用于颗粒状淀粉水解的酶组合物中天然的谷物淀粉酶专利检索-植酸酶有机耕作专利检索查询-专利查询网

用于颗粒状 淀粉 水解的酶组合物中天然的谷物淀粉酶

阅读：457发布：2021-04-11

专利汇可以提供用于颗粒状淀粉水解的酶组合物中天然的谷物淀粉酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明所述的是在低于淀粉胶凝温度的温度下，从磨碎的植物材料中的淀粉获得可发酵糖的淀粉水解方法，并且其使用外源性植物α淀粉酶以进一步发酵糖以生产最终产品例如乙醇。，下面是用于颗粒状淀粉水解的酶组合物中天然的谷物淀粉酶专利的具体信息内容。

权利要求

1.从包含颗粒状淀粉的磨碎的植物材料水解淀粉的方法，所述方法包括：
a)在温度低于所述颗粒状淀粉的淀粉胶凝温度下，使磨碎的植物材料与外源性植物α-淀粉酶和木霉属(Trichoderma)或腐质酶属(Humicola)葡糖淀粉酶接触，以生产寡糖，和
b)产生可发酵糖。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
c)在介于10℃和40℃之间的温度下、在发酵微生物存在下发酵所述可发酵糖10小时至250小时的一段时间，以产生醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述磨碎的植物材料是包含颗粒状淀粉的浆状物，并且所述浆状物具有介于5％至60％之间的DS。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述磨碎的植物材料是包含颗粒状淀粉的浆状物，并且所述浆状物具有介于25％至40％之间的DS。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述磨碎的植物材料是包含颗粒状淀粉的浆状物，并且所述浆状物具有介于15％至45％之间的DS。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述α-淀粉酶以0.001至30AAU/g DS之间的量加入。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤进一步包括使所述磨碎的植物材料与微生物α-淀粉酶接触。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤在温度介于50℃至70℃之间进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物α-淀粉酶是选自下述的α-淀粉酶：大麦、小麦、玉米、黑麦、高梁、稻米、黍、小黑麦、木薯、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物材料是玉米、高粱、大麦、小麦、稻米或其组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述植物材料是分级玉米。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述醇是乙醇。
13.根据权利要求12所述的方法，进一步包含回收所述乙醇。
14.用于生产乙醇的方法，包括：
a)使包含从植物材料获得的颗粒状淀粉的浆状物与能溶解颗粒状淀粉的外源性植物α-淀粉酶以及木霉属(Trichoderma)或腐质酶属(Humicola)葡糖淀粉酶在温度低于所述颗粒状淀粉的淀粉胶凝温度下接触5分钟至24小时的一段时间；
b)获得底物，和
c)在发酵微生物存在下、在10℃和40℃之间的温度下发酵所述底物10小时至250小时的一段时间，以生产乙醇。
15.根据权利要求14所述的方法，进一步包含回收所述乙醇。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述α-淀粉酶是选自下述的α-淀粉酶：大麦、小麦、玉米、黑麦、高梁、稻米、黍、小黑麦、木薯、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。
17.根据权利要求14所述的方法，进一步包括使所述浆状物与微生物α-淀粉酶接触。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述接触步骤在50℃至70℃之间的温度下进行。
19.根据权利要求14所述的方法，进一步包括在所述发酵步骤之前使所述底物澄清。
20.根据权利要求14所述的方法，进一步包括加入另外的酶至所述接触步骤。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述另外的酶选自葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、纤维素酶和/或半纤维素酶。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述另外的酶是植酸酶。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述另外的酶是蛋白酶。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述浆状物具有5-60％DS颗粒状淀粉。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述浆状物具有20-40％DS颗粒状淀粉。
26.根据权利要求14所述的方法，进一步包括使所述底物与包含涡流的水溶液接触，以在所述发酵步骤之前稀释所述浆状物的DS。
27.根据权利要求14所述的方法，其中所述颗粒状淀粉是从玉米、高粱、大麦、小麦、稻米或其组合物获得的。

