基于pH的FCA控制的用途
阅读：381发布：2020-05-08
专利汇可以提供基于pH的FCA控制的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且披露了一种基于添加或限制性底物后pH 信号 的扰动来控制至补料分批 发酵 罐的 碳 进料的方法。，下面是基于pH的FCA控制的用途专利的具体信息内容。
1.一种控制补料分批发酵的碳进料的方法，该方法包括向发酵液中添加限制性底物的等分试样、测量该发酵液的pH中的扰动、并响应于pH信号扰动的大小调节碳进料。
2.如权利要求1所述的方法，其中该限制性底物选自碳源，例如碳水化合物、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、甘露糖、甘油和半乳糖；和氮源，例如氨。
3.如权利要求2所述的方法，其中该限制性底物是碳源，并且该限制性底物与该碳进料中的碳源相同。
4.如权利要求3所述的方法，其中该碳进料以规则间隔(以规则频率)提供的离散脉冲添加，或以振荡但连续的方式添加，并且pH信号的大小用于控制该碳进料。
5.如权利要求4所述的方法，其中通过揭示pH信号的振荡频率的傅里叶变换对pH信号进行处理，并且如果以振荡但连续的方式添加碳进料，当处在与进料脉冲的频率或进料振荡的频率一致的频率下的傅里叶变换的pH信号超过固定值时，增加脉冲或峰值的大小，并且当处在与进料脉冲的频率或进料振荡的频率一致的频率下的傅里叶变换的pH信号低于固定值时，减小脉冲或峰值的大小。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中发酵是一种或多种微生物的发酵，用于生产一种或多种目的产物。
7.如权利要求6所述的方法，其中该一种或多种微生物选自细菌菌株和真菌菌株。
8.如权利要求7所述的方法，其中这些细菌菌株选自：革兰氏阳性菌株，例如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属或链霉菌属菌株；或者革兰氏阴性菌株，例如弯曲杆菌属、埃希氏菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属或脲原体属菌株。
9.如权利要求8所述的方法，其中该一种或多种微生物选自：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、马链球菌马亚种、不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌或浅青紫链霉菌菌株。
10.如权利要求7所述的方法，其中这些真菌菌株选自酵母菌株，例如假丝酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属菌株；或丝状真菌菌株，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属、小腔球菌属、梨孢菌属、黑果菌属、亚灰树花菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属菌株。
11.如权利要求10所述的方法，其中这些菌株选自解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌、粪状金孢子菌、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、带纹金孢子菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰孢菌、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢菌、镶片镰孢菌、灰腐质霉、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳、成层梭孢壳菌、白毛梭孢壳、澳洲梭孢壳、粪梭孢壳、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、秘鲁梭孢壳、毛梭孢壳、瘤孢梭孢壳、耐热梭孢壳、土生梭孢壳、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、或卵形酵母菌株。
12.如权利要求6-11中任一项所述的方法，其中该一种或多种产物选自蛋白质，例如酶。
13.如权利要求12所述的方法，其中这些酶选自氨基肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、溶菌酶、胞壁酸酶、黄原胶酶或木聚糖酶。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该碳进料包含至少10％碳源，例如至少
20％、例如至少30％、例如至少40％、至少50％碳源。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中发酵罐的体积是至少20升，例如至少50升，例如至少100升，例如至少500升，例如至少1000升，例如至少5000升，例如至少10,000升，例如至少50.000升，例如至少100.000升。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中该发酵在该发酵的至少一部分中发生氧限制的条件下进行。
