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耐高温植酸酶突变体及其编码基因和应用

阅读:499发布:2020-05-08

专利汇可以提供耐高温植酸酶突变体及其编码基因和应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公布了一种新型耐高温 植酸酶 突变体及其编码基因,属于 生物 技术领域。通过定点突变方式改造大肠杆菌植酸酶基因,并使其在毕赤 酵母 菌中高效表达。本发明的突变体在高温环境中表现出更优良的性能,热 稳定性 更高,能够更好的适应工业生产的需求。改造后的植酸酶突变体经过90℃ 热处理 3min后,残余酶活同原始植酸酶相比较有了大幅度的提高,在动物 饲料 添加领域具有良好的应用前景。,下面是耐高温植酸酶突变体及其编码基因和应用专利的具体信息内容。

1.一种耐高温植酸酶突变体,其特征在于,所述突变体为基酸序列为SEQ ID NO.2的植酸酶的第31位和第177位,或者第141位和第200位,或者第224位和第232位中任意一对或者多对氨基酸同时突变成半胱氨酸。
2.如权利要求1所述的耐高温植酸酶突变体,其特征在于,所述的取代包括第31位和第
177位氨基酸同时突变成半胱氨酸;或者第141位和第200位氨基酸同时突变成半胱氨酸;或者第224位和第232位氨基酸同时突变成半胱氨酸。
3.如权利要求2所述的耐高温植酸酶突变体,其特征在于,所述的取代还包括第31位、第177位、第141位和第200位氨基酸同时突变成半胱氨酸;或者第31位、第177位、第141位、第200位、第224位和第232位氨基酸同时突变成半胱氨酸。
4.权利要求1所述的耐高温植酸酶突变体的编码基因。
5.根据权利要求1中任一项所述的耐高温植酸酶突变体,其在细菌宿主或者真核宿主细胞中表达。
6.一种包含权利要求1所述的耐高温植酸酶突变体的表达载体。
7.一种包含权利要求1所述的耐高温植酸酶突变体的宿主细胞。
8.一种包含权利要求1所述的耐高温植酸酶突变体的工程菌的构建方法,其特征在于:
包含有权利要求1的植酸酶突变体表达载体,转化宿主菌中,构建获得重组菌株;重组菌株分泌表达,发酵制备耐高温植酸酶。
9.包含权利要求1-4所述的任一耐高温植酸酶突变体的饲料添加剂。
10.权利要求1所述的耐高温植酸酶突变体用于解植酸的应用。

说明书全文

耐高温植酸酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域,涉及基因的定点突变和重组DNA技术,具体涉及耐高温植酸酶突变体及其基因、工程菌和制备方法。

背景技术

[0002] 植酸即肌醇六磷酸,为磷酸的储存库,广泛存在于植物种子中。由于矿物质结合在蛋白-植酸-矿物元素复合物中,因此就降低了某些植物性食物和一些植物蛋白分离物中矿物质的营养效价。植酸酶(Phytase),即肌醇六磷酸解酶,是一种重要的饲料添加剂,能够催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸,同时植酸盐上螯合的多种矿物质离子2+ 2+ 2+ 2+
(Zn ,Ca ,Mg ,Fe 等)和基酸、蛋白质等营养物质得以释放,进而增加饲料的营养利用率。植酸酶的添加,也在一定程度上缓解单胃动物(猪),家禽和鱼类对无机磷的摄入需求压,减少无机磷的人工添加和无效排放,极大程度上减轻磷排放造成的环境污染。目前,植酸酶在作为饲料添加剂的过程中需要经历短暂的高温(75-93℃)制粒处理,从而导致植酸酶的活性大幅度减少或者完全丧失。因此,提升植酸酶的耐温性就成为了生产应用中需要迫切解决的问题。
[0003] 根据结构和催化机理的差异,植酸酶被划分为四个家族,分别为组氨酸酸性磷酸酶、β-螺旋桨植酸酶、半胱氨酸磷酸酶和紫色酸性磷酸酶。来源于大肠杆菌的植酸酶,属于组氨酸酸性植酸酶的一种,目前为市场应用最广的产品之一。在众多来源的植酸酶中,大肠杆菌植酸酶以pH耐受性范围广,酶的比活力高等性质而被大量的用于实验性研究和工业化应用。
[0004] 已有很多通过理性及非理性设计的方法用于提高植酸酶的热稳定性的研究。非理性设计方法包括易错PCR,DNA shuffling等以及基于基因组学的筛选技术来获得热稳定较高的植酸酶。随着植酸酶晶体结构的解析、催化机理的阐明和酶耐温机制的不断研究和探索,基于分子动力学模拟、结构动力学和基于分子内部的作用力如氢键、盐桥、二硫键的修饰等方面的理性设计同样为高温植酸酶的进化和筛选提供了参考数据和改造策略。
[0005] 本申请人在研究中通过对大肠杆菌来源的植酸酶进行定点突变,获得了可以适用于工业化生产的耐高温植酸酶突变体AppA-M1~M5,这些突变体在耐热性能方面得到明显的提高,在饲料添加剂领域具有较好的应用前景。