说明书全文

用于颗粒状淀粉 水解的酶组合物中天然的谷物淀粉酶

技术领域

[0002] 本发明涉及淀粉水解方法，其用于在温度低于淀粉胶凝温度下，从在碾碎的植物材料中的淀粉获得可发酵糖，并且进一步涉及糖发酵以生产最终产品，例如乙醇。背景技术

[0003] 淀粉是重要的原料，广泛用于工业目的，例如高果糖浆和乙醇的生产。在植物种子中淀粉形成主要储存糖类成分，并且淀粉颗粒通常是抗降解的。传统上，高温和/或酶的组合物已经被用于水解淀粉。淀粉水解酶，例如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1.)——其是内切作用水解酶，水解淀粉分子内部的α-1，4键，在工业中是最经常使用的。α-淀粉酶由植物、动物和微生物产生。用源自微生物源的α-淀粉酶，从植物种子进行淀粉水解、特别是从谷粒进行淀粉水解，在很多工业方法中是常规的，其中淀粉降解的第一步是淀粉水解为葡萄糖或淀粉水解为麦芽糖糊精。传统上，这些方法在高温下进行(例如，高于包含底物的淀粉的初始胶凝温度)(Corn：Chemistry and Technology，Watson S.A.等人编辑，(1991)American Association of Cereal Chemists，Inc.和The AlcoholTextbook，第三版，Jacques等人编辑，(1999)，Nottingham UniversityPress)。最近，工业上已经探索通过发酵使用低能量方法进行淀粉水解和生产醇(例如在低于植物材料中包含的淀粉的初始胶凝温度的温度下)(USP 4,514,496、WO 03/066826；WO 04/081193；WO 04/106533； WO04/080923和WO 05/069840)。

发明内容

[0004] 本发明涉及从磨碎的植物材料水解淀粉的方法，包括在温度低于该磨碎的植物材料中的颗粒状淀粉的初始胶凝温度下，使磨碎的植物材料与外源性植物α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和任选的微生物α-淀粉酶的组合物接触，以获得可发酵糖。本发明进一步涉及在发酵微生物的存在下发酵该可发酵糖为最终产品。

[0005] 在一个方面，本发明包括从磨碎的植物材料水解淀粉的方法，该磨碎的植物材料包含颗粒状淀粉，通过在温度低于颗粒状淀粉的淀粉胶凝温度下使磨碎的植物材料与外源性植物α-淀粉酶和葡糖淀粉酶接触而进行，以生产寡糖和生产可发酵糖。该方法也可以包括在发酵微生物存在下，在10℃和40℃之间的温度下，发酵可发酵糖10小时至250小时的一段时间，以生产醇。所述磨碎的植物材料可以为具有颗粒状淀粉的浆状物，该浆状物具有5％至60％之间的DS，或者可选地25％至40％之间的DS，或者可选地15％至45％之间的DS。α淀粉酶可以被加入0.001至30AAU/DS之间的量。

[0006] 在其它方面，接触步骤也包括使磨碎的植物材料与微生物α-淀粉酶接触。温度可以在50℃至70℃之间。植物α-淀粉酶可以是来自植物的α-淀粉酶，所述植物包括：大麦、小麦、稻、玉米、黑麦、高梁、稻米、黍、小黑麦、木薯、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。优选地，所述植物材料是玉米、高粱、大麦、小麦、稻米或其组合物。在一些重要的方面，所述植物是分级玉米(fractionated corn)。在一些方面，所述醇是乙醇，并且方法进一步包括回收乙醇。