基于pH的FCA控制的用途
技术领域
背景技术
[0002] 细菌微生物和真菌微生物是工业微生物学的主力，因为它们用于许多不同治疗剂(例如青霉素和头孢菌素)、药物蛋白(例如胰岛素)、多糖类(例如透明质酸)、酶(例如蛋白酶)、以及大宗化学品(例如柠檬酸)的商业化生产。
[0003] 在工业上，使用补料分批发酵方法是非常普遍的。补料分批发酵是基于将生长限制性营养底物进料至培养物的方法。生长限制性营养物底物通常是碳水化合物，但是原则上它可以是任何营养物，例如氮源。
[0004] 补料分批发酵(其中微生物生产目的化合物或微生物本身是目的产物)中的碳水化合物添加速率是极其关键的工艺参数。已经示出，由于例如不需要的副产物的产生，碳水化合物的过度补料导致多个批次的损失或严重降低的生产力。
[0006] 一种此类基于扰动的控制策略是频率含量分析(FCA)，它是一种在无需过量配料细胞并且不必处理不期望的溢出代谢物(例如乙酸盐)的情况下，在发酵过程中找到最大碳配料速率的方法。通过脉冲化碳源并随后分析溶解氧(DO)信号中的响应来获得FCA信号。DO信号中缺乏响应表明配料速率超过培养物的底物摄取容量。在这种情况下，细胞将不会完全氧化碳源，而是形成不想要的副产物，其可能对期望发酵产物的生长和生产产生负面影响。DO信号中的大的响应表明培养物迅速氧化添加的碳，随后溶解氧迅速降低。
[0007] 通常，在FCA控制中，当FCA信号超过界定的固定点时，进料脉冲增加，而当FCA低于固定点时，进料脉冲减少，从而控制向培养物容量的碳进料，以代谢碳源并防止过量进料。
[0008] [M. 等人1999,Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程]64(5):590-598；O.Johnsson 2015,PhD thesis[博士学位论文],Perturbation-based control of
industrial fed-batch bioprocesses[工业补料分批生物过程的基于扰动的控制],Lund University[隆德大学]]，披露通过跟踪DO随时间对脉冲的响应并相应地调整配料速率，可以防止培养物中乙酸盐的形成
industrial fed-batch bioprocesses[工业补料分批生物过程的基于扰动的控制],Lund University[隆德大学]]，披露通过跟踪DO随时间对脉冲的响应并相应地调整配料速率，可以防止培养物中乙酸盐的形成
[0009] 已经使用扰动方法将DO和摄氧速率(oxygen uptake rate，OUR)用于配料控制[M.等人1999,Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程]64(5):590-598；V.S.Whiffin等人2004,Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程]85(4):422-433；B.Henes&
B.Sonnleiter 2007,J.Biotech.[生物技术杂志]132:118-126；S.Schaepe等人2014,J.Biotech.[生物技术杂志]192:146-153；O.Johnsson 2015,PhD thesis[博士学位论文],Perturbation-based control of industrial fed-batch bioprocesses,Lund
University[工业补料分批生物过程的基于扰动的控制],Lund University[隆德大学]]。
B.Sonnleiter 2007,J.Biotech.[生物技术杂志]132:118-126；S.Schaepe等人2014,J.Biotech.[生物技术杂志]192:146-153；O.Johnsson 2015,PhD thesis[博士学位论文],Perturbation-based control of industrial fed-batch bioprocesses,Lund
University[工业补料分批生物过程的基于扰动的控制],Lund University[隆德大学]]。
发明内容
[0010] 本发明提供控制补料分批发酵的碳进料的方法，该方法包括向发酵液中添加限制性底物的等分试样、测量发酵液的pH中的扰动、并响应于pH信号扰动的大小调节碳进料。
具体实施方式
[0011] 本领域已知例如芽孢杆菌属补料分批发酵中的碳水化合物添加速率是极其关键的工艺参数。已经示出，底物的过度补料导致多个批次的损失或降低的碳利用效率。因此，具有可用于控制补料分批发酵中的进料的可靠的方法是很重要的，以在不过度进料的情况下实现最高可能的生产率。
