病毒样颗粒或病毒体，包含但不限于源自噬菌体的蛋白质和其它缀合化合物，尽管颗粒的基因组中不含有衍生颗粒的噬菌体的结构基因。
[0162] 因此，鉴于根据第八或任何上述方面所述的重组噬菌粒颗粒的基因组缺乏衍生型噬菌体基因组(包含结构基因)，需要替代系统以提供将重组噬菌粒基因组包装在噬菌体衣壳中以产生本发明的颗粒所必需的结构(即衣壳)基因。因此，发明人设计了一种用于产生根据第八或任何上述方面所述的颗粒的新系统，所述新系统包含使用单独的所谓“辅助病毒”载体。因此，实际上，根据第八或任何上述方面所述的颗粒是杂合噬菌粒载体，其包含噬菌粒和真核病毒的组分。
[0163] 因此，在第十九方面，提供了一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的系统，所述系统包括：-
[0164] (i)第一载体，所述第一载体被配置成在原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码或对由一个或多个过继转移的T细胞识别的一个或多个抗原进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；以及
[0165] (ii)第二载体，所述第二载体包括核酸，所述核酸对包装所述单链DNA所需的结构蛋白进行编码，从而导致从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒。
[0166] 有利地，将噬菌粒颗粒的繁殖元件分离成携带对由所述或每个过继转移的T细胞识别的所述或每个抗原或细胞因子进行编码的转基因的第一“治疗”载体和携带病毒结构基因的第二单独的“辅助”载体显著降低基因组/载体大小，并由此显著增加转基因能力。噬菌粒颗粒用于治疗(例如在CAR-T细胞疗法中)，并且增加的转基因能力对于新系统的基因治疗应用是特别有用的优势。因此，这导致生产产率、基因转导效率和用于其它应用的载体系统的灵活性增强。
[0167] 根据第十九方面所述的系统的新颖性在于其能够将由第一载体提供的真核病毒(如AAV或慢病毒)的基因组包装到由第二载体提供的原核病毒衣壳(即噬菌体)中。因此，尽管现有技术系统(即AAVP)是两个基因组的嵌合体，但根据第十九方面所述的系统(即PAAV)是原核病毒表型与真核病毒基因型之间的嵌合体。
[0168] 抗原可以是本文所公开的任何抗原。在优选的实施例中，所述或每个抗原是在靶肿瘤细胞的细胞表面上表达的肽或蛋白质。优选地，所述或每个抗原是肽或蛋白质，当由肿瘤细胞表达时，所述肽或蛋白质可以被CAR T细胞接近。肽或蛋白质可能是这样的，当由肿瘤细胞表达时，其在细胞表面处或细胞表面上作为折叠的肽蛋白存在。所述或每个抗原可以是适用于人类的现有CAR T细胞的已知靶标。例如，所述或每个抗原可以选自由以下组成的组：MUC1；PSMA；CD19；CD20；雌激素相关受体β2型(ErRB2)；或其任何组合。在一个实施例中，所述或每个抗原可以是登革热病毒或黄热病疫苗抗原。
[0169] 优选地，根据第十九方面所述的系统用于产生根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒。因此，第一载体优选地包括重组噬菌粒颗粒的基因组。第一载体的包装信号可以优选地包括复制起点。优选地，第一载体中的复制起点包括F1ori，更优选地来自F1噬菌体。
[0170] 优选地，第一载体包括用于使双链载体能够在原核宿主内复制的第二复制起点。优选地，复制起点使得能够在宿主内对载体进行高拷贝数复制。优选地，复制起点包括pUC ori。可替代地，第一载体可以包括一个或多个有利于靶向整合到宿主基因组中的DNA序列，从而因此消除了对任何复制起点的要求。
[0171] 转基因表达盒包括病毒转基因表达盒，更优选地，哺乳动物病毒转基因表达盒。例如，所述至少一个转基因表达盒可以包括慢病毒转基因表达盒或AAV转基因表达盒。AAV转基因表达盒是优选的。
[0172] 图7中展示了第二载体的一个优选实施例，图8中示出了优选组分。第二载体或“辅助噬菌体”优选是被改造成专门用于从原核宿主中拯救携带第一载体(即噬菌粒颗粒的基因组)的噬菌粒颗粒的噬菌体，其实施例如图3所示。因此提供第二载体(即辅助噬菌体)以将其蛋白质和多肽借给第一载体(即噬菌粒颗粒的基因组)或任何含有功能包装信号和/或单链复制起点的其它DNA实体。第二载体最优选为复制缺陷型。优选地，第二载体包括破坏的包装信号，这显著地阻碍第二载体将其自身包装到噬菌体颗粒中的能力。优选地，第二载体包括破坏的复制起点。在一个实施例中，破坏的复制起点是中等拷贝数量的起点，如p15a。在另一个实施例中，破坏的复制起点是低拷贝数量的起点，如pMB1。优选地，第一载体(即噬菌粒颗粒的基因组)被配置成在复制和包装过程中与第二载体(即辅助噬菌体)竞争。
[0173] 可以改造第二载体的基因组以产生所得的重组噬菌粒颗粒靶向特性(或如WO 2014/184528中所述的多功能特性)。因此，其提供了用于噬菌粒颗粒组装的结构衣壳蛋白。
优选地，第二载体包括对一个或多个衣壳次要外壳蛋白或一个或多个衣壳主要外壳蛋白进行编码的核酸。所有衣壳蛋白可以是野生型或重组的，以单拷贝或多拷贝存在，并且经过修饰以显示嵌合肽或合成肽。这包含显示用于肽疫苗递送的其它病毒的抗原或在需要DNA疫苗(由根据第八方面所述的噬菌粒颗粒递送)的情况下作为佐剂的抗原。
[0174] 因此，在一个实例中，第二载体可以包括对pIII次要外壳蛋白进行编码的第一核酸序列，所述pIII次要外壳蛋白被配置成显示用于使重组噬菌粒颗粒能够递送到靶细胞(例如肿瘤)的细胞靶向性配体。因此，可能令人期望的是在重组噬菌粒颗粒的pIII次要外壳蛋白中诱导9-氨基酸突变，以便赋予其对表达αvβ3和αvβ5整联蛋白的肿瘤细胞和血管生成肿瘤相关内皮细胞的特异性。因此，第二载体的基因组可以包括RGD4C靶向性肽(CDCRGDCFC–SEQ ID No:7)。
[0175] 在另一个实例中，第二载体可以包括对至少一个pVIII衣壳主要外壳蛋白进行编码的第二核酸序列，所述pVIII衣壳主要外壳蛋白被配置成显示其上的外源肽。因此，可能令人期望的是在重组噬菌粒颗粒的野生pVIII主要外壳蛋白中诱导突变，以便显示例如长度小于10个氨基酸的短肽。短肽可以是靶向部分和/或在体内或体外具有固有的生物学/化学功能。例如，通过抗原显示在体内进行免疫刺激，其中在pVIII外壳蛋白上显示的肽可以通过外源途径处理并呈递在靶细胞的MHC II上，从而因此呈现过继转移的T细胞的另一个靶标。可替代地，所述至少一个pVIII主要外壳蛋白可以通过显示金结合肽而对例如体外纳米颗粒(例如金)具有结合功能。
[0176] 第一载体可以是逆转录病毒科或正反转录病毒亚科的成员。第一载体可以是慢病毒属的成员。优选地，第一载体是细小病毒科或亚科的成员。优选地，第一载体是依赖病毒属或腺相关病毒属的成员。
[0177] 一旦构建了第一载体(即噬菌粒颗粒的基因组)和第二载体(即辅助噬菌体)，它们就一起用于在原核宿主中产生根据第八或任何上述方面所述的重组噬菌粒颗粒。应当理解的是，用于使所述噬菌粒基因组能够复制到单链DNA中的第一载体的包装信号(例如复制起点)的功能是向第二载体(即辅助噬菌体)结构蛋白发出信号使其包装噬菌粒基因组(即它们在宿主中以反式形式一起工作)以产生在第八或任何上述方面中使用的颗粒。
[0178] 在一个优选的实施例中，第一载体(噬菌粒颗粒基因组)包括基本上如SEQID No:9所阐述的核酸序列或其片段或变体，其中SEQ ID No:9表示如下，其中“N”是转基因：
[0179] CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCNAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT
[0180]                                          [SEQ ID No:9]
[0181] 在一个优选的实施例中，第二载体(具有RGD序列的辅助噬菌体)包括基本上如SEQ ID No:10所阐述的核酸序列或其片段或变体，其中SEQ ID No:10表示如下：
[0182] AACGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTACATGGAATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAGCTACAGCACCAGATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTGTTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTGGTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCCCAATTTACTACTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTTGTGATTGTAGGGGGGATTGTTTTTGTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGGTATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGATTTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAGGTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTGTTACTGTATATTCATCTGACGTTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCTAATAATTTTGATATGGTTGGTTCAATTCCTTCCATAATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTCGGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCACCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTCTACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCG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[0183]                                              [SEQ ID No:10]
[0184] 在一个优选的实施例中，第二载体(不具有RGD序列的辅助噬菌体)包括基本上如SEQ ID No:11所阐述的核酸序列或其片段或变体，其中SEQ ID No:11表示如下：
[0185] AACGCTACTACTATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTACATGGAATGAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAGCTACAGCACCAGATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTCTCTAATCCTGACCTGTTGGAGTTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAAGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCGTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACTATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCTTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTTTATCGTCGTCTGGTAAACGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACTATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAATGTGGTATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTTCTACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCACAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCCCAATTTACTACTCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTTCTTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTTCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCTCAATTACCCTCTGACTTTGTTCAGGGTGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAATAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTATATCTGATTTGCTTGCTATTGGGCGCGGTAATGATTCCTACGATGAAAATAAAAACGGCTTGCTTGTTCTCGATGAGTGCGGTACTTGGTTTAATACCCGTTCTTGGAATGATAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTACATGCTCGTAAATTAGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGACTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACATGTTGTTTATTGTCGTCGTCTGGACAGAATTACTTTACCTTTTGTCGGTACTTTATATTCTCTTATTACTGGCTCGAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGCGTTGTTAAATATGGCGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTGTATAACGCATATGATACTAAACAGGCTTTTTCTAGTAATTATGATTCCGGTGTTTATTCTTATTTAACGCCTTATTTATCACACGGTCGGTATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATTGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCACTCACATATATTGATTTATGTACTGTTTCCATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAGGTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTTGTAACTTGGTATTCAAAGCAATCAGGCGAATCCGTTATTGTTTCTCCCGATGTAAAAGGTACTGTTACTGTATATTCATCTGACGTTAAACCTGAAAATCTACGCAATTTCTTTATTTCTGTTTTACGTGCTAATAATTTTGATATGGTTGGTTCAATTCCTTCCATAATTCAGAAGTATAATCCAAACAATCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATAATCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACTTTTAAAATTAATAACGTTCGGGCAAAGGATTTAATACGAGTTGTCGAATTGTTTGTAAAGTCTAATACTTCTAAATCCTCAAATGTATTATCTATTGACGGCTCTAATCTATTAGTTGTTAGTGCACCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCTCAATTCCTTTCTACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAGGGTTTGATATTTGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCATTTGCTGCTGGCTCTCAGCGTGGCACTGTTGCAGGCGGTGTTAATACTGACCGCCTCACCTCTGTTTTATCTTCTGCTGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAATGGCGATGTTTTAGGGCTATCAGTTCGCGCAT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[0186]                                                   [SEQ ID No:11][0187] 根据第十九方面所述的系统可以用于生产根据本文公开的任何用途使用的颗粒。颗粒可以根据第二、第九或第十方面使用。在一个实施例中，所产生的重组噬菌粒颗粒用于治疗未暴露于递送的一个或多个抗原的受试者，例如通过预先接种疫苗。
[0188] 在一个实施例中，在进一步包括一个或多个过继转移的T细胞的用途的方法中使用由根据第十九方面所述的系统产生的重组噬菌粒颗粒。优选地，过继转移的T细胞选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)T细胞；T细胞受体(TCR)转基因T细胞；和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。过继转移的T细胞可以对由重组噬菌粒颗粒引入肿瘤细胞的一个或多个抗原具有特异性。在优选的实施例中，过继转移的T细胞是CAR T细胞。
[0189] 如实例1中所述，发明人设计了用于在原核宿主中产生本发明的重组噬菌粒颗粒的两种替代方法(参见图9和10)。
