技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物制药技术领域，特别涉及抗体药物开发和生产领域，具体而言，涉及一种分离纯化重组抗人-EGFR单克隆抗体的方法。
背景技术
[0002]
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的
疾病，在各种疾病所致的死亡中紧跟心脏病之后位居第二位。随着人口老龄化和城市化
进程的不断发展，恶性肿瘤的发病率呈明显上升趋势。
[0003] 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因C-erbB-1的表达产物，erbB-1广泛分布于除血管组织外的上皮细胞膜上。目前在多种实体瘤如
结直肠癌、头颈癌、
肺癌中均发现EGFR的过渡表达。EGFR是一种跨膜糖蛋白，分子量约为170KD，由胞外区、跨膜区及胞内区3部分组分：胞外区由
氨基端的621个氨基酸构成，是配体结合区；跨膜区是由23个氨基酸残基螺旋构成的疏
水区；胞内区含有保守的酪氨酸激酶磷
酸化位点。EGFR的
信号传导途径是癌症发生发展的重要影响因素，在肿瘤细胞的增值、损失修复、侵袭及新生血管形成等方面起着重要作用。大量研究证明，EGFR可以作为肿瘤
治疗的一个有效靶点。
[0004] 靶向EGFR的药物主要有两类：一类是作用于受体胞内区的小分子酪氨酸激酶
抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼等；另一类是作用于受体胞外区的单克隆抗体，如西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗等。
[0005] 分离纯化工艺的开发是抗体药物开发的核心，是决定产品的安全、有效、收率和成本的技术
基础。
[0006] 然而，目前的重组抗人-EGFR单克隆抗体的分离纯化方法，仍有待改进。
发明内容
[0007] 本发明是基于
发明人的下列发现而完成的：
[0008] 目前文献报道的制备重组抗人-EGFR单克隆抗体的方法主要集中在上游方面，关于下游分离纯化工艺报道的较少，并且目前的重组抗人-EGFR单克隆抗体的纯化工艺，是将细胞上清液依次经过亲和层析、低pH值灭活病毒、阴离子交换层析、除病毒过滤、切向流膜包洗滤更换缓冲液、阳离子交换层析、切向流膜包洗滤更换缓冲液及
超滤浓缩、无菌过滤等步骤实现，该工艺存在所得产品的内毒素不合格的
风险，且阳离子交换层析纯化步骤前后均需要用切向流膜包洗滤更换缓冲液，过程较繁琐，在工业生产中延长了时间和增加了成本。
[0009] 本发明旨在至少解决
现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种在重组抗人-EGFR单克隆抗体制备工艺中，高效分离纯化制备的重组抗人-EGFR单克隆抗体的手段。
[0010] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分离纯化单克隆抗体的方法。根据本发明的
实施例，该方法包括以下步骤：将包含单克隆抗体的细胞培养上清液进行Protein A亲和层析，以便获得第一洗脱组分；将所述第一洗脱组分保持特定pH值状态下室温放置特定时间，以便获得经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分；将经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分中和后进行阳离子交换层析，以便获得第二洗脱组分；将所述第二洗脱组分稀释后进行阴离子交换层析，以便获得流穿；利用除病毒
过滤器，将所述流穿进行过滤，以便获得滤液；以及将所述滤液依次进行超滤浓缩和洗滤更换缓冲液，以便得到所述单克隆抗体的原液。
[0011] 发明人惊奇地发现，本发明的分离纯化单克隆抗体的方法简单易行，所得产品内毒素含量及其它各项
质量指标均符合单克隆抗体药物的质量标准。具体地，本发明的方法创造性地将阴离子交换层析步骤置于阳离子交换层析步骤之后，由此，既能通过阴离子交换层析有效去除内毒素，使得内毒素更容易控制，而且经过阳离子交换层析获得的第二洗脱组分通过简单的稀释即可直接上样于阴离子层析柱，省去了切向流膜包洗滤更换缓冲液步骤，节省了时间和成本。
[0012] 另外，根据本发明上述实施例的分离纯化单克隆抗体的方法还可以具有如下附加的技术特征：
[0013] 根据本发明的实施例，所述单克隆抗体为选自重组抗人-EGFR单克隆抗体、重组抗人TNF-α单克隆抗体、重组抗人CD-20单克隆抗体、重组抗人HER-2单克隆抗体和重组抗人-VEGF单克隆抗体的至少一种。
