用于在丝状真菌中改进的蛋白质生产的方法
阅读：932发布：2021-04-11
专利汇可以提供用于在丝状真菌中改进的蛋白质生产的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及遗传修饰丝状 真菌 宿主用于改进的 蛋白质 生产的方法。所述方法包括对丝状真菌宿主进行遗传修饰以过表达或缺失特定基因。本发明还涉及所述经修饰的宿主。进一步地，本发明涉及用于在丝状真菌宿主中改进的蛋白质生产，或用于产生改进的蛋白质组合物的方法，所述蛋白质为例如 纤维 素酶、半 纤维素 酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质或其他蛋白质。，下面是用于在丝状真菌中改进的蛋白质生产的方法专利的具体信息内容。
1.遗传修饰丝状真菌宿主用于改进的蛋白质生产的方法，其包括遗传修饰丝状真菌宿主使之以增加的量或活性过表达，或使之以减少或缺乏的量或者以减少或缺乏的活性缺失一种或多种基因，所述基因选自：基因tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524(SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)和tre120120(SEQ ID NO:5)；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其他核苷酸序列，所述宿主相比于亲本菌株能够增加或降低纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质的生产。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法包括，丝状真菌宿主经遗传修饰以过表达一种或多种基因，所述基因选自:基因tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524(SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)和tre120120(SEQ ID NO:5)；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其他核苷酸序列，所述宿主相比于亲本菌株能够增加纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质的生产。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法包括，丝状真菌宿主经遗传修饰以缺失一种或多种基因，所述基因选自：基因tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524(SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)和tre120120(SEQ ID NO:5)；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其他核苷酸序列，所述宿主相比于亲本菌株能够降低纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质的生产。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中宿主选自木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属和青霉属。
5.丝状真菌宿主，其经遗传修饰以过表达或缺失一种或多种基因，所述基因选自：
基 因 tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524(SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)和tre120120(SEQ ID NO:5)；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其他核苷酸序列，所述宿主相比于亲本菌株能够增加或降低纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质的生产。
6.根据权利要求5的宿主，其中丝状真菌宿主经遗传修饰过表达一种或多种基因，所述基因选自：基因tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524(SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)和tre120120(SEQ ID NO:5)；或者至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其他核苷酸序列，所述宿主相比于亲本菌株能够增加纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质的生产。
7.根据权利要求5或6的宿主，其中丝状真菌宿主经遗传修饰缺失一种或多种基因，所述基因选自：基因tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524(SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)和tre120120(SEQ ID NO:5)；或者选自至少一种所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其他核苷酸序列，所述宿主相比于亲本菌株能够降低纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质的生产。
8.根据权利要求5-7中任何一项的宿主，其中宿主选自木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属和青霉属。
9.根据权利要求5-7中任何一项的宿主，其中宿主为丝状真菌生产宿主。
10.用于在丝状真菌宿主中改进的生产或产生改进的蛋白质组合物的方法，其包括将根据权利要求5-9中任何一项的经修饰的丝状真菌宿主在用于蛋白质生产的适合培养条件下进行培养。
11.根据权利要求10的方法，其中蛋白质选自：纤维素酶、半纤维素酶、侧链裂解酶、木质纤维素降解酶、果胶酶、木质酶；淀粉糖化酶；蛋白酶；转化酶；植酸酶、磷酸酶和疏水蛋白。
12.根据权利要求10或11的方法，其中蛋白质为在生产受宿主的遗传修饰影响的任何一种蛋白质的启动子下表达的异源或重组蛋白质。
13.根据权利要求12的方法，其中异源或重组蛋白质在编码纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质或其他分泌蛋白质的基因的启动子下表达。
14.根据权利要求12或13的方法，其中异源或重组蛋白质在选自以下的蛋白质的启动子下表达：纤维素酶、半纤维素酶、侧链裂解酶、木质纤维素降解酶、果胶酶、木质酶；淀粉糖化酶；蛋白酶；转化酶；植酸酶、磷酸酶和疏水蛋白。
用于在丝状真菌中改进的蛋白质生产的方法
发明领域
[0001] 本发明涉及遗传修饰丝状真菌宿主用于改进的蛋白质生产的方法。本发明还涉及提供经经遗传修饰的丝状真菌宿主用于改进的蛋白质生产，特别是提供木霉属宿主。进一步地，本发明涉及用于在丝状真菌中，改进的蛋白质生产或产生改进的蛋白质组合物的方法。这些蛋白质可以为内源蛋白质如水解酶、或异源蛋白质。
[0002] 发明背景
[0003] 许多降解生物多聚物的水解酶，如纤维素酶、半纤维素酶、木质纤维素酶和果胶酶已经引起人们的关注，因为其可能潜在地应用于食品、饲料、纺织以及纸浆和造纸工业。工业丝状真菌生产株尤其是曲霉属（Aspergillus）和木霉属（Trichoderma）菌株可生产高量的细胞外酶类。这些真菌在大的生物反应器中的生长简单且经济，并且具有良好的分泌能力，能够进行在很多较高等真核细胞中发生的相似类型的蛋白质修饰。高分泌型菌株和强启动子如纤维素酶启动子的存在使得丝状真菌宿主也可潜在地用于异源蛋白质的生产。
[0004] 已知丝状真菌中，主要是在转录水平上对纤维素酶、半纤维素酶、木质纤维素酶和果胶酶的生产进行调控（Aro等人，FEMSMicrobiology Reviews 29(2005)719-739）。Stricker 等 人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(2208)78:211-220 描 述 了 黑 曲 霉（Aspergillusniger）和红褐肉座菌（Hypocreajecorina(里氏木霉T.reesei)中在半纤维素酶和纤维素酶表达的转录调控中的相似和不同之处，包括XlnR和Xyr1的作用。
在红褐肉座菌中，一些调控组分在纤维素调控中起正向作用(XYRI、ACE2、HAP2/3/5)，而另一 些起负 向作用(ACEI、CREI)(Kubicek等 人，Biotechnology and Biofuels
2009,2:19； 等 人，Appl and Environmental Microbiology,July
2009,p.4853-4860)。