[0190] 因此，在第十二方面，提供了一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的方法，所述方法包括：-
[0191] (i)将第一载体引入到原核宿主细胞中，所述第一载体被配置成在原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码或对由一个或多个过继转移的T细胞识别的一个或多个抗原进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；
[0192] (ii)将辅助噬菌体引入到所述宿主中，所述辅助噬菌体包括对噬菌体结构蛋白进行编码的核酸；以及
[0193] (iii)在导致所述单链DNA被所述结构蛋白包装以从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒的条件下培养所述宿主。
[0194] 有利地，所述方法(如图9中所示)导致非常高的颗粒产率。例如通过感染可以将第一载体(即噬菌粒颗粒的基因组)引入宿主细胞。然后可以用辅助噬菌体转化宿主细胞，这导致重组噬菌粒颗粒的产生。优选地，所述方法包括在培养步骤之后的纯化步骤。纯化可以包括离心和/或过滤。
[0195] 抗原可以是本文所公开的任何抗原。在优选的实施例中，所述或每个抗原是在靶肿瘤细胞的细胞表面上表达的肽或蛋白质。优选地，所述或每个抗原是肽或蛋白质，当由肿瘤细胞表达时，所述肽或蛋白质可以被CAR T细胞接近。肽或蛋白质可能是这样的，当由肿瘤细胞表达时，其在细胞表面处或细胞表面上作为折叠的肽蛋白存在。所述或每个抗原可以是适用于人类的现有CAR T细胞的已知靶标。例如，所述或每个抗原可以选自由以下组成的组：MUC1；PSMA；CD19；CD20；雌激素相关受体β2型(ErRB2)；或其任何组合。在一个实施例中，所述或每个抗原可以是登革热病毒或黄热病疫苗抗原。
[0196] 细胞因子可以是本文所公开的任何细胞因子。具体地说，所述细胞因子可以为IL-4、IL-12、IL-15、TNFα、TRAIL、IFN-γ或其任何组合。优选地，所述细胞因子为IL-15，优选地，所述细胞因子为IL-4。优选地，所述细胞因子为IL-12。优选地，所述细胞因子为TRAIL。
优选地，所述细胞因子为IFN-γ。
[0197] 优选地，所述细胞因子不是TNFα。优选地，所述细胞因子为TNFα。优选地，所述细胞因子为包括非内源性信号肽的杂合TNFα，所述非内源性信号肽被配置成增加TNFα的表达和/或分泌。优选地，所述信号肽为除TNFα信号肽之外的细胞因子信号肽。
[0198] 优选地，根据第二十方面所述的方法用于产生根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒。因此，第一载体优选地包括重组噬菌粒颗粒的基因组。第一载体的包装信号可以优选地包括复制起点。优选地，第一载体中的复制起点包括F1ori，更优选地来自F1噬菌体。
[0199] 根据第二十方面所述的方法可以用于生产根据本文公开的任何用途使用的颗粒。颗粒可以根据第二、第九或第十方面使用。在一个实施例中，所产生的重组噬菌粒颗粒用于治疗未暴露于递送的一个或多个抗原的受试者，例如通过预先接种疫苗。
[0200] 在一个实施例中，在进一步包括一个或多个过继转移的T细胞的用途的方法中使用通过根据第二十方面所述的方法产生的重组噬菌粒颗粒。优选地，过继转移的T细胞选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)T细胞；T细胞受体(TCR)转基因T细胞；和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。过继转移的T细胞可以对由重组噬菌粒颗粒引入肿瘤细胞的一个或多个抗原具有特异性。在优选的实施例中，过继转移的T细胞是CAR T细胞。
[0201] 在第二十一方面，提供了一种用于从原核宿主产生重组噬菌粒颗粒的方法，所述方法包括：-
[0202] (i)将以下引入到原核宿主细胞中：(a)第一载体，所述第一载体被配置成在所述原核宿主内持续存在并且包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码或对由一个或多个过继转移的T细胞识别的一个或多个抗原进行编码的核酸序列的转基因表达盒以及用于使所述载体能够复制到单链DNA中的包装信号；和(b)第二载体，所述第二载体包括对包装所述单链DNA所需的结构蛋白进行编码的核酸；以及
[0203] (ii)在导致所述单链DNA被所述结构蛋白包装以从所述原核宿主形成并挤出重组噬菌粒颗粒的条件下培养所述宿主。
[0204] 有利地，所述方法(如图10中所示)导致改进的安全性。例如通过感染可以将第二载体(即辅助噬菌体)引入宿主细胞。然后可以用第一载体(即噬菌粒颗粒的基因组)转化宿主细胞，这导致重组噬菌粒颗粒的产生。优选地，所述方法包括在培养步骤之后的纯化步骤。纯化可以包括离心和/或过滤。
[0205] 抗原可以是本文所公开的任何抗原。在优选的实施例中，所述或每个抗原是在靶肿瘤细胞的细胞表面上表达的肽或蛋白质。优选地，所述或每个抗原是肽或蛋白质，当由肿瘤细胞表达时，所述肽或蛋白质可以被CAR T细胞接近。肽或蛋白质可能是这样的，当由肿瘤细胞表达时，其在细胞表面处或细胞表面上作为折叠的肽蛋白存在。所述或每个抗原可以是适用于人类的现有CAR T细胞的已知靶标。例如，所述或每个抗原可以选自由以下组成的组：MUC1；PSMA；CD19；CD20；雌激素相关受体β2型(ErRB2)；或其任何组合。在一个实施例中，所述或每个抗原可以是登革热病毒或黄热病疫苗抗原。
[0206] 细胞因子可以是本文所公开的任何细胞因子。具体地说，所述细胞因子可以为IL-4、IL-12、IL-15、TNFα、TRAIL、IFN-γ或其任何组合。优选地，所述细胞因子为IL-15。优选地，所述细胞因子为IL-4。优选地，所述细胞因子为IL-12。优选地，所述细胞因子为TRAIL。
优选地，所述细胞因子为IFN-γ。
[0207] 优选地，所述细胞因子不是TNFα。优选地，所述细胞因子为TNFα。优选地，所述细胞因子为包括非内源性信号肽的杂合TNFα，所述非内源性信号肽被配置成增加TNFα的表达和/或分泌。优选地，所述信号肽为除TNFα信号肽之外的细胞因子信号肽。
[0208] 优选地，根据第二十一方面所述的方法用于产生根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒。因此，第一载体优选地包括重组噬菌粒颗粒的基因组。第一载体的包装信号可以优选地包括复制起点。优选地，第一载体中的复制起点包括F1ori，更优选地来自F1噬菌体。
[0209] 根据第二十一方面所述的方法可以用于生产用于本文公开的任何用途的重组噬菌粒颗粒。颗粒可以根据第二、第九或第十方面使用。在一个实施例中，重组噬菌粒颗粒用于治疗未暴露于递送的一个或多个抗原的受试者，例如通过预先接种疫苗。
[0210] 在一个实施例中，在进一步包括一个或多个过继转移的T细胞的用途的方法中使用通过根据第二十一方面所述的方法产生的重组噬菌粒颗粒。优选地，过继转移的T细胞选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)T细胞；T细胞受体(TCR)转基因T细胞；和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。过继转移的T细胞可以对由重组噬菌粒颗粒引入肿瘤细胞的一个或多个抗原具有特异性。在优选的实施例中，过继转移的T细胞是CAR T细胞。
[0211] 在第二十二方面，提供了一种包括对病毒载体结构蛋白进行编码的核酸的辅助噬菌体的用途，其用于从原核宿主产生根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒。
[0212] 提供了一种宿主细胞，其包括如第二十一方面所定义的第一和/或第二载体。
[0213] 宿主细胞优选是原核细胞，更优选是细菌细胞。合适的宿主细胞的实例包含：(i)- -TG1(基因型：K-12supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5,(rK mK ),质粒：F'[traD36proAB+lacIq lacZΔM15])，(ii)DH5αF′IQTM(基因型： Δ
(lacZYA-argF)U169recA1endA1hsdR17(rk-,mk+)phoA supE44λ-thi-1gyrA96relA1,质粒：
F′proAB+lacIqZΔM15zzf::Tn5[KmR]；和(iii)XL1-Blue MRF'(基因型：Δ(mcrA)183Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173endA1supE44thi-1recA1gyrA96relA1lac,质粒：F′proAB lacIqZΔM15Tn10(Tetr)。
[0214] 所述颗粒用于治疗或用于诊断方法中，优选在体内。
[0215] 由于本发明的重组噬菌粒颗粒具有靶特异性和改进的转导效率，本发明可以用于治疗多种癌症。因此，本发明可以显著增加基因治疗中使用的重组噬菌体的治疗机会，因为其具有携带一个或多个转基因表达盒的能力。本发明可以预防性地用于预防癌症，或在癌症产生后，用于改善、控制和/或治疗癌症。
[0216] 应当理解的是，本发明可以用于产生多种不同的重组噬菌粒颗粒，其可以用于治疗和/或诊断多种癌症，这取决于颗粒的性质和显示的外来蛋白质(如果是抗原)。应当理解的是，细胞因子可能不会在肿瘤细胞上显示。基因治疗技术中的靶细胞优选是真核细胞，并优选是哺乳动物。
[0217] 基因治疗技术用于治疗、预防、改善或管理癌症。肿瘤可以是液体肿瘤，如血液恶性肿瘤或血液形成组织，或恶性血液病。肿瘤可以是实体瘤。肿瘤可能在脑中，例如成神经管细胞瘤、胶质母细胞瘤或弥漫性脑桥脑胶质瘤(DIPG)。重组噬菌粒颗粒可以与常规治疗组合使用，如化学治疗药物(例如阿霉素、替莫唑胺、洛莫司汀、顺铂、长春新碱)、放射疗法或其它药物/异生素化合物，包含但不限于组蛋白脱乙酰酶的抑制剂(HDAC抑制剂)、蛋白酶体抑制药物(例如MG132、borzotemib、卡非佐米)和来自天然和膳食来源的抗癌产物(例如染料木黄酮、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、白藜芦醇)。
[0218] 重组噬菌粒颗粒还可以用于在主要pVIII外壳蛋白上直接显示和表达所关注的抗原，从而为单个噬菌体颗粒同时递送多个抗原或蛋白质或具有相关生物活性的蛋白质提供有效平台。受试者可以是哺乳动物，并且优选是人。
[0219] 应当理解的是，根据本发明的重组噬菌粒颗粒和系统(即下文称为“药剂”)可以在可用于单一疗法的药物中使用，或者作为用于治疗、改善、控制或预防癌症的已知疗法的辅助药物或与所述已知疗法组合使用。例如，使用本发明的噬菌粒颗粒和系统与现有化学治疗剂(如替莫唑胺、顺铂、阿霉素、长春新碱或染料木黄酮)的组合治疗方法是优选的。
[0220] 在另一个优选的实施例中，治疗可以包括本发明的重组噬菌粒颗粒和系统与细胞外基质降解剂(如酶或氯沙坦)的组合。发明人认为细胞外基质降解剂应该增强被治疗受试者中的噬菌粒扩散，并且特别是在实体瘤内。
[0221] 根据本发明的药剂(即，在第八或任何上述方面中使用的或由根据第十九方面所述的系统产生的重组噬菌粒颗粒)可以组合在具有多种不同形式的组合物中，具体地说，取决于使用所述组合物的方式。因此，例如，组合物可以为粉末、片剂、胶囊、液体等形式或可以施用于需要治疗的人或动物的任何其它合适的形式。应当理解的是，根据本发明的药物的媒剂应该是被施用药物的受试者能够良好耐受的媒剂。
[0222] 可以以多种方式使用包括根据本发明的药剂的药物。例如，可能需要口服施用，在这种情况下，药剂可以包含在可以例如以片剂、胶囊或液体的形式口服摄入的组合物中。包括本发明的药剂的组合物可以通过吸入(例如鼻内)施用。也可以配制组合物用于局部使用。例如，可以将乳膏或软膏施用于皮肤。
[0223] 也可以将根据本发明的药剂掺入慢速或延迟释放装置中。这种装置可以例如插入皮肤上或皮肤下，并且药物可以在数周或甚至数月内释放。所述装置可以至少定位在治疗位点附近。当需要用根据本发明使用的药剂进行长期治疗并且通常需要频繁施用(例如至少每日注射)时，这种装置可能是特别有利的。
[0224] 在一个优选的实施例中，根据本发明的药剂和组合物可以通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的位点而施用于受试者。注射可以是静脉内(推注或输注)、皮下(推注或输注)、皮内(推注或输注)或通过常规增强(对流增强递送——与疾病位点的局部注射相关)。
[0225] 应当理解的是，所需药剂的量由其生物活性和生物利用度、药剂(即重组噬菌粒病毒颗粒或系统)的生理化学性质以及其是用作单一疗法还是用于综合疗法决定，所述生物活性和生物利用度进而取决于施用方式。施用频率也将受到所治疗受试者内药剂的半衰期的影响。待施用的最佳剂量可以由本领域的技术人员确定，并且将随使用的特定药剂、药物组合物的强度、施用方式和疾病的进展而变化。取决于所治疗的特定受试者的其它因素将导致需要调整剂量，所述其它因素包含受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。
[0226] 通常，可以使用每日剂量介于0.01μg/kg体重与500mg/kg体重之间的本发明的药剂。更优选地，每日剂量介于0.01mg/kg体重与400mg/kg体重之间，更优选介于0.1mg/kg与200mg/kg体重之间。
[0227] 如实例中所讨论的，可以在疾病发作之前、期间或之后施用药剂。例如，可以在受试者患有疾病后立即施用药剂。每日剂量可以作为单次施用全身给药(例如每日一次注射)。可替代地，可能需要在一天内施用两次或更多次药剂。例如，药剂可以作为两个(或多个，取决于所治疗疾病的严重程度)介于25mg与7000mg之间(即假设体重为70kg)的每日剂量施用。接受治疗的患者可以在醒来时服用第一剂量，然后在晚上服用第二剂量(如果在两剂量方案下)或之后以3或4小时的间隔服用。可替代地，可以使用缓释装置向患者提供根据本发明的最佳剂量的药剂，而无需施用重复剂量。
[0228] 可以使用如制药工业常规采用的程序等已知程序(例如体内实验、临床试验等)来形成包括根据本发明的颗粒或系统的特定配制品和精确的治疗方案(如药剂的每日剂量和施用频率)。
[0229] 因此，在本发明的第二十三方面，提供了一种包括根据第八方面所述的重组噬菌粒病毒颗粒的药物组合物，其包括由根据第十九方面所述的系统产生、通过根据第二十或第二十一方面所述的方法产生或根据第二十二方面所述的用途产生的重组噬菌粒病毒颗粒以及药学上可接受的媒剂。
[0230] 在第二十四方面，本发明还提供了一种用于制备根据第二十三方面所述的药物组合物的过程，所述过程包括使治疗有效量的根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒与药学上可接受的媒剂接触，所述重组噬菌粒颗粒由根据第十九方面所述的系统产生、通过第二十或第二十一方面所述的方法产生或根据第二十二方面所述的用途产生。
[0231] “受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的药剂、组合物和药物可以用于治疗任何哺乳动物，例如家畜(例如马)、宠物，或者可以用于其它兽医应用。然而，最优选地，受试者是人。
[0232] “治疗有效量”的药剂(即重组噬菌粒病毒颗粒)是当施用于受试者时，治疗目标疾病所需的药物量，或产生所需效果(例如导致转基因有效递送到靶细胞或组织，如导致肿瘤杀伤)的任何量。
[0233] 例如，所用药剂的治疗有效量可以从约0.01mg到约800mg，并且优选从约0.01mg到约500mg。
[0234] 本文提及的“药学上可接受的媒剂”是本领域技术人员已知的任何已知化合物或已知化合物的组合，其可以用于配制药物组合物。
[0235] 在一个实施例中，药学上可接受的媒剂可以是固体，并且组合物可以为粉末或片剂的形式。固体的药学上可接受的媒剂可以包含一种或多种物质，所述物质也可以充当调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、涂料或片剂崩解剂。媒剂也可以是包封材料。在粉末中，媒剂是与根据本发明的细碎活性剂混合的细碎的固体。在片剂中，活性剂(例如本发明的颗粒或系统)可以与具有必要压缩性能的媒剂以合适的比例混合，并以期望的形状和大小进行压实。粉末和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固体媒剂包含例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一个实施例中，药物媒剂可以是凝胶，并且组合物可以为乳膏等形式。
[0236] 然而，药物媒剂可以是液体，并且药物组合物是溶液的形式。液体媒剂用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂和加压组合物。根据本发明的颗粒或系统可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体媒剂中，如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪。液体媒剂可以含有其它合适的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。用于口服和肠胃外施用的液体媒剂的合适实例包含水(部分含有如上所述的添加剂，例如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包含一元醇和多元醇，例如二醇)及其衍生物和油(例如，分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，媒剂也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒剂在用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物中是有用的。用于加压组合物的液体媒剂可以是卤代烃或其它药学上可接受的推进剂。
[0237] 可以通过例如肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内和特别是皮下注射来使用作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物。可以将颗粒或系统(即杂合载体)制备成无菌固体组合物，其可以在施用时使用无菌水、盐水或其它合适的无菌可注射介质进行溶解或悬浮。