发明内容

[0006] 本发明的目的是通过定点突变的方法对大肠杆菌来源的植酸酶AppA进行改造,使改造后的植酸酶突变体AppA-M1~M5具有更加优良的耐热性能。
[0007] 本发明提供了大肠杆菌来源的植酸酶AppA作为改造模板,其核酸序列和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
[0008] 本发明提供了改造后的耐高温植酸酶突变体AppA-M1,所述的取代为氨基酸序列为SEQID NO.2的植酸酶的第31位天冬氨酸和第177位亮氨酸同时变成半胱氨酸。
[0009] 本发明还提供了另一种改造后的耐高温植酸酶突变体AppA-M2,所述的取代为氨基酸序列为SEQ ID NO.2的植酸酶的第141位苏氨酸和第200位缬氨酸同时变成半胱氨酸。
[0010] 本发明还提供了另一种改造后的耐高温植酸酶突变体AppA-M3,所述的取代为氨基酸序列为SEQ ID NO.2的植酸酶的第224位谷氨酰胺和第232位脯氨酸同时变成半胱氨酸。
[0011] 本发明还提供了另一种改造后的耐高温植酸酶突变体AppA-M4,所述的取代为氨基酸序列为SEQ ID NO.2的植酸酶的第31位天冬氨酸、第177位亮氨酸、第141位苏氨酸和第200位缬氨酸同时变成半胱氨酸。
[0012] 本发明还提供了另一种改造后的耐高温植酸酶突变体AppA-M5,所述的取代为氨基酸序列为SEQ ID NO.2的植酸酶的第31位天冬氨酸、第177位亮氨酸、第141位苏氨酸、第200位缬氨酸、第224位谷氨酰胺和第232位脯氨酸同时变成半胱氨酸。
[0013] 本发明的另一目的是提供包含上述耐高温植酸酶突变体的编码基因的重组菌株。
[0014] 本发明提供了耐高温植酸酶突变体AppA-M1、AppA-M2、AppA-M3、AppA-M4和AppA-M5毕赤酵母重组菌株摇瓶发酵后的胞外植酸酶的热失活数据。
[0015] 本发明提供了耐高温植酸酶突变体AppA-M1、AppA-M2、AppA-M3、AppA-M4和AppA-M5毕赤酵母重组菌株50L发酵罐发酵后的植酸酶酶活数据。
[0016] 本发明具有以下优点和益处:
[0017] (1)此发明公布了耐高温植酸酶突变体,在一定程度上解决了植酸酶耐热性能,以大肠杆菌来源的植酸酶为基础,分别选取两个或者多个特定的氨基酸位点进行定点突变,获得的新型植酸酶突变体,在耐热性能方面得到明显的提高。改造获得的植酸酶突变体经过90℃热处理3min,酶活的残留率达到32~75%,而原始酶热处理后的酶活的残留率仅为13%。
[0018] (2)改造后的耐高温植酸酶突变体可以用于基于原核表达系统和真核表达系统进行发酵生产。例如进行毕赤酵母发酵,其催化活性最高可达到29000U/mL。
[0019] (3)此专利在一定的范围内,为后期持续性的进行植酸酶的耐温性、蛋白酶抵抗性和耐pH范围等性能的改造提供一定的指导意义和参考价值。附图说明
[0020] 图1为原始植酸酶AppA和植酸酶突变体AppA-M1、AppA-M2、AppA-M3、AppA-M4和AppA-M5毕赤酵母表达菌株摇瓶发酵的SDS-PAGE图;
[0021] 图2为植酸酶突变体AppA-M1、AppA-M2、AppA-M3、AppA-M4和AppA-M5与原始酶AppA分别经过90℃热处理3min后的酶活的残留率的比较图;
[0022] 图3为植酸酶突变体AppA-M1、AppA-M2、AppA-M3、AppA-M4和AppA-M5毕赤酵母表达菌株利用50L发酵罐发酵的胞外植酸酶酶活数据。

