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一种磷霉素降解菌筛选及其菌剂制备方法和该菌剂的应用

阅读：330发布：2021-04-13

专利汇可以提供一种磷霉素降解菌筛选及其菌剂制备方法和该菌剂的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种磷霉素降解菌的筛选方法，所述方法中使用的富集培养基、筛选培养基和驯化培养基是以磷霉素作为唯一碳源的培养基.本发明做到以磷霉素为唯一碳源，在磷霉素降解菌的初筛、驯化及纯化等过程，菌株在磷霉素浓度梯度逐渐升高的培养基，强化其对磷霉素的耐受力和降解效率，并成为混合菌的优势菌种。，下面是一种磷霉素降解菌筛选及其菌剂制备方法和该菌剂的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种磷霉素抗生素降解菌的筛选方法，其特征在于所述方法中使用的富集培养基、筛选培养基和驯化培养基是除了营养元索，以磷霉素作为唯一碳源的培养基。
2.根据权利要求1所述的一种磷霉索抗生索降解菌的筛选方法，其特征在于所述含磷霉索的培养液中磷霉素的浓度为100-200ppm，其余为营养元素和水。
3.根据权利要求1所述的一种磷霉素抗生素降解菌的筛选方法，其特征在于所述营养元索的成份和浓度如下：(NH4)2SO41000-1200mg/L，KH2PO4800-1000mg/L，K2HPO4200-300mg/L，MgSO4·7H2O500-600mg/L，FeSO410-20mg/L，CaCl250-70mg/L.使用时稀释25-50倍左右。
4.根据权利要求1所述的一种磷霉索抗生索降解菌的筛选方法，其特征在于具体步骤为：
1)菌源的采集
以处理含有磷霉素抗生素制药废水污水处理厂的活性污泥为磷霉素降解土著菌的菌源.
2)驯化
取自污水处理厂的活性污泥，先空曝2d后静置12h，排出上清液，加入体积3L的反应器中，温度控制在25-30℃，pH控制在6.5-7.5左右，设置转速为150-200r/min，以磷霉素钠作为唯一碳源，对活性污泥进行驯化.
3)菌种的纯化
a)取驯化后的活性污泥的上清液，按照不同稀释倍数涂布到筛选培养基平板上，35℃恒温培养48h；
b)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；
c)纯化后的菌落按种于菌种保藏培养基斜面上，35℃恒温培养48h后，保存于-20℃冰箱。
5.根据权利要求4所述的一种磷霉素抗生索降解菌的筛选方法，其特征在于：所述筛选培养基为：无机盐营养液和磷霉素钠和营养盐、微量元索制备.
其中无机营养液由以下营养元素组成：
营养液；(NH4)2SO41000mg/L，KH2PO4800mg/L，K2HPO4200mg/L，MgSO4·7H2O 500mg/L，FeSO410mg/L，CaCl250mg/L；
微量元索：NiSO432mg/L，Na2BO7·H2O7.2mg/L，(NH4)6Mo7O24·H2O 14.4mg/L，ZnCl223mg/L，CoCl2·H2O21mg/L，CuCl2·2H2O 10mg/L，MnCl2·4H2O 30mg/L.每升培养基加
50ml无机营养液、50ml微量元素、15g琼脂，121℃灭菌30min，冷却后加入200mg/L磷霉素.所述菌种保藏培养基为：
胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、950ml纯水、15g琼脂.pH＝7.0-7.2，121℃灭菌30min。
6.一种磷霉索抗生索降解菌，其特征在于由权利要求1-5所述方法制备得到。
7.一种磷霉素抗生索降解菌菌剂，其特征在于：由权利要求6所述方法制备。
8.根据权利要求7所述的磷霉素抗生素降解菌菌剂，其特征在于具体的制备方法为：
1)将纯化后得到的磷霉索降解菌株接种在种子培养基中，经一级种子、二级种子、种子罐逐步扩大培养后作为液体种子，液体种子的菌体密度达到1×107cfu.
2)将各个单一菌株液体种子混合接入发酵培养基，温度控制在25℃，pH控制在7.0左右，设置转速为150r/min，通气量为1.2L/h，总接种量为20％(V/V) 。
9.根据权利要求8所述磷霉素降解菌剂，其特征在于：
一级种子采用固体培养基培养，培养条件为：35℃培养48h；二级种子采用液体培养基摇床培养，培养条件为：恒温35℃，转速150r/min培养24h；种子罐培养条件为：液体培养基搅拌培养，恒温35℃，转速150r/min，通气量1.2L/n；
其中：液体培养基为每1000ml无菌水中含有：200mg磷霉素，(NH4)2SO440mg，KH2PO432mg，K2HPO48mg，MgSO4·7H2O 20mg，FeSO40.4mg，CaCl22mg，固体培养基是在液体培养基的基础上加入15g琼脂，pH＝7.0，121℃灭菌30min.
发酵培养基为每1000ml无菌水中含有：200mg磷霉素，胰蛋白胨10g、酵母提取物5g，KH2PO4400mg，K2HPO4100mg，MgSO4·7H2O 250mg，CaCl225mg，pH＝7.0，121℃灭菌30min。
10.权利要求6-9所制备的磷霉索降解菌剂用于含磷霉索制药废水的降解。