[0238] 可以以含有其它溶质或悬浮剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以使溶液等渗)、胆汁盐、阿拉伯胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨糖醇的油酸酯及其与环氧乙烷共聚的酸酐)等的无菌溶液或悬浮液的形式口服施用本发明的重组噬菌粒颗粒、系统和药物组合物。也可以以液体或固体组合物的形式口服施用根据本发明的颗粒和系统。适于口服施用的组合物包含固体形式(如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉末)和液体形式(如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液)。可用于肠胃外施用的形式包含无菌溶液、乳液和悬浮液。
[0239] 应当理解的是，腺相关病毒(AAV)通常是基因治疗所选择的载体。作为基因传递载体，慢病毒载体与其它系统相比也具有关键的几个优点。慢病毒载体具有至少8Kb DNA的大包装容量，这在包装组织特异性启动子和转基因的大量表达盒时是重要的特征。此外，与腺病毒载体相比，慢病毒载体具有降低的免疫原性，使得可以考虑全身递送途径。然而，使用AAV或慢病毒进行实验室和临床研究的障碍包含其极高的生产成本和低产率。
[0240] 发明人已经表明，除了在基因治疗中表现出有用的应用之外，本发明的重组噬菌粒颗粒还可以用于体外或体内(包含原位)产生重组病毒载体，如AAV或慢病毒。噬菌体引导的AAV生产利用噬菌粒颗粒包装大量单链ssDNA的能力。典型的AAV生产系统由三个主要元件组成：rAAV、rep-cap和adenohelper基因，它们共同起作用以产生rAAV颗粒。
[0241] 因此，在第二十五方面，提供了根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒，其由根据第十九方面所述的系统产生、通过根据第二十或第二十一方面所述的方法产生或根据第二十二方面所述的用途产生，其中所述重组噬菌粒颗粒用于产生包括或源自所述噬菌粒颗粒的基因组内的病毒基因组的重组病毒载体，其中所述重组病毒载体用于将对一个或多个抗原或细胞因子进行编码的核酸序列递送到至少邻近肿瘤细胞，当序列对一个或多个抗原进行编码时，一个或多个抗原被表达并且可以被一个或多个过继转移的T细胞识别。
[0242] 可以产生重组病毒载体的重组噬菌粒颗粒可能是有利的，所述重组病毒载体进而对过继转移的T细胞(如CAR T细胞)识别的抗原进行编码。图16展示了核酸序列向恶性肿瘤的递送；病毒载体的产生使得肿瘤能够自动感染，使得核酸序列在整个肿瘤中递送。这可能是有利的，因为这使得过继转移的T细胞识别的抗原能够在整个肿瘤中递送。这与任何后续的过继转移疗法(如CAR T细胞疗法)协同作用，因为其为CAR T细胞提供了合适的靶标。此外，其可以允许使用较低浓度的引入载体(即重组噬菌粒颗粒)。
[0243] 在优选的实施例中，所述或每个抗原是在靶肿瘤细胞的细胞表面上表达的肽或蛋白质。优选地，所述或每个抗原是肽或蛋白质，当由肿瘤细胞表达时，所述肽或蛋白质可以被CAR T细胞接近。肽或蛋白质可能是这样的，当由肿瘤细胞表达时，其在细胞表面处或细胞表面上作为折叠的肽蛋白存在。所述或每个抗原可以是适用于人类的现有CAR T细胞的已知靶标。例如，所述或每个抗原可以选自由以下组成的组：MUC1；PSMA；CD19；CD20；雌激素相关受体β2型(ErRB2)；或其任何组合。在一个实施例中，所述或每个抗原可以是登革热病毒或黄热病疫苗抗原。
[0244] 根据第二十五方面所述的重组噬菌粒颗粒可以用于本文公开的任何用途。颗粒可以根据第二、第九或第十方面使用。在一个实施例中，重组噬菌粒颗粒用于治疗未暴露于递送的一个或多个抗原的受试者，例如通过预先接种疫苗。
[0245] 在一个实施例中，在进一步包括一个或多个过继转移的T细胞的用途的方法中使用第二十五方面的重组噬菌粒颗粒。优选地，过继转移的T细胞选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(CAR)T细胞；T细胞受体(TCR)转基因T细胞；和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。过继转移的T细胞可以对由重组噬菌粒颗粒引入肿瘤细胞的一个或多个抗原具有特异性。在优选的实施例中，过继转移的T细胞是CAR T细胞。
[0246] 还提供了一种用于生产重组病毒载体的方法，所述方法包括向真核宿主细胞中引入根据第八方面所述的重组噬菌粒颗粒或根据第十九方面所述的系统，并允许宿主细胞产生重组病毒载体。
[0247] 优选地，重组病毒产物是重组哺乳动物病毒，如AAV或慢病毒。优选地，病毒载体产物是rAAV。优选地，根据第八方面所述的噬菌粒病毒颗粒或根据第十九方面所述的系统与产生哺乳动物病毒(如通过噬菌粒颗粒的基因组所确定的)所需的其它遗传元件的递送和/或存在一起在真核宿主细胞内以顺式和/或反式形式使用。用于辅助或增强噬菌粒颗粒向宿主细胞的基因转移的方法包含WO 2014/184528(即多功能)和WO 2014/184529(即与阳离子聚合物组合以形成具有净正电荷的复合物)中描述的方法。
[0248] 真核宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以包含或源自人胚肾细胞(HEK293)、草地夜蛾蛹卵巢组织(Sf9)或中国仓鼠卵巢(CHO)。还设想了昆虫细胞。
[0249] 在一个实例中，可以用携带选自由以下组成的组的基因的一个或多个噬菌粒颗粒基因组转化宿主细胞：rAAV、慢病毒、衣壳、复制、对基因进行编码的辅助蛋白，以及表达和包装哺乳动物病毒所需的任何其它基因。
[0250] 例如，在杂合噬菌粒颗粒引导的rAAV生产中，rAAV基因可以由根据第八方面所述的重组噬菌粒病毒颗粒携带，如图3所示，并且adenohelper基因和rep-cap基因可以携带在分开的载体上，或整合到真核宿主基因组中。例如，图12示出了一个载体上的adenohelper基因，并且图13示出了分开的载体上的rep-cap基因。rAAV基因、rep-cap基因和adenohelper基因的任何组合可以携带在一个或多个载体上，即以顺式或反式配置。可替代地，在rAAV产生的情况下，rep-cap蛋白或adenohelper蛋白也可以作为稳定表达的辅助DNA(例如质粒)整合或引入真核宿主中，由此杂合噬菌粒颗粒提供重组病毒基因组以便包装如通过噬菌粒颗粒基因组内的转基因盒所确定的重组病毒。
[0251] 在一个优选的实施例中，rAAV基因、rep-cap基因和adenohelper基因携带在单一载体上，如图14和15所示。发明人认为这是所有三组基因第一次被携带在同一载体上。
[0252] 因此，在第二十六方面，提供了一种重组载体，其包括rAAV基因、rep-cap基因、adenohelper基因以及对一个或多个细胞因子进行编码或对由一个或多个过继转移的T细胞识别的一个或多个抗原进行编码的核酸序列，所述重组载体用于治疗、预防或改善癌症。
[0253] 重组载体可以用于本文公开的任何用途或方法。
[0254] 在第二十七方面，提供了一种重组噬菌粒颗粒，其包括根据第十二方面所述的载体，所述重组噬菌粒颗粒在用于治疗、预防或改善癌症的方法中使用。
[0255] 重组噬菌粒颗粒可以用于本文公开的任何用途或方法。
[0256] 提供了用于产生包括或源自所述噬菌粒颗粒的病毒基因组的重组AAV病毒载体的根据第二十六方面所述的载体或根据第二十七方面所述的颗粒的用途。
[0257] 提供了一种用于生产重组AAV病毒载体的方法，所述方法包括向真核宿主细胞中引入根据第二十六方面所述的载体或根据第二十七方面所述的颗粒，并允许宿主细胞产生重组病毒载体。
[0258] 在rAAV生产的背景下，当引入同一真核宿主细胞时(参见图11和14)，载体上的rep-cap基因和adenohelper基因表现为反式作用或顺式作用或两个元件的组合，其促进在AAV病毒衣壳中包装rAAV基因组。所述生产过程相当于多种质粒的瞬时共转染，并且通常涉及三种质粒。然而，在这个实施例中，质粒被靶向真核细胞(优选哺乳动物细胞)的本发明的重组噬菌粒颗粒替代，所述真核细胞也携带相同的元件。
[0259] 所述方法可以体内、体外、离体或原位进行。对于原位生产，重组噬菌粒颗粒优选地包括作为指定的真核宿主的靶真核细胞的靶向部分。优选地，在原位、离体和体内病毒产生的背景下，指定的真核宿主细胞类型是患病细胞。优选地，患病细胞是恶性或良性肿瘤。在体外病毒生产的背景下，优选地，真核宿主是上文列出的真核宿主的任何一个的衍生物。
可以以如前所述的任何方式(顺式作用或反式作用的组合)在真核宿主细胞内应用重组噬菌粒颗粒和产生重组病毒(如通过杂合噬菌粒颗粒中的转基因盒所确定的)所需的遗传元件。
[0260] 在第二十八方面，提供了一种在用于治疗、预防或改善癌症的方法中使用的用于在用颗粒转导的靶肿瘤细胞中表达转基因的重组噬菌粒颗粒，其中所述噬菌粒颗粒包括至少一个包括对一个或多个细胞因子进行编码或对由一个或多个过继转移的T细胞识别的抗原进行编码的核酸序列的转基因表达盒，并且包括缺少其噬菌体基因组的至少50％的基因组，并且其中所述方法包括将所述核酸序列递送到至少邻近所述肿瘤细胞，当序列对一个或多个抗原时进行编码，一个或多个抗原被表达并且可以被一个或多个过继转移的T细胞识别。
[0261] 应当理解的是，本发明延伸至任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，其包括本文提及的任何序列的大体上氨基酸或核酸序列，包含其功能变体或功能片段。术语“大体上氨基酸/多核苷酸/多肽序列”、“功能变体”和“功能片段”可以是与本文提及的序列中的任何一个的氨基酸/多核苷酸/多肽序列具有至少40％的序列同一性的序列，例如与本文识别的核酸具有40％的同一性。
[0262] 还设想了与所提及的序列中的任何一个具有大于65％、更优选大于70％、甚至更优选大于75％、还更优选大于80％的序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提及的序列中的任何一个具有至少85％的同一性，更优选与本文提及的序列中的任何一个具有至少90％的同一性、甚至更优选至少92％的同一性、甚至更优选至少95％的同一性、甚至更优选具有至少97％的同一性、甚至更优选至少98％的同一性以及最优选至少99％的同一性。
[0263] 技术人员将理解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性，必须首先制备两个序列的比对，然后计算序列同一性值。两个序列的百分比同一性可以取不同的值，这取决于：-(i)用于比对序列的方法，例如，ClustalW、BLAST、FASTA、史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)(在不同程序中实施)或来自3D比较的结构比对；和(ii)比对方法使用的参数，例如，局部与全局比对，使用的配对分数矩阵(例如BLOSUM62、PAM250、Gonnet等)和空位罚分，例如，功能形式和常数。
[0264] 在进行比对后，有许多不同的方法来计算两个序列之间的百分比同一性。例如，可以通过以下方式划分同一性的数量：(i)最短序列的长度；(ii)对齐的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数量；或(v)不包括突出的等价位置的数量。此外，应当理解的是，百分比同一性也强烈依赖于长度。因此，一对序列越短，可能预期偶然发生的序列同一性越高。
[0265] 因此，应当理解的是，蛋白质或DNA序列的精确比对是一个复杂的过程。流行的多重比对程序ClustalW(Thompson等人,1994《, 核酸研究(Nucleic Acids Research)》,22,4673-4680；Thompson等人,1997《, 核酸研究》,24,4876-4882)是用于产生根据本发明的蛋白质或DNA的多重比对的优选方式。ClustalW的合适参数可以如下：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0，空位延伸罚分＝6.66，并且矩阵＝同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝
10.0，空位延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1，并且GAPDIST＝4。本领域的技术人员将意识到，可能需要改变这些和其它参数以进行最佳序列比对。
[0266] 优选地，然后根据这种(N/T)*100比对计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性，其中N是序列共享相同残基的位置数，并且T是比较的位置数，其包含空位但不包含突出。因此，用于计算两个序列之间的相对百分比同一性的最优选方法包括(i)使用ClustalW程序使用合适的一组参数制备序列比对，例如，如上所述；以及(ii)将N和T的值插入下式：-序列同一性＝(N/T)*100。
[0267] 用于识别相似序列的替代方法是本领域技术人员已知的。例如，基本上相似的核苷酸序列将由在严格条件下与本文所述核酸序列或其互补序列杂交的序列进行编码。在严格条件下，我们指的是核苷酸与过滤结合的DNA或RNA在约45℃下在3x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在约20-65℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中至少洗涤一次。可替代地，基本上相似的多肽可以与本文所示序列相差至少1个，但少于5个、10个、20个、50个、或100个氨基酸。
[0268] 由于遗传密码的简并性，显然可以改变或更改任何核酸序列以提供其功能变体，而基本上不影响由其进行编码的蛋白质的序列。合适的核苷酸变体是具有通过取代对序列内相同氨基酸进行编码的不同密码子而改变的序列的核苷酸变体，从而产生沉默变化。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列但包括序列的全部或部分的变体，所述序列通过取代对具有与其替代的氨基酸具有相似生物物理特性的侧链的氨基酸进行编码的不同密码子而改变，以产生保守的变化。例如，小的非极性疏水氨基酸包含甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸。大的非极性疏水氨基酸包含苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包含丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括含赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸。因此，应当理解哪些氨基酸可以被具有相似生物物理特性的氨基酸取代，并且技术人员将知道对这些氨基酸进行编码的核苷酸序列。
[0269] 本文(包含任何随附权利要求、摘要以及附图)描述的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合形式与上述方面中的任一个组合，这种特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。为避免疑义，提及细胞因子可以优选涉及IL-4、IL-12、IL-15、TNFα、TRAIL、IFN-γ或其任何组合。优选地，所述细胞因子为IL-15，优选地，所述细胞因子为IL-4。优选地，所述细胞因子为IL-12。优选地，所述细胞因子为TRAIL。优选地，所述细胞因子为IFN-γ。
[0270] 然而，在另一个优选的实施例中，所述细胞因子为TNFα。优选地，所述细胞因子为包括非内源性信号肽的杂合TNFα，所述非内源性信号肽被配置成增加TNFα的表达和/或分泌。优选地，所述信号肽为除TNFα信号肽之外的细胞因子信号肽。例如，所述信号肽优选为IL-2信号肽。
[0271] 为了更好地理解本发明并示出如何实现本发明的实施例，现在将通过实例的方式来参考
[0272] 所附的示意图，其中：
[0273] 图1是示出与现有技术AAVP病毒颗粒相比较的根据本发明的噬菌粒-AAV(PAAV)病毒颗粒的特征的表；
[0274] 图2示出了根据本发明的辅助噬菌体和噬菌粒基因组(PAAV)的实施例的示意图，以及由辅助细胞和噬菌粒产生的噬菌粒-AAV(PAAV)颗粒。结构基因是将DNA包装到病毒颗粒中不可或缺的，并且由复制辅助噬菌体提供。噬菌粒基因组极易寄生于辅助噬菌体。最终，PAAV颗粒的产率远远超过现有技术系统；
[0275] 图3是噬菌粒基因组(PAAV)的一个实施例的示意图；
[0276] 图4示出了图3中所示的噬菌粒基因组上的f1ori和pUC ori的相应位置；
[0277] 图5示出了图3中所示的噬菌粒基因组上的重组腺相关病毒(rAAV)转基因盒上的选择标记物基因(AmpR)的位置；
[0278] 图6示出了图3中所示的噬菌粒基因组上的含有所关注的基因(例如GFP)的rAAV转基因盒，所述基因的表达由CMV启动子和/或增强子序列驱动，并用polyA信号加尾。整个转基因盒的侧翼是来自AAV的反向末端重复序列(ITR)；
[0279] 图7示出了作为被改造成用于从携带噬菌粒基因组的原核宿主中拯救噬菌粒颗粒的一种噬菌体的辅助噬菌体的实施例，如图3所示；
[0280] 图8示出了图5中所示的辅助噬菌体的基因组的片段，所述辅助噬菌体包括pIII次要外壳蛋白中的RGD4C靶向性肽，并且如SEQ ID No:26和27所示；
[0281] 图9示出了用于生产噬菌粒-AAV(PAAV)颗粒的方法的第一个实施例；
[0282] 图10示出了用于生产噬菌粒-AAV(PAAV)颗粒的方法的第二个实施例；
[0283] 图11示出了用于体外AAV生产的基于噬菌体的方法的一个实施例，其示出了三种载体，(i)噬菌粒-AAV(PAAV)、(ii)Rep-Cap噬菌粒和(iii)adenohelper噬菌粒；
[0284] 图12示出了图11中所示的adenohelper噬菌粒载体的实施例的基因组图谱；
[0285] 图13示出了图11中所示的Rep-Cap噬菌粒载体的实施例的基因组图谱；
[0286] 图14示出了统一的adenohelper/Rep-cap/噬菌粒-AAV(PAAV)载体的实施例；