[0007] 在其它方面，本发明包括用于生产乙醇的方法，该方法通过如下进行：在温度低于颗粒状淀粉的胶凝温度下，使从植物材料获得的、包含颗粒状淀粉的浆状物与能溶解颗粒状淀粉的外源性植物α-淀粉酶接触5分钟至24小时的一段时间，获得底物，以及在发酵微生物的存在下，在10℃至40℃之间的温度下，发酵该底物10小时至250小时的一段时间，产生乙醇。在一些方面，所述方法也包括回收乙醇。所述α-淀粉酶可以是例如包括下述的α-淀粉酶：大麦、小麦、稻、玉米、黑麦、高梁、稻米、黍、小黑麦、木薯、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗、大豆和豌豆。在一些方面，所述方法包括使浆状物与微生物α淀粉酶接触。所述接触步骤可以在50℃至70℃之间的温度下进行。所述方法也可以包括，在发酵步骤之前使底物澄清。在一些方面，所述方法可以包括在接触步骤添加另外的酶，如葡糖淀粉酶、植酸酶、蛋白酶、纤维素酶和/或半纤维素酶。在一些优选的方面，所述另外的酶是植酸酶和/或蛋白酶。在一些方面，所述浆状物具有5-60％DS之间的颗粒状淀粉，或者可选地20-40％DS之间。在一些方面，所述方法包括使底物与水溶液接触，该水溶液包含涡流以在发酵步骤之前稀释％DS。所述颗粒状淀粉可以从玉米、高粱、大麦、小麦、稻米或其组合物获得。附图说明

[0008] 图1说明从大麦面粉(32％DS)经发酵时间(小时)产生乙醇(％v/v)，其经各种处理，包括：STARGEN 001(-◇-)；大麦AA+AnGA(-■-)；大麦AA+TrGA(-●-)和大麦AA+HGA(-▲-)。

[0009] 图2说明从大麦面粉(32％DS)经发酵时间(小时)产生乙醇(％v/v)，其经各种处理，包括：STARGEN 001(-◇-)；HGA(-□-)；大麦AA+STARGEN 001(-ж-)；大麦AA+HGA(-■-)；和对照(未添加酶)(-●-)。
发明详述

[0010] 除非另有定义，本发明所用的技术和科学术语，与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的具有相同意义。

[0011] 尽管与本文中所述的那些类似或等价的任何方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用，但是描述的是优选的方法和材料。

[0012] 现在，使用下面的定义和实施例，仅通过参考的方式对本发明进行详细描述。本文中提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有序列，被明确地引入作为参考。定义：

[0013] 如本文中所使用，术语“淀粉(starch)”是指由植物复合多糖碳水化合物组成的任何物质，由具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成，其中X可以是任何数。 [0014] 术语“颗粒状淀粉(granular starch)”是指粗淀粉，即在植物材料(例如，谷粒和根茎类)中发现的、自然形态的淀粉。

[0015] 术语“干固体含量(ds)”是指基于干重以百分比(％)计的浆体中的总固体。术语“浆体(slurry)”是指含有不溶性固体的含水混合物。

[0016] 术语“可发酵糖(fermentable sugars)”是指寡糖和单糖，其能通过使用发酵微生物的发酵被转化为最终产品。

[0017] 术语“糊精(dextrins)”是指短链的葡萄糖聚合物(例如，2至10个单位)。 [0018] 术语“寡糖”是指具有2至10个以糖苷键连接的单糖单元的任何化合物。简单糖的这些短链聚合物包括糊精。

[0019] 术语“α-淀粉酶(alpha-amylase)(例如E.C.类别3.2.1.1)”是指催化α-1，4-糖苷键水解的酶。

[0020] 术语“糖化酶(saccharifying enzyme)”和“淀粉水解酶(starchhydrolyzing enzymes)”是指能转化淀粉为单糖或寡糖(例如，己糖或戊糖)的任何酶。

[0021] 术语“颗粒状淀粉水解(GSH)酶”和“具有颗粒状淀粉水解(GSH)活性的酶”是指能水解颗粒状形态淀粉的酶。

[0022] 术语“淀粉的水解”是指糖苷键因加入水分子而断裂。

[0023] 术语“内源性植物α-淀粉酶”是指具有α-淀粉酶活性的、由植物材料表达和产生的酶。如在此使用的内源性植物α-淀粉酶可以是异源的或同源的。

[0024] 术语“外源性植物α-淀粉酶”是指具有α-淀粉酶活性的酶，其源自植物α-淀粉酶并且独立于用作淀粉水解底物的植物材料而提供。

[0025] 术语“微生物的α-淀粉酶”是指具有α-淀粉酶活性的、源自微生物源(例如细菌或真菌)的酶，并包括修饰的酶、活性片段和其杂种。

[0026] 涉及多核苷酸或蛋白质的术语“异源的(heterologous)”是指在宿主细胞中非天然发生的多核苷酸或蛋白质。该术语意图包括由天然发生的基因、突变基因、合成基因和/或过表达基因编码的蛋白质。