[0013] 在现有技术中，已经使用上述扰动方法将DO和摄氧速率(OUR)用于配料控制[M.等人1999,Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程]64(5):590-598；V.S.Whiffin等人2004,Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程]85(4):422-433；B.Henes&
B.Sonnleiter 2007,J.Biotech.[生物技术杂志]132:118-126；S.Schaepe等人2014,J.Biotech.[生物技术杂志]192:146-153；O.Johnsson 2015,PhD thesis[博士学位论文],Perturbation-based control of industrial fed-batch bioprocesses,Lund
University[工业补料分批生物过程的基于扰动的控制],Lund University[隆德大学]]。
B.Sonnleiter 2007,J.Biotech.[生物技术杂志]132:118-126；S.Schaepe等人2014,J.Biotech.[生物技术杂志]192:146-153；O.Johnsson 2015,PhD thesis[博士学位论文],Perturbation-based control of industrial fed-batch bioprocesses,Lund
University[工业补料分批生物过程的基于扰动的控制],Lund University[隆德大学]]。
[0014] 然而，我们发现对pH信号的分析也可以用于此目的。这是出人意料的，因为在整个发酵过程中pH值被控制在设定值，因此，pH值并不明显响应进料速度的脉冲，并且其并不明显揭示有关培养物生理状态的有用信息。
[0015] 根据本发明，通过引入过程扰动来控制补料分批发酵中的碳进料，所述引入过程扰动是通过添加限制性底物的等分试样以及测量发酵液的pH值的扰动并且响应于pH信号的扰动的大小调节碳进料实现。
[0016] 术语“碳进料”根据本发明意欲意指包含碳源的溶液，该溶液在发酵过程的补料分批阶段期间进料至发酵罐。碳进料将向微生物输送必需的碳源，以使其生长并任选地生产目的产物。
[0018] 限制性底物的等分试样的添加会导致微生物对限制性底物的摄取和代谢，这也反映在发酵的pH值中，其中发酵液的pH受扰动影响并逐渐返回至添加限制性底物的等分试样之前的pH值。据信微生物的代谢活性是触发pH信号的因素，这意味着，如果限制性底物的添加引起代谢活性的高增长，则会看到大的pH信号，然而如果限制性底物的添加导致代谢活性小增长或甚至无增长，则只能看到小的pH信号。因为代谢活性需要可用的碳源，所以根据本发明，基于由添加限制性底物引起的pH信号的扰动来控制碳进料。这意味着，如果在添加限制性底物后观察到大的pH信号，表明代谢活性大大增加，则增加碳进料；如果在添加限制性底物后观察到小的pH信号，则减少碳进料。这样，根据本发明的控制将确保，当微生物中的代谢活性高(这意味着它们可以转化高水平量的碳源)时，碳进料的添加高，当微生物中的代谢活性低时碳进料低，因此它们不会转化很多碳源。
[0019] 限制性底物和碳进料可以以相同的或以分开的一个或多个溶液提供给发酵罐。如果限制性底物是碳源，则优选碳进料是输送限制性底物的料流。
[0020] 在一个优选的实施例中，以规则的间隔将限制性底物以脉冲递送添加到发酵中，或者以振荡但连续的方式添加，并且其中碳进料的大小由pH信号确定。
[0021] 在该实施例中，如本领域已知的，通过傅里叶变换处理pH信号是方便的。pH信号的傅里叶变换揭示了一起构成pH信号的振荡的频率谱。通过分析限制性底物被进料到发酵罐的频率下的谱，可以对限制性底物脉冲对微生物的代谢活性的响应进行定量。该响应被表征为FCA值。pH信号对限制性底物脉冲的响应越大，则FCA值将越高。
[0022] 在一个特定优选的实施例中，限制性底物进料包括在碳进料中，以如下方式进行控制：如果给定脉冲或进料中的峰值(如果以振荡但连续的方式添加限制性底物)导致pH信号发生小的变化，则下一个脉冲或进料中的峰值(如果以振荡但连续的方式添加限制性底物)将会是小的，这意味着仅添加少量的碳进料，然而如果所述脉冲或所述进料中的峰值(如果以振荡但连续的方式添加限制性底物)导致pH信号发生大的变化，则下一个脉冲或进料中的峰值(如果以振荡但连续的方式添加限制性底物)将会是大的，这意味着添加大量的碳进料。
[0023] 当FCA值用于调节发酵的碳进料时，通常会针对发酵界定FCA值的设定点，如果测得的FCA值高于设定点，则增加碳进料，如果测得的FCA值低于设定点，则减少碳进料。
[0024] 基于用于特定发酵的具体条件和信号处理，针对给定的发酵定义合适的设定点属于普通技术人员的技能范围。
[0025] 基于DO的关于工业补料分批生物过程的基于扰动的控制(尤其是基于FCA的发酵过程的控制)都是已知的，并且除了本发明的方法是基于pH信号而不是氧信号的情况，关于此类控制机制的已知技术也适用于本发明的方法。
[0026] 与使用基于氧的扰动控制方法的相应方法相比，本发明的方法具有若干优点：
[0027] ·本发明的方法更稳健，并且可以在不规则的情况下(例如在搅拌、氧供应和压力/背压中)，满意地控制发酵过程；