[0287] 图15示出了图11中所示的统一的adenohelper-Rep-Cap噬菌粒载体的实施例的基因组图谱；
[0288] 图16示出了使用图11-13中所示的三种噬菌粒载体或图14和15中所示的统一的adenohelper-Rep-Cap噬菌粒载体的原位AAV生产的实施例；
[0289] 图17示出了根据本发明的已知的AAVP载体和PAAV载体的透射电子显微镜(TEM)。(A)RGD.AAVP.GFP细丝(粉红色)的长度通常为1455.02nm。(B)RGD.PAAV.GFP细丝(蓝色)的长度通常为729.96nm；存在于病毒样品(绿色)中的辅助噬菌体的长度通常为1186.03nm；
[0290] 图18示出了根据本发明的已知的AAVP载体和PAAV载体在2小时和4小时后在(A)293AAV和(B)U87细胞中的内化。使用流式细胞术分析，门控阈值设定为总细胞群的20000个事件。(n＝3)*＝p<0.05,**＝p<0.01；
[0291] 图19示出了在转导后9天GFP阳性细胞在(A)293AAV、(B)添加DEAE.DEXTRAN的293AAV、(C)U87和(D)添加DEAE.DEXTRAN的U87中的定量。使用流式细胞术分析，门控阈值设定为总细胞群的20000个事件。(n＝3)*＝p<0.05,**＝p<0.01；
[0292] 图20示出了对rAAV表达元件进行噬菌粒指导的基因转移(A)或转染(B)后来自细胞裂解物的rAAV-GFP的基因组拷贝数的定量。(实验A：n＝1；实验B：n＝3)；
[0293] 图21示出了UW228和DAOY人成神经管细胞瘤细胞的免疫荧光染色，以证明αV、β3和β5整联蛋白亚基，RGD4C-噬菌粒受体的表达。使用原代兔抗αV、β3或β5抗体(在PBS-1％BSA中1:50稀释)，然后用山羊抗兔AlexaFluor-488二抗(以绿色显示)染色肿瘤细胞，并用0.05μg/ml DAPI(蓝色)复染。使用共聚焦显微镜拍摄图像；
[0294] 图22示出了通过RGD4C-噬菌粒向儿科成神经管细胞瘤细胞的靶向基因递送。成神经管细胞瘤细胞(UW228)在96孔板上生长，然后用携带荧光素酶基因(RGD)的RGD4C-噬菌粒载体转导。未处理的细胞或用非靶向载体(M13)处理的细胞用作阴性对照。在转导后第2天到第4天的时间过程中监测荧光素酶表达；
[0295] 图23示出了蛋白质印迹分析(Western blot analyses)，其显示在用携带对mTOR/shRNA(RGD4C-mTOR/shRNA)进行编码的序列的RGD4C-噬菌粒处理后，儿科UW228和DAOY成神经管细胞瘤细胞中mTOR表达的下调。在载体处理后第4天收集细胞裂解物，并通过BCA测定法测量总蛋白质。用针对人mTOR的单克隆抗体(细胞信号技术公司)探测蛋白质印迹。未处理的细胞(CTR)和用缺乏mTOR/shRNA的RGD4C-噬菌粒(RGD4C)处理的细胞用作阴性对照；
[0296] 图24示出了替莫唑胺(TMZ)和携带对shRNA或mTOR进行编码的序列的RGD4C-噬菌粒在成神经管细胞瘤中的组合治疗。用RGD4C-噬菌粒(RGD4C)或携带对mTOR/shRNA(RGD4C-mTOR/shRNA)进行编码的序列的RGD4C-噬菌粒转导成神经管细胞瘤细胞(UW228和DAOY)。未处理的细胞也用作对照。在载体处理后第7天，在少量处理的孔中加入替莫唑胺(TMZ，100uM)以评估载体与化学疗法的组合的效果。在载体处理后第8天拍摄图像；
[0297] 图25示出了用TNFα噬菌粒载体处理成神经管细胞瘤细胞。用RGD4C-噬菌粒-TNFα(RGD4C/TNFα)和非靶向(ctr)处理UW228细胞。A)在TNFα表达后使用MTT测定的细胞活力。B)使用人TNFαELISAMax测量的载体处理细胞培养基中的TNFα表达。误差棒：平均值±SEM；
[0298] 图26示出了DIPG细胞的免疫荧光染色，以证明αV、β3和β5整联蛋白亚基，RGD4C-噬菌粒受体的表达。用原代兔抗体，然后用山羊抗兔AlexaFluor-488二抗染色细胞。对照细胞仅接受二抗。使用共聚焦显微镜拍摄图像；
[0299] 图27示出了通过RGD4C-噬菌粒/AAV向UW228、DAOY和DIPG细胞选择性且剂量依赖性递送基因表达。使用携带报告基因Luc(荧光素酶)基因的增加载体剂量1x 106或2x 106TU/细胞的RGD4C-噬菌粒-Luc(RGD4C)来处理细胞。每天测量Luc表达。缺乏RGD4C(ctr)的非靶向载体用作靶向的阴性对照。误差棒：平均值±SEM。(A)示出了对DIPG细胞的处理，(B)示出了对UW228的处理，(C)示出了对DAOY细胞的处理；
[0300] 图28示出了用RGD4C-噬菌粒-TNFα对UW288、DAOY或DIPG细胞的处理。用2x 106TU/细胞RGD4C-噬菌粒-TNFα(RGD4C)和作为阴性对照(ctr)的非靶向载体转导DIPG。用含有或6
不含DEAE葡聚糖的1×10TU/细胞转导UW288细胞或DAOY细胞。通过测量活细胞的百分比或使用半胱天冬酶-Glo测定法(半胱天冬酶3/7、半胱天冬酶8和半胱天冬酶9)在载体处理后第9天测量凋亡活性。误差棒：mean±SEM。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001；
[0301] 图29示出了在RGD.PAAV的不同转导单位下用RGD.PAAV转导后的荧光素酶表达；
[0302] 图30示出了与293AAV细胞的细胞表面结合的PAAV载体的百分比。相对于各自的对照，RGD.PAAV载体具有58.2％的结合效率而M13.PAAV载体具有7.1％的结合效率；
[0303] 图31示出了用于噬菌体引导的CAR T细胞疗法的表达质粒构建体的实施例的示意图。31a代表由CMV启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，31b代表由CMV启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒，31c代表由CMV启动子驱动的PSMA表达质粒，31d代表由Grp78启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，31e代表由Grp78启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒并且31f代表由Grp78启动子驱动的PSMA表达质粒。
[0304] 图32示出了转导后第6天的MUC-1.CD28、MUC-1.GPI和PSMA抗原表达。通过106TU/细胞的RGD靶向PAAV(RGD)或非靶向PAAV(NT)转导HEK 293细胞。未处理的HEK 293细胞(Ctrl)和仅有488二抗染色(Ant.488)的靶向PAAV转导的HEK 293细胞显示为对照。A代表由CMV启动子驱动的PAAV载体(图31a、31b和31c中的构建体)转导的HEK 293细胞的MUC-1或PSMA表达。加入DEAE-葡聚糖。B代表在未加入DEAE葡聚糖的情况下由CMV启动子驱动的PAAV载体(图31a、31b和31c中的构建体)转导的HEK293细胞的MUC-1或PSMA表达。C代表在未加入DEAE葡聚糖的情况下由Grp78启动子驱动的PAAV载体(图31d和31e中的构建体)转导的HEK 293细胞的MUC-1表达；
[0305] 图33示出了具有嘌呤霉素抗性基因的表达质粒构建体的示意图，所述嘌呤霉素抗性基因用于稳定细胞系选择噬菌体引导的CAR T细胞疗法治疗；33a代表由CMV启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，33b代表由CMV启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒，33c代表由CMV启动子驱动的PSMA表达质粒，33d代表由Grp78启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，33e代表由Grp78启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒并且33f代表由Grp78启动子驱动的PSMA表达质粒；
[0306] 图34示出了转导后第6天的癌细胞的MUC-1.CD28、MUC-1.GPI和PSMA抗原表达。通过106TU/细胞的RGD靶向PAAV(RGD)或非靶向PAAV(M13)转导癌细胞。未显示任何抗体染色的未处理细胞(CTRL)显示为对照，同时用一抗和二抗(Stain)对未处理细胞进行染色以通过FACS检查抗原的内部表达。A代表由CMV启动子驱动的PAAV载体转导的A549细胞的MUC-1或PSMA表达。B代表由CMV启动子驱动的PAAV载体转导的Suit2细胞的MUC-1或PSMA表达。C代表由CMV启动子驱动的PAAV载体转导的UW 228细胞的MUC-1表达。
[0307] 图35示出了稳定癌细胞中的MUC-1.CD28、MUC-1.GPI和PSMA抗原表达。用嘌呤霉素抗生素选择表达MUC1或PSMA抗原的RGD4C-PAAV稳定转导的癌细胞(稳定细胞)，然后用于对MUC-1或PSMA表达进行FACS分析。未显示任何抗体染色的未处理细胞(CTRL)显示为对照，同时用一抗和二抗(Stain)对未处理细胞进行染色以检查抗原的内部表达。A代表A549细胞的MUC-1或PSMA表达。B代表Suit2细胞的MUC-1或PSMA表达。C代表UW228细胞的MUC-1表达；
[0308] 图36示出了对携带跨膜tmTNFα或分泌型sTNFα的PAAV之间的体外杀伤DIPG细胞的处理和比较。用RGD4C-PAAV-tmTNFα或RGD4C-PAAV-sTNFα(RGD4C和非靶向M13[ctr])处理DIPG细胞，并在载体处理后第7天测量细胞活力。携带分泌型sTNFα的RGD4C-PAAV-sTNFα颗粒在诱导DIPG细胞杀伤方面比RGD4C-PAAV-tmTNFα更有效，即使在只有少量细胞被载体转导的瞬时转导环境中；
[0309] 图37示出了本发明公开的方法使用的质粒构建体的实施例的示意图；37a代表PAAV-CMV-IRES GFP质粒，37b代表PAAV.Grp78.IRES.GFP；
[0310] 图38示出了PAAV-tm.TNFα转导后TNFα的表达。(A)将UW228和Daoy接种在96孔板中，并用含有DEAE葡聚糖的1×106TU/细胞转导，在第6天收集上清液，并通过ELISA测定上清液中的TNFα。。数据表示为平均值±SEM。
[0311] 图39示出了TNFα和顺铂组合治疗在UW228细胞方面的作用。使用磺胺多胺B测定法在不同时间点测量细胞活力。在接种细胞后48小时，用1μM和5μM顺铂化疗处理稳定转导的UW228。。数据表示为平均值±SEM。***P≤0.001。此图显示，与顺铂(顺式)化疗组合使用可以增加针对成神经管细胞瘤的tmTNFα细胞因子基因治疗；
[0312] 图40示出了PAAV-sTNF转导后TNF的表达。将DIPG接种在96孔板中，并用含有DEAE葡聚糖的2×106TU/细胞转导，在第3天收集上清液，并通过ELISA测定上清液中的TNFα；
[0313] 图41示出了PAAV-CMV-tmTNFα的产生；
[0314] 图42示出了PAAV-sTNFα的产生；
[0315] 图43示出了靶向PAAV载体，显示了在M13丝状噬菌体的pIII外壳蛋白上显示的RGD-4C配体。杂合基因组示出了表达期望的基因所必需的重要基因片段；
[0316] 图44示出了用于产生RGD pVIII辅助病毒的示意图；
[0317] 图45示出了用于产生RGD pVIII PAAV-GFP和RGD pVIII PAAV-lucia的示意图，二者用于体外转导实验以评估载体效率和基因表达水平；
[0318] 图46示出了用于产生PAAV-hTRAIL的示意图(来自SnapGene的图像)；
[0319] 图47示出了用初级抗噬菌体抗体和Alexa Fluor-488标记的二抗(绿色)孵育的DIPG细胞的荧光显微图像，以便评估整联蛋白(αv/β3/β5)的表达。仅考虑没有抗体或二抗的对照细胞的图像来解释背景荧光。用DAPI(蓝色)染色细胞核；
[0320] 图48示出了在M13丝状噬菌体的pIII(左)或pVIII(右)外壳蛋白上显示的RGD-4C配体的理论构建体。
[0321] 图49示出了在转导后第6天，用未靶向的RGD pIII PAAV-GFP或RGD pVIII PAAV-GFP载体以0.1m TU、0.5m TU和1m TU孵育的HEK293T细胞的荧光显微图像。在所有TU中，RGD pIII PAAV-GFP中的GFP表达最高；
[0322] 图50示出了在转导后第6天，用未靶向的RGD pIII PAAV-lucia或RGD pVIII PAAV-lucia载体以0.1m TU、0.5m TU和1m TU孵育的HEK293T细胞的RLU。在所有TU中，RGD pIII PAAV-lucia中的RLU最高。误差棒为+/-1标准误差；
[0323] 图51示出了在转导后第4天用载体孵育的HEK293T细胞的RLU。在所有TU中，H5W RGD pIII PAAV-lucia中的RLU最高。误差棒为+/-1标准误差。(Sajee Waramit，未发表的数据)；
[0324] 图52示出了在转导后第3天，用未靶向的RGD pIII PAAV-lucia或H5W RGD pIII PAAV-lucia载体以1m TU和2m TU孵育的DIPG细胞的RLU。在所有TU中，H5W RGD pIII PAAV-lucia中的RLU最高。误差棒为+/-1标准误差；
[0325] 图53在0.2ng、0.4ng和0.6ng DNA下用PAAV-hTRAIL和对照PAAV-GFP质粒转染的DIPG细胞的显微图像。在转染后18小时拍摄图像。在所有DNA浓度下用PAAV-hTRAIL转染的细胞中的细胞活力较低；
[0326] 图54示出了显示在用标准化为1μg蛋白质的PAAV-CMV-IL-12转导后第6天收集的培养基的IL-12浓度的柱状图。示出了使用具有CMV启动子和模拟转导的靶向和非靶向空载体的转导的对照。外部选择条指定通过双向ANOVA对所有载体滴度和对照的IL-12产生数据的分析。内部选择条通过非配对t检验指定每个滴度的载体与对照之间的比较。一式三份地进行实验；
[0327] 图55示出了显示在用PAAV-CMV-mIL-12转导后不同天数取样的培养基的小鼠IL-12浓度的曲线图。示出了使用具有CMV启动子和模拟转导的靶向和非靶向空载体的转导的对照。外部选择条指定通过双向ANOVA对来自载体和对照的所有采样天数的小鼠IL-12产生数据的分析。特定数据点上的星号指定在每个指定日期通过非配对t检验进行的载体和对照之间的比较；
[0328] 图56示出了显示在用RGD-4C靶向的PAAV-CMV-mIL-12(n＝4)处理后、用不含转基因的RGD-4C靶向的PAAV-CMV(n＝4)处理后以及不处理对照(n＝4)7天内C57BL/6小鼠中B16-F10鼠黑素瘤肿瘤的平均肿瘤大小(以mm3计)的柱状图。在第0天、第2天和第5天静脉内施用三剂5×1010TU载体。通过双向ANOVA与Tukey的多重比较检验分析数据。
[0329] 图57示出了IL2信号序列；
[0330] 图58示出了Il-2/TNFα构建体；
[0331] 图59示出了DIPG中RGD4C-sTNFα和RGD4C-tmTNFα的细胞杀伤效率。用携带分泌型或跨膜型TNFα(sTNFα)转基因的靶向PAAV(RGD4C)或非靶向PAAV(M13)转导DIPG细胞。将细胞接种在96孔板中。两天后，用含有40ng/μg蛋白质DEAE葡聚糖的2×〖10〗^6TU/细胞转导细胞。用磺酰罗丹明B(SRB)测定法测量活力。通过学生t检验数据确定的统计学意义表示为平均值±SEM。*P≤0.05,**P≤0.01；
[0332] 图60示出了用PAAV-sTNFα和PAAV-tmTNFα转导后TNFα的表达。将DIPG细胞接种在6孔板中，并用携带分泌型或跨膜形式的TNFα转基因的RGD4C和M13转导。A)提取RNA并通过qRT-PCR测定TNFα的表达。B)收集上清液并通过ELISA测定上清液中的TNFα。数据表示为平均值±SEM。**P≤0.01***P≤0.001。统计学意义由学生t检验确定；

背景技术

[0333] 基因递送技术的发展有助于基础研究向社会成功转化。在过去的十年中，许多病毒和非病毒载体已成为工业和治疗应用的潜在递送载体。除了有效递送基因外，载体的一个重要特性是其还必须易于生产且具有商业可行性。2006年，Hajitou等人试图通过在重组腺相关病毒(rAAV)和丝状噬菌体(噬菌体)之间产生杂交——被称为腺相关病毒/噬菌体(AAVP)——来满足对这种载体的需要(《自然实验手册(Nature protocols)》2,523-531(2007)；《细胞学(Cell)》125,385-398(2006))。得到的AAVP载体具有哺乳动物和原核病毒的有利特征，但不具有这些单独载体通常携带的缺点。然而，AAVP载体的某些方面仍然留有显著改善的空间。最重要的是，这包含载体的基因设计，其在生产和治疗性质方面具有分支。最终，这导致与哺乳动物病毒相比，AAVP的基因转导效力相对较低。
[0334] 本文所述的研究涉及通过使用所谓的“噬菌粒系统”设计噬菌体基因递送载体的最先进版本以及其对已知和现有噬菌体载体AAVP的优越性，其中新型噬菌粒载体被称为噬菌粒/腺相关病毒体噬菌粒(即PAAV)。与插入丝状噬菌体基因组的rAAV盒所组成的AAVP基因组不同，PAAV基因组不含任何结构噬菌体基因——需要原核辅助病毒来促进载体组装(《分子治疗(Mol Ther)》3,476-484；《药学研究(Pharmaceutical research)》27,400-420(2010))。将病毒的生殖元件和治疗元件分离到携带转基因的治疗载体和携带结构基因的单独辅助病毒中，大大降低了基因组/载体的大小，并从而显著提高了转基因的能力，这是新系统的基因治疗应用的有用优势。因此，这导致真核病毒基因组被包装到原核病毒的衣壳中，从而产生作为真核基因组与原核衣壳之间的杂合体的载体，其具有增强的生产产率、基因转导效率和用于其它应用的载体系统的灵活性。
[0335] 如以下实例中所述，发明人已经：-
[0336] 1.设计并构建了一种杂合噬菌粒-AAV载体(PAAV)颗粒表达系统；
[0337] 2.表征和确定了噬菌粒/AAV载体(PAAV)在基因转导方面是否比已知的AAVP系统在各个阶段更有效，所述各个阶段包含但不限于：
[0338] a.与细胞表面结合，