在红褐肉座菌中，一些调控组分在纤维素调控中起正向作用(XYRI、ACE2、HAP2/3/5)，而另一 些起负 向作用(ACEI、CREI)(Kubicek等 人，Biotechnology and Biofuels
2009,2:19； 等 人，Appl and Environmental Microbiology,July
2009,p.4853-4860)。
[0005] 虽然一些调控基因对纤维素酶和半纤维素酶的生产的作用已经在现有技术中有所公开，但是仍然需要改进的菌株，其能够在丝状真菌中加强或改变纤维素酶或半纤维素酶或其他水解性酶的生产。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明的一个目标是提供用于遗传修饰丝状真菌宿主用于改进的蛋白质生产的方法。
[0008] 本发明的另一个目标是提供经遗传修饰的丝状真菌用于改进的蛋白质生产。
[0009] 本发明的一个进一步的目标是提供在丝状真菌中，改进的蛋白质生产或用于产生改进的蛋白质组合物的方法。
[0010] 本发明的一个方面提供了遗传修饰丝状真菌宿主用于改进的蛋白质生产的方法。所述方法包括
[0011] ——遗传修饰丝状真菌宿主使之（以增加的量或活性）过表达某些基因，所述基因引起纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质生产的增加；
[0012] 及/或
[0013] ——通过制造缺失（以减少或缺乏的量或者减少或缺乏的活性）基因来遗传修饰丝状真菌宿主，所述基因引起纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料和/或其他蛋白质降解的蛋白质生产的增加。
[0014] 在丝状真菌宿主中，可单独地或组合地遗传修饰一种或多种基因，所述基因引起纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质生产的增加。
[0015] 在一方面，本发明提供了用于增加一组蛋白质的生产的方法，所述蛋白质通常为分泌蛋白质或在编码分泌蛋白质的基因启动子下产生的蛋白质。
[0016] 在另一方面，本发明提供了降低一组蛋白质的生产的方法，所述蛋白质通常为分泌蛋白质，以在生产例如异源蛋白质时修饰所生产蛋白质的模式或降低不期望有的副产品的生产。
[0017] 在丝状真菌宿主中，可单独地或组合地遗传修饰一种或多种基因，所述基因引起纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质生产的增加。
[0018] 在本发明的多种实施方式中，宿主可选自木霉属、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属（Fusarium）、脉孢菌属（Neurospora）、篮状菌属（Talaromyces）、平革菌属（Phanerochaete）、金孢属（Chrysosporium）和青霉属（Penicillium）。在一个具体的实施方式中，所述丝状真菌宿主为木霉属宿主。
[0019] 在本发明的一个方面，过表达的基因引起纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质和/或其他蛋白质(通常为分泌蛋白质)或使用编码分泌蛋白质的基因的启动子产生的蛋白质的生产比亲本宿主有所增加。经遗传修饰的宿主造成的生产增加可通过培养过程中最大生产水平比亲本宿主的生产水平高或在培养过程中任何时间点的生产水平比亲本宿主高并使生产过程更快而检测到。
[0020] 在本发明的一个实施方式中，过表达的基因可选自木霉属基因tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524（SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)及tre120120(SEQ ID NO:5)；或者为至少一种所述基因在曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者任何所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述基因或所述同源基因的其他序列。这些基因的过表达引起蛋白质生产比亲本宿主增加，所述蛋白质通常地为分泌蛋白质和/或在编码分泌蛋白质的基因的启动子下产生的蛋白质、参与木质纤维素材料降解的蛋白质，所述木质纤维素材料特别是为纤维素酶和/或半纤维素酶。
[0021] 在本发明的多种实施方式中，可将丝状真菌宿主构建为过表达特定基因或特定基因的组合，或者缺失特定基因或特定基因的组合，或者修饰以改变基因的蛋白质产物的量或活性。在进一步的实施方式中，可将丝状真菌宿主构建为过表达特定基因或特定基因的组合，并在同时缺失特定基因或特定基因的组合。
[0022] 在一个进一步的方面，本发明提供了用于在丝状真菌宿主中，改进的蛋白质生产或产生改进的蛋白质组合物的方法，其包括用如上文所述的方式对丝状真菌宿主进行遗传修饰，并将经修饰的丝状真菌宿主在用于蛋白质生产的适合培养条件下培养（培养）。
[0023] 在本发明的一个实施方式中，所产生的蛋白质产物可为内源酶。合适的酶的实例为水解酶，特别是为纤维素酶、半纤维素酶、纤维素或半纤维素侧链裂解酶、木质纤维素降解酶，特别是为果胶酶和木质酶；淀粉糖化酶；蛋白酶；转化酶；植酸酶、磷酸酶和疏水蛋白。
[0024] 在本发明的另一个实施方式中，所述蛋白质为在受宿主的遗传修饰影响的基因启动子如纤维素酶或半纤维素酶启动子的调控下产生的异源或重组蛋白质。
[0025] 在一个进一步的方面，本发明提供了经遗传修饰的丝状真菌宿主。
[0026] 所述宿主可选自木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属。更特异地，所述宿主可为木霉属宿主。
[0027] 通过对调控基因或其调控机制进行遗传修饰，有可能普遍改进细胞外蛋白质的生产，或丝状真菌（特别是为木霉属）所生产的不同组蛋白质和酶的生产。当将编码分泌蛋白质的基因的启动子和/或调控元件用于异源或重组表达时，这些遗传修饰还可用于改进异源蛋白质的生产。可对真菌宿主进行遗传修饰以更多或更少地表达调控基因，或从所述基因产生更多或更少的活性调控蛋白质。所述遗传修饰可包括过表达、删除或任何其他改变基因的表达强度或所述基因产物活性的遗传修饰。这些遗传修饰对真菌生产宿主的产生蛋白质模式产生所需要的效应。有益的是对生产宿主进行遗传修饰，使得减少不期望有的副产物的生产或使得所选择的蛋白质或一组蛋白质表达更多而其他蛋白质产生地更少。对应的遗传修饰还可在其他丝状真菌中进行，通过修饰对应的同源基因以修饰宿主的蛋白质生产特性。此外可向其他真菌种属以本身的形式或修饰形式引入来自其他真菌物种的对应基因以对其他生物体中蛋白质生产产生所需要的效应。
[0028] 在下文中，本发明将借助详细描述及一些可用实施例的参考得到进一步描述。
[0030] 图1–5经遗传修饰以过表达特定基因的菌株的蛋白质生产结果。
[0032] 图6B以微晶纤维素（Avicel）、云杉（spruce）、麦秸或槐糖诱导的里氏木霉培养物及诱导前预培养物和未诱导对照培养物的pH。
[0033] 图7A诱导实验中一组编码水解酶的已知基因的转录水平:abf1(阿拉伯呋喃糖酶1)、bga1(β-半乳糖苷酶1)、bgl1(β-葡萄糖苷酶1)、bxl1(β-木糖苷酶1)、cip1(纤维素结合)、cip2()egl1(内切葡聚糖酶1)、glr1(葡糖醛酸酶1)、man1、xyn2和xyn4。
[0034] 图7B诱导实验中一组编码水解酶的已知基因的转录水平:abf1(阿拉伯呋喃糖酶1)、bga1(β-半乳糖苷酶1)、bxl1(β-木糖苷酶1)、cip2()、glr1(葡糖醛酸酶1)和xyn2。
[0035] 图8用于转化里氏木霉菌株QM9414并生成过表达编码推定的调控因子的基因的菌株的质粒构建物的示意图。通过用基因特定序列取代含有基因ccdB和CmR的attR1 attR2位点之间的区域，将所述基因插入质粒载体。列出了通过转化获得的质粒及对应里氏木霉菌株的名称，以及插入质粒的对应基因名称。
[0036] 发明详述
[0037] 本发明涉及在丝状真菌中多种蛋白质的改进生产。本发明基于的是发现影响多种蛋白质生产的调控因子，特别是为水解酶。在本发明范围内的为纤维素酶，如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶；及半纤维素酶，如木聚糖酶、甘露聚糖酶、β-木糖苷酶；及侧链裂解酶、阿拉伯糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、乙酰基木聚糖酯酶；以及其他木质纤维素纤维素降解酶，特别是果胶酶，如内切-和外切聚半乳糖醛酸酶，果胶酯酶，果胶及果胶酸裂解酶；以及木质纤维素酶，如木质纤维素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶；淀粉糖化酶，如α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、环糊精酶;疏水蛋白质；蛋白酶（丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶）；转化酶；植酸酶；磷酸酶，及疏水蛋白质。