[0028] ·在线pH和DO测量在发酵工业中是标准的，其中pH测量比DO测量更可靠。摄氧速率(OUR)的测量依赖于专业的设备(例如质谱仪)，该专业的设备不是每个发酵设施中的标准设备。另外，为了通过快速傅里叶变换计算FCA值，需要频繁采样以捕获pH和/或DO信号中的振荡。对于一些类型的氧电极，高频测量会减少探头的使用寿命，然而测量频率不会影响pH电极的使用寿命。
[0029] ·本发明的方法可以在不能使用基于氧的扰动控制方法的情况下(例如在氧限制的条件下)使用。
[0030] 本发明的方法特别适合于发酵微生物以产生目的产物，或者微生物本身可以是目的产物。
[0031] 微生物
[0032] 根据本发明使用的微生物可以是可以在发酵罐中培养的本领域已知的任何微生物，或者它甚至可以是此类微生物的混合物或此类微生物中的两种或多种。
[0033] 根据本发明的微生物可以是细菌菌株，例如，革兰氏阳性菌株(例如芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属菌株)或革兰氏阴性菌株(例如弯曲杆菌属、埃希氏菌属、黄杆菌属、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、或脲原体属菌株)。
[0034] 在一方面，该菌株是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌
(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株；特别地，该菌株是地衣芽孢杆菌菌株。
(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株；特别地，该菌株是地衣芽孢杆菌菌株。
[0035] 在另一方面，该菌株是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌马亚种(Streptococcus equi)菌株。
[0036] 在另一方面，该菌株是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)菌株。
[0037] 该微生物可以是真菌菌株。例如，该菌株可以是酵母菌株，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia菌株；或丝状真菌菌株，例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属
(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属菌株。
(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属菌株。
[0038] 在另一方面，该菌株是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、黄色镰孢菌
(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium
graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳
(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉
(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。
(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium
graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢菌(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、成层梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、粪梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳
(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、哈茨木霉
(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。
[0039] 在另一方面，该菌株是酵母菌株，例如卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomyces
oviformis)菌株。
oviformis)菌株。
[0040] 这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
[0041] 微生物可以是天然地生产目的产物的生物，或者它可以是已经被遗传改造以生产目的产物(例如通过插入在合适的控制元件的控制下编码目的产物的基因以确保基因的生产)的微生物。构建生产目的产物的生物的方法是本领域已知的，并且此类方法也适用于本发明。