[0339] b.从细胞表面内化载体，
[0340] c.重组转基因表达。
[0341] 3.确定了杂合噬菌粒PAAV载体系统是否能够从哺乳动物生产细胞系产生rAAV。
[0342] 4.证明了所述系统可以在用于癌症治疗的CAR-T治疗中使用。
[0343] 5.证明了所述系统可以用于将细胞因子IL-12、TRAIL和杂合TNFα递送到靶细胞以进行癌症治疗。
[0344] 6.设计并构建了包括杂合TNFα构建体的噬菌粒颗粒。
[0345] 7.证明了与全长TNFα相比，杂合TNFα构建体显示出增加的表达、分泌和细胞杀伤效率。
[0346] 首先参考图1，其示出了将根据本发明的噬菌粒-AAV(PAAV)颗粒(即病毒体)的特征与现有技术AAVP病毒颗粒的特征进行比较的表。可以看出，本发明的PAAV颗粒(6kb)比已知的AAVP颗粒(14kb)小得多(即DNA减少42％，病毒颗粒减少50％)，并且PAAV颗粒的产率远远超过现有技术系统(100X)AAVP的产率。因此，本发明的PAAV颗粒可以携带更大的有效载荷，这对于在基因治疗方法中递送多个转基因非常有用。因此，发明人已经证明了经过修饰的噬菌体表达系统(PAAV)可以用作基因治疗的高度病毒载体，或用于大规模生产病毒载体。
[0347] 实例1——噬菌粒-AAV载体(PAAV)构建
[0348] 参考图2，其示出了根据本发明的辅助噬菌体基因组和噬菌粒基因组(PAAV DNA)的实施例，二者在原核生物中表达时一起使用以产生噬菌粒-AAV(PAAV)颗粒，也在图1中示出。结构基因是将DNA包装到病毒颗粒中不可或缺的，并且由复制缺陷的辅助噬菌体提供，这将在下文详细讨论。噬菌粒基因组极易寄生于辅助噬菌体，这意味着其在复制和包装中都胜过复制缺陷的辅助噬菌体。
[0349] A)噬菌粒/AAV载体
[0350] 现在参考图3，其示出了作为含有两个复制起点和两个其它基因元件的质粒的噬菌粒基因组的一个实施例。噬菌粒基因组需要两个复制起点以促进其在原核(例如细菌)宿主内的复制，并在被辅助病毒拯救时包装到噬菌粒颗粒中。
[0351] 参考图4，第一复制起点(ori)是高拷贝数复制起点(pUC ori)，其能够在原核宿主内大量复制双链噬菌粒(dsDNA)。第二个复制起点是噬菌体复制起点(f1ori)，其能够将质粒复制到随后可以被包装到噬菌粒载体颗粒(PAAV)中的单链DNA中。
[0352] 参考图5，噬菌粒基因组包含选择标记物基因。为了使噬菌粒基因组在原核宿主内有效复制，使用选择标记物(例如氨苄青霉素抗性)来确保表达并提供选择性压力以防止噬菌粒基因组以抗生素抗性基因(具有其自身启动子)的形式丢失。当在选择标记物赋予抗性的抗生素存在的情况下培养原核宿主时，这确保了噬菌粒基因组的表达(和复制)。
[0353] 参见图6，噬菌粒基因组进一步包含含有所关注的转基因的重组(腺相关病毒，AAV)转基因盒。这可以包含但不限于多肽/蛋白质、短发夹/小干扰/短指导样RNA，或两者的组合。仅通过举例的方式，图6中所示的转基因对GFP和人β-珠蛋白进行编码。转基因的表达由病毒启动子(例如CMV)和/或增强子序列驱动，并用polyA信号加尾。启动子也可以是癌症基因治疗应用中的哺乳动物和肿瘤特异性启动子(即葡萄糖调节蛋白的启动子[grp78])。整个转基因盒的侧翼是来自AAV的反向末端重复序列(ITR)，其形成保护性发夹结构，所述发夹结构允许转基因盒在由噬菌粒颗粒转导的哺乳动物细胞核中作为多特征游离(染色体外)DNA稳定维持。ITR允许AAV的多联体形成，并且随后使AAV转基因盒能够在长时间内稳定表达。
[0354] 由于缺乏结构噬菌体基因，噬菌粒不能将自身包装到颗粒中。因此，噬菌粒需要辅助病毒“拯救”，如图7所示，其提供了从原核宿主形成并挤出颗粒所需的结构(即衣壳)蛋白。常规地说，载体中的基因元件是通用的并且在基因工程中广泛使用。
[0355] B)辅助噬菌体
[0356] 参考图7，辅助噬菌体(本文中被称为M13KO7)是被改造成专门用于从携带和/或含有图3中所示的噬菌粒基因组的原核宿主中拯救噬菌粒颗粒(即PAAV)的噬菌体。辅助噬菌体含有破坏的复制起点(p15a，中等拷贝数)和包装信号，这显著阻碍了其将自身包装到噬菌体颗粒中的能力。因此，噬菌粒基因组将在复制和包装中胜过辅助噬菌体。
[0357] 为了给出噬菌粒靶向特性(或WO 2014/184528中描述的多功能特性)，必须对辅助噬菌体的基因组进行工程改造，因为其提供了用于噬菌粒颗粒组装的结构衣壳蛋白。例如，辅助基因组可对pIII衣壳微次要外壳蛋白进行编码，所述pIII衣壳微次要外壳蛋白被配置成显示用于使所得PAAVP颗粒能够递送到期望的靶细胞(例如肿瘤)的细胞靶向性配体。辅助基因组还可以对至少一个pVIII主要外壳蛋白进行编码，其被配置成在所得PAAV颗粒上显示外源肽。因此，在一个实施例中，令人期望的是在pIII次要外壳蛋白中诱导9-氨基酸突变，以便赋予对表达αvβ3和αvβ5整联蛋白受体的肿瘤细胞和血管生成肿瘤相关内皮细胞的特异性。因此，参考图8，辅助噬菌体的基因组包括靶向这些αvβ3和αvβ5整联蛋白的RGD4C肽(CDCRGDCFC-SEQ ID No:7)。
[0358] 一旦构建了PAAV噬菌粒基因组和辅助噬菌体，二者就一起使用以便在原核宿主中产生噬菌粒-AAV载体(PAAV)颗粒，如下所述。
[0359] 实例2——噬菌粒-AAV载体(PAAV)生产
[0360] 发明人设计了用于生产噬菌粒-AAV载体(PAAV)颗粒的两种不同的方法(方法1和2)，并且这些方法在图9和10中展示。
[0361] 注意：
[0362] -TG1：携带生育因子(F′菌毛)的大肠杆菌菌株。
[0363] -2xYT：用于培养TG1大肠杆菌的液体肉汤。
[0364] -卡那霉素：存在于辅助噬菌体上的抗生素抗性选择标记物。
[0365] -氨苄青霉素：存在于噬菌粒载体上的抗生素抗性选择标记物。
[0366] -TYE顶层琼脂：用于培养TG1大肠杆菌的固体培养基，通过添加1.25％细菌琼脂改编自2x TY。
[0367] 噬菌粒/AAV载体(PAAV)生产方法1：感染性拯救
[0368] 参考图9：
[0369] 1.将4-5ml携带PAAV基因组的TG1大肠杆菌预培养物(过夜)加入到60ml补充有1％葡萄糖的2xYT(100μg/mL氨苄青霉素)。
[0370] 2.在37℃振荡器(250RPM)中孵育培养物。
[0371] 3.一旦OD600处于0.5到0.8范围内(对数期)，就将至少1×1010个辅助噬菌体(M13KO7)转导单位加入培养物中。
[0372] 4.反转混合。在37℃下孵育30分钟。
[0373] 5.将来自步骤3的感染的起子培养物倒入具有补充有1％葡萄糖的2x YT(100μg/mL氨苄青霉素+25μg/mL卡那霉素)的2L烧瓶中直至最终体积为400-450mL。
[0374] 6.在轨道振荡器中以37℃、250rpm孵育过夜16-20小时。
[0375] 7.从上清液中纯化噬菌粒(PAAV)颗粒。
[0376] 培养方法1的好处是它的产率非常高。
[0377] 噬菌粒/AAV载体(PAAV)生产方法2：稳定的生产细胞系
[0378] 参考图10：
[0379] 第1部分：感受态生产细胞系生产
[0380] 1.在TYE顶层琼脂(50μg/mL卡那霉素)中用来自辅助噬菌体M13KO7的ssDNA基因组转化并平板接种TG1感受态大肠杆菌(Zymo研究公司，美国)
[0381] 1.挑取单个菌落并接种补充有1％葡萄糖的5mL 2xYT培养基(50μg/mL卡那霉素)。
[0382] 2.在轨道振荡器中以37℃、250rpm孵育过夜16-20小时
[0383] 3.通过使用商业提取试剂盒(QIAGEN，荷兰)从5mL过夜培养物中提取DNA并针对DNA梯度在1％琼脂糖凝胶(100伏，2.5mA)上运行来检查真阳性转化体。
[0384] 4.使用公布的方案(改编自加州大学伯克利分校Krantz等人公布的方案)从步骤4中鉴定的正确转化体中制备化学感受态细胞。
[0385] 第2部分：PAAV噬菌粒颗粒生产
[0386] 1.用噬菌粒/AAV基因组转化第1部分中产生的感受态细胞系，并在TYE顶层琼脂(100μg/mL氨苄青霉素+50μg/mL卡那霉素)上培养
[0387] 2.挑取菌落并接种补充有1％葡萄糖的5mL 2xYT(100μg/mL氨苄青霉素+50μg/mL卡那霉素)。
[0388] 3.在轨道振荡器中以37℃、250rpm孵育4小时
[0389] 4.将来自步骤3的感染的起子培养物倒入具有补充有1％葡萄糖的2xYT(100μg/mL氨苄青霉素+25μg/mL卡那霉素)的2L烧瓶中直至最终体积为400-450mL
[0390] 5.在轨道振荡器中以37℃、250rpm孵育过夜16-20小时
[0391] 6.从上清液中纯化噬菌粒颗粒
[0392] PAAV噬菌粒颗粒纯化
[0393] 1.将温热的过夜培养物转移到离心瓶中，并通过在3300G、4℃下离心30分钟使细菌沉淀。
[0394] 2.丢弃沉淀物并将上清液转移到干净的离心瓶中。
[0395] 3.在具有冰冷的20％PEG-8000/2.5M NaCl的每个瓶中加入30％体积的上清液并旋转混合。
[0396] 4.在冰上孵育4-24小时
[0397] 5.通过在10000G、4℃下离心30分钟使噬菌粒颗粒沉淀。丢弃上清液。
[0398] 6.通过在10000G、4℃下离心1分钟使噬菌粒颗粒沉淀物干燥。
[0399] 7.用PEG/NaCl去除剩余的上清液
[0400] 8.将噬菌粒颗粒沉淀物重悬于0.5-2mL PBS中
[0401] 9.使用0.45微米过滤器过滤重悬浮的噬菌粒颗粒制剂。
[0402] 10.将制剂保持在4℃下。在4℃下，所述制剂可以稳定长达2年。25％甘油原料可以无限期保存在-80℃下。
[0403] 实例3——噬菌粒-AAV载体(PAAV)用于基因治疗技术的用途
[0404] 实例1和2描述了产生噬菌粒-AAV载体(PAAV)颗粒所需的本发明的组分(即图3中所示的噬菌粒基因组和图7中所示的辅助噬菌体)和两种生产方法。一旦产生并纯化，PAAV颗粒可以具有多种用途，如在基因治疗中。
[0405] 例如，本文所述的PAAV颗粒携带GFP转基因，因为其在已知测定中易于检测以显示成功递送到靶细胞。在治疗中，可以选择任何转基因并将其改造成图3所示的噬菌粒基因组，以在所得的PAAV颗粒中携带。例如，转基因可以是对蛋白质进行编码的任何基因，其可以具有治疗性或工业用途。例如，转基因可以对由过继转移的T细胞(如CAR T细胞)识别的一个或多个抗原进行编码。转基因还可以对在RNAi疗法中使用的短发夹/小干扰/短指导样RNA分子进行编码。转基因可以使用内部核糖体进入位点(IRES)或病毒融合肽(用于框内融合的T2A肽)对多个多肽、核酸或两者的组合进行编码。
[0406] 实例4——噬菌粒-AAV载体(PAAV)用于体外AAV生产的用途
[0407] 除基因治疗外，可以在用于产生腺相关病毒(AAV)的新方法中使用本文所描述的PAAV颗粒。噬菌体引导的AAV生产利用噬菌粒颗粒包装大量dsDNA的能力。典型的AAV生产系统由三个主要元件组成：rAAV、rep-cap和adenohelper基因，它们共同起作用以产生重组AAV颗粒。发明人设计了两种不同的策略。
[0408] 参考图11，采用的第一种策略是产生携带rAAV生产元件的三种不同的噬菌粒载体。这些是噬菌粒-AAV载体(PAAV)(参见图3)、adenohelper噬菌粒颗粒(参见图12)和rep-cap噬菌粒颗粒(参见图13)。这些颗粒的基本结构是相似的，因为它们含有两个复制起点和一个选择标记物，如噬菌粒/AAV构建部分所述。然而，关键的区别在于转基因盒。虽然噬菌粒-AAV(PAAV)基因组含有AAV转基因盒，如图3所示，但adenohelper和rep-cap颗粒含有adenohelper转基因或rep-cap转基因，分别如图12和13所示。
[0409] 在另一个实施例中，发明人已经基因工程改造了所谓的“统一构建体”，其含有单个载体基因组内的所有必需元件，如图14和15所示。
[0410] 当引入相同的哺乳动物生产细胞(参见图11和14)时，无论是在单独的载体上还是在相同的统一载体上，rep-cap和adenohelper基因都表现为有助于在噬菌粒/AAV载体中包装rAAV基因组的反式作用元件。所述生产过程相当于三种质粒的瞬时共转染。然而，在这种情况下，用携带非常相同元件的噬菌粒载体替换质粒。
[0411] 下文描述了用于PAAV噬菌粒引导的腺相关病毒(AAV)生产的方案。
[0412] 注意：
[0413] DMEM：杜氏改良的伊格尔氏培养基。
[0414] FBS：胎牛血清，一种生长补充剂。
[0415] 完全培养基：DMEM+10％FBS。
[0416] EDTA：乙基-二胺四乙酸，一种用于通过隔离紧密连接形成所需的钙离子来离解细胞的离子螯合剂。
[0417] GlutaMax：一种生长补充剂，L-谷氨酰胺的类似物。
[0418] 用于噬菌粒引导AAV生产的方案：
[0419] 1.在15cm组织培养板中在完全培养基(补充有10％FBS、20mMGlutaMax、青霉素/链霉素和非必需氨基酸的DMEM)中接种并生长HEK293细胞，持续至少48小时直至达到80％汇合。
[0420] 2.在5mL总体积下混合噬菌粒/AAV、rep-cap噬菌粒和adeno-helper噬菌粒以实现1:1:1转导单位比率，或等分统一载体(单个载体含有单个颗粒中的所有三种元件)以实现每个细胞1百万个转导单位。
[0421] 3.将等体积的无血清DMEM(补充有20mM GlutaMax)加入步骤3中制备的转导混合物中
[0422] 4.反转混合。在室温下孵育15分钟。
[0423] 5.用PBS洗涤步骤1中平板接种的HEK293细胞，重复3次。
[0424] 6.加入转导混合物并轻轻旋转，使混合物均匀分布。
[0425] 7.在37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育72小时
[0426] a.在用转导混合物孵育6小时后，补充等体积的完全培养基(补充有10％FBS、20mM GlutaMax、青霉素/链霉素和非必需氨基酸的DMEM)。
[0427] b.24小时后，用完全培养基(补充有10％FBS、20mM GlutaMax、青霉素/链霉素和非必需氨基酸的DMEM)替换培养基。
[0428] rAAV纯化：
[0429] 1.向组织培养板中的培养基中加入0.5M EDTA溶液至最终浓度为0.010M，在室温下孵育5分钟。
[0430] 2.通过抽吸和研磨收集细胞和培养基，并转移到50mL离心管中。
[0431] 3.通过在室温下以1500RPM离心5分钟使细胞沉淀。
[0432] a.任选：收集上清液用于进一步的AAV纯化。
[0433] 4.将细胞沉淀物重悬于2-5mL无血清DMEM中。
[0434] 5.通过在乙醇-干冰浴和设定为37℃的水浴中进行4次冻融循环来裂解悬浮液中的细胞。
[0435] 6.在室温下以10000G离心细胞裂解物，持续10分钟。
[0436] a.将上清液等分，用于定量/进一步纯化/浓缩。
[0437] b.丢弃沉淀物(碎片)。
[0438] 实例5——噬菌粒-AAV载体(PAAV)用于原位AAV生产的用途
[0439] 参考图16，发明人设计了一种用于使用PAAV原位产生AAV颗粒的方法。
[0440] 首先，通过静脉内/脑/腹膜或肌肉内/皮下(或任何上述施用途径)在体内引入三种噬菌粒载体或统一载体的最佳剂量(或多剂量)。患病组织是显示相关整联蛋白的肿瘤，并且因此噬菌粒PAAV颗粒上的靶向部分是RGD4C序列。肿瘤应该开始产生含有在杂合噬菌粒颗粒中经过编码的病毒转基因的rAAV而不是野生型AAV。这些AAV治疗颗粒应该自动感染附近的位点，因为其天然地对哺乳动物组织具有高亲和力，并且在给定时间内根除肿瘤。
[0441] 实例6——用于大规模靶向基因转移和重组腺相关病毒生产的工程假病毒体[0442] 透射电子显微镜
[0443] 在表征颗粒时，发明人将PAAV颗粒成像以显示当使用基于噬菌粒的载体系统时载体大小显著降低。通过使用透射电子显微镜，发明人在用乙酸双氧铀染色后，在网状铜TEM网格上将本发明的PAAV和已知的AAVP颗粒的长度成像并进行测量(参见图17)。发现AAVP颗粒的平均长度为1455.02nm(图17A)，而根据本发明的典型PAAV颗粒的长度仅为729.96nm(图17B)——这相当于粒径减小约50％。与用于产生PAAV颗粒的辅助噬菌体(通常为1186.03nm，图17B)相比，相对载体的大小比辅助病毒短约38％。
[0444] 载体大小的差异构成了以下理论的基础：即PAAV作为基因递送载体可能比AAVP更有效，不仅在生产产率方面，而且在哺乳动物细胞中进入和表达基因时的后续感染过程中。因此，发明人探测了感染的各个阶段的载体效率，包含293AAV(人胚肾293的衍生物)和U87成胶质细胞瘤细胞系中的结合、内化和基因表达。
[0445] 载体内化
[0446] 结合后，载体经历靶细胞的受体介导的胞吞作用。为了研究载体内化的潜在差异，发明人使用流式细胞术在两个时间点(2小时，2H；4小时，4H)测定了靶细胞中内化载体的数量(参见图18)。发现PAAV载体在2小时内更有效地内化(中值荧光强度(MFI)＝1031.7，比AAVP高335，p<0.05)，并且与AAVP相比，在4小时处两种细胞系中的总体程度更大。2小时处PAAV的MFI显著高于AAVP，比293AAV高335，并且比U87细胞高207(p<0.05)。在转导后4小时，这种差异对于293AAV(829MFI，p<0.05)变得非常大，但对于U87(157MFI，非显著)则很小。总体而言，对于PAAV1处理的细胞，MFI在2092(293AAV，p<0.05，图18A)和1137(U87，图18B)处达到峰值，这显著高于分别在1063(293AAV)和980(U87)处达到峰值的AAVP。数据表明，对于两种细胞系中的两个时间点，PAAV在内化的速率和程度上始终优于AAVP。
[0447] AAVP和PAAV介导的基因转移后的绿色荧光蛋白表达
[0448] 为了研究载体内化的差异是否转化为增加的基因表达，发明人使用RGD和NT PAAV.GFP和AAVP.GFP载体进行了GFP表达测定(参见图19)。在这个实验中，他们还测试了添加阳离子聚合物DEAE.DEXTRAN(Dex)是否可以通过增加PAAV载体的生物利用度和内体逃逸来增强基因转移，如WO2014/184529中所述。转导后9天，用胰蛋白酶处理细胞，并使用流式细胞仪进行计数和分析。发现293AAV细胞中的转基因表达通常高于U87，无论Dex是否用于辅助载体转导。当使用单独的载体时，靶向RGD.PAAV.GFP载体转导具有更高效力的靶细胞(在293AAV和U87细胞中分别为7.7％，p<0.01和1.4％，p<0.05GFP+ve细胞)——与AAVP相比，这转化为293AAV和U87细胞分别增加2.44倍和1.56倍(图19A、C)。