具体实施方式

[0023] 本发明所用到的实验材料及试剂如下:
[0024] 1.实验材料
[0025] (1)菌株和载体:大肠杆菌DH5a,毕赤酵母GS115和毕赤酵母表达载体pPICZaA购自Invitrogen公司。
[0026] (2)酶与试剂盒:PmeI内切酶购自Thermo公司。PrimeSTARMax DNAPolymerase购自TaKaRa公司。无缝克隆试剂盒购自南京诺韦赞公司。质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购自Omega公司。
[0027] (3)试剂:博来霉素Zeocin购自Invitrogen公司;酵母粉、蛋白胨购自OXOID公司;植酸钠、YNB购自上海源叶生物科技有限公司,乙酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司;
钼酸铵、偏矾酸铵、甲醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;NaCl、葡萄糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司;甘油购自天津基准化学试剂有限公司;生物素购自北京索莱宝科技有限公司;其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0028] 2.培养基
[0029] 大肠杆菌培养基为LB(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%NaCl,pH 7.0);
[0030] 低盐LB(1%蛋白胨,0.5%酵母提取物,0.5%NaCl,pH 7.5);
[0031] 酵母培养基YPD(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖);
[0032] 酵母培养基BMGY(1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%YNB、4×10-5%Biotin、1%甘油(V/V));
[0033] 酵母甲醇诱导培养基BMMY(1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34%YNB、4×10-5%Biotin、1%甲醇(V/V))。
[0034] BSM培养基:26.7ml/L 85%H3PO4,0.93g/L CaSO4.2H2O,18.2g/L K2SO4,14.9g/LMgSO4.2H2O,4.13g/L KOH,40g/L甘油,4ml/L PMT1微量元素(6g/L CuSO4.5H2O,0.088g/LKI,3g/LMnSO4.H2O,0.2g/LNa2MoO4.2H2O,0.02g/L H3BO3,0.5g/L CoCl2.6H2O,20g/L ZnCl2,65g/LFeSO4.7H2O,0.2g/Lbiotin,5ml/L浓硫酸)。
[0035] 具体实施例1构建植酸酶突变体表达质粒
[0036] 按照毕赤酵母密码子进行优化,通过全基因合成技术(苏州金唯智生物科技有限公司)获得SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌植酸酶基因(编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2),通过无缝连接克隆技术构建到pPICZaA载体上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中,涂布于含有25μg/mL Zeocin的低盐LB固体培养平板上,挑选阳性转化子进行菌落PCR验证,验证引物为phytase-F:5’-TTGCTGACGTCGACGAAAG-3’和phytase-R:
[0037] 5’-GCTGCAAAGTTTGGAAGAC-3’,验证条带大约为819bp。将菌落PCR验证正确的菌接种于含有25μg/mLZeocin的低盐LB液体培养基中过夜培养,提取质粒,送测序,测序正确的质粒命名为pPICZaA-AppA。
[0038] 以含有上述植酸酶基因的重组质粒pPICZaA-AppA为最初PCR扩增模板,每个植酸酶突变体通过两轮或者多轮PCR反应引入两个或者多个点突变(引物参考表2)获得。以构建pPICZaA-AppA-M1质粒为例,PCR体系如下:
[0039] 表1 PCR反应体系
[0040]
[0041] PCR扩增条件:98℃30s;98℃10s,55℃15s,72℃1min/2kb,30cycles;72℃4min[0042] 第一轮PCR模板为pPICZaA-AppA,引物为phytase-M1-F1和phytase-M1-R1,PCR产物经回收后,用DpnI 37℃酶切1小时,去除模板DNA,随后回收溶解至10μl无菌ddH2O中,转化DH5a。挑取单菌落送测序,将测序正确的质粒当作模板,进行第二轮PCR,PCR引物为phytase-M1-F2和phytase-M1-R2,PCR产物经回收后,用DpnI 37℃酶切1小时,去除模板DNA,随后回收溶解至10μl无菌ddH2O中,转化DH5a。挑取单菌落送测序,测序正确的质粒命名为pPICZaA-AppA-M1,该质粒中含有两个植酸酶的氨基酸突变位点,即第31位天冬氨酸和第177位亮氨酸同时变成半胱氨酸。相同方法构建另外四个质粒。构建pPICZaA-AppA-M2质粒模板为pPICZaA-AppA,选用引物为phytase-M2-F1和phytase-M2-R1及phytase-M2-F2和phytase-M2-R2,构建好的质粒pPICZaA-AppA-M2包含氨基酸突变位点为第141位苏氨酸和第200位缬氨酸同时变成半胱氨酸。构建pPICZaA-AppA-M3质粒模板为pPICZaA-AppA,选用引物为phytase-M3-F1和phytase-M3-R1及phytase-M3-F2和phytase-M3-R2,构建好的质粒pPICZaA-AppA-M3包含氨基酸突变位点为第224位谷氨酰胺和第232位脯氨酸同时变成半胱氨酸。构建pPICZaA-AppA-M4质粒模板为pPICZaA-AppA-M1,选用引物为phytase-M2-F1和phytase-M2-R1及phytase-M2-F2和phytase-M2-R2,构建好的质粒pPICZaA-AppA-M4包含氨基酸突变位点为第31位天冬氨酸、第177位亮氨酸、第141位苏氨酸和第200位缬氨酸同时突变成半胱氨酸。构建pPICZaA-AppA-M5质粒模板为pPICZaA-AppA-M4,选用引物为phytase-M3-F1和phytase-M3-R1及phytase-M3-F2和phytase-M3-R2,构建好的质粒pPICZaA-AppA-M5包含氨基酸突变位点为第31位天冬氨酸、第177位亮氨酸、第141位苏氨酸、第200位缬氨酸、第224位谷氨酰胺和第232位脯氨酸同时突变成半胱氨酸。
[0043] 表2实施例中所用的引物
[0044]
[0045] 具体实施例2构建植酸酶突变体毕赤酵母重组菌株
[0046] (1)制备毕赤酵母GS115感受态
[0047] 从-80度箱冻存的毕赤酵母GS115甘油管,划线于YPD平板,30℃培养48h。选取单克隆菌落接种到装有50mL液体YPD培养基的250mL三瓶中,放置于30℃220rpm摇床过夜培养至OD600达到0.8~1.2。取1mL菌液冰上预冷30min,4℃8500g离心30s。去除上清液,剩余菌体重悬于1mL电转液(电转液配方:0.1M醋酸锂,0.6M山梨醇,10mM Tris-HCl(pH7.5),10mM DTT),室温放置30min,4℃8500g离心30s收集菌体,以下转为冰上操作:用1mL预冷的
1M山梨醇洗涤3次,4℃8500g离心30s;剩余菌体重悬于55μl 1M山梨醇,即为一管制备好的感受态,冰上备用。