[0042] 目的化合物
[0043] 根据本发明的目的化合物可以是多肽例如治疗性多肽(例如胰岛素)；或肽、或蛋白质(例如酶)
[0044] 目的化合物也可以是多糖(例如透明质酸)、抗生素(例如青霉素或头孢菌素或红霉素)、或商业化学品(例如柠檬酸)。
[0045] 根据本发明的优选的肽包含2至100个氨基酸；优选地10至80个氨基酸；更优选地15至60个氨基酸；甚至更优选地15至40个氨基酸。
[0046] 在一个优选实施例中，目的化合物是酶，具体地是水解酶(根据Enzyme Nomenclature[酶命名法]；Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry[国际生物化学联合会命名委员会的建议]为EC3类)。
[0047] 在一个特定优选的实施例中，以下酶是优选的氨基肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、甘露聚糖酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶、溶菌酶、胞壁酸酶、黄原胶酶或木聚糖酶。
[0048] 蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。蛋白酶可以是酸性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例有枯草杆菌蛋白酶，尤其是来源于芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06279)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)，以及在WO 89/
06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。
06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。
[0049] 有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在下述位置中的一个或多个处发生取代的变体：27、36、57、76、
87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。
[0050] 优选的可商购的蛋白酶包括ALCALASETM、SAVINASETM、PRIMASETM、DURALASETM、ESPERASETM、RELASETMand KANNASETM(诺维信公司(Novozymes A/S))、MAXATASETM、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM、PURAFECTTM、PURAFECT OXPTM、FN2TM和FN3TM(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))。
[0051] 脂肪酶：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(与嗜热霉属同义)，例如来自如EP 258 068和EP 305 216中描述的疏棉状腐质霉(细毛嗜热霉)或来自如WO 96/13580中描述的特异腐质霉的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(EP 331 376)、施氏假单胞菌(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌、假单胞菌属物种菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(WO 96/12012)；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois等人，(1993)，Biochemica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报]，1131，253-360)，嗜热脂肪芽抱杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(WO 91/16422)。
[0052] 脂肪酶变体的其他实例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO 97/04079以及WO 97/07202中描述的那些。
[0053] 优选的可商购脂肪酶包括LIPOLASETM、LIPOLASE ULTRATM和LIPEXTM(诺维信公司(Novozymes A/S))。
[0054] 淀粉酶：适合的淀粉酶(α-和/或β-淀粉酶)包含细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。
[0055] 有用的淀粉酶的实例是描述于WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、WO 97/43424、以及WO 01/66712中的变体，尤其是在以下一个或多个位置处发生取代的变体：15、