[0038] 在真菌宿主中通过过表达特定基因和/或通过制造缺失特定基因，所述特定基因编码调控因子，可能增加或改变内源蛋白质的生产，这些蛋白质特别是为水解酶如纤维素酶、半纤维素酶、木质纤维素降解酶、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质或其他蛋白质，通常为分泌蛋白质。还可能在修饰的宿主中生产在所影响的基因启动子调控下的异源或重组蛋白质，且产量佳，所述启动子为如纤维素酶或半纤维素酶基因启动子或其他编码参与木质纤维素材料降解的蛋白质的基因启动子或其他分泌蛋白质启动子。
[0039] 本文描述了用于修饰丝状真菌宿主，如木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属和青霉属的方法。在这些方法中使用的基因是基于生长于不同底物的培养物中的基因表达情况及基因的序列数据而选择的。序列优选地包括以编码调控蛋白质的基因为特征的序列结构域，所述调控蛋白质如转录因子、其他转录因子、蛋白质激酶、参与组蛋白修饰或染色质重塑的蛋白质，或这些基因优选地与纤维素酶或半纤维素酶在丝状真菌宿主的基因组中进行共调控。
[0040] “过表达一种基因”（此处特别是为调控基因）可以如下方式进行，例如通过向真菌宿主中引入另一份或多份拷贝的特定基因，或表达在使所述基因表达增加的另一个启动子下的基因，或将真菌宿主进行遗传修饰使基因表达更多或基因产物活性增加。基因的过表达对蛋白质生产的效应可通过将经修饰的宿主在适合蛋白质生产的条件下进行培养而研究。对一种或多种内源蛋白质的生产的效应可通过例如确定特定酶活性，确定总蛋白质的量，或者确定所产生的特定内源或异源蛋白质的量而进行研究。
[0041] “制造缺失基因”指的是对真菌宿主进行遗传修饰以删除或截短特定基因（本文具体为调控基因），或通过任何合适方法对真菌宿主进行遗传修饰导致基因表达减少或缺乏或者使得基因产物的活性减少或缺乏。“失活”指的是遗传修饰（通常为删除）导致基因产物的活性完全丢失。在本发明中，特定基因的遗传修饰对蛋白质生产的效应可通过例如确定特定酶活性、确定总蛋白质的量或者确定所产生的内源或异源蛋白质的量而研究。
[0042] “调控基因”在本文指的是其功能能影响真菌宿主的蛋白质生产的基因。“过表达一种基因”（如上文所述）或“制造缺失基因”（如上文所述）对真菌的蛋白质生产有影响。所述基因可编码例如转录因子、其他转录调控子、蛋白质激酶、参与组蛋白修饰或染色质重塑的蛋白质，或其他调控蛋白质。
[0043] “诱导型底物”在本文指的是底物，其能够诱导产生水解酶或木质纤维素降解酶（如纤维素酶或半纤维素酶）、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质或其他蛋白质（通常为分泌蛋白质）、或使用编码分泌蛋白质的启动子产生的蛋白质。为研究编码所提到的酶的基因，可使用的底物为如 预处理的麦秸、预处理的云杉、乳糖、废弃的谷物提取物或槐糖、或其他植物衍生碳源。云杉和麦秸的预处理可使用汽爆并洗涤处理的材料而进行。所述材料的纤维部分可用于进行诱导。
[0044] 在一方面，改进的生产可指所需要的酶或其他蛋白质的生产的改进。如本文公开的，可将丝状真菌宿主构建为过表达一种或多种特定的调控基因，或构建为缺失一种或多种特定的其他调控基因，以改进的蛋白质生产。
[0045] “蛋白质生产的适合培养条件”在本文指的是适合产生所需蛋白质或所需蛋白质组合的任何培养条件。用于产生水解酶或木质纤维素降解酶（如纤维素酶或半纤维素酶）、其他参与木质纤维素材料降解的蛋白质或其他蛋白质、或用于产生许多分泌或其他蛋白质的条件对本领域技术人员熟知。
[0046] “改进的生产”在本文一方面指的是所产生的蛋白质的量增加。所述蛋白质可生产进入培养基或进入宿主细胞，优选地是进入培养基。增加的生产可检测为例如比亲本宿主更高的蛋白质或酶活性如纤维素酶或半纤维素酶活性或者所产生的细胞外总蛋白质的最大水平。此外或备选地，改进的蛋白质生产可以检测为相比于亲本宿主菌株，在培养的任何时间点所产生的酶活性或所产生的蛋白质的水平更高，这导致在培养的更早阶段的产量水平更高并因此使得生产过程更快。改进的生产还可指的是培养物中每份生物质量的分泌蛋白质或酶活性的生产增加。较低量的生物质的蛋白质生产是有益的，因为蛋白质产物的下游处理更简单，并且在生产过程中对营养的消耗减少。而且，还有在生产菌株的遗传操作上的所需效应是由于例如生产过程中生物质的量降低或由于菌株的其他特性使得产物培养物粘度降低。纤维素酶和半纤维素酶活性可使用多种方法、使用不同的底物而测量（这些方法的实例见Zhang Y.H.,Hong J.,Ye X.,Cellulase assays,Methods Mol.Biol.,(2009),581:213-231;Sharrock K.R.,Cellulase assay methods:areview,J.Biochem.Biophys.Methods.(1988),17:81-105;T.K.Ghose,Measurement ofcellulase activities,(1987),Pure&Appl.Chem.,59,257-268;T.K.Ghose
and V.S.Bisaria,Measurement ofhemicellulase activities.Pure&Appl.
Chem.,(1987),59,1739—1752）。可例如测量针对底物4-甲基伞形酮-β-D-乳糖苷(MULac)的酶活性作为纤维素酶活性。使用MUlac作为底物用于测量CBHI、EGI和β-半乳糖苷酶(本文称为"总MULac"活性)的组合活性以及这些酶的分别的活性的方法已经有所描述(Bailey和 2003;Collen等人，2005;van Tilbeurgh等人，
1982、1985、1988)。其他经常用于纤维素酶活性测量的底物包括例如CMC纤维素、羟乙基纤维素和滤纸。可测量例如针对桦树木聚糖底物的活性作为半纤维素酶的活性（Bailey等人，1992,Bailey M.J.,Biely,P.和Poutanen,K.(1992)Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity.J.Biotechnol.23:257-270)，以及使用任何本领域已知的测量蛋白质浓度的方法测量的细胞外总蛋白质的产量，例如使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio.Rad)。丝状真菌的培养中的生长和进程可通过测量生物质的产生情况以及通过测量培养基的pH值而确定。蛋白质生产的诱导情况以及基因表达水平的差异可通过分离RNA并对样品进行微阵列杂交分析或RNA杂交或TRAC分析而进行分析(Rautio,J.J.,Smit,B.A.,Wiebe,M., M.&Saloheimo,M.2006.Transcriptional monitoring of steady state and effects of anaerobic phases in chemostat cultures of the filamentous fungusTrichoderma reesei.BMC Genomics7,文章号247.
15p.10.1186/1471-2164-7-247)。
and V.S.Bisaria,Measurement ofhemicellulase activities.Pure&Appl.
Chem.,(1987),59,1739—1752）。可例如测量针对底物4-甲基伞形酮-β-D-乳糖苷(MULac)的酶活性作为纤维素酶活性。使用MUlac作为底物用于测量CBHI、EGI和β-半乳糖苷酶(本文称为"总MULac"活性)的组合活性以及这些酶的分别的活性的方法已经有所描述(Bailey和 2003;Collen等人，2005;van Tilbeurgh等人，
1982、1985、1988)。其他经常用于纤维素酶活性测量的底物包括例如CMC纤维素、羟乙基纤维素和滤纸。可测量例如针对桦树木聚糖底物的活性作为半纤维素酶的活性（Bailey等人，1992,Bailey M.J.,Biely,P.和Poutanen,K.(1992)Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity.J.Biotechnol.23:257-270)，以及使用任何本领域已知的测量蛋白质浓度的方法测量的细胞外总蛋白质的产量，例如使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio.Rad)。丝状真菌的培养中的生长和进程可通过测量生物质的产生情况以及通过测量培养基的pH值而确定。蛋白质生产的诱导情况以及基因表达水平的差异可通过分离RNA并对样品进行微阵列杂交分析或RNA杂交或TRAC分析而进行分析(Rautio,J.J.,Smit,B.A.,Wiebe,M., M.&Saloheimo,M.2006.Transcriptional monitoring of steady state and effects of anaerobic phases in chemostat cultures of the filamentous fungusTrichoderma reesei.BMC Genomics7,文章号247.