说明书全文

一种磷霉素降解菌筛选及其菌剂制备方法和该菌剂的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及磷霉素制药生产废水生物强化处理技术领域，特别涉及一种磷霉素降解菌的筛选方法及由其筛选的菌制备磷霉素降解菌剂的方法和该菌剂在磷霉素制药生产废水处理中的应用。技术背景

[0002] 磷霉素制药废水是一类典型的抗生素类废水，它是在磷霉素生产过程中产生的一类较为复杂的废水。目前，我国磷霉素的生产主要以化学合成工艺为主。

[0003] 磷霉素的合成步骤多，工艺长，原料和生产过程中所引入的物质及产生的中间产物较多，并且在实际生产过程中因分离、提纯、消毒等操作而引入许多有机物质(如各种溶剂等)，致使所产生的废水水量大，水质复杂。尤其是在环氧化和拆分过程中产生的环氧母液和拆分母液废水，不但COD浓度极高，而且含有钨酸钠、乙醇、苯乙胺、反应物及中间副产物等，具有极高的有机磷浓度。同时，由于拆分效率的有限，使得废水中也含有一定量的磷霉素成品药物。

[0004] 磷霉素(Fosfomysin，FOM)，化学名称(1R，2S)-1，2-环氧丙基磷酸，是一种新型广谱抗生素，由西班牙的CEPA公司和美国的默克公司从链丝菌的代谢产物中发现，并逐渐应用于临床。

[0005] 磷霉素是自成一派的一类抗生素类药物，它既不是β-内酰胺类也不是四环类，既不是氨基糖苷类也不是大环内酯类。它通过与细菌细胞壁合成酶的结合阻滞细菌合成细胞壁，从而对细菌产生抑制作用。其抗细菌性广谱范围极其广，对革兰阳性菌和阴性菌都有一定的抗菌作用，在临床上是常见细菌性感染的首选药物之一。同时由于磷霉素的组织渗透性好，血、尿药物浓度高，过敏反应少，在临床上更是作为联合抗菌药物得到广泛的应用。

[0006] 磷霉素化学结构如图1所示。磷霉素含有有机磷结构，环氧丙基结构较为稳定，特别是C-P键，键能高、毒性大、不易断裂。工业上主要以其二钠盐或钙盐的形式生产。为应对超级菌的出现，磷霉素的应用会受到更多的重视，其工业生产规模也必将扩大。

[0007] 同时磷霉素作为一种抗生素，在药物设计时主要针对人体和动物体内的病原性致病菌，这就使其必然也对人体和环境中其他有机体产生潜在的健康威胁，产生环境污染问题。