[0048] (2)制备转化片段
[0049] 转化前用PmeI内切酶分别对质粒pPICZaA-AppA、pPICZaA-AppA-M1、pPICZaA-AppA-M2、pPICZaA-AppA-M3、pPICZaA-AppA-M4和pPICZaA-AppA-M5进行单酶切,酶切体系如下:质粒~5μg,PmeI 5μl,10×buffer 5μl,ddH2O补齐50μl。37℃酶切1h,1%琼脂糖凝胶电泳检测,对条带进行胶回收,溶解在10μl无菌ddH2O中。
[0050] (3)转化
[0051] 取一管制备好的感受态细胞,加入10μl(~5μg)待转化的回收片段,转移至冰上预冷的0.1cm电转杯中,加盖,冰浴5min,随后进行电转化,电转参数设定如下:电压1.5kV;电容25μF;电阻200-400Ω。电击完毕后,加入1mL预冷的1M山梨醇进行重悬,转入1.5mL的Ep管中,室温静置2h。7000rpm离心3min,去除上清,留存大约200μl菌体悬液涂布于含有100μg/mL zeocin的YPD平板上,30℃避光培养48~72h。挑取平板上的单菌落进行菌落PCR验证,验证引物为phytase-F:5’-TTGCTGACGTCGACGAAAG-3’和phytase-R:5’-GCTGCAAAGTTTGGAAGAC-3’,验证条带大小约为819bp,以转化空质粒pPICZaA的毕赤酵母GS115(pPICZaA)为对照,确定阳性转化子。选取验证正确的阳性克隆接种于含有5mL 100μg/mL zeocin的YPD培养基中,30℃培养48h,将培养物保存在终浓度为20%的甘油中,冻存于-80℃冰箱中,由此获得原始植酸酶毕赤酵母表达菌株GS115(AppA)和植酸酶突变体毕赤酵母表达菌株GS115(AppA-M1)、GS115(AppA-M2)、GS115(AppA-M3)、GS115(AppA-M4)和GS115(AppA-M5)。
[0052] 具体实施例3植酸酶突变体的制备、酶活及耐热性检测
[0053] 从-80度冰箱冻存的植酸酶表达菌GS115(AppA)、GS115(AppA-M1)、GS115(AppA-M2)、GS115(AppA-M3)、GS115(AppA-M4)和GS115(AppA-M5),划线于含有100μg/mL Zeocin的YPD平板,30℃培养48h。选取单克隆菌落接种到装有5mL含有100μg/mL Zeocin的YPD培养基的试管中,30℃200rpm培养48h。按照OD=0.12的接种量接种到装有30mL含有100μg/mLAmpicillin和50μg/mL Kanamycin的BMGY培养基中,30℃200rpm培养24h后,按照OD=0.17接种量接种到装有30mL含有100μg/mLAmpicillin、50μg/mL Kanamycin和1%甲醇的BMMY培养基中,30℃200rpm培养6天。每隔24h补加0.5%甲醇。发酵结束后,取1mL发酵液,
7000rpm离心3min,上清液与5×蛋白上样缓冲液进行混合,煮沸20min后,12000rpm离心
3min,取10μl制备的样品用12%SDS-PAGE凝胶电泳检测。检测结果显示(图1),毕赤酵母植酸酶表达菌株GS115(AppA)、GS115(AppA-M1)、GS115(AppA-M2)、GS115(AppA-M3)、GS115(AppA-M4)和GS115(AppA-M5)发酵液中均含有两条明显的蛋白条带,分子量大小略高于大肠杆菌植酸酶的理论分子量(~45kDa),分析应该是植酸酶的两种不同糖基化修饰形式。
[0054] 1.酶活及热稳定性检测
[0055] 酶活定义:在温度37℃、pH5.5条件下,每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol/L无机磷,即为一个植酸酶活性单位,以U表示。