15p.10.1186/1471-2164-7-247)。
[0047] 改进的CBHI活性可通过使用改良用于分析CBHI活性的方法测定的针对MULac底物的酶活性的更高生产水平而检测。
[0048] 改进的EGI活性可通过针对MULac底物的酶活性的更高生产水平而检测，尤其是通过在特定地测量EGI活性的条件下的针对MULac底物的更高活性。
[0049] 增加的半纤维素酶生产可通过针对桦树木聚糖底物的酶活性的更高产生水平而检测。
[0050] 在一个实施方式中，所述蛋白质可为内源蛋白质，特别是为水解酶，如纤维素酶、半纤维素酶或木质纤维素降解酶，或其他分泌蛋白质。更具体地，所述蛋白质可为纤维素酶或半纤维素酶。
[0051] 在另一个实施方式中，所述蛋白质可为在受影响的内源基因启动子下产生的任何蛋白质。所述蛋白质可在例如多种纤维素酶和半纤维素酶基因启动子下产生，例如编码CBHI、EGI或XYNI的基因的启动子。
[0052] 改进的蛋白质生产意味着真菌宿主产生的蛋白质含量以及所需蛋白质或蛋白质混合物的生产的改变。如本文所公开的，丝状真菌宿主可构建为过表达一种或多种特定调控基因，或可构建为缺失一种或多种特定的其他调控基因，以改变相对于亲本宿主的蛋白质生产。
[0053] 术语“内源蛋白质”在本文指的是为丝状真菌宿主的天然产物的蛋白质。
[0054] “异源蛋白质”指的是并非所述真菌种属的天然产物的蛋白质。
[0055] “重组蛋白质”在本文指的是并非丝状真菌的天然产物或由丝状真菌中的非天然构建物所产生的蛋白质。编码所需同源或异源蛋白质的DNA序列可通过合适的方法转移到宿主中。
[0056] “可分泌蛋白质”或“分泌蛋白质”在本文指的是可分泌的或从宿主细胞向外分泌到培养基的蛋白质。
[0057] 增加的蛋白质生产指的是蛋白质生产比使用未经遗传修饰的亲本真菌宿主细胞的蛋白质生产高至少3%、优选地至少5%、更优选地至少10%、更优选地至少20%、更优选地至少30%或最优选地至少50%。
[0058] 降低的蛋白质产量指的是蛋白质生产比使用未经遗传修饰的亲本真菌宿主细胞的蛋白质生产低至少3%、优选地至少5%、更优选地至少10%、更优选地至少20%、更优选地至少30%或最优选地至少50%。
[0059] 本发明的一个实施方式包括表达负责调控水解酶生产的基因序列。所述基因可增加或降低酶的生产，或其可增加一些酶活性并降低其他的酶活性的产生。
[0060] 对丝状真菌宿主的“遗传修饰”在本文指的是任何遗传修饰方法，通过此种方式使丝状真菌宿主被修饰为过表达特定调控基因或获得所述一种或多种基因的修饰特性及/或缺失所述基因。
[0061] 用于木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属和青霉属的菌株的遗传修饰方法是本领域技术人员可得并熟知的(Sambrook等人，1989, 等人，1987;Jain等人，1992;Austin等人，1990;Bull等人，1988;Maier等人，2005;Akileswaran等人，1993)。
[0062] M,Nevalainen H, M,Salminen E,Knowles J.(1987)A versatile transformation system for the cellulolyticfilamentous fungus Trichoderma reesei.Gene.1987;61:155-64。
[0063] Jain S,Durand H,Tiraby G.(1992)Development of atransformation system for the thermophilic fungus Talaromyces sp.CL240 based on the use of phleomycin resistance as a dominantselectable marker.Mol Gen Genet.1992Sep;234(3):489-93。
[0064] Austin B,Hall RM,Tyler BM.(1990)Optimized vectors and selection for transformation of Neurospora crassa and Aspergillusnidulans to bleomycin and phleomycin resistance.Gene.199093:157-62.
[0065] Bull JH,Smith DJ,Turner G.(1988)Transformation of Penicillium chrysogenum with a dominant selectable marker.CurrGenet.1988 May;13(5):377-82。
[0066] Maier FJ,Malz S, AP,Lacour T, W.(2005)Developmentof a highly efficient gene targeting system for Fusarium graminearum using the disruption of a polyketide synthasegene as a visible marker.FEMS Yeast Res.2005Apr;5(6-7):653-62。
[0067] Akileswaran L,Alic M,Clark EK,Hornick JL,Gold MH.(1993)Isolation and transformation of uracil auxotrophs of the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrysosporium.CurrGenet.1993;23(4):351-6。
[0068] “基因”在本文特别指的是编码调控蛋白质如转录因子、其他转录调控子、蛋白质激酶、参与组蛋白修饰或染色质重塑的蛋白质的一种或多种基因，或者在丝状真菌宿主基因组中位于纤维素酶或半纤维素酶基因附近（共表达）的基因。这些基因是使用本文所述方法选择的。这些基因的功能已在木霉属，特别是是里氏木霉中有示例说明，在其中显示了这些基因对蛋白质生产的效应。所述基因在其他丝状真菌中，特别是是曲霉属中的修饰对于改进的蛋白质生产是有用的。本发明中的“基因”优选地为木霉属基因。在本发明的范围内也可以是丝状真菌其他种属中的最近同源基因以及在严格条件下杂交于所述基因或所述同源基因的核苷酸序列。在本发明的范围内，还可为所述在严格条件下杂交于所述基因或所述同源基因的片段、衍生物或其他核苷酸序列。所述“基因”可以为分离的，这意味着其是分离自其天然组分。所述“基因”可部分或全部合成而得。在本发明的范围内还包括所述基因的衍生物，这指的是相比所述基因包含删除、置换、插入或其他修饰，但具有与所述基因相同或等价功能的核酸序列。
[0069] “真菌宿主”在本文指所选择或遗传修饰以高效生产（或不生产）所需产物，并用于蛋白质生产以进行例如分析、医疗或工业用途的任何真菌宿主菌株。真菌宿主特别是“真菌生产宿主”，其适合用于特定蛋白质产物的工业生产。所述宿主菌株优选地为经基因技术修饰以高效产生目标产物的重组菌株。所述真菌宿主可属于例如木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属等属。通常，所述宿主为木霉属或曲霉属宿主。
[0070] 在其他丝状真菌种属中的“木霉属基因的最近同源物”在本文指的是所述生物体的所有基因中与木霉属基因具有最高百分比的相同核苷酸的基因；或在所述生物体的所有基因产物中其的蛋白质产物与木霉属基因编码的蛋白质产物具有最高百分比的相同氨基酸的基因。不同生物体中的同源调控基因的序列同一性通常非常低。通常，结合于DNA或参与调控事件的其他蛋白质的位点具有同源性，但这些位点之间中间序列可能并不保守。因此，不同生物体中同源调控基因的序列同一性总%相对较低。然而，在所比对的核苷酸序列中的序列同一性百分比可用作一种识别其他生物体中所述基因的最近同源基因的量度，因此也很可能为其他生物体中所述基因的功能对等物。存在有用于同源性搜索的软件和算法以及包含多种物种的整个基因组序列信息的公共数据库，如BLAST程序(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,WebbMiller, 及 David J.Lipman(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs",Nucleic AcidsRes.25:3389-3402.Reference for compositional score matrixadjustment:Stephen F.Altschul,John C.Wootton,E.Michael Gertz,Richa Agarwala,Aleksandr Morgulis,Alejandro A.Schaffer,and Yi-Kuo Yu(2005)"Protein database searches usingcompositionallyadjusted substitution matrices",FEBS J.272:5101-5109)以及NCBI数据库(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=fungi)。