[0014] 根据本发明的实施例，所述Protein A亲和层析进一步包括：将所述包含单克隆抗体的细胞培养上清液上样于平衡后的protein A亲和层析柱中，然后依次进行缓冲液A洗涤、缓冲液B冲洗、缓冲液A洗涤和缓冲液C洗脱，以便得到所述第一洗脱组分，其中，缓冲液A为含100-200mM NaCl的
磷酸盐缓冲液，缓冲液B为含0.5-1.5M NaCl的磷酸盐缓冲液，缓冲液C为
醋酸盐缓冲液、
柠檬酸盐缓冲液或甘氨酸盐缓冲液。由此，捕获纯化效率高。根据本发明的一些具体示例，所述缓冲液A包含20mM磷酸盐缓冲液和100-200mM NaCl，pH值为7.0-7.5；所述缓冲液B包含20mM磷酸盐缓冲液和0.5-1.5M NaCl，pH值为5.5-7.0；所述缓冲液C为0.05-0.15M的醋酸盐缓冲液或甘氨酸盐缓冲液，pH值为3.0-3.5。由此，洗脱效果好。
[0015] 根据本发明的实施例，Protein A亲和层析所采用的层析填料不受特别限制，只要能够有效捕获目标抗体，实现纯化的目的即可。根据本发明的一些实施例，可以利用选自Mabselect SuRe、Mabselect SuRe LX、ProSep Ultra Plus和POROS MabCapture A层析填料的至少一种进行所述Protein A亲和层析。由此，纯化效果好，有利于后续步骤的进行。
[0016] 根据本发明的实施例，将所述第一洗脱组分保持pH值为3.2-3.7状态下室温放置0.5-4小时。由此，可以有效灭活病毒。
[0017] 根据本发明的实施例，所述阳离子交换层析进一步包括：将所述经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分进行中和，然后上样于平衡后的阳离子交换层析柱中，再依次进行缓冲液D洗涤和缓冲液E洗脱，以便得到所述第二洗脱组分，其中，所述缓冲液D包含20mM磷酸盐缓冲液和0-50mM NaCl、pH值为5.8-6.4，缓冲液E包含20mM磷酸盐缓冲液和100-200mM NaCl、pH值为5.8-6.4。由此，纯化效果好，有利于后续步骤的进行。
[0018] 根据本发明的实施例，将所述经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分中和至pH值为5.0-5.8后进行所述阳离子交换层析。由此，可将单克隆抗体有效的结合于阳离子交换层析柱上。
[0019] 根据本发明的实施例，利用pH值为7.0-8.0的磷酸盐缓冲液，将所述经过低pH值灭活病毒处理的第一洗脱组分进行中和。
[0020] 根据本发明的实施例，所述阳离子交换层析采用的层析填料不受特别限制，只要能够有效实现纯化目标抗体的目的即可。根据本发明的一些实施例，利用选自Capto SP ImpRes、POROS XS和Eshmuno CPX层析填料的至少一种进行所述阳离子交换层析。由此，纯化效果好。
[0021] 根据本发明的实施例，所述阴离子交换层析进一步包括：将所述第二洗脱组分稀释后上样于平衡后的阴离子交换层析柱中，收集流穿。
[0022] 根据本发明的实施例，利用pH值为6.0-7.0的15-25mM的磷酸盐缓冲液，将所述第二洗脱组分进行2-5倍稀释。由此可以降低第二洗脱组分的盐浓度并使其pH值与阴离子交换层析所使用的平衡缓冲液pH值相近，有利于目标抗体流穿，而内毒素、宿主DNA、宿主蛋白等杂质结合与阴离子交换层析填料，实现有效纯化目标抗体。
[0023] 根据本发明的实施例，所述阴离子交换层析采用的层析填料不受特别限制，只要能够有效实现纯化目标抗体的目的即可。根据本发明的一些实施例，利用选自Capto Q、POROS XQ和Eshmuno Q层析填料的至少一种进行所述阴离子交换层析。由此，纯化效果好。
[0024] 根据本发明的实施例，所述除病毒过滤器的处理量为200-800L/m2。由此，能够有效过滤去除病毒。
[0025] 根据本发明的实施例，将所述滤液超滤浓缩4-8倍。
[0026] 根据本发明的实施例，进一步包括，利用除菌过滤器将所述单克隆抗体的原液进行无菌过滤。
[0027] 由此，本发明所带来的有益效果为：
[0028] (1)所得产品的纯度和活性合格，且杂质如内毒素、宿主DNA、宿主蛋白、protein A等残留量易于控制；
[0029] (2)纯化方法简单可行，易于放大，且产品收率高。
[0030] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0031] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0032] 图1显示了实施例1中，Mabselect SuRe亲和层析纯化色谱图；