[0027] 涉及多核苷酸或蛋白质的术语“同源的(homologous)”是指在宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。

[0028] 术语“葡糖淀粉酶(glucoamylase)”是指淀粉葡糖苷酶类的酶(例如，E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基残基。

[0029] 在此使用的术语“磨碎的(milled)”是指尺寸被减小的植物材料，例如，通过碾碎、压碎、分级或任何其它减小颗粒尺寸的方法。

[0030] 术语“胶凝(gelatinization)”是指淀粉分子的增溶作用，通常通过烹煮形成粘稠悬液进行。

[0031] 术语“胶凝温度(gelatinization temperature)”是指包含底物的淀粉开始胶凝的最低温度。确切的胶凝温度取决于具体淀粉，并且可以依赖于例如植物种类和环境以及生长条件这些因素而变化。对于可以根据在此所述方法使用的许多颗粒状淀粉，初始淀粉胶凝温度的范围包括：大麦(52℃至59℃)、小麦(58℃至64℃)、黑麦(57℃至70℃)、玉米(62℃至72℃)、高直链淀粉玉米(67℃至80℃)、稻米(68℃至77℃)、高梁(68℃至77℃)、马铃薯(58℃至68℃)、木薯(59℃至69℃)和甘薯(58℃至72℃)(J.J.M.Swinkels的STARCHCONVERSION TECHNOLOGY中32-38页，Van Beynum等人编辑(1985)Marcel Dekker Inc.New York和The Alcohol Textbook第三版，Jacques等人编辑，A Reference for the Beverage，Fuel and IndustrialAlcohol Industries(1999)Nottingham University Press，UK)。

[0032] 术语“低于胶凝温度”是指温度小于胶凝温度。

[0033] 如本文中所使用，术语“干固体含量(ds)”是指基于干重以百分比(％)计的浆体中的总固体，包括水分。

[0034] 术语“浆状物”是指包含不溶固体(例如，颗粒状淀粉)的含水混合物。 [0035] 术语“醪液(mash)”是指液态的可发酵底物的混合物，其被用于产生发酵产物，并且该术语被用于指从初始混合可发酵底物与一种或多种淀粉水解酶和发酵有机体至发酵实验完成的任意发酵阶段。

[0036] 术语“发酵(fermentation)”是指通过微生物酶分解和厌氧分解有机底物，以生产更简单的有机化合物。虽然发酵发生在缺氧条件下，但该术语不意图仅限于严格缺氧条件，因为发酵也在氧存在下发生。

[0037] 短语“同步糖化和发酵(SSF)”是指产生最终产品的过程，其中发酵有机体例如产乙醇微生物和至少一种酶例如糖化酶在同一工艺步骤中结合在同一容器中。

[0038] 术语“糖化(saccharification)”是指不可直接使用的多糖被酶转化为单糖或寡糖，以便发酵转化为最终产品。

[0039] 术语“最终产品”是指从可发酵底物酶转化的任何碳源衍生产品。在一些优选的实施方式中，所述最终产品是醇，例如乙醇。

[0040] 在此使用的术语“发酵有机体”是指任意的微生物或细胞，其适合用于发酵，以便直接或间接生产最终产品。

[0041] 在此使用的术语“产乙醇者”或“产乙醇微生物”是指能从单糖或寡糖生产乙醇的发酵生物。

[0042] 如在此使用的术语“回收 (recovered)”、“分离(isolated)”和“分开(separated)”是指蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从至少一种与其天然相关的成分中去除。 [0043] 术语“源自 (derived)”包括术语“起源自 (originated from)”、“得自(obtained)”或“可得自(obtainable from)”和“分离自(isolatedfrom)”，并且在一些实施方式中，如在此使用的，是指从细胞产生核苷酸序列编码的多肽，在所述细胞中核苷酸是天然存在的或核苷酸已经被插入所述细胞中。