[0071] 特定“基因”在本文由特定序列(SEQ ID NO)表示。基因的效应使用特定SEQ ID NO(其在本文中为木霉属序列)的序列显示。所述序列可包含所述基因的编码区前和/或后的其他序列。如本文所描述的，另一种丝状真菌的最近同源基因可代替木霉属序列使用。如本领域技术人员已知的，还可使用在严格条件下杂交于木霉属序列或杂交于其最近同源基因的序列。其中的严格条件在本文指的是于42摄氏度下，在包含50%甲酰胺、5XSSC（750mM NaCl,75mM柠檬酸三钠）、50mM磷酸钠（pH7.6）、5XDenhardt氏溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中孵育过夜，随后在大约65摄氏度下以0.1XSSC洗涤滤膜。
[0072] 纤维素酶活性、CBHI活性或EGI活性的检测方法对本领域技术人员已熟知。这些方法在例如以下文献中有所描述，Bailey and 2003;Collen等 人，2005；van Tilbeurgh 等 人 ,1982,1985,1988.Collén,A.,Saloheimo,M.,Bailey,M., M.&Pakula,T.M.(2005)Protein production and induction of
the unfolded proteinresponse in Trichoderma reesei strain Rut-C30and its transformantexpressing endoglucanase I with a hydrophobic tag.Biotech.Bioeng.89,335-344.Bailey MJ, J.2003.Efficient cellulaseproduction
by Trichoderma reesei in continuous cultivation on lactosemedium with a computer-controlled feeding strategy.Appl MicrobiolBiotechnol62:156-62.van Tilbeurgh H,Claeyssens M,de Bruyne C.1982.The use of 4-methylumbelliferyl and other chromophoricglycosidases in the study of cellulolytic enzymes.FEBS Lett149:152-156.van Tilbeurgh H,Loontiens FG,de Bruyne CK,Claeyssens M.1988.Fluorogenic and chromogenic glycosides assubstrates and ligands of carbohydrates.Methods Enzymol160:45-59.van Tilbeurgh H,Pettersson G,Bhikabhai R,De Boeck H,Claeyssens M.1985.Studies of the cellulolytic system of Trichodermareesei QM9414.Reaction specificity and thermodynamics ofinteractions of small substrates and ligands with the1,4-β-glucancellobiohydrolase II.Eur J Biochem148:329-34。
the unfolded proteinresponse in Trichoderma reesei strain Rut-C30and its transformantexpressing endoglucanase I with a hydrophobic tag.Biotech.Bioeng.89,335-344.Bailey MJ, J.2003.Efficient cellulaseproduction
by Trichoderma reesei in continuous cultivation on lactosemedium with a computer-controlled feeding strategy.Appl MicrobiolBiotechnol62:156-62.van Tilbeurgh H,Claeyssens M,de Bruyne C.1982.The use of 4-methylumbelliferyl and other chromophoricglycosidases in the study of cellulolytic enzymes.FEBS Lett149:152-156.van Tilbeurgh H,Loontiens FG,de Bruyne CK,Claeyssens M.1988.Fluorogenic and chromogenic glycosides assubstrates and ligands of carbohydrates.Methods Enzymol160:45-59.van Tilbeurgh H,Pettersson G,Bhikabhai R,De Boeck H,Claeyssens M.1985.Studies of the cellulolytic system of Trichodermareesei QM9414.Reaction specificity and thermodynamics ofinteractions of small substrates and ligands with the1,4-β-glucancellobiohydrolase II.Eur J Biochem148:329-34。
[0073] 使用特异于不同酶的一组更广的酶活性测量可更详细地分析其中调控基因得到修饰的菌株培养物产生的蛋白质模式。此外，可进行2D凝胶电泳，随后通过质谱分析鉴定蛋白质以分析所产生的蛋白质模式。2D凝胶分析还可反应不同菌株培养物之间所产生的蛋白质模式的定量差异。该信息能反应出受到特定遗传修饰影响的产生蛋白质的特定组。进一步地，可构建其他的遗传修饰菌株以能够分析基因的过表达和缺失（通常为删除）的作用，通过这些方式反映出功能受所述基因修饰影响的靶标基因和蛋白质情况，并显示特定基因修饰对所产生的蛋白质模式的效应。还可确定这些遗传修饰菌株的转录谱以说明所述遗传修饰对基因表达水平的效应并反映出受到此修饰的靶标基因。通过（从对培养物上清进行酶测定及2D凝胶分析得到的）所述遗传修饰对所产生的蛋白质形式的效应的信息以及关于所述遗传修饰引起的转录应答以及调控的靶标基因的信息有可能修饰蛋白质生产特性以及效率，也可能以限定的方式修饰产生入培养基的蛋白质混合物的组合物。
[0074] 蛋白质生产过程的改进指的是所有分泌蛋白质的生产增加，或特定的一组蛋白质的生产改进，或不期望的产物的生产减少，或蛋白质的生产过程加快或减慢，或生产过程用于蛋白质以外的产物（例如对于生物质或不期望的副产物）消耗的营养更少，或蛋白质生产单位的理化特性更佳（例如，培养中较少粘性、生产宿主形态更佳），或培养基蛋白质产物的下游加工特性更好，或产物的理化质量更好。
[0075] 根据本发明的具体实施方式，在真菌宿主中过表达基因序列tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)、tre122523(SEQ ID NO:4)和tre120120(SEQ ID NO:5)(表2)中的一种或多种基因；或者至少一中所述序列在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、金孢属或青霉属的最近同源基因；或者所述基因的片段或衍生物，或者在严格条件下杂交于至少一种所述序列或所述同源基因的其他序列。这些基因在遗传修饰宿主中的过表达使纤维素酶、半纤维素酶、其他参与木质纤维素材料和/或降解的蛋白质或其他蛋白质（通常是分泌蛋白质）和/或细胞外总蛋白质相对于亲本宿主蛋白质的生产增加，或使得用编码分泌蛋白质启动子产生的蛋白质生产提高。这可检测为相对亲本宿主，在培养期间所产生的酶活性或蛋白质的最大水平更高或者在培养的任何时间点所产生的酶活性或所产生的蛋白质的水平更高而导致在培养的更早阶段的生产水平更高并因此使得生产过程更快。
[0076] 可测量例如针对底物4-甲基伞形酮-β-D-乳糖苷(MULac)的酶活性作为纤维素酶活性。使用MUlac作为底物用于测量CBHI、EGI和β-半乳糖苷酶的组合活性(本文称为“总MULac”活性)以及这些酶的分别的活性的方法已经被Bailey和2003;Collen等人，2005;van Tilbeurgh等人，1982、1985、1988所描述。可测量例如针对桦树木聚糖底物的活性（Bailey等人,1992,Bailey M.J.,Biely,P.和Poutanen,K.(1992)Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity.J.Biotechnol.23:257-270)以及使用本领域已知的测量蛋白质浓度的任何方法测量的细胞外总蛋白质的生产作为半纤维素酶的活性，例如使用Bio-Rad蛋白质测定法(Bio.Rad)。
[0077] 如果基因tre66966(SEQ ID NO:1)、tre112524SEQ ID NO:2)、tre123668(SEQ ID NO:3)中的一种或多种，更优选地是基因tre66966(SEQ ID NO:1)和/或tre112524（SEQ ID NO:2)中一种或两种在真菌宿主中过表达，这非常有利。术语“基因”在本文还包括至少一种所述序列在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、篮状菌属、平革菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于至少一种所述序列或所述同源基因的其他核苷酸序列。
[0078] 表1.