[0449] 然而，当加入Dex时，RGD.AAVP和RGD.PAAV载体的基因表达显著增加。在293AAV细胞中，RGD.AAVP.GFP处理的细胞中的GFP表达增加至25％而RGD.PAAV.GFP处理的细胞经历GFP表达显著增加至50％(所有p<0.01)；添加Dex导致RGD.AAVP的基因表达增加7.9倍，并且RGD.PAAVP的基因表达增加6.5倍(图19B、D)。在被认为对转导具有高弹性的U87细胞中，Dex能够将RGD.PAAV.GFP中的基因表达增加超过3.6倍至4.8％GFP+ve细胞(p<0.01)——这不是RGD.PAAV.GFP的情况，因为Dex仅使基因表达增加1.5倍至1.3％GFP+ve细胞(p<0.05)。有趣的是，Dex通过293AAV细胞中的NT.PAAV(非靶向)载体(7.34％)启用转导，而不是U87中的。
[0450] 噬菌粒引导的重组腺相关病毒生产
[0451] 为了评估PAAV和噬菌粒衍生的载体是否可以用于在商业生产细胞系中产生rAAV，发明人用三种靶向载体转导293AAV细胞，所述靶向载体通常是需要转染用于基因转移的质粒。他们能够从细胞裂解物中收获rAAV颗粒，并在噬菌粒引导转导后的三个时间点上定量每mL的rAAV基因拷贝数(GC)(图20A)。与使用FuGene6的常规转染(转染试剂，3.99e11GC/mL，图20B)相比，噬菌粒引导的rAAV生产在168小时后的rAAV产率中提供超过1.9倍的增加(7.69e11GC/mL，图21A)。因为噬菌粒引导的基因转移需要大量的细胞内加工(与转染不同)，所以需要更长的时间将病毒基因表达并包装到功能性颗粒中。然而，当在相同的72小时时间点比较产率时，转染产生比噬菌体引导的rAAV生产高1.76e11GC/mL的产率。在所有时间点，来自转染或噬菌粒引导的生产培养皿的每mL培养上清液的rAAV产率约为8-9e10GC/mL，没有可观察到的趋势(数据未显示)。
[0452] 实例7——RGD4C-噬菌粒的构建和用途
[0453] 三肽RGD存在于细胞外基质的蛋白质中，包含纤连蛋白。整联蛋白通过与定位在细胞附着于αvβ3整联蛋白的位点中的纤连蛋白中的RGD基序结合而充当纤连蛋白的受体，因此发明人在重组噬菌粒颗粒的pIII次要外壳蛋白中诱导9-氨基酸突变，以便赋予对表达αvβ3和αvβ5整联蛋白受体的肿瘤细胞和血管生成肿瘤相关内皮细胞的特异性。因此，第二载体的基因组包括RGD4C靶向性肽(CDCRGDCFC-SEQ ID No:7)。
[0454] 参考图21，其示出了UW228和DAOY人成神经管细胞瘤细胞的免疫荧光染色，其证明了αV、β3和β5整联蛋白亚基，RGD4C-噬菌粒受体的表达。这些数据表明含有RGD4C靶向性肽的噬菌粒载体可以用于儿科脑肿瘤、成神经管细胞瘤中的靶向基因递送和基因治疗。
[0455] 参考图22，其示出了RGD4C-噬菌粒在4天的时间过程中向儿科成神经管细胞瘤细胞的靶向基因递送。数据显示RGD4C-噬菌粒介导增加成神经管细胞瘤的时间延长的有效且具有选择性的基因递送。
[0456] 图23示出了蛋白质印迹分析(Western blot analyses)，其显示在用携带对mTOR/shRNA(RGD4C-mTOR/shRNA)进行编码的序列的RGD4C-噬菌粒处理后，儿科UW228和DAOY成神经管细胞瘤细胞中雷帕霉素哺乳动物靶标(mTOR)表达的下调。这些数据表明RGD4C-噬菌粒可以成功地用于在肿瘤细胞中递送shRNA以选择性且有效地敲低治疗性靶mTOR的表达。
[0457] 图24示出了替莫唑胺(TMZ)和携带对shRNA或mTOR进行编码的序列的RGD4C-噬菌粒在成神经管细胞瘤细胞中的组合治疗，已知成神经管细胞瘤细胞对替莫唑胺具有抗性。数据表明靶向RGD4C-mTOR/shRNA可以使成神经管细胞瘤细胞对TMZ重新敏化并实现完全的肿瘤细胞根除。因此，通过RGD4C-噬菌粒靶向敲低mTOR表达是与替莫唑胺组合使用对抗化学抗性肿瘤细胞(如成神经管细胞瘤)的有效策略。
[0458] 图25示出了用TNFα载体处理成神经管细胞瘤细胞。因此，RGD4C/TNFα具有在靶向肿瘤杀伤(如成神经管细胞瘤)中使用的治疗潜力。图26示出了DIPG细胞的免疫荧光染色，以证明αV、β3和β5整联蛋白亚基，RGD4C-噬菌粒受体的表达。这些数据表明含有RGD4C靶向性肽的噬菌粒载体可以用于儿科脑肿瘤、DIPG中的靶向基因递送和基因治疗。
[0459] 图27示出了通过RGD4C-噬菌粒/AAV向UW288、DAOY或DIPG细胞选择性且剂量依赖性递送基因表达。这些数据证明RGD4C-噬菌粒能够以剂量依赖性和选择性方式成功地向DIPG递送基因表达。这些数据还表明RGD4C-PAAV在体外显示出对成神经管细胞瘤的有效基因转移，其随时间增加。在用对照(非靶向PAAV-Luc)转导的细胞中不存在非特异性摄取。用于成神经管细胞瘤细胞系的阳离子聚合物DEAE葡聚糖增强了转导效率。
[0460] 图28示出了用RGD4C-噬菌粒-TNFα进行处理。这些数据表明RGD4C-噬菌粒能够以选择性方式成功地将TNFα递送到DIPG(弥漫性内源性脑桥胶质瘤)，从而导致细胞凋亡诱导。因此，RGD4C-噬菌粒-TNFα具有在针对DIPG的靶向治疗中使用的治疗潜力。图28还显示成神经管细胞瘤是用RGD4C-噬菌粒-TNFα治疗的良好候选物，因为当用任一细胞系UW288或DAOY测试时，所述治疗导致肿瘤细胞杀伤作用。例如，相对于对照，UW288在第6天显示约60％的细胞死亡。用阳离子聚合物DEAE葡聚糖进一步增强肿瘤细胞杀伤作用。
[0461] 实例8——RGD4C-噬菌粒的荧光素酶表达
[0462] 方案：
[0463] 将HEK细胞置于完全培养基(DMEM、10％FBS、1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素)中的48孔板中并孵育至少48小时直至达到70-80％汇合。然后用PBS洗涤细胞，并用悬浮在无血清培养基(DMEM)中的杂合噬菌体/噬菌粒载体转导12小时，然后向所述培养基补充完全培养基。通过向50uL制备的Quanti-luc(InvivoGen，美国)试剂中加入10uL培养基来测量荧光素酶表达。使用配备有发光计(普洛麦格公司(promega)，美国)的读板器测量照片的发射。
[0464] 图29示出了在不同浓度的转导单位下用RGD.PAAV转导后的荧光素酶表达。此图显示了在用各种浓度的杂合噬菌体/噬菌粒载体孵育后，时间与荧光素酶的表达之间的剂量依赖性指数关系。此图表明，可以利用噬菌粒载体通过分泌荧光素酶的测定来实现可定量的基因表达。
[0465] 实例9——RGD.PAAV载体与293AAV细胞的结合
[0466] 方案：
[0467] 将293AAV细胞接种在完全培养基(DMEM+10％FBS、1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素)中的24孔板上并使其达到70-90％汇合，持续至少48小时。将细胞用500uL PBS洗涤两次并置于冰上，然后用200000Tu/细胞(转导单位/细胞)悬浮于200uL无血清DMEM中的PAAV载体进行转导。在冰上孵育1小时后，从孔中回收培养基，并在TG1大肠杆菌上滴定噬菌粒颗粒的量，并通过菌落计数进行定量。
[0468] 参考图30，其示出了与293AAV细胞的细胞表面结合的PAAV载体的百分比。相对于各自的对照，RGD.PAAV载体具有58.2％的结合效率而M13.PAAV载体具有7.1％的结合效率。
[0469] 实例10-通过PAAV转导肿瘤细胞以在其细胞表面上表达MUC1或PSMA抗原，使得肿瘤细胞可以被特异性CAR T细胞靶向
[0470] 目前，癌症的常规治疗包括以下三种选择中的一种或多种：外科手术、化学疗法和放射疗法。尽管这些干预措施有时可以治愈疾病，但在许多情况下，癌细胞并未完全消除，因此复发率很高。更糟糕的是，化疗和放疗会产生令人不快的副作用。因此，人们对开发癌症治疗的替代方法非常感兴趣。这些新治疗技术中最有前景的一种是癌症免疫疗法，其旨在利用患者自身免疫系统的能力和特异性来消除癌细胞。癌症免疫疗法是一种不断发展的治疗途径。两种主要策略涉及靶向肿瘤相关抗原(TAA)的主动免疫疗法和增强现有抗肿瘤反应的被动免疫疗法。
[0471] 癌症的实例包含小儿脑肿瘤，如成神经管细胞瘤和弥漫性内脑桥脑胶质瘤(DIPG)。成神经管细胞瘤是最常见的脑肿瘤并且起源于小脑，按照目前由手术切除、放疗和化疗所组成的治疗策略(Rudin等人,2009)，其生存率为5年。然而，幸存者通常具有长期的分泌和神经认知副作用。因此，迫切需要开发非侵入性、肿瘤特异性、更安全、成本有效且高效的新型治疗方法，以避免当前治疗的长期副作用。另一方面，弥漫性脑桥脑胶质瘤(DIPG)是仅在儿童中出现的最具攻击性的脑肿瘤，两年以上的生存率仅为6-10％。由于其弥漫性质，对于这种类型的癌症没有有效的治疗策略(Jansen等人,2012,Mueller和Chang,2009)。
[0472] 由于免疫系统的独特性质及其在生物体中的核心和普遍作用，免疫疗法具有治疗癌症的巨大潜力，并提供长期保护，同时可能提供比其它治疗更少的副作用。一种特殊的方法，过继细胞疗法(ACT)，涉及具有抗肿瘤活性的免疫细胞的转移。这些细胞可以是已经存在于肿瘤中的被称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的T细胞，其中一些对TAA具有特异性。这些细胞可以从切除的肿瘤组织中分离、离体培养、活化和扩增，然后重新注入患者体内。可用于ACT的其它类型的细胞包含表达经过修饰的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因工程T细胞。这些人工受体特异性地指导T细胞靶向由肿瘤细胞表达的抗原(Blankenstein T等人《肿瘤免疫原性的决定因素(The determinants of tumour immunogenicity)》《癌症自然评论(Nat Rev Cancer)》2012；12(4):307-13.；Sharpe M和Mount N《癌症治疗中的基因修饰T细胞：机遇和挑战(Genetically modified T cells in cancer therapy:opportunities and challenges)》《疾病模型与机制(Dis Model Mech)》2015；8(4):337-
50)。
[0473] CAR蛋白在T细胞表面表达，并含有与特定肿瘤抗原强烈结合的细胞外结合结构域、连接细胞外结构域和跨膜结构域的铰链区、跨膜结构域和细胞内信号结构域(也被称为共刺激结构域)，如CD28和OX40(肿瘤坏死因子受体)。由这些结构域介导的共刺激信号能够提高效率并延长T细胞的抗肿瘤活性(Sharpe M和Mount N《. 癌症治疗中的基因修饰T细胞：机遇和挑战》《疾病模型与机制》2015；8(4):337-50；Till BG等人《使用具有CD28和4-1BB结构域的嵌合抗原受体的CD20特异性淋巴瘤过继免疫疗法：试验性临床试验结果(CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28and 4-1BB domains:pilot clinical trial results)》《血液(Blood)》2012；119(17):3940-50；Koehler H等人《CD28共刺激克服了在抗肿瘤细胞攻击中转化生长因子-β介导的对重定向的人CD4+和CD8+T细胞增殖的抑制(CD28co-stimulation overcomes  transforming growth factor-beta-mediated repression of 
proliferation of redirected human CD4+and CD8+T cells in an antitumor cell attack)》《癌症研究(Cancer Res)》2007；67(5):2265-73)。可以将CAR T细胞设计成识别可以在肿瘤细胞表面上表达的广泛类型的抗原。潜在的靶抗原包含蛋白质、碳水化合物和糖脂。与常规T细胞和转基因TCR T细胞不同，CAR T细胞不需要由MHC处理和呈递抗原。因此，相同的基于CAR的策略可应用于表达相同肿瘤抗原的所有患者，无论患者的MHC单倍型如何(Sharpe M和Mount N《. 癌症治疗中的基因修饰T细胞：机遇和挑战》《疾病模型与机制》
2015；8(4):337-50，Haji-Fatahaliha M等人《用于癌症的CAR修饰的T细胞疗法：更新评论(CAR-modified T-cell therapy for cancer:an updated review)》《人造细胞、纳米医学和生物技术(Artif Cells Nanomed Biotechnol)》2015:1-11)。
[0474] 尽管有许多优点，CAR T细胞疗法仍有一些局限性。例如，肿瘤可能不表达合适的靶抗原。这可能由于各种原因而发生，如新抗原未知、以不适当的水平表达、仅在肿瘤细胞的亚群上表达、也在非肿瘤组织上表达、不以适合于将CAR T细胞靶向组织的方式表达，或者在治疗期间肿瘤抗原的表达可能减少或丢失。
[0475] 例如，据报道，一些CAR T细胞疗法在动物模型和临床试验中均具有不期望的毒性。当CAR T细胞识别的抗原不仅在肿瘤细胞上表达而且还在正常细胞上呈递导致健康组织损伤时，可能会出现这个问题(Palmer DC等人《靶向黑素瘤/黑素细胞相关抗原的有效肿瘤治疗触发严重的眼部自身免疫(Effective tumour treatment targeting a melanoma/melanocyte-associated antigen triggers severe ocular autoimmunity)》《美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)》2008；105(23):8061-6；Morgan RA等人《施用由识别ERBB2的嵌合抗原受体转导的T细胞后发生严重不良事件的病例报告(Case report of a serious adverse event following the administration of T cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing ERBB2)》《分子疗法(Mol Ther)》2010；18(4):843-51；Lamers CHJ等人《用基因性地重新靶向碳酸酐酶IX的自体T淋巴细胞治疗转移性肾细胞癌：首个临床经验(Treatment of Metastatic Renal Cell Carcinoma With Autologous T-Lymphocytes Genetically Retargeted Against Carbonic Anhydrase IX:First Clinical Experience)》《临床肿瘤学杂志(Journal of clinical oncology)》2006；24(13):e20-e2；Grupp SA等人《针对急性淋巴性白血病的嵌合抗原受体修饰的T细胞(Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia)》《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》2013；368(16):1509-18)。因此，靶抗原的可用性和选择是具有挑战性的。理想情况下，抗原仅由肿瘤细胞或由对生存不重要的正常细胞呈现(Rosenberg SA、Restifo NP《作为人类癌症的个性化免疫疗法的过继细胞转移(Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer)》《科学(Science)》
2015；348(6230):62-8)。目前，已经成功开发出许多针对各种肿瘤抗原的CAR T细胞，如用于治疗前列腺癌和乳腺癌的粘蛋白1(MUC1)(Sanchez C等人《结合t细胞免疫疗法和抗雄激素疗法治疗前列腺癌(Combining T-cell immunotherapy and anti-androgen therapy for prostate cancer)》《前列腺癌及前列腺疾病(Prostate Cancer Prostatic Dis)》
2013；16(2):123-31,S1；Wilkie S等人《将人T细胞重新靶向肿瘤相关MUC1：嵌合抗原受体的进化(The Evolution of a Chimeric Antigen Receptor)》《免疫学期刊(The Journal of Immunology)》2008；180(7):4901-9)、用于治疗前列腺癌的前列腺特异性膜抗原(PSMA)(Maher J等人《由单一嵌合TCR[zeta]/CD28受体指导的人T淋巴细胞细胞毒性和增殖(Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCR[zeta]/CD28receptor)》《自然生物技术(Nat Biotech)》2002；20(1):70-5)、用于治疗B细胞恶性肿瘤的CD19和CD20(Brentjens RJ等人《过继转移的自体CD19靶向T细胞在患有复发或化疗难治性B细胞白血病的患者中的安全性和持久性(Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias)》《血液》
2011；118(18):4817-28)以及用于治疗前列腺癌和乳腺癌的雌激素相关受体β2型(ErRB2)(Pinthus JH等人《使用嵌合受体重定向的人淋巴细胞建立前列腺肿瘤的免疫基因疗法(Immuno-Gene Therapy of Established Prostate Tumors Using Chimeric Receptor-redirected Human Lymphocytes)》《癌症研究(Cancer research)》2003；63(10):2470-6)。