[0044] 术语“酶促转化(enzymatic conversion)”通常是指底物通过酶作用修饰。 [0045] 术语“产量(yield)”是指使用本发明的所述方法生产的最终产品的量。在一些实施方式中，该术语是指最终产品的体积，并且在其它实施方式中，该术语是指最终产品的浓度。

[0046] 在此使用的术语“酶单位(enzyme unit)”是指在特定测定条件下每分钟生产1微摩尔产品的酶的量。例如，在一个实施方式中，术语“葡糖淀粉酶活性单位(GAU)”定义为在测定条件60℃和pH 4.2下，从可溶淀粉底物(4％DS)每小时生产1g葡萄糖所需要的酶的量。在另一实施方式中，对“可溶淀粉单位(SSU)”，1单位的酶活性等价于在特定培养条件下每分钟释放的葡萄糖中1mg的还原力，并且是基于等份的酶样品在pH 4.5、50℃下水解可溶马铃薯淀粉底物(4％DS)的程度。DS是指“干固体(dry solids)”。

[0047] 如本文中所使用，术语“包括(comprising)”和其同源词以其包含性意义使用；也就是说，等价于术语“包含(including)”及其相应的同源词。

[0048] “一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复数形式，除非上下文中另外明确指出。

[0049] 数值范围包括限定该范围的数。

[0050] 本文所提供的标题不是对本发明的不同方面或实施方式的限制，其可以通过整体上参考说明书而被理解。实施方式

[0051] 在植物细胞以及微生物的细胞中，α-淀粉酶也涉及淀粉的水解，并且在谷类种子的发芽期间，淀粉降解的起始伴随大量的α-淀粉酶的从头合成。因此，谷类种子有其自己的内源性淀粉水解α-淀粉酶，其涉及产生用于发芽和生长的简单糖。

[0052] 在低于初始淀粉胶凝温度的温度条件下(例如低于80℃)，淀粉水解酶的酶组合物，包括那些来自微生物源的和那些来自天然植物α-淀粉酶的，提供了水解颗粒状淀粉并获得可发酵糖以及其它最终产品的改进方法。磨碎的植物材料

[0053] 包含颗粒状淀粉的植物材料可以得自，但不仅限于，小麦、玉米、黑麦、高梁(买罗高粱)、稻米、黍、大麦、小黑麦、木薯(木薯粉)、马铃薯、甘薯、甜菜、甘蔗和豆类如大豆和豌豆。优选的植物材料包括玉米、大麦、小麦、稻米、高粱及其组合。植物材料可以包括杂交品种和遗传改良品种(例如，包含异源基因的转基因玉米、大麦或大豆)。植物任意部分可以被用作植物材料，包括但不仅限于植物的各部分，例如叶、茎、荚、外果壳、根茎、穗轴、谷粒和类似物。在一个实施方式中，整谷粒可以被用作颗粒状淀粉源。优选的整谷粒包括玉米、小麦、黑麦、大麦、高梁和其组合。

[0054] 优选情况下，所述整谷粒的尺寸通过本领域已知的方法被减小，其包括碾磨(例如锤碾磨或滚筒碾磨)；乳化技术；旋转脉动；分级和类似方法。在一些实施方式中，所述植物材料被磨细，以至至少70％将通过具有0.5毫米滤网的筛。在一些实施方式中，磨细的植物材料的至少90％将通过具有0.5毫米滤网的筛。

[0055] 在其它实施方式中，所述植物材料是分级的谷类谷粒，其包括纤维、胚乳和/或芽孢部分。在一些实施方式中，某些级分将被用于本发明的淀粉水解方法。用于分级植物材料例如玉米、大麦和小麦的方法是本领域公知的。植物α-淀粉酶