[0079]质粒 里氏木霉基因 菌株
pMH35 tre66966 35-10
pMH17 tre112524 17-6
pMH18 tre123668 18-11
pMH29 tre122523 29-8
pMH22 tre120120 22-1
pMH35 tre66966 35-10
pMH17 tre112524 17-6
pMH18 tre123668 18-11
pMH29 tre122523 29-8
pMH22 tre120120 22-1
[0080] 根据本发明的其他具体实施方式，基因tre112524(SEQ ID NO:2);或者所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于所述序列或所述同源基因的其他核苷酸序列，在真菌宿主中过表达。此基因的过表达使得纤维素酶活性，尤其是在特异性测量EGI活性的条件下针对MULac底物的酶活性得到增加。此基因的过表达也导致半纤维素酶活性的增加。这可检测为生产的增加。进一步地，此基因的过表达导致培养基中细胞外蛋白质生产的增加。
[0081] 在真菌宿主中还可以过表达和/或缺失所述基因的其他组合以得到这些基因对真菌宿主的蛋白质生产特性的组合效应。一种或多种所提到的基因的失活或活性降低可有利于减少不想要的副产物的生产。因此在本发明的保护范围内包括通过过表达或缺失至少一种所述基因对真菌宿主的遗传修饰。上文提到的基因在丝状真菌宿主中的过表达在本文中通过构建表达这些基因的木霉属菌株得到示例说明。在其他丝状真菌宿主中相同或对应的基因（即，所述基因的最近同源基因）的表达是在本发明的保护范围内。
[0082] 在其他丝状真菌宿主中的对应基因也可如上文描述的方法进行过表达或缺失。
[0083] 在一些其他（例如其中需要更高水平的EGI和木聚糖酶活性）的应用中，需要修饰蛋白质产物。对于此种应用，基因tre112524(SEQ ID NO:2);或者所述基因在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、脉孢菌属、金孢属或青霉属中的最近同源基因；或者所述基因的片段或衍生物或者在严格条件下杂交于所述序列或至少一种所述同源基因的其他核苷酸序列，应当在真菌宿主中过表达。
[0084] 在本发明的保护范围内还包括在严格条件下杂交于木霉属基因或其在其他丝状真菌宿主中的最近同源基因。在下文中，“基因”也指杂交于如本文所描述的基因或同源基因的所述基因或序列的最近同源基因。“基因”在下文中还指任何片段或衍生物或修饰形式，其包含删除、置换、插入或其他遗传修饰，但具有与所述“基因”相同或等价的功能。
[0085] 为示例说明这些基因对蛋白质生产的效应，将这些基因在里氏木霉QM9414宿主中进行过表达，如实施例4-6中所示。
[0086] 这些基因结构的相似之处在于其都包含对于编码调控蛋白质的基因而言典型的序列结构域，如表2所示的转录因子。
[0087] 表2.
[0088]
[0089] 基因tre66966(图1)由SEQ ID NO:1表示，其效应通过构建过表达此基因的菌株里氏木霉35-10进行示例说明。此基因的过表达引起增加的纤维素酶生产，这是以总Mulac活性、CBHI活性和EGI活性进行测量的。尤其是CBHI活性相对于亲本宿主有所增加。半纤维素酶生产（以木聚糖酶活性的产生测量）和总细胞外蛋白质生产相对于亲本宿主菌株的生产都有所增加。基因tre66966的过表达可特别地用于增加纤维素酶或半纤维素酶生产，或其他分泌蛋白质的生产。此外，相比于亲本宿主菌株，过表达所述基因的菌株可以更高水平生产在纤维素酶或半纤维素酶基因启动子（或类似调控的启动子）下的多种异源蛋白质。
[0090] 基因tre112524(图2)由SEQ ID NO:2表示，其效应通过构建过表达此基因的菌株里氏木霉17-6进行示例说明。在菌株17-6的培养物中，比在亲本宿主菌株的培养物中更早达到所生产的细胞外总蛋白质的最大水平。通过过表达所述基因，可获得分泌蛋白质可的更快生产过程。具体地，菌株17-6产生了更高量的半纤维素酶活性，其针对木聚糖底物进行测量，以及稍高量的纤维素酶活性，测量为总MULac活性或EGI活性。然而，CBHI活性的产生不受过表达的影响。半纤维素酶活性或所选的纤维素酶活性的产生提高可通过过表达基因112524而获得。在过表达菌株中，在这些半纤维素酶和纤维素酶基因启动子下的异源蛋白质也可获得改进的生产。
[0091] 基因123668(图3)由SEQ ID NO:3表示，其效应通过构建过表达此基因的菌株里氏木霉18-11进行示例说明。此基因的过表达引起相比亲本宿主增加的纤维素酶产量，这尤其测量为总Mulac活性或CBHI活性。此基因的过表达还对半纤维素酶活性的产生有轻度的正效应，其测量为木聚糖活性。在菌株18-11的培养物中，所产生的活性的最大水平比亲本宿主培养物中更高，并且更早达到。该基因的过表达也对细胞外总蛋白质的生产有轻度的正效应，尤其是在观察每份真菌生物质的生产蛋白质的量时。基因tre123668的过表达特别地用于增加纤维素酶和半纤维素酶生产，或其他分泌蛋白质的生产。此外，与亲本宿主菌株相比，过表达此基因的菌株以更高的水平生产在这些半纤维素酶和纤维素酶基因的启动子（或类似调控的启动子）下的多种异源蛋白质。
[0092] 木霉属基因tre122523(图4)由SEQ ID NO:4表示，其效应通过构建过表达此基因的菌株里氏木霉29-8进行示例说明。此基因的过表达引起宿主中增加的纤维素酶生产，测量为总Mulac活性和CBHI及EGI活性。木聚糖酶活性和所产生的细胞外总蛋白质都比亲本宿主稍高。基因tre122523的过表达可用于增加分泌蛋白质的生产，特别是是增加纤维素酶和半纤维素酶生产，或其他分泌蛋白质的生产。此外，与亲本宿主菌株相比，过表达此基因的菌株以更高的水平生产在这些半纤维素酶和纤维素酶基因的启动子（或类似调控的启动子）下的多种异源蛋白质。
[0093] 木霉属基因tre120120(图5)由SEQ ID NO:5表示，其效应通过构建过表达此基因的菌株里氏木霉22-1进行示例说明。该基因的过表达对纤维素酶活性的产生有正效应，测量为总MULac活性，或尤其是CBHI活性。在菌株22-1的培养物中，比在亲本宿主的培养物中更早达到所产生活性的最大水平。半纤维素酶活性（针对木聚糖底物测量）的产生也比亲本宿主菌株的培养物中更快达到最大水平。22-1培养物比亲本宿主菌株的培养物产生更少的生物质。在观察每份真菌生物质产生的蛋白质量或酶活性时，培养过程中培养基中改进的更快蛋白质生产相比于亲本宿主尤其显著。在观察每份真菌生物质所产生的蛋白质量时，该基因的过表达对细胞外总蛋白质产量尤其是在培养的较早阶段也有正向效应。通过过表达基因tre120120，有可能改进纤维素酶和半纤维素酶或其他分泌蛋白质的生产。该基因的过表达还可改进在纤维素酶或半纤维素酶启动子下所产生的异源蛋白质的生产。通过过表达该基因尤其可能使生产过程更快。而且，在过表达该基因的菌株中用于生物质而消耗的营养更少。由于与EGI活性的产生相比，在CBHI活性产生情况下改进的产生更显著，因此还可过表达该基因用于优选地过量产生CBHI活性或cbh1启动子下的异源蛋白质。
[0094] 已经通过将其在木霉属中过表达而示例说明了如本文所描述的基因的效应。所述菌株为木霉属QM9414(ATCC 26921),其通常可向公众提供。
[0095] 总Mulac是作为针对Mulac底物的酶活性测量的，测量的是CBHI、EGI和BGL的活性。
[0096] 在葡萄糖存在下（抑制BGLI）并且在纤维二糖存在下（抑制CBHI活性）测量针对Mulac的酶活性，作为EGI。
[0097] 可将存在葡萄糖且不存在纤维二糖时测量的活性减去存在葡萄糖、纤维二糖时测量的活性获得针对Mulac的酶活性作为CBHI。