此外，为了在肿瘤细胞上追求更高的选择性，已经通过几种策略开发了T细胞，包含双CAR T细胞，其被修饰成表达特异性靶向在同一肿瘤细胞上表达的两个不同抗原的两个CAR(Kloss CC等人《具有平衡信号传导的组合抗原识别促进工程化T细胞的选择性肿瘤根除(Combinatorial antigen recognition with balanced signalling promotes selective tumor eradication by engineered T cells)》《自然生物工艺学(Nat Biotechnol)》2013；31(1):71-5；Wilkie S等人《在乳腺癌中使用被工程化以提供互补信号的嵌合抗原受体对ErbB2和MUC1进行双重靶向(Dual targeting of ErbB2and MUC1 in breast cancer using chimeric antigen receptors engineered to provide complementary signalling)》《临床免疫学杂志(J Clin Immunol)》2012；32(5):1059-
70)。
[0476] 分子克隆和基因工程
[0477] 通过将PAAV-CMV-GFP质粒(图3)与pUC57-CD28-IL4质粒、pUC57-GPI-IL4或pUC57-PSMA质粒组合来构建每个PAAV-CMV-CD28-IL4、PAAV-CMV-GPI-IL4和PAAV-CMV-PSMA(图32f)，而PAAV-Grp78-GFP质粒与pUC57-CD28-IL4质粒、pUC57-GPI-IL4或pUC57-PSMA质粒组合以构建PAAV-Grp78-CD28-IL4、PAAV-Grp78-GPI-IL4和PAAV-Grp78-PSMA。
[0478] 新质粒；PAAV.CMV.MUC1.CD28.IL4、PAAV.CMV.MUC1.GPI.IL4、PAAV.CMV.PSMA、PAAV.Grp78.MUC1.CD28.IL4、PAAV.Grp78.MUC1.GPI.IL4和PAAV.Grp78.PSMA通过限制酶消化和连接进行，转化到TG1感受态大肠杆菌中，并在含有氨苄青霉素的2xYT顶层琼脂上平板接种。首先通过限制性消化和凝胶电泳并然后通过DNA测序(MRC CSC基因组学核心实验室，英国)来验证所有构建体。
[0479] 图31示出了用于噬菌体引导的CAR T细胞疗法的表达质粒构建体的实施例的示意图。32a代表由CMV启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，32b代表由CMV启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒，32c代表由CMV启动子驱动的PSMA表达质粒，32d代表由Grp78启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，32e代表由Grp78启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒并且32f代表由Grp78启动子驱动的PSMA表达质粒。
[0480] CD28、GPI和PSMA抗原表达
[0481] 将12孔板中约60％汇合的HEK 293细胞与每个载体(1,000,000TU/细胞)在由补充有10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)、L-谷氨酰胺(2mM，西格玛公司(Sigma))、青霉素(100单位/毫升，西格玛公司)和链霉素(100mg/ml，西格玛公司)组成的完全培养基中孵育24小时。未处理的细胞用作阴性对照。第二天，从培养物中除去所有载体，并将细胞保持在37℃、5％CO2的潮湿培养箱中，作为完全培养基中的单层。培养基每两天更新一次。
[0482] 在转导后第6天，用细胞解离缓冲液(英杰公司(Invitrogen))收获细胞，在洗涤缓冲液(含有2％FBS和0.1％NaN3的PBS)中洗涤，并在室温下在Clear Back(人Fc受体阻断剂，MBL)中孵育20分钟。随后将细胞与John Maher博士(伦敦国王学院，英国)提供的HMFG2抗体或在洗涤缓冲液中稀释的PSMA抗体(MBL)一起在4℃下孵育过夜。第二天，将细胞在洗涤缓冲液中洗涤，并在室温下与抗小鼠IgG Alexa fluor 488缀合的二抗(英杰公司)一起孵育30分钟。最后在洗涤缓冲液中洗涤细胞，并进行FACs calibur流式细胞仪(BD生物科学公司)。测量每个三个孔的至少20,000个门控细胞的平均荧光强度。使用Flowjo(TreeStar)软件分析结果。
[0483] 转导后第6天的MUC-1.CD28、MUC-1.GPI和PSMA抗原表达
[0484] 通过106TU/细胞的RGD靶向PAAV(RGD)或非靶向PAAV(NT)转导HEK 293细胞。图33示出了结果数据。未处理的HEK 293细胞(Ctrl)和仅有488二抗染色(Ant.488)的靶向PAAV转导的HEK 293细胞显示为对照。(A)代表由CMV启动子驱动的PAAV载体转导的HEK 293细胞的MUC-1或PSMA表达。加入DEAE-葡聚糖。(B)代表在未加入DEAE葡聚糖的情况下由CMV启动子驱动的PAAV载体转导的HEK 293细胞的MUC-1或PSMA表达。(C)代表在未加入DEAE葡聚糖的情况下由Grp78启动子驱动的PAAV载体转导的HEK 293细胞的MUC-1表达。
[0485] 稳定的细胞系选择
[0486] 为了选择在其细胞表面上表达MUC-1.CD28、MUC-1.GPI或PSMA抗原的稳定细胞系，将嘌呤霉素抗性序列插入PAAV-CMV-CD28-IL4、PAAV-CMV-GPI-IL4、PAAV-CMV-PSMA、PAAV-Grp78-CD28-IL4、PAAV-Grp78-GPI-IL4和PAAV-Grp78-PSMA质粒中。
[0487] 图34示出了具有嘌呤霉素抗性基因的表达质粒构建体的示意图，所述嘌呤霉素抗性基因用于稳定细胞系选择噬菌体引导的CAR T细胞疗法治疗；34a代表由CMV启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，34b代表由CMV启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒，[0488] 34c代表由CMV启动子驱动的PSMA表达质粒，34d代表由Grp78启动子驱动的MUC1-CD28.IL4表达质粒，34e代表由Grp78启动子驱动的MUC1-GPI.IL4表达质粒并且34f代表由Grp78启动子驱动的PSMA表达质粒。
[0489] 新质粒通过限制酶消化和连接进行，转化到TG1感受态大肠杆菌中，并在含有氨苄青霉素的2xYT顶层琼脂上平板接种。首先通过限制性消化和凝胶电泳并然后通过DNA测序(MRC CSC基因组学核心实验室，英国)来验证所有构建体。
[0490] 结果
[0491] 使用辅助噬菌体系统产生对MUC1或PSMA转基因进行编码的PAAV载体。这些转基因产物在被PAAV转导后在肿瘤细胞表面上显示。MUC1-CAR T细胞和PSMA-CAR T细胞特异性识别MUC1和PSMA抗原。
[0492] 本文提供的数据显示，本发明的噬菌粒颗粒可以用于转导癌细胞，并且癌细胞随后以适合用作过继转移的T细胞的靶标的方式稳定地显示被递送的抗原。
[0493] 讨论
[0494] 有强有力的证据表明，在商业细胞系和疾病细胞系中，靶向PAAV载体在基因转导方面比AAVP载体更有效。内化和基因表达数据均一致表明PAAV比AAVP更有效。还提供证据表明DEAE-Dex与PAAV载体之间的强协同效应在基因转导上超过AAVP的协同效应。尽管这些数据表明PAAV优于AAVP，但还必须考虑到PAAV载体样品含有辅助噬菌体污染物。尽管做出了在载体生产过程中优化实验条件的努力，辅助噬菌体污染物(在这种情况下，大约1/10)是不可避免的并且将竞争性地抑制转导，因为辅助噬菌体污染物也在其次要外壳蛋白上显示RGD靶向性序列。考虑到这一点，内化和基因表达数据很可能低估了RGD.PAAV的“真实”功效。此外，因为内化测定利用细胞内噬菌体衣壳的染色进行信号检测，所以较小的PAAV总体大小(和每颗粒可用的衣壳蛋白)意味着内化的颗粒的比例数不能直接与AAVP的比例数进行比较，我们已经使用长度为PAAV颗粒的两倍的TEM示出了这一点。因此，本发明的方法涉及用于除去辅助噬菌体的纯化步骤(例如FPLC)。
[0495] 至关重要的是，除了提供机械洞察力之外，未来的工作必须涵盖使用纯PAAV样品复制所有实验。具体地说，噬菌粒引导的rAAV生产可以从辅助噬菌体污物染物降低竞争性抑制中获益，并且与常规转染方案相比，产生倍数更高的rAAV颗粒。
[0496] 总结
[0497] 描述了在向哺乳动物细胞进行基因转移方面高效的杂合噬菌粒载体。这些噬菌粒/AAV(PAAV)载体具有非常大的克隆能力并且靶向哺乳动物细胞，这意味着不需要转染试剂。这种平台允许产生适合于治疗性基因治疗的载体。提供证据表明，这种平台可以将基因(包含适于通过过继性T细胞转移疗法或CART细胞疗法靶向的抗原)递送到肿瘤细胞。
[0498] 施例11——用于将TRAIL基因导向递送到儿科DIPG细胞的优良噬菌粒/AAV杂合载体。
[0499] 研究了细胞因子在基因治疗中的用途，因为细胞因子通过细胞凋亡发挥分化、增殖、激活或诱导细胞死亡的多种功能。肿瘤坏死因子(TNF)超家族是一类受关注的分子，因为它们能够诱导肿瘤细胞的死亡。包含Fas配体(FasL)、CD95配体(CD95L)和TNFα的TNF超家族的成员已被鉴定为癌症生物疗法的重要治疗剂。它们的施用可以诱导不同癌细胞的细胞凋亡，但也会对肝脏产生严重的毒性，这妨碍了其在临床中的应用。
[0500] 鉴于全身毒性的困境，TNF超家族的另一成员TRAIL正在成为一种有前景的癌症治疗药物。使用重组TRAIL和针对TRAIL受体的抗体的临床前和早期临床试验表明，TRAIL在保持其抗肿瘤特性的同时对肿瘤细胞具有优先毒性，对正常组织通常具有很小毒性或无毒性。TRAIL以mRNA水平既定存在于许多组织中，最主要存在于脾、肺和前列腺中，并且主要由如自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞等免疫系统的细胞表达。
[0501] TRAIL合成为II型跨膜蛋白，其也可被半胱氨酸蛋白酶蛋白水解切割以产生分泌形式7。膜结合构象似乎更有效，因为TRAIL作为同源三聚体具有生物活性，并且这种特定构象可能促进配体-受体复合物的交联，从而增加信号传导强度。分泌形式的效力较低，但通过改造与基序(如亮氨酸拉链)融合的细胞外结构域可以增强效果，这有助于稳定和形成同源三聚体。
[0502] 与它他TNF超家族成员一样，TRAIL通过与靶细胞表面上的交联受体分子相互作用来诱导细胞凋亡5、10。已经鉴定出5种受体：TRAIL R-1和R-2是含有触发细胞凋亡的细胞质序列死亡结构域(DD)的死亡受体，而TRAIL R-3、R-4和骨保护蛋白是预防细胞凋亡5、6、10的诱饵受体。
[0503] 当同源三聚体TRAIL与死亡受体结合时，受体形成三聚体并募集衔接蛋白Fas相关死亡结构域(FADD)。FADD募集启动子半胱天冬酶8或10，从而形成死亡诱导信号复合物(DISC)，其中启动子半胱天冬酶通过蛋白水解自动激活。激活的半胱天冬酶8或10然后切割效应子半胱天冬酶3，从而导致死亡底物的裂解和细胞死亡。相反，如果TRAIL与诱饵受体结合，则不会募集FADD并且不会触发细胞凋亡。即使在对TRAIL诱导的细胞凋亡具有抗性的细胞中，TRAIL也能诱导坏死性凋亡11。TRAIL受体系统可以诱导肿瘤支持性免疫细胞的直接杀伤，并且其在NK细胞上的表达是免疫系统用于杀死癌细胞的重要机制。
[0504] 遗憾的是，目前用于提供TNF超家族的激动剂(包含重组TRAIL或针对TRAIL受体的激动剂抗体)的临床试验未能在癌症患者中产生临床益处，部分原因是由于激动剂活性不足以及药物的半衰期短。此外，由于担心全身递送更强的药剂可能引起致命的副作用，这些药物通常从设计上功效受到限制。为了确保以最佳浓度递送TRAIL以产生临床结果，需要合适的载体以选择性地靶向癌细胞并将TRAIL转运到癌细胞。
[0505] 使用基于噬菌体显示的技术，显示靶向并结合在肿瘤组织中选择性表达的受体的配体的病毒载体可以用于递送TRAIL。大多数研究都集中在使用真核病毒(如逆转录病毒和腺病毒)作为载体，因为它们提供了优异的转基因递送。然而，由于这些真核病毒对哺乳动物细胞膜受体的广泛趋向性(从而导致肝脏、网状内皮系统和不需要的组织不期望地摄取)以及免疫原性，它们在全身基因治疗中取得的成功有限。相反，原核病毒是有利的(因为其不需要消除针对哺乳动物细胞的天然趋向性)、是成本有效的并且容易以高滴度产生。由于原核病毒缺乏趋向性，其本身就是用于哺乳动物细胞转导的不良媒剂13。然而，通过改变噬菌体的外壳蛋白以显示选择性配体肽基序，噬菌体可以内化到细胞中。
[0506] 使用基于细菌病毒、细菌噬菌体或噬菌体的载体，可以实现仅对肿瘤有效施用治疗以获得延长的效果而不存在全身毒性。这些基于噬菌体的载体可以被改造成在其外壳蛋白上显示选择性配体肽基序，以允许病毒与靶细胞结合并随后内化从而配体定向递送基因19。通过组合真核病毒和原核病毒的有利生物学特性，构建了嵌合病毒载体，其包括重组腺相关病毒(AAV)和M13衍生的丝状噬菌体，其被命名为AAV/噬菌体或AAVP13。噬菌体的pIII外壳蛋白被改造成显示双环肽CDCRGDCFC(RGD-4C，SEQ ID NO:7)，所述双环肽结合在肿瘤和支持血管生成的脉管系统两者中过量表达的特定αv整联蛋白受体(ανβ3或αvβ5)。这允许作为靶向平台的治疗性转基因的优异的配体指导递送和细胞转导，并且这些功能属性已经在包含前列腺癌、乳腺癌和软组织肉瘤的几种癌症的临床前模型中得到证实。
[0507] 发明人通过使用噬菌粒系统改进已知的载体平台以产生被称为噬菌粒-AAV(PAAV)的下一代载体(图43)。PAAV载体是嵌合病毒——含有使用来自AAV血清型2的DNA序列构建的杂合基因组的M13丝状噬菌体。所关注的基因受组成型活性巨细胞病毒、CMV启动子调控，并且侧翼为全长反向末端重复序列(ITR)。噬菌粒含有用于单链复制和包装到噬菌体颗粒中的f1复制起点；以及用于进入靶细胞后的双链复制的复制起点。在克隆和产生病毒载体期间可以用氨苄青霉素进行选择。
[0508] 在这个杂合载体模型中，大部分噬菌体基因组被去除从而允许容纳更长的DNA序列，但是需要使用辅助病毒来提供衣壳和其它噬菌体组分。首先在M13噬菌体的pIII外壳蛋白上显示RGD-4C肽基序，以产生靶向骨架辅助病毒。然后使用辅助病毒转导含有工程化噬菌粒的TG1大肠杆菌，并且可以使用抗生素选择压力来选择含有噬菌粒的靶向载体。新模型能够容纳更长的DNA序列，具有更高的转导效率，并且可以以比原始AAVP更高的滴度产生。
[0509] 不希望受任何特定理论的束缚，可以通过两种方法实现转导效率的进一步改善。首先，通过改造RGD-4C肽以将其显示在pVIII外壳蛋白上而不是pIII外壳蛋白上。作为主要外壳蛋白的pVIII以高达2700个拷贝表达，而pIII仅表达高达5个拷贝。因此，认为可用于靶向并结合整联蛋白的更多数量的RGD-4C配体在结合和转导细胞方面具有更高的效率。
[0510] 不希望受任何特定理论束缚，另一种提高效率的策略是通过在重组pVIII外壳蛋白上显示富含组氨酸的H5W配体，即内体逃逸肽。即使内化效率高，通过诱捕载体并阻止载体发挥其治疗效果，细胞内屏障(如内体)也可以限制基因表达的速率。组氨酸侧链可以形成两性离子，使其充当质子海绵并在配体导向的噬菌体载体内吞作用后缓冲内体中的低pH。当质子进入内体时，水通过液泡膜质子泵被吸入内体，导致在内体上形成孔，从而释放噬菌体载体。
[0511] 这个研究的目的是通过改变载体外壳蛋白上显示的肽，开发出具有最佳DIPG细胞转导效率的优质PAAV载体。接下来，使用最合适的PAAV载体递送TRAIL转基因以评估TRAIL作为治疗基因在DIPG治疗中的有效性。
[0512] 不受任何特定理论束缚，发明人假设：
[0513] 1.通过在pVIII外壳蛋白上显示RGD-4C配体或在重组pVIII外壳蛋白上显示H5W肽，可以增强靶向特异性和基因转移功效。
[0514] 2.TRAIL是一种可以在体外实验和体内原位DIPG动物模型中特异性诱导DIPG细胞死亡的有效的治疗基因。
[0515] 研究目的
[0516] 1.设计并生产用于特异性靶向DIPG细胞的病毒载体，其具有期望基因的最佳表达。
[0517] 2.评估并研究治疗基因TRAIL对DIPG的杀伤潜力
[0518] 3.评估靶向TRAIL表达在体内对DIPG的特异性，并研究将载体静脉内施用于具有已建立的原位人DIPG的免疫缺陷小鼠后的治疗功效。
[0519] 方案
[0520] 细胞培养
[0521] 将HEK293T细胞系维持在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素和链霉素的杜氏改良的伊格尔氏培养基(DMEM)中。巴塞罗那妇女儿童医院(Hospital Saint Joan de Déu Barcelona)获得DIPG肿瘤细胞系。将其维持在补充有10％FBS的肿瘤干细胞培养基(TSM)中。根据提供的配方制备TSM(表XXX)。
[0522] 整联蛋白染色
[0523] 将DIPG细胞接种在24孔板中的聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片上，并生长至60-70％汇合。用5个孔染色：对照、仅二抗、αv、β3和β5整联蛋白。洗涤细胞并在室温(RT)下在4％甲醛中固定10分钟。将细胞在PBS中洗涤三次，并与50mM氯化铵一起孵育5分钟。用PBS再次洗涤细胞三次，并在2％牛血清蛋白(BSA-PBS)中封闭30分钟。随后，将细胞与一抗抗αv整联蛋白(1:100)、抗β3整联蛋白(1:50)和抗β5整联蛋白(1:100)一起在1％BSA-PBS中稀释一天并在4℃下保持在湿润的室中。然后，用1％BSA-PBS将细胞洗涤三次，并将细胞与二级Alex Fluor 488缀合的抗体(1:750)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1:2000)一起孵育1小时。将盖玻片用1％BSA-PBS洗涤三次，用PBS洗涤三次，并用无菌水洗涤一次。空气干燥后，将盖玻片安装在Mowiol封固剂中。观察细胞并用荧光显微镜拍摄图像。
[0524] 用pVIII外壳蛋白上显示的RGD-4C配体产生、纯化和滴定辅助噬菌体(图44)[0525] 通过聚合酶链反应(PCR)修饰野生型M13噬菌体DNA以在pVIII外壳蛋白上表达RGD-4C。在PCR中使用的引物是在项目开始之前由同事(Sajee Waramit)设计的。使用T4DNA连接酶(NEB公司)连接PCR产物，并将其转化到DH5α细菌中进行克隆。通过Miniprep(凯杰公司(QIAGEN))提取质粒，通过限制性消化和凝胶电泳验证质粒，然后送去测序以确保DNA序列的完整性(MRC CSC基因组学核心)。然后将选择的克隆转化到TG1感受态大肠杆菌(Zymo研究公司)中，并在37℃的培养箱中在含有50μg/ml卡那霉素的2xYT(西格玛公司)琼脂上平板接种过夜。