[0056] 在优选的实施方式中，根据本发明，用于磨碎的植物材料的淀粉水解的酶组分是外源性植物α-淀粉酶。

[0057] 外源性植物α-淀粉酶可以从各种植物和植物部分获得，例如玉米、大麦、小麦、稻米和高粱。至少一种植物α-淀粉酶已经被纯化，并且可以从例如Sigma-Aldrich的来源商业获得。优选的植物淀粉酶包括那些源自大麦和高粱的。

[0058] 很多植物α-淀粉酶已经被纯化，并且这些酶中的一些已经被测序。植物α-淀粉酶的实例包括那些在拟南芥(Arabidopsis)(GenBank NP564977)；稻米(Karrer等人(1992)The Plant J.2：517-532；和Karrer等人(1991)Plant Mol.Biol.16：797-805)；玉米(美国专利2005/0138688；Warner等人(1991)Plant Sci.78：143-150和Subbarao等人(1998)Phytochem.49：657-666)；大麦(Xavier等人(2003)Structure11：973-984；
MacGregor等人(2001)Biochim.Biophys.Acta 1546：1-20；和GenBank X05166)中发现的。 [0059] 在本方法进行的温度下，可以相信内源性植物α-淀粉酶未被灭活并且也可以促进颗粒状淀粉水解。

[0060] 根据本发明的外源性植物α-淀粉酶可以被单独添加或与其它酶结合添加。葡糖淀粉酶-

[0061] 在本发明的优选实施方式中，所述方法包括使磨碎的植物材料与外源性植物α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的组合物接触。

[0062] 葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3.)可以源自细菌、植物和真菌源的异源或内源蛋白质表达。优选的，对本发明有用的葡糖淀粉酶通过数个丝状真菌和酵母菌的菌株生产。特别是，从曲霉(Aspergillus)和木霉菌(Trichoderma)的菌株分泌的葡糖淀粉酶是商业上重要的。适合的葡糖淀粉酶包括天然产生的野生型葡糖淀粉酶以及变体和基因工程突变体葡糖淀粉酶。以下的葡糖淀粉酶是可以用于本发明考虑的方法中的葡糖淀粉酶的非限制性实例。黑曲霉(Aspergillus niger)G1和G2葡糖淀粉酶(Boel等人(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381、WO00/04136和USP 6,352,851)；泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(WO 84/02921)；米曲霉(Aspergillus oryzae)葡糖淀粉酶(Hata等人(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949)和Aspergillus shirousami(见Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen等人(1995)Prot.Eng.8：575-582；和Chen等人(1994)Biochem J.302：275-281)。

[0063] 葡糖淀粉酶也从踝节菌属(Talaromyces)的菌株获得，例如那些源自埃默森篮状菌(T.emersonii)、T.leycettanus、T.duponti和嗜热篮状菌(T.thermophilus)的(WO99/28488；USP No.RE：32,153；USP No.4,587,215)；木霉属(Trichoderma)菌株例如里氏木霉(T.reesei)，特别是与公开在US专利公开号2006-0094080中的SEQ ID NO：4具有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉属(Rhizopus)的菌株，例如雪白根霉(R.niveus)和米根霉(R.oryzae)；白霉属(Mucor)菌株和腐质霉属(Humicola)菌株，例如灰色腐殖霉(H.grisea)(见Boel等人(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；
WO 00/04136；Chen等人(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等人(1978)Carbohydrate Res.61：301-308；USP.4,514,496；USP 4,092,434；USP 4,618,579；Jensen 等人 (1988)Can.J.Microbiol.34：218-223和WO 2005/052148的SEQ IDNO：3)。在一些实施方式中，葡糖淀粉酶将与WO 05/052148的SEQ IDNO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、
95％、96％、97％、98％和99％的序列同一性。