[0056] 取摇瓶发酵6天后的发酵液,7000rpm离心3min,上清液用做酶活检测及耐热性分析。植酸酶测定方法参考饲料植酸酶活性的国标测定法GB/T18634-2009。所用试剂如下:
[0057] (1)乙酸缓冲液(1):0.25mol/L乙酸钠,用冰乙酸调节pH至5.50±0.1。
[0058] (2)乙酸缓冲液(2):0.25mol/L乙酸钠,0.5g/L Triton X-100,0.5g/L血清蛋白,用冰乙酸调节pH至5.50±0.1。
[0059] (3)底物溶液:用乙酸缓冲液(2)配制7.5mmol/L植酸钠,用冰乙酸调节pH至5.50±0.1,现用现配。
[0060] (4)钼酸铵溶液:称取10g钼酸铵于50mL烧杯中加去离子水微加热溶解,转移至100mL容量瓶中,加入1mL氨水(25%)后用水定容至刻度。
[0061] (5)偏酸铵溶液:称取0.235g偏钒酸铵于50mL烧杯中,加入2mL硝酸溶液,及少量去离子水,并用玻璃棒研磨溶解,再转移至100mL棕色容量瓶中,用水定容至刻度。避光保存一周内有效。
[0062] (6)酶解反应终止及显色液:2份硝酸溶液(1+2水溶液),1份钼酸铵溶液,和1份偏钒酸铵溶液混合使用,现配现用。
[0063] 酶活具体检测方法如下:
[0064] 用乙酸缓冲液(2)对发酵粗酶液上清进行稀释,取0.2mL稀释液(标准空白对照加入0.2mL乙酸缓冲液(2)),同1.8mL乙酸缓冲液(1)混合,37℃预热5min;加入底物溶液4mL,混匀,37℃反应30min;加入终止及显色液4mL,混匀,室温静置10min,如出现浑浊,4000rpm离心10min,在分光光度计415nm波长处测定对照组A0和实验组A的吸光值,A-A0为实测吸光值。根据标准曲线(标准曲线按照植酸酶活性的国标测定法GB/T18634-2009标准制作)计算植酸酶的活性。
[0065] 2.热稳定性检测
[0066] 将实施例2所得植酸酶的粗酶液在恒温90℃水浴处理3min后,放置于冰上快速冷却。按照酶活测定方法分别测定经过热处理和未经热处理的酶活,结果如图2所示,原始植酸酶的残余酶活为13%,而植酸酶突变体AppA-M1、AppA-M2、AppA-M3、AppA-M4和AppA-M5的残余酶活分别为32%、43%、47%、62%和75%。
[0067] 实施例4植酸酶突变体毕赤酵母表达菌株的50L发酵罐发酵
[0068] 从-80℃冰箱冻存的植酸酶突变体表达菌株GS115(AppA-M1)、GS115(AppA-M2)、GS115(AppA-M3)、GS115(AppA-M4)和GS115(AppA-M5),划线于含有100μg/mL Zeocin的YPD平板,30℃培养48h。挑取单菌落接种到含有100μg/mL Zeocin的5mLYPD试管中,30℃220rpm培养48h。按照1%接种量转接到两个含有400mLYPD的2L三角瓶中,30℃220rpm培养24h。将800mL种子液转接到含有30LBSM培养基的50L(BLBIO-50SJA-2,上海百伦生物科技有限公司)发酵罐中。发酵初始阶段,当培养基中甘油耗尽,溶(DO)发生反弹时候,补加1%甲醇开始诱导植酸酶的生产。发酵过程中以溶氧的急剧增加时刻作为甲醇补加点,甲醇添加速度设定为3.1mL/L/h。初始发酵阶段,空气送体积为50L/min,搅拌速度开始设置为
350rpm。发酵过程中压力保持在0.05mPa,搅拌速度最大设定为800rpm,并根据发酵罐的使用说明将空气泵送体积改变为最大容量。整个发酵过程中通过加入氨水调节发酵液的pH值保持在5.0,并根据需要加入消泡剂。发酵过程中不定时取样检测植酸酶酶活。
[0069] 酶活数据(图3)显示:发酵200h后,植酸酶突变体的酶活均达到25000U/mL以上,其中GS115(AppA-M1)达到29000U/mL,植酸酶突变体表达菌株均具有良好的工业生产应用前景。
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