[0526] 在菌落形成后，选择单个菌落并在振荡培养箱(32℃、220rpm)中在含有卡那霉素的1升2xYT培养基中生长18小时。将过夜培养物在4℃下以6000g离心30分钟。收集噬菌体上清液，加入20％v/v PEG/NaCl(20％PEG 6000，2.5M NaCl)并充分混合。在冷室中孵育过夜后，再次将上清液在4℃下以10000g离心30分钟。将噬菌体沉淀重悬于16mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)和20％v/v PEG/NaCl中，并在冷室中保持过夜。将最终的噬菌体悬浮液在4℃下以10,000g离心30分钟，并丢弃上清液。将纯化的噬菌体沉淀物重悬于1-2mL PBS中(取决于沉淀物大小)并通过0.45μm滤筒进行无菌过滤。
[0527] 使用10倍增量的连续稀释液进行滴定。使用5μL每种稀释度的噬菌体感染500μL通过在37℃下孵育30分钟而生长至对数期(OD600＝0.45-0.50)的幼稚TG1大肠杆菌。孵育后，将100μL细菌在37℃的培养箱中在2xYT琼脂上与卡那霉素一起接种过夜。第二天早晨，在孵育18小时后计数菌落，估计病毒滴度并将其表示为细菌转导单位(TU)。
[0528] 含有报告基因(绿色荧光蛋白\[GFP]和lucia萤光素酶\[lucia])的RGD pVIII载体的产生、纯化和滴定(图45)
[0529] 为了评估DIPG细胞转导的效率，构建具有报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和lucia(InvivoGen)的含有噬菌粒的载体。通过荧光显微镜可以检测GFP表达，而lucia是分泌型荧光素酶，其可以通过测量相对荧光素酶单位(RLU)用其底物Quanti-Luc定量。以下方案使用PAAV-GFP质粒或PAAV-lucia质粒。
[0530] 首先将质粒转化到TG1感受态大肠杆菌(Zymo研究公司)中，并在37℃的培养箱中在含有50μg/ml氨苄青霉素的2xYT(西格玛公司)琼脂上平板接种过夜。在菌落形成后，选择单个菌落并在振荡培养箱(32℃、220rpm)中在含有氨苄青霉素的2xYT培养基中生长。使100mL细菌生长至对数期(OD600＝0.45-0.50)，然后加入15-20μL RGD pVIII辅助噬菌体并在振荡培养箱(32℃、150rpm)中孵育。然后将细菌在振荡培养箱(32℃、150rpm)中在1L含有卡那霉素和氨苄青霉素的2xYT培养基中生长18小时。按照先前的研究进行纯化。通过仅用氨苄青霉素在2xYT上培养细菌和仅用卡那霉素在另一个平板上培养细菌来进行滴定，以分别估计报告基因载体和辅助噬菌体的滴度。
[0531] 含有报告基因(lucia)的H5W肽RGD pIII载体的产生、纯化和滴定
[0532] H5W RGD pIII辅助噬菌体是在项目开始之前由同事(Sajee Waramit)制备的。制备过程与之前陈述的方案非常相似，除了还加入1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)以选择H5W RGD pIII载体外。按照先前的研究对载体进行纯化和滴定。
[0533] 将载体转导入细胞
[0534] 将转导中使用的细胞(HEK293T或DIPG)接种在平板中直至60-70％汇合。然后移除培养基，并将细胞与在OptiMEM中稀释的载体一起孵育过夜，基于从滴定获得的病毒滴度得到所述载体的量。然后移除转导介质并用完全培养基替换。对于用GFP转导的细胞，在指定的时间点，在荧光下观察细胞，并拍摄图像以寻找表达GFP的细胞。对于用lucia转导的细胞，在指定的时间点，将10μl细胞培养基和25μl Quantti-Luc(InvivoGen)，即lucia的底物，在白色聚苯乙烯96孔板中混合，然后在室温下孵育5分钟。使用普洛麦格公司Glomax酶标仪定量荧光素酶表达。
[0535] 评估并研究治疗基因TRAIL对DIPG的杀伤潜力
[0536] 用于转染的PAAV-人TRAIL(hTRAIL)质粒的产生(图46)
[0537] 通过PCR用hTRAIL基因序列替换PAAV-GFP质粒中的GFP序列。通过使用特异性引物(表1)克隆pUNO1-hTRAIL(InvivoGen)来扩增hTRAIL基因并将其设计成在末端含有EcoRI和SalI的限制性位点。按照先前的研究进行分子克隆、质粒提取和DNA序列验证。然后将选择的克隆转化到TG1细菌中进行扩增，然后通过Maxiprep(凯杰公司)进行提取。
[0538] 表1：使用pUNO1-hTRAIL和PCR用于产生具有限制性位点(EcoRI/SalI)的hTRAIL片段的引物序列(英杰公司)。
[0539] 正向引物5′–3′GAG TGA ATT CGC TGT GAC CGG CGC CTA C–SEQ ID NO:24
反向引物5′–3′
GCT CGT CGA CTC ATG TCT GGC CAG CTA GCT TAG CC–SEQ ID NO:25
[0540] 将质粒转染到细胞中
[0541] 将DIPG细胞接种在48孔板中直至60-70％汇合。在开始实验之前，将细胞在OptiMEM低血清培养基中孵育1-2小时。对于48孔板，FuGENE Hd转染方案(普洛麦格公司)所述方案建议瞄准0.5-2.0ml的介质体积、0.6-1.8μl的FuGENE体积、0.2-0.6μg的DNA量。转染效率取决于FuGENE与DNA的比例，在这种情况下使用3:1的比例。
[0542] 制备Eppendorf管并标记用于实验。根据要使用的FuGENE的体积，将OptiMEM添加到每个管中，最多20μl。然后将FuGENE直接加入培养基中而不与塑料管壁接触，并将混合物在室温下孵育5分钟。将质粒DNA加入管中，并将转染试剂：DNA复合物在室温下孵育15分钟。然后将所述复合物以逐滴的方式添加到DIPG细胞中并且将板旋转以确保均匀分布。将细胞在37℃下孵育6小时，然后将转染培养基更换为补充有不含抗生素的FBS的TSM培养基。在培养箱中替换细胞，并在接下来的24-48小时内观察细胞活力。
[0543] 结果
[0544] DIPG细胞表达用于RGD-4C配体结合的整联蛋白受体
[0545] 为了确定用于在这种细胞系中靶向基因递送的这种载体模型的适合性，首先通过荧光显微镜研究细胞的整联蛋白αvβ3和αvβ5的表达。如图47所示，测试的DIPG细胞对于αv、β3和β5单位的表达呈阳性，在没有抗体或仅二抗的情况下孵育的细胞中未观察到荧光。
[0546] 显示在pIII外壳蛋白上的RGD-4C配体比pVIII外壳蛋白的配体产生更高的转导效率和基因表达水平。
[0547] 来自发明人实验室的先前数据表明，与未靶向载体介导相比，靶向RGD-4C pIII载体介导的基因递送和表达是具有选择性且有效的。为了优化转导，假设之一是在pVIII外壳蛋白上显示RGD-4C，以便增加每个噬菌体的配体拷贝数(图48)。
[0548] 使用报告基因载体(GFP或lucia)，使用人肾胚细胞HEK293T(连续用于表征噬菌体载体的细胞模型)比较转导效率。将细胞与未靶向的载体(缺乏RGD-4C的对照)、靶向的RGD pIII PAAV-GFP或RGD pVIII PAAV-GFP载体一起孵育，并在荧光显微镜下观察细胞(图49)。在所有TU中，在用RGD pIII PAAV-GFP转导的细胞中观察到最高的GFP表达。
[0549] 类似地，在用未靶向的RGD pIII PAAV-lucia或RGD pVIII PAAV-lucia载体转导的HEK293T细胞中，在RGD pIII PAAV-lucia中观察到最高的RLU(图50)。这表明在pIII上显示的RGD在转导和基因表达方面优于pVIII。
[0550] 在重组pVIII外壳蛋白上显示的H5W肽提高转导效率和基因表达
[0551] 优化载体的另一种策略是在重组pVIII外壳蛋白上显示H5W肽。来自实验室的先前数据显示，在使用含有报告基因lucia的载体的转导实验中(Sajee Waramit，未发表的数据)，与单独的RGD pIII相比，H5W肽的显示增加了HEK293T细胞中的荧光素酶表达(图51)。
[0552] 为了研究这一发现是否可以应用于DIPG细胞，将DIPG细胞与未靶向的RGD pIII PAAV-lucia或H5W RGD pIII PAAV-lucia载体一起孵育。与HEK293T数据一致，在H5W RGD pIII PAAV-lucia中观察到DIPG细胞中的最高RLU(图52)。这表明H5W肽能够提高DIPG细胞中的载体效率，并且应该用于最终的载体构建体中。
[0553] 将PAAV-hTRAIL质粒转染到DIPG细胞中诱导了细胞死亡
[0554] 在优化载体之后并且在进行进一步实验之前，必须确定选择的所关注基因，即人TRAIL(hTRAIL)是否能够通过转染在DIPG细胞中诱导细胞死亡。
[0555] 用PAAV-hTRAIL或对照PAAV-GFP质粒转染DIPG细胞。根据在所有DNA浓度下转染后18小时拍摄的显微图像，在用PAAV-hTRAIL转染的细胞中存在显著更多的细胞死亡(图53)。
[0556] 讨论
[0557] 不希望受任何给定理论的束缚，迄今为止的数据显示，在pIII外壳蛋白上表达H5W和RGD-4C的载体在靶向并诱导DIPG细胞中期望基因的表达方面是最佳的。来自转染实验的数据还表明治疗基因TRAIL能够诱导DIPG细胞死亡，这需要进一步研究。
[0558] 实例12——杂合IL2-TNFa
[0559] 为了增加肿瘤位点内TNFα的靶向局部区域生产，发明人通过将来自IL-2的信号肽插入缺少跨膜结构域的TNFα序列之前构建了对分泌型TNFα进行编码的噬菌粒。据发明人所知，这是第一次设计杂合IL2-TNFα，并且他们的数据表明，用IL2信号肽序列开始TNFα基因显著增强了癌细胞中TNFα的表达和分泌。这些修饰代表了可用于肿瘤微环境中TNFα靶向生产和释放的技术的显著进步，并且应该考虑这些修饰以便增加TNFα的治疗水平。
[0560] 方案
[0561] PAAV.Grp78.IL-2SP.hTNFa构建
[0562] 插入噬菌粒中的编码性治疗序列是杂合序列，其含有葡萄糖调节蛋白(Grp78)的肿瘤特异性启动子、来自IL-2的信号肽(SP)序列(图57)和人TNFa序列。Grp78启动子是应激诱导的，并且受到葡萄糖剥夺、慢性缺氧和酸性pH条件的强烈激活，这些条件在侵袭性且灌注不良的肿瘤中持续存在。此外，Grp78启动子在多种肿瘤中被诱导，并因此使其成为用于基因治疗的有吸引力的候选物。先前的研究已经证明这种启动子优于病毒启动子的几个优点。在携带LacZ转基因的转基因小鼠中也已经优雅地报道了这种启动子的安全性和肿瘤特异性。在这些转基因小鼠中建立的肿瘤中显示出高LacZ表达，而在主要的正常组织中未检测到启动子活性。此外，与基因治疗载体中使用的病毒启动子不同，如Grp78等哺乳动物启动子在真核细胞中不沉默。在发明人先前发表的研究中，他们报道了，相比于携带巨细胞病毒CMV启动子的RGD4C/噬菌体-CMV，双靶向RGD4C/噬菌体-Grp78提供持久的转基因表达。包含RGD4C配体和Grp78启动子产生具有靶向细胞进入和转录水平的双肿瘤的载体。
[0563] TNFα是跨膜的，为了产生在肿瘤细胞的细胞表面具有更好的受体可用性的分泌型TNFα，我们通过去除TNFα的跨膜结构域并用白细胞介素-2(IL-2)的信号肽替换跨膜结构域来产生分泌形式的TNFα。IL-2先前用作在各种研究中测试的有效信号肽，以便增强其它细胞因子或生长因子到细胞外环境中的分泌并随后增加这些因子对其相应受体的功效和可用性。将侧翼为BamHI和EcoRI限制性位点的IL-2信号肽序列(赛默飞世尔科技公司(Thermoscientific)，英国)连接至PAAV.Grp78骨架。通过聚合酶链式反应(PCR)从pUNO1-hTNFα(Invivogen，法国)提供侧翼为EcoRI和SalI限制性位点的hTNFα序列，然后将其连接至PAAV.Grp78.IL-2骨架。使用限制酶消化(NEB公司，英国)和用于连接的快速T4DNA连接酶(NEB公司，英国)进行分子克隆步骤。将经过修饰的质粒转化到TG1感受态大肠杆菌(Zymo研究公司，美国)中。然后在2xYT琼脂板上通过氨苄青霉素筛选选择携带质粒的细菌。通过限制性消化和凝胶电泳以及DNA测序(MRC CSC基因组学核心实验室，英国)来验证构建体，参见图58。
[0564] 实例13——PAAV递送的TNFα细胞因子基因疗法在DIPG中的应用
[0565] 介绍
[0566] 弥漫性脑桥脑胶质瘤(DIPG)是仅在儿童中出现的最具攻击性的脑肿瘤，两年以上的生存率仅为6-10％。由于其扩散性质及其在脑干中的敏感位置，手术切除并不可行，并且对于这种类型的癌症没有有效的治疗策略。目前DIPG的标准治疗方法是放射治疗，但并未取得任何成功，因为即使与放射增敏剂联合使用，所有儿童仍会复发。许多临床试验已经测试了化学疗法与常规放疗相结合的效果，但即使结合高剂量的化学治疗药物，也未能改善总生存率的提高。这种对化学疗法的抗性是由于完整的血脑屏障以及脑桥中DIPG的解剖位置使得任何药物更难以到达目标位置导致的。为了克服这个问题，临床试验已经应用对流增强递送(CED)来递送化学药物托泊替康，从而治疗2名儿童的DIPG。在这项初步研究中，尽管最初肿瘤大小缩小，但两名患者在治疗后死亡。CED是一种通过持续流动将化学治疗药物递送到脑肿瘤的技术。临床试验最近使用这种技术通过绕过血脑屏障来克服药物递送挑战。
[0567] DIPG的靶向治疗似乎是最好的解决方案，因为其具有弥散性和敏感的位置。为了靶向DIPG肿瘤，正在进行的临床试验通过用8H9抗体标记放射性物质124I来应用靶向放射的概念，已知所述抗体选择性地结合癌细胞而不损害健康脑细胞(美国临床试验注册中心(clinicaltrials.gov)号NCT01502917)[8]。如我们小组(Hajitou实验室)所建议的在胶质母细胞瘤中表现出高选择性的另一个靶向脑瘤的候选者是第3章讨论的RGD4C肽结合的整联蛋白3和5。事实上，靶向DIPG的RGD4C用于正在进行的I期临床试验(美国临床试验注册中心号NCT03178032)。在这项试验中，使用溶瘤腺病毒DNX2401靶向肿瘤细胞并诱导细胞死亡。在30项正在进行的DIPG临床试验中，大多数都专注于测试不同的药物和放射治疗，尚未应用包含基因治疗其它治疗。TNFα是一种炎性细胞因子，以其通过介导细胞凋亡、坏死和免疫细胞活化的抗癌特性而闻名。根据细胞背景，其还可以诱导细胞增殖和血管生成。已经在许多实体肿瘤中研究了TNFα的抗肿瘤活性，所述实体肿瘤包含结肠癌、食管腺癌、黑素瘤、胰腺癌和许多其它肿瘤。然而，TNFα作为治疗剂的效率非常有限，因为其在全身引入时具有显著的毒性。这限制了TNFα在临床中作为用于软组织肉瘤、黑素瘤和其它不可切除的肿瘤的癌症治疗剂的临床用途，这些肿瘤以隔离肢体灌注(ILP)的形式被局限于肢体以避免肢体截肢。实际上，通过靶向破坏VE-钙粘蛋白的肿瘤脉管系统，TNFα在体内与化学治疗药物协同作用，从而增加化学治疗药物对肿瘤环境的渗透。因此，需要努力克服全身毒性的限制以增强TNFα的治疗功效。一种策略是通过制备突变形式的TNFα来降低TNFα毒性并保持其抗肿瘤活性。这种突变的TNFα通过信号肽RGD4C进一步靶向肿瘤环境，并提高了肝癌和肉瘤同种异体移植物中化疗药物的效率。
[0568] DIPG的体外研究非常有限，只有很少的人体组织可用于研究，这限制了对这种破坏性脑癌的理解。由于缺乏体外应用和理解，除化疗药物和放射疗法之外的治疗应用也受到阻碍。因此，发明人研究了两种形式的TNFα，即跨膜(tmTNFα)和分泌型(sTNFα)对DIPG的治疗效果。以基因治疗的形式使用TNFα，以便利用信号肽RGD4C靶向的PAAV进行表达并递送到细胞。不希望受任何特定理论的束缚，使用RGD4C靶向的PAAV作为肿瘤位点的治疗性基因递送媒剂将确保用于治疗DIPG的更安全、具有选择性且有效的基因转移。
[0569] 为了理解由TNFα诱导的细胞死亡的机制，发明人研究了响应于对携带两种不同形式的TNFα(tmTNFα和sTNFα)的PAAV进行转导的活力和细胞凋亡活性。通过测量半胱天冬酶3/7、半胱天冬酶8和半胱天冬酶9的活性来确定凋亡活性。
[0570] 最后，研究了化疗药物顺铂在增强基因治疗方面的作用。因此，使用TNFα上游的两种不同启动子GRP78和CMV来理解基因治疗与顺铂的协同作用。使用在GRP78和CMV启动子控制下的Lucia报告基因来对顺铂处理后基因表达进行定量分析，并进一步理解顺铂在增强基因表达方面的作用。
[0571] 结果
[0572] 用携带跨膜tmTNFα和分泌型sTNFα转基因的PAAV转导DIPG：
[0573] 将跨膜TNFα基因和分泌型TNFα克隆到PAAV载体、PAAV-tmTNFα和PAAV-sTNFα(包括如实例12中所示的载体)中，然后产生靶向(RGD4C)和非靶向(M13/对照)病毒。转导DIPG细胞并在转导后第7天测量细胞活力。用40ng/μg噬菌体蛋白DEAE葡聚糖进一步增强转导效率。DIPG细胞在诱导细胞死亡方面对PAAV-sTNFα表现出比PAAV-tmTNFα更好的反应，其中前者在第7天显示出约50％的细胞死亡，而后者由跨膜形式诱导仅20％的细胞死亡，如图59所示。总之，这些数据表明sTNFα是治疗DIPG的良好候选者。
[0574] 用PAAV转导后的基因递送和TNFα表达：
[0575] 通过测量转导后的mRNA水平来评估PAAV基因递送的效率。两种形式的TNFα在转导细胞中均以高特异性表达，因为与靶向PAAV(RGD4C)相比，非靶向(M13)形式显示出的TNFα的mRNA表达可忽略不计，如图60A所示。在蛋白质水平处，PAAV-tmTNFα的转导不会导致培养基中TNFα的分泌，如通过ELISA检测的(图60B)。尽管两种形式的转导均显示mRNA水平的TNFα表达，但只有分泌形式与TNFα蛋白水平有关。这进一步证实了转基因的转导是有效的，并且可能表明通过跨膜形式诱导细胞死亡的低效率是由于缺乏可溶性分泌蛋白导致的。因为从初始膜结合形式释放sTNFα需要酶活性或TNFα转化酶(TACE)的表达。因此，通过蛋白质印迹测量TACE酶表达，并将其与其它儿科脑肿瘤细胞(成神经管细胞瘤)进行比较。TACE酶的DIPG表达比UW228的表达水平低4倍，并且比Daoy细胞的表达水平低2倍。
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