[0064] 用于本发明的其它葡糖淀粉酶包括从罗耳阿太菌(Athelia rolfsii) 和其变体(WO 04/111218)获得的那些。

[0065] 商业使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如从黑曲霉素(来自GenencorInternational Inc.，商品名为DISTILLASE，OPTIDEX L-400和G ZYME G990 4X)或根霉属某种(Rhizopus sp.)(来自日本Shin NihonChemicals，商品名CU.CONC)产生。同样，商业的消化酶，来自日本的Amano Pharmaceuticals，商品名GLUCZYME(Takahashi等人(1985)J.Biochem.98：663-671)。另外的酶包括根霉属某种的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)的三种形式，即“Gluc1”(MW 74,000)、“Gluc2”(MW58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)。酶制剂GC480(Genencor InternationalInc.)也用于本发明。
微生物源的α-淀粉酶

[0066] 在本发明的其它优选的实施方式中，所述方法包括使磨碎的植物材料与外源性植物α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和微生物源的α-淀粉酶组合物接触。

[0067] 在本发明中，作为微生物α-淀粉酶，任何适合的α-淀粉酶可以被使用。在一些实施方式中，所述α-淀粉酶源自细菌菌株，并且在其它实施方式中所述α-淀粉酶源自真菌菌株。在进一步的实施方式中，优选的α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。在其它实施方式中，所述α-淀粉酶是酸稳定α-淀粉酶。适合的α-淀粉酶可以是天然产生的以及重组的(杂交和变体)和突变的α-淀粉酶(WO 99/19467和WO 97/41213)。在一些优选的实施方式中，所述α-淀粉酶源自杆菌(Bacillus)某种。优选的杆菌种包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、迟缓芽胞杆菌(B.lentus)、藓样芽胞杆菌(B.licheniformis)、凝结芽胞杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)(USP 5,093,257；USP 5,763,385；USP 5,824,532；USP5,958,739；USP 6,008,026；USP 6,361,809；USP 6,867,031；WO96/23874；WO 96/39528和WO 05/001064)。特别优选的α-淀粉酶源自杆菌菌株嗜热脂肪芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌和藓样芽胞杆菌(USP6,187,576；USP 6,093,562；USP 5,958,739；US 2006/0014265和WO99/19467)。这样的α-淀粉酶包括野生型、杂交和变体α-淀粉酶。见 Suzuki等人(1989)J.Biol.Chem.264：18933-18938和US 2006/0014265，尤其是SEQ ID NOs：3、4和16。
也参考下述菌株，其具有美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)编号-ATCC 39709；ATCC 11945；ATCC 6598；ATCC 6634；ATCC 8480；ATCC 9945A和NCIB 8059。

[0068] 除了细菌α-淀粉酶之外，真菌α-淀粉酶也被考虑用于本发明的所述方法。适合的真菌α-淀粉酶源自丝状真菌菌株例如曲霉，例如米曲霉和黑曲霉素(例如FUNGAMYL和CLARASE L)以及木霉属、根霉属、白霉属和青霉菌(Penicillium)。

[0069] 考虑用于本发明所述方法的商业可得的α-淀粉酶包括：SPEZYME AA；SPEZYME FRED；SPEZYME ETHYL；GZYME G997；CLARASE L(Genencor International Inc.)；TERMAMYL120-L、LC、SC和SUPRA(Novozymes Biotech)；LIQUOZYME X和SAN SUPER(Novozymes A/S)和ULTRA THIN(/Valley Research)。
发酵有机体

[0070] 发酵有机体的实例是产乙醇微生物或产生乙醇的微生物，例如产乙醇细菌，其表达醇脱氢酶和丙酮酸酯脱氢酶，并且其可以从运动发酵单胞菌(Zymomonas moblis)获得(见，例如USP 5,000,000；USP5,028,539；USP 5,424,202；USP 5,514,583和USP5,554,520)。在另外的实施方式中，所述产乙醇微生物表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，它们是转化木糖为木酮糖的酶。在进一步的实施方式中，木糖异构酶被用于转化木糖为木酮糖。尤其优选的实施方式中，能发酵戊糖和己糖为乙醇的微生物被使用。例如，在一些实施方式中，微生物可以是天然的或非基因工程的微生物，或在其它实施方式中微生物可以是重组微生物。