23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、
391、408、和444。
23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、
391、408、和444。
[0056] 可商购的淀粉酶是DURAMYLTM、TERMAMYLTM、FUNGAMYLTM、NATALASETM、TERMAMYL TM TM TM TM TM TMLC 、TERMAMYL SC 、LIQUIZYME-X 和BAN (诺维信公司)，RAPIDASE 和PURASTAR (来自杰能科国际公司)。
[0057] 纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳菌属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如披露于US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢产生的真菌纤维素酶。
[0058] 特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO 96/29397、WO 98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中所描述的那些。
[0059] 可商购的纤维素酶包括CELLUZYMETM、CAREZYMETM和CAREZYME CORETM(诺维信公司)、CLAZINASETM和PURADAX HATM(杰能科国际公司)、以及KAC-500(B)TM(花王株式会社(Kao Corporation))。
[0060] 支链淀粉酶：支链淀粉酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。
[0061] 根据本发明的支链淀粉酶优选是来自火球菌属(Pyrococcus)或芽孢杆菌属(例如嗜酸性普鲁兰芽抱杆菌(Bacillus acidopullulyticus))的支链淀粉酶，例如描述于Kelly等人，1994，FEMS Microbiol.Letters[欧洲微生物学会联合会微生物学快报]115:97-106的支链淀粉酶；或从诺维信公司可得的支链淀粉酶，例如PromozymeTM。
[0062] 支链淀粉酶还可以来自长野芽孢杆菌(Bacillus naganoencis)或脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)，例如衍生自脱支芽孢杆菌(美国专利5,736,375)。
[0063] 氧化还原酶：氧化还原酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。氧化还原酶包括过氧化酶、以及氧化酶，例如漆酶、和过氧化氢酶。
[0064] 其他优选水解酶是碳水化合物水解酶，包括MANNAWAYTM。其他优选酶是转移酶、裂解酶、异构酶、以及连接酶。
[0065] 发酵
[0066] 因此，本发明可以有用于具有以微规模的培养基的任何发酵，并且直至有用于具有以工业规模培养基的任何发酵,典型地从1000升至500.000升。
[0067] 可以通过本领域已知的任何方法发酵微生物，条件是添加限制性底物。发酵培养基可以是复合培养基，包括复合的氮源和/或碳源，例如大豆粉、大豆蛋白、大豆蛋白水解物、棉籽粉、玉米浆、酵母提取物、酪蛋白、酪蛋白水解物、马铃薯蛋白、马铃薯蛋白水解物、糖蜜、等。发酵培养基可以是化学成分确定的培养基，例如在WO 98/37179中所定义的培养基。
[0068] 碳源
[0069] 本发明可用于任何可代谢的碳源。
[0070] 优选选自以下组的碳水化合物或碳源，该组由以下组成：葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、麦芽酮糖、甘露糖、甘油、和半乳糖；特别地，优选选自以下组的碳水化合物或碳源，该组由以下组成：葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油和麦芽糖。
[0071] 目的化合物的回收
[0072] 本发明的另一方面涉及发酵液的下游处理。在发酵过程结束之后，可以使用针对目的化合物研发的标准技术将目的化合物从发酵液中回收。
[0073] 有待应用的相关下游处理技术取决于目的化合物的性质。
[0074] 用于将目的化合物从发酵液中回收的过程将典型地(但不局限于)涉及以下步骤中的一些或全部：
[0075] 1)发酵液的预处理(例如絮凝)
[0076] 2)将细胞和其他固体物料从发酵液中除去(初级分离)
[0077] 3)过滤
[0078] 4)浓缩
[0079] 5)稳定化并且标准化。
[0081] 在以下实例中进一步阐明本发明，该实例不以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。