[0098] 用于确定纤维素活性的方法在Bailey和 2003;Collen等人，2005;van Tilbeurgh等人，1982、1985、1988中有所描述。
实施例
实施例
[0099] 实施例1
[0100] 培养里氏木霉用于转录组分析以研究诱导水解酶产生过程中的细胞应答[0101] 培养步骤
[0102] 在含 有7.6g/l(NH4)2SO4、15.0g/l KH2PO4、2.4mM MgSO4.7H2O、4.1mM CaCl2.H2O、3.7mg/l CoCl2、5mg/l FeSO4.7H2O、1.4mg/lZnSO4.7H2O、1.6mg/l MnSO4.7H2O和10g/l木糖醇的培养基的摇瓶中培养里氏木霉Rut-C30(ATCC56765)。通过添加KOH将培养基的pH调整
7
至4.8。以8x10 孢子/200ml培养基接种这些培养物并在锥形瓶中于28℃下以250rpm振荡培养4天。为诱导水解酶产生，组合这些培养物并将组合的培养物的等分试样转移至含有诱导培养基（每90ml诱导培养基用于200ml所述培养物）的烧瓶中。诱导培养基的组成如上文所述，只是不含有2g/l山梨醇，并补充有Avicel纤维素、预处理的麦秸、预处理的云杉或槐糖。未诱导的对照培养物也是类似处理的，只是在诱导培养基中不使用补充物。诱导物质的浓度为1%(w/v)的Avicel、小麦或云杉，或者0.7mM的槐糖。云杉和麦秸的预处理是使用汽爆完成的，随后进行洗涤步骤。将所述材料的纤维部分用于诱导。
7
至4.8。以8x10 孢子/200ml培养基接种这些培养物并在锥形瓶中于28℃下以250rpm振荡培养4天。为诱导水解酶产生，组合这些培养物并将组合的培养物的等分试样转移至含有诱导培养基（每90ml诱导培养基用于200ml所述培养物）的烧瓶中。诱导培养基的组成如上文所述，只是不含有2g/l山梨醇，并补充有Avicel纤维素、预处理的麦秸、预处理的云杉或槐糖。未诱导的对照培养物也是类似处理的，只是在诱导培养基中不使用补充物。诱导物质的浓度为1%(w/v)的Avicel、小麦或云杉，或者0.7mM的槐糖。云杉和麦秸的预处理是使用汽爆完成的，随后进行洗涤步骤。将所述材料的纤维部分用于诱导。
[0103] 样品收集及样品处理
[0104] 在预培养步骤中不同时间点并在诱导前组合的培养物中收集样品用于分析生物质生产、培养物上清的pH及用于RNA分离。在添加诱导物质之后，从培养物中取样用于pH测量和RNA分离；仅从用于此目的分离的未诱导对照烧瓶中测量生物质形成。诱导培养物的取样时间点为诱导起始后0h、6h、17h和41h。通过将菌丝体样品过滤并在105℃下干燥至恒重(24h)而测量生物质的干重。用于RNA分离，过滤50ml的菌丝体样品并用等体积的0.7%(w/v)NaCl洗涤，立即于液氮中冷冻，并储存于-80℃。大体上根据制造商说明书使TM用Trizol Reagent(Gibco BRL)分离总RNA，并进一步通过柱纯化进行纯化（Qiagen,根据说明书进行)。从纯化的RNA合成cDNA，接着进行荧光标记和表达微阵列分析，使用定制的寡核苷酸微阵列，RocheNimbleGen公司。根据里氏木霉基因组版本v2.0(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)设计微阵列探针和芯片。
[0105] 对培养物的监视
[0106] 在预培养阶段，通过分析生物质形成及培养物上清的pH变化而监视培养的进程。在诱导开始后，仅仅从特定用于此目的的未诱导对照培养物中测量生物质形成，因为诱导培养基中不可溶材料不能与真菌生物质相分离。在整个培养步骤中，对所有培养物测量pH。
诱导前预培养物中及未诱导对照培养物中的生物质干重(g/l)显示于图7A，各培养物的pH显示于图7B。生物质及pH数据显示，在诱导时间为100h时，培养物是活跃生长的，且在对照培养物中在诱导时间段内生长还持续着。在这些时间内培养物中pH降低的程度表示复样培养物有等同的生长特征。在未诱导及槐糖诱导的培养基之间未检测到显著差异。在有Avicel的培养物中，相比于未诱导培养物其的pH下降稍快，而有云杉和小麦的培养物pH下降最快，然而差异相对较小。
诱导前预培养物中及未诱导对照培养物中的生物质干重(g/l)显示于图7A，各培养物的pH显示于图7B。生物质及pH数据显示，在诱导时间为100h时，培养物是活跃生长的，且在对照培养物中在诱导时间段内生长还持续着。在这些时间内培养物中pH降低的程度表示复样培养物有等同的生长特征。在未诱导及槐糖诱导的培养基之间未检测到显著差异。在有Avicel的培养物中，相比于未诱导培养物其的pH下降稍快，而有云杉和小麦的培养物pH下降最快，然而差异相对较小。
[0108] 为选择用于表达微阵列分析的诱导实验的最佳时间点，使用TRAC法分析一组编码水解酶的已知基因的转录水平。显示了abf1(阿拉伯呋喃糖酶1)、bga1(β-半乳糖苷酶1)、bgl1(β-葡萄糖苷酶1)、bxl1(β-木糖苷酶1)、cip1(纤维素结合)、cip2()egl1(内切葡聚糖酶1)、glr1(葡糖醛酸酶1)、man1、xyn2和xyn4的相对表达水平。在槐糖培养物中对大多数基因在6h和17h以及41h的时间点都检测到明显的诱导，选择这些时间点进行微阵列分析。由TRAC分析检测到的转录水平显示于图8A和图8B。
[0109] 实施例3.诱导培养物的表达微阵列分析
[0110] 对由Avicel、槐糖、预处理的麦秸或预处理云杉诱导的培养物进行微阵列表达分析。将0h、6h、17和41h的时间点时的未诱导和槐糖诱导的培养物用于分析，而对于Avicel、小麦和云杉诱导的培养物则选择0h、6h和17h的时间点。使用Roche NimbleGen公司的定制寡核苷酸微阵列进行微阵列分析。根据里氏木霉基因组版本v2.0(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)设计微阵列探针和芯片。使用R和Bioconductor软件包Oligo,Limma and Mfuzz分析原始微阵列数据。
[0111] 分析显示一组基因与纤维素酶或半纤维素酶基因同共表达。这些基因包括先前未曾描述的新型基因，其具有不同类型调控蛋白质的基因（包括转录因子、激酶及参与组蛋白修饰和染色质重塑的蛋白质、磷脂酰肌醇/磷脂酰胆碱转移蛋白质的基因）所典型的序列结构域。为评估这些基因对蛋白质生产，尤其是对水解酶如纤维素酶和半纤维素酶生产的效应，克隆了一组这些基因并在里氏木霉QM9414(ATCC26921)中进行过表达。所选择的基因在至少三种所研究的诱导条件下显著高于未诱导培养物在相同时间点的表达，或所述基因的表达模式类似于（根据表达数据的Mfuzz聚类）已知的半纤维素酶或纤维素酶基因的表达模式。表3列出了所选基因及其对应的蛋白质识别号、基于序列结构域的预测功能，以及在不同诱导物质存在下诱导实验的不同时间点的诱导情况相关信息。
[0112] 对于这些基因提供的信息包括根据JGI基因组版本2.0的ID号(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)、基于序列数据预测的基因功能以及在不同诱导物存在下（微晶纤维素、预处理麦秸、预处理云杉或槐糖）不同诱导时间点的基因诱导情况的数据。“1”表示在Avicel、云杉、小麦或槐糖诱导的培养物中在时间点0h、6h、17h或41h有统计学显著的诱导（比相同时间点的未诱导对照培养物表达水平高），而“-1”表示表达水平有统计学显著的减少。
[0113] 表3.编码推定调控因子并选择在里氏木霉中过表达的诱导基因。
[0114]
[0115] 实施例4.