[0033] 图2显示了实施例1中，Capto SP ImpRes层析纯化色谱图；
[0034] 图3显示了实施例1中，Capto Q层析纯化色谱图；
[0035] 图4显示了实施例1中所得重组抗人-EGFR单克隆抗体原液纯度的SEC-HPLC色谱图；
[0036] 图5显示了实施例1中所得重组抗人-EGFR单克隆抗体原液的还原性SDS-PAGE
电泳图，
[0037] 其中：泳道1为对照品；泳道2为标准
蛋白质分子量marker；泳道3、4、5均为实施例1重组抗人-EGFR单克隆抗体原液样品；以及
[0038] 图6显示了实施例1中所得重组抗人-EGFR单克隆抗体原液的非还原性SDS-PAGE电泳图，
[0039] 其中：泳道1为对照品；泳道2、3、4均为实施例1重组抗人-EGFR单克隆抗体原液样品；泳道5为标准蛋白质分子量marker。
具体实施方式
[0040] 下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0041] 需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0042] 在下列实施例中所使用的术语“PB”是指磷酸盐缓冲液。
[0043] 实施例1：
[0044] 将150L
发酵罐
收获的细胞培养上清液分三份，分三次用Mabselect SuRe层析柱进行第一步的纯化，第一次上样40L于平衡后的Mabselect SuRe层析柱(BPG200/50)中，上样结束后，用缓冲液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.2)淋洗层析柱，再依次用缓冲液B(包含20mM PB、1M NaCl、pH 6.5)和缓冲液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.2)冲洗层析柱，然后用缓冲液C(即0.1M NaAC-HAc、pH 3.4)洗脱，收集洗脱组分；重复此纯化步骤两次，纯化过程色谱图见图1；将每次收集的洗脱组分(pH 3.7，称为“洗脱组分I”)室温放置2小时，然后用pH 7.2的磷酸盐缓冲液稀释中和至pH 5.2；合并三次稀释中和后的洗脱组分I，然后分成两份，分两次进行Capto SP ImpRes层析纯化，将其中一份上样于平衡后的Capto SP ImpRes层析柱(BPG200/50)中，上样结束后，用缓冲液D(20mM PB，pH 6.0)冲洗层析柱，然后用缓冲液E(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 6.0)洗脱，收集洗脱组分，再重复此纯化步骤一次，合并两次的洗脱组分称为洗脱组分II，此纯化过程色谱图见图2；将洗脱组分II用20mM PB(pH 6.5)5倍稀释，然后上样于平衡后的Capto Q层析柱(BPG140/50)中，收集流穿约100L，此纯化过程色谱图见图3；将Capto Q流穿用有效过滤面积为0.2m2的除病毒过滤器过滤，收集滤液；将除病毒过滤后的滤液用30KD切向流膜包超滤浓缩8倍后再洗滤换液，保持跨膜压为10psi；然后用0.22μm除菌过滤器无菌过滤得到重组抗人-EGFR单克隆抗体原液。
[0045] 实施例2：
[0046] 将7.5L
发酵罐收获的细胞培养上清液上样于平衡后的Mabselect SuRe LX层析柱(XK50/30)中，上样结束后，用缓冲液A(包含20mM PB、120mM NaCl、pH 7.5)淋洗层析柱，再依次用缓冲液B(包含20mM PB、1M NaCl、pH 7.0)和缓冲液A(包含20mM PB、120mM NaCl、pH 7.5)冲洗层析柱，然后用缓冲液C(即0.1M glycine、pH 3.2)洗脱，收集洗脱组分，称为洗脱组分I；将洗脱组分I(pH 3.5)室温放置1小时，然后用pH 7.2的磷酸盐缓冲液稀释中和(至pH 5.5)，上样于平衡后的POROS XS层析柱(XK50/20)中，上样结束后，用缓冲液D(20mM PB，pH 6.2)冲洗层析柱，然后用缓冲液E(20mM PB、100mM NaCl、pH 6.2)洗脱，收集洗脱组分，称为洗脱组分II；将洗脱组分II用20mM PB(pH 6.2)2倍稀释，然后上样于平衡后的POROS XQ层析柱(XK26/20)中，收集流穿约2L；将POROS XQ流穿用有效过滤面积为0.01m2的除病毒过滤器过滤，收集滤液；将除病毒过滤后的滤液用30KD切向流膜包超滤浓缩4倍后再洗滤换液，保持跨膜压为10psi；然后用0.22μm除菌过滤器无菌过滤得到重组抗人-EGFR单克隆抗体原液。