[0082] 实例
[0083] 材料与方法
[0084] 微生物：如WO 02/00907中所述，使用编码迟缓芽孢杆菌蛋白酶(Savinase)基因的基因的拷贝转化地衣芽孢杆菌菌株。
[0085] 发酵：实例中使用了配备有pO2和pH探针的中试规模发酵罐(约1m3)。向含培养基的发酵罐中接种种子培养物(约占培养基体积的15％)，并在通风和恒定搅拌下开始发酵，并按照实例中的说明控制添加碳进料培养基。
[0086] 培养基：
[0087] 选择发酵罐中的碳限制的培养基以实现最佳生长和产物形成，并且该培养基包含2+ 2+ + 2+ 2- 3-
复杂的氮源、无机盐(至少包括：Na 、Ca 、K、Mg 、SO4 、PO4 )和痕量元素。在发酵期间添加碳源，并且碳进料培养基由高浓度的糖溶液组成。
复杂的氮源、无机盐(至少包括：Na 、Ca 、K、Mg 、SO4 、PO4 )和痕量元素。在发酵期间添加碳源，并且碳进料培养基由高浓度的糖溶液组成。
[0088] 制备培养基后，将其通过热处理灭菌并冷却至38℃，并将pH调节至期望值。
[0089] 种子培养物：
[0090] 种子培养物在中试规模种子发酵罐(约1m3)中制备。培养基由复合的碳和氮源以及无机盐(包括PO43-)组成。通过热处理将混合物灭菌并且，冷却至37℃后，将pH调节至期望值。启动搅拌和通风，接种微生物并继续发酵直到培养物具有满意的细胞密度。
[0091] 实例1使用基于pH信号的FCA以控制发酵。
[0092] 将种子发酵如上所述进行，并使用标准培养基将其用于接种4个相同的主发酵罐。
[0093] 接种后，以0.3l/h的低进料速度开始碳进料。碳源以150s脉冲之间的固定间隔的脉冲进料。这会引起溶解氧(DO)和pH信号二者的振荡。
[0094] pH信号的傅里叶变换揭示振荡的频率，该频率可以在pH信号中找到。6.7mHz频率下的响应对应于将碳源供料给发酵罐的频率。该响应被表征为FCA值。pH信号对碳进料脉冲的响应越大，则FCA值越高。
[0095] 为该实验界定的设定点为0.5，如果测得的FCA值高于设定点，则增加进料速度；如果测得的FCA值低于设定点，则降低进料速度。
[0096] 所有4个发酵均提供了可重现的指数进料速度，证实基于pH信号的FCA控制为补料分批发酵中的进料提供了可靠的控制方法。
[0097] 实例2.pH和DO FCA值之间的比较
[0098] 计算实例1中所述的四个批次中的一个的基于pH和DO的FCA值，并绘制在同一张图表中，见图1。
[0099] 比较显示，信号非常相似，这意味着在正常条件下，两个计算出的FCA值之间没有重大差异，它们均可以用于控制发酵中的进料速度。
[0100] 实例3.基于DO和pH的FCA值对过程扰动的响应。
[0101] 在该实例中，如实例1中所述进行发酵。当DO达到20％的值时，将进料速度将切换至固定速度，并过程扰动启动。
[0102] 在该实例中，通过振荡搅拌速度+/-10％来扰动发酵。扰动的频率为6.7mHz，其与碳进料脉冲的频率相同。
[0103] 扰动的影响如图2A所示，基于DO和pH的FCA值如图2B所示。
[0104] 结果显示，基于DO的FCA值下降约50％并在扰动结束后恢复完毕，然而基于pH的FCA值受影响程度不高。
[0105] 这意味着，如果进料速度受基于DO的FCA值控制，则进料由于扰动明显降低，然而如果该进料速度受基于pH值的FCA值控制，则该进料将不会受到很大影响。
[0106] 实例4.基于DO和pH的FCA值对过程扰动的响应。
[0107] 在该实例中，如实例1中所述进行发酵。当DO达到20％的值时，将进料速度将切换至固定速度，并过程扰动启动。
[0108] 在该实例中，通过振荡背压+/-10％来扰动发酵。扰动的频率为6.7mHz，其与碳进料脉冲的频率相同。
[0109] 扰动的影响如图3A所示，基于DO和pH的FCA值如图3B所示。
[0110] 结果显示，基于DO的FCA值几乎翻倍并在扰动结束后恢复完毕，然而基于pH的FCA值不会受到很大影响。
[0111] 这意味着，如果进料速度受基于DO的FCA值控制，则进料会由于扰动而显著增加，然而如果该进料速度受基于pH的FCA值控制，则该进料将不会受到很大影响。
[0112] 实例5-在氧限制条件下FCA控制的发酵
[0113] 在该实例中，如实例1中所述进行发酵。当DO达到20％的值时，将进料速度切换至固定速度，并降低搅拌以建立氧限制条件。
[0114] 测量DO和pH并且其显示在图4A中，以及计算基于DO和pH的FCA值并且其显示在图4B中。
[0115] 结果显示，在减少搅拌后，DO立即降低到约0％，基于DO的FCA值跟随DO至0，这意味着在此类条件下，基于DO的FCA值不可用于控制进料速度。
[0116] 基于pH的FCA值降低到较低水平(大概是由于氧限制，细胞的代谢活性也降低了)，但是尽管水平较低，仍可以很容易地测量FCA值，这反映出在这些条件下微生物的代谢活性。
[0117] 因此，该实例清楚地证实，可以在氧限制条件下测定基于pH的FCA，然而在此类条件下基于DO的FCA不可行。
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