[0116] 用于扩增来自里氏木霉QM6a(CBS383.78)基因组的基因的引物如下：
[0117] 5′端引物含有一个通用部分，由四个5′末端G、25nt attB1位点(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT)(SEQ ID NO:6)以及cbh1基因起始密码子上游8nt的区域(TGCGCATC)构成,其一同形成序列GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGCATC(SEQID NO:7)
[0118] 寡核苷酸的通用组分后接着为对应基因5'端的基因特定序列。
[0119] 3′端引物含有四个5′末端G、25nt的attB2位点(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)(SEQ ID NO:8)
[0120] 以及核苷酸CTTA，接着是对应基因3'端的基因特定序列。
[0121] 引物的基因特异部分是基于基因组版本v2.0(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)的ORF预测而设计的，或在一些情况下是根据基因组v1.2(http://genome.jgi-psf.org/trire1/trire1.home.html)设计的，如下文所示。
[0122] 使用里氏木霉基因组DNA作为模板用于扩增所述基因的引物如下：
[0123] pMH17112524
[0124] 5 ′ GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGCATCATGGCTGGATCGCCTGC TGCTG(SEQ ID NO:9)
[0125] pMH17112524
[0126] 3′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACACATTCATCCCTGCGCCCAG(SEQ ID NO:10)[0127] pMH18123668
[0128] 5′GGGGACAAGTTTGTACAAAApAGCAGGCTTGCGCATCATGCCTCTCGTTGTCGTCCCAG(SEQ ID NO:11)
[0129] pMH18123668
[0130] 3′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATTGAGCAGCGGCTCGCG(SEQ ID NO:12)[0131] pMH22120120
[0132] 5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGCATCATGTCCCGCCAAATCTCCCACC(SEQ ID NO:13)
[0133] pMH22120120
[0134] 3′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACTCGGTGCTGATACTTCT(SEQ ID NO:14)[0135] pMH29122523
[0136] 5′GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGCATCATGGTAGCACATAGTCTACCCT(SEQ ID NO:15)
[0137] pMH29122523
[0138] 3 ′ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATATCGGCACCATGTCGACGT(SEQ ID NO:16)
[0139] pMH3566966
[0140] 5 ′ GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGCGCATCATGGCCAAGAAGGCGCGTC(SEQ ID NO:17)
[0141] pMH3566966
[0142] 3′GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTAGGCGCCGTTGACGACTC(SEQ ID NO:18)[0143] 使用上文提到的引物的PCR扩增反应产生的DNA片段含有下文描述的基因特异性序列，其插入在来源于引物通用部分的5′和3′末端序列之间。
[0144] 实施例5.构建过表达基于含Avicel、小麦、云杉或槐糖的培养基上进行的诱导实验数据而选择的调控基因的里氏木霉菌株
[0145] 从木霉属基因组（里氏木霉QM6a;CBS383.78）进行PCR扩增出与已知纤维素酶或半纤维素酶基因共表达的、编码推定调控因子的基因，并将其克隆入表达载体，然后转化入里氏木霉QM9414。基于存在于表达盒中的AmdS选择标记物基因的功能选择转化子，从来源于单一孢子的菌落中纯化转化子，通过对表达盒进行PCR扩增以确认表达盒向基因组的整合情况。用于转化的质粒示意图显示于图8。
[0146] 实施例6.培养过表达推定调控因子的里氏木霉菌株，并分析培养物的生长及蛋白质生产情况。
[0147] 在摇瓶中培养过表达编码推定调控因子的基因的修饰菌株，其中的培养基含有7.6g/l(NH4)2SO4、15.0g/l KH2PO4、2.4mMMgSO4.7H2O、4.1mM CaCl2.H2O、3.7mg/l CoCl2、5mg/l FeSO4.7H2O、1.4mg/l ZnSO4.7H2O、1.6mg/l MnSO4.7H2O并补充有4%的乳糖及2%废弃谷物提取物。分析这些培养物的生长和蛋白质生产情况，包括测定纤维素酶和半纤维素酶活性。使用4-甲基伞形酮-β-D-乳糖苷(MULac)作为底物测量纤维素酶活性。MULac可用于测量里氏木霉培养物中的CBHI、EGI和BGL的组合活性(Bailey和
2003;Collen等人，2005;van Tilbeurgh等人，1982、1985、1988）。使用改良的方法也可使用MULac底物特异地测量CBHI和EGI的活性(Bailey和 2003;Collen等人，
2005;van Tilbeurgh等人，1982、1985、1988)。使用桦树木聚糖作为底物测量木聚糖酶活性(Bailey M.J.,Biely P.,and Poutanen,K.,(1992)Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity.J.Biotechnol.23:257-270)。在修饰菌株以及亲本菌株里氏木霉QM9414培养物中的蛋白质生产情况的结果见图1-5。
2003;Collen等人，2005;van Tilbeurgh等人，1982、1985、1988）。使用改良的方法也可使用MULac底物特异地测量CBHI和EGI的活性(Bailey和 2003;Collen等人，
2005;van Tilbeurgh等人，1982、1985、1988)。使用桦树木聚糖作为底物测量木聚糖酶活性(Bailey M.J.,Biely P.,and Poutanen,K.,(1992)Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity.J.Biotechnol.23:257-270)。在修饰菌株以及亲本菌株里氏木霉QM9414培养物中的蛋白质生产情况的结果见图1-5。
[0148] 实施例7.
[0149] 基因在另一种真菌种属中的最近同源基因可例如基于使用程序例如Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)针对基因组数据库进行的同源性搜索而鉴定。同源性搜索可使用基因的核苷酸序列或翻译基因的氨基酸序列查询而进行。可在任何有已测序基因组的生物中获得最近同源基因的信息。对于众多真菌种属都已有可用的完整基因组序列用于同源性搜索，而且全长测序的真菌生物的数量仍在增加。
[0150] 在此实施例中，对里氏木霉基因tre77513、tre80291、tre41573、tre74765和tre64608的ORF的翻译的序列针对一组真菌种属的蛋白质序列数据库进行BLASTP同源性搜索。里氏木霉ORF的翻译的序列是根据JGI而得的(联合基因组研究所（Joint Genome Institute）;基因组版本2.0,http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。
[0151] 所述搜索是使用NCBI的真菌基因组BLAST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi?organism=fungi)进行的，其含有大量真菌种属的完整基因组序列以及完全基因组鸟枪序列数据及对应的蛋白质序列。此实施例中所使用的数据库为：
[0152] 完整烟曲霉（Aspergillus fumigatus）蛋白质；
[0153] 完整构巢曲霉（Aspergillus nidulans）FGSC A4蛋白质；
[0154] 完整土曲霉（Aspergillus terreus）蛋白质；
[0155] 完整球毛壳霉（Chaetomium globosum）CBS148.51蛋白质；
[0156] 完整玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae）PH-1蛋白质；
[0157] (所 使 用 的BLASTP2.2.23+ 程 序 参 考 自：S.F.Altschul,T.L.Madden,A.A.Schaffer,J.Zhang,Z.Zhang,W.Miller, 和 D.J.Lipman(1997),"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs",Nucleic Acids Res.25:3389-3402。组合物得分矩阵调整的参考为：S.F.Altschul,J.C.Wootton,E.M.Gertz,R.Agarwala,A.Morgulis,A.A.Schaffer, 和 Y.-K.Yu(2005)"Proteindatabase searches using compositionally adj usted substitutionmatrices",FEBS J.272:5101-5109.)。
[0158] 搜索中使用的参数如下：
[0159] 通用参数:
[0160] -最大靶标序列数：100(要显示的比对序列的最大数(实际的比对数可能比此数大))。
[0161] -短查询序列：自动调整关键词大小及其他参数以提高短查询序列的结果。
[0162] -预期阈值：10（随机模型中机会匹配的预期数）
[0164] 得分参数：
[0165] -矩阵：BLOSUM62(为比对的残基对指定一个得分，并确定总体比对得分）[0166] -缺口成本：存在：11，延伸：1(在比对中创造及延伸一个缺口需要的成本）[0167] -组合调整：条件性组合得分矩阵调整（补偿序列氨基酸组合物的矩阵调整方法）[0168] 过滤器及掩蔽：
[0169] -过滤器：低复杂度区域过滤器（掩蔽低组合物复杂度的区域，其可能引起假的或者误导性结果）。
[0170] 表4显示了由BLAST搜索获得的在其他真菌种属中里氏木霉基因的最近同源基因：tre66966在玉蜀黍赤霉中、tre112524在构巢曲霉中、tre123668在球毛壳霉中、tre122523在球毛壳曲霉中以及tre120120在马尔尼菲青霉（P.marneffei）和烟曲霉中的最近同源基因。
[0171]
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