[0071] 在一些实施方式中，优选的发酵微生物包括来自杆菌属、乳酸菌属(Lactobacillus)、大肠杆菌、欧文菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)(例如柠檬假交替单胞菌(P.citrea))、假单胞菌属(Pseudomonas)和克雷白氏杆菌属(Klebsiella)(例如产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))的细菌菌株。(见，例如USP 5,028,539，USP 5,424,202和WO
95/13362)。用于发酵步骤的发酵微生物取决于要生产的最终产物。

[0072] 在进一步的优选实施方式中，产乙醇微生物是真菌微生物，例如，酵母、特别是酵母属(Saccharomayces)例如酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(USP 4,316,956)。各种酿酒酵母是商业可得的并且这些包括但不仅限于FALI(Fleischmann’s Yeast)、SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSM Specialties)、RED STAR(Lesaffre)和Angel醇酵母(安琪酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)。第二种酶

[0073] 虽然本发明的优选实施方式包括外源性植物α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和任选的微生物源α-淀粉酶，但另外的酶可以与发酵微生物和其它组分一起包括在接触步骤和/或发酵步骤中。所述另外的酶非限制性包括，纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、脂肪酶、角质素分解酶(cutinase)、果胶酶、β-葡聚糖酶、环糊精转糖基转移酶、β-淀粉酶和其组合物。

[0074] 其它葡糖淀粉酶，其可以与所述α淀粉酶和所述葡糖淀粉酶一起被包括，可以来自细菌、植物和真菌的异源或内源的蛋白质表达。优选的葡糖淀粉酶通过丝状真菌和酵母菌的数个菌株生产。特别是，从下列获得的葡糖淀粉酶：曲霉菌株(黑曲霉素，见，Boel等人的(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381和USP 6,352,851)；米曲霉菌株，见Hata等人的(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949和A.shirousami菌株，见Chen等人的(1996)Prot.Eng.9：499-505)。木霉属、根酶属(雪白根霉和米根霉)、腐质霉属(灰色腐殖霉，见Boel等人的(1984)EMBO J.3：1097-1102；USP 4,514,496和USP 4,092,434)、踝节菌属(埃默森篮状菌、嗜热篮状菌和T.duponti，见WO 99/28488和USP4,587,215)和阿太菌属(Athelia)(罗尔阿太菌(A.rolfsii)，见WO04/111218)可以是有用的。具有葡糖淀粉酶活性的、商业使用的酶例如从黑曲霉素(商品名DISTILLASE、OPTIDEX L-400和G ZYME G9904X，来自Genencor International Inc.)生产。

[0075] 根据本发明有用的包含葡糖淀粉酶和α淀粉酶的组合物是STARGENTM 001，其是具有GSH活性的Aspergillus kawachi α淀粉酶和黑曲霉素葡糖淀粉酶(商业可得自Genencor International，Inc)的混合物。

[0076] 在一些实施方式中，另外的酶是α淀粉酶例如细菌的或真菌的α淀粉酶，并且在其它实施方式中α淀粉酶是真菌的或细菌的α淀粉酶的衍生物、突变体或变体。与根据本发明的、具有GSH活性的、淀粉水解酶组合使用的α淀粉酶的非限制实例是源自杆菌、曲霉、木霉属、根霉属、镰孢菌属(Fusarium)、青霉菌、脉孢霉属(Neurospora)和腐质霉属的那些。

[0077] 一些优选的另外的α淀粉酶源自杆菌包括藓样芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌、枯草杆菌和它们的杂种、突变体和变体(USP5,763,385；USP 5,824,532；USP 5,958,739；USP 6,008,026和USP 6,361,809)。这些淀粉酶的一些是商业可得的，例如TERMAMYL和SUPRA可来自Novo NordiskA/S，ULTRATHIN来自Diversa，LIQUEZYME SC来自Novo NordiskA/S以及SPEZYME FRED、SPEZYME