[0008] 尹莉(尹莉，陈丹.应用微电解法预处理磷霉素制药废水[J].环境保护科学，2010，36，(3)：47-49.)等利用铁屑和活性碳材料对磷霉素制药废水进行微电解预处理，研究发现在最佳实验条件下，废水COD的去除率能够达到40％～50％。王洪(王洪.磷霉素制药废水的净化研究[D].东北大学，2004.)等人应用微电解-SBR联合工艺对磷霉素制药废水进行了探索研究，研究表明废水经过微电解后可生化性提高，再经过SBR处理后的出水能够达到污水排放二级标准。肖宏康(肖宏康，肖书虎，宋永会，等.高温强化电化学法处理磷霉素制药废水试验研究[J].环境工程技术学报，2011，1，(2)，106-110.)等人利用高温强化电化学法处理磷霉素制药废水，试验研究发现经电化学处理后废水的可生化性得到提高。崔娜(崔娜，王国文，徐晓晨，等.催化湿式空气氧化处理磷霉素钠、黄连素制药废水试验研究[J].水处理技术.2012，(02)，72-75.)、邱光磊(邱光磊，宋永会，曾萍，等.湿式氧化-磷酸盐固定化组合工艺处理磷霉素制药废水及其资源化[J].环境科学学报，2011，31，(7)，1431-1439；邱光磊，宋永会，曾萍，等.湿式氧化处理高浓度磷霉素废水的动力学研究[J].环境工程技术学报，2011，4，289-294)等采用湿式氧化技术处理高浓度磷霉素制药废水，并利用磷酸盐固定化手段实现了资源的回收利用。物化处理方式虽然取得一定的效果，但是成本较高，在工业上的应用依旧存在限制。

[0009] 生物处理以其处理效果好、费用低、无二次污染等优点受到关注，生物强化技术是生物处理中的一种。该技术利用废水中的特征污染物筛选出功能微生物，分离纯化或通过基因工程产生高效菌株，投加到污水处理厂或反应器中以提高废水的降解效率。生物强化技术具有提高废水处理效率和降低运行成本、强化污染物降解效果的特点。此技术是目前针对难降解有机污染物废水生物处理最具发展潜力的技术之一。

[0010] 生物强化技术的核心是高效降解菌的开发，目前筛选高效菌株的手段主要包括以下三种：

[0011] (1)从自然环境中筛选：利用常规的微生物手段，从被污染的环境中通过选择性培养基分离具有特定降解功能的微生物；

[0012] (2)通过将土著微生物长期的驯化，诱导微生物产生能够降解特定化合物的代谢途径和代谢酶，得到具有一定降解能力的微生物菌群；

[0013] (3)通过基因工程手段构建高效工程菌，改良或者提高微生物的降解性能。

[0014] 磷霉素作为自成一派的抗生素类药物，国内外对其降解规律的研究还较少。John W.McGrath，Friedrich Hammerschmidt(McGrath，J W，Hammerschmidt，F，Preusser，W，et al.Studies on the biodegradation of fosfomycin：growth of Rhizobium huakuii PMY1 on possible intermediates synthesised chemically[J].Organic&biomolecular chemistry.2009，7，(9)，1944-1953；McGrath，J W，Hammerschmidt，F.Quinn，J P.Biodegradation of phosphonomycin by Rhizobium huakuii PMY1[J].Applied and environmental microbiology.1998，64，(1)，356-358.)等研究发现华癸中生根瘤菌Rhizobium huakuii PMY1能够降解磷霉素并且在降解磷霉素的过程中可能有中间产物的产生，认为磷霉素矿化的第一步是环的水解，形成一种膦酸。除此之外，没有关于磷霉素降解菌及其菌剂制备的技术。

发明内容

[0015] 本发明的目的是提供一种以磷霉素为唯一碳源筛选磷霉素降解菌。

[0016] 1、根据权利要求1所述的一种磷霉素抗生素降解菌的筛选方法，其特征在于具体步骤为：

[0017] 1)菌源的采集

[0018] 以处理含有磷霉素抗生素制药废水污水处理厂的活性污泥为磷霉素降解土著菌的菌源。

[0019] 2)驯化

[0020] 取自污水处理厂的活性污泥，先空曝2d后静置12h，排出上清液，加入体积3L的反应器中，温度控制在25-30℃，pH控制在6.5-7.5左右，设置转速为150-200r/min，以磷霉素钠作为唯一碳源，对活性污泥进行驯化。