[0047] 实施例3：
[0048] 将7.5L发酵罐收获的细胞培养上清液上样于平衡后的ProSep Ultra Plus层析柱中，上样结束后，用缓冲液A(包含20mM PB、180mM NaCl、pH 7.0)淋洗层析柱，再依次用缓冲液B(包含20mM PB、1.5M NaCl、pH 6.0)和缓冲液A(包含20mM PB、180mM NaCl、pH 7.0)冲洗层析柱，然后用缓冲液C(即0.1M glycine、pH 3.0)洗脱，收集洗脱组分，称为洗脱组分I；将洗脱组分I(pH 3.2)室温放置0.5小时，然后用pH 8.0的磷酸盐缓冲液稀释中和至pH5.8，上样于平衡后的Eshmuno CPX层析柱中，上样结束后，用缓冲液D(20mM PB、50mM NaCl、pH 5.8)冲洗层析柱，然后用缓冲液E(20mM PB、200mM NaCl、pH 5.8)洗脱，收集洗脱组分，称为洗脱组分II；将洗脱组分II用20mM PB(pH 7.0)4倍稀释，然后上样于平衡后的Eshmuno Q层析柱中，收集流穿约3L；将Eshmuno CPX流穿用有效过滤面积为0.01m2的除病毒过滤器过滤，收集滤液；将除病毒过滤后的滤液用30KD切向流膜包超滤浓缩6倍后再洗滤换液，保持跨膜压为10psi；然后用0.22μm除菌过滤器无菌过滤得到重组抗人-EGFR单克隆抗体原液。
[0049] 实施例4：
[0050] 将7.5L发酵罐收获的细胞培养上清液上样于平衡后的POROS MabCapture A层析柱中，上样结束后，用缓冲液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.0)淋洗层析柱，再依次用缓冲液B(包含20mM PB、0.5M NaCl、pH 5.5)和缓冲液A(包含20mM PB、150mM NaCl、pH 7.0)冲洗层析柱，然后用缓冲液C(即0.15M NaAC-HAc、pH 3.5)洗脱，收集洗脱组分，称为洗脱组分I；将洗脱组分I(pH 3.7)室温放置4小时，然后用pH 7.0的磷酸盐缓冲液稀释中和至pH5.0，上样于平衡后的POROS XS层析柱中，上样结束后，用缓冲液D(20mM PB、10mM NaCl、pH 6.4)冲洗层析柱，然后用缓冲液E(20mM PB、150mM NaCl、pH 6.4)洗脱，收集洗脱组分，称为洗脱组分II；将洗脱组分II用20mM PB(pH 6.4)3倍稀释，然后上样于平衡后的POROS XQ层析柱中，收集流穿约2.4L；将POROS XQ流穿用有效过滤面积为0.01m2的除病毒过滤器过滤，收集滤液；将除病毒过滤后的滤液用30KD切向流膜包超滤浓缩6倍后再洗滤换液，保持跨膜压为10psi；然后用0.22μm除菌过滤器无菌过滤得到重组抗人-EGFR单克隆抗体原液。
[0051] 实施例5：
[0052] 将实施例1-实施例4中的重组抗人-EGFR单克隆抗体原液，分别进行蛋白含量、生物学活性、结合活性、还原性SDS-PAGE、SEC-HPLC纯度、宿主DNA残留量、宿主蛋白残留量、蛋白A残留量和内毒素含量的检测，结果如下表和图4-图6所示。
[0053]
[0054] 其中，图4是测定本发明实施例1中所得重组抗人-EGFR单克隆抗体原液纯度的SEC-HPLC色谱图。图5为实施例1重组抗人-EGFR单克隆抗体原液样品的还原性SDS-PAGE电泳图，其中：泳道1为对照品，泳道2为标准蛋白质分子量marker，泳道3、4、5均为实施例1重组抗人-EGFR单克隆抗体原液样品。图6为实施例1重组抗人-EGFR单克隆抗体原液样品的非还原性SDS-PAGE电泳图，其中：泳道1为对照品；泳道2、3、4均为实施例1重组抗人-EGFR单克隆抗体原液样品；泳道5为标准蛋白质分子量marker。
[0055] 由上述结果可知，实施例1-4获得的产品纯度和活性合格，且杂质含量如内毒素含量、宿主DNA残留量、宿主蛋白残留量、protein A残留量等其它各项质量指标均符合单克隆抗体药物的质量标准。且该方法简单易行，易于放大，同时所得产品收率高。
[0056] 在本
说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0057] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、
修改、替换和变型，本发明的范围由
权利要求及其等同物限定。