[0021] 3)菌种的纯化

[0022] a)取驯化后的活性污泥的上清液，按照不同稀释倍数涂布到筛选培养基平板上，35℃恒温培养48h

[0023] b)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；

[0024] c)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，35℃恒温培养48h后，保存于-20℃冰箱。

[0025] 2、根据权利要求4所述的一种磷霉素抗生素降解菌的筛选方法，其特征在于：

[0026] 所述筛选培养基为：无机盐营养液和磷霉素钠和营养盐、微量元素制备。

[0027] 其中无机营养液由以下营养元素组成：

[0028] 营养液：(NH4)2SO4 1000mg/L，KH2PO4 800mg/L，K2HPO4 200mg/L，MgSO4·7H2O 500mg/L，FeSO4 10mg/L，CaCl2 50mg/L；

[0029] 微量元素：NiSO4 32mg/L，Na2BO7·H2O 7.2mg/L，(NH4)6Mo7O24·H2O 14.4mg/L，ZnCl2 23mg/L，CoCl2·H2O 21mg/L，CuCl2·2H2O 10mg/L，MnCl2·4H2O 30mg/L。

[0030] 使用时稀释25-50倍。

[0031] 本发明的有益效果是：

[0032] (1)在磷霉素降解菌的富集、驯化及纯化等过程中培养基均以磷霉素为唯一碳源。在混合菌源的驯化过程中驯化培养基中的磷霉素浓度逐步提高，菌株逐渐驯化而适应含磷霉素的培养基。
附图说明

[0033] 图1磷霉素结构图。

[0034] 图2各菌株的生长量和磷霉素浓度变化

具体实施方式

[0035] 以下通过实施例进一步解释本发明的方法，但是，本发明的实施不限于以下形式。

[0036] 实施例1：

[0037] 采集东北某制药厂处理含有磷霉素抗生素制药废水的污水处理厂的活性污泥为磷霉素降解土著菌的菌源，先空曝2d后静置12h，排出上清液，加入体积3L的反应器中，温度控制在25-30℃，pH控制在6.5-7.5左右，设置转速为150-200r/min，以磷霉素作为唯一碳源，磷霉素浓度从100ppm逐渐增加到200ppm，对活性污泥进行驯化。

[0038] 菌种的纯化：1)取驯化后的活性污泥的上清液，按照不同稀释倍数涂布到筛选培养基平板上，35℃恒温培养48h，2)重复上述步骤，直至得到形态单一的纯化菌落；3)纯化后的菌落接种于菌种保藏培养基斜面上，35℃恒温培养48h后，保存于-20℃冰箱。

[0039] 经过纯化后筛选出3支细菌，如表1所示。

[0040] 表1降解磷霉素的三支菌株的形态特征

[0041]

[0042] 实施例2：

[0043] 在35℃、150r/min条件下，三株菌株各挑取一环菌落，接种到含有磷霉素(FOM)的培养基中，每个一段时间测定其生长量，得到其生长曲线(图2-a)和磷霉素变化曲线(图2-b)如附图2所示。3株菌株对磷霉素的基质环境都有一个适应期。纯菌在开始的第一天内菌液浓度逐渐降低，生长量下降，之后慢慢提高。进入第四天后，菌液浓度达到最大，这也表明此时体系内生物量最大。随后菌株生长量呈现缓慢升高然后又逐渐下降的趋势。这可能是由于降解产物不利于菌株生长，在逐渐积累的过程中对菌株生长产生了抑制。

[0044] 实施例3：

[0045] 用接种环将菌株F3接入在不同基质，其耐受情况如表2所示。由表可以看到，菌株F3在四种基质(α-苯乙胺、四环素、3，5-二氯苯酚、邻苯二甲酸)条件下均能长出菌落，表明菌株F3可以降解上述四种基质。

[0046] 表2菌种F3对不同基质耐受情况

[0047]

[0048] (+表示长出菌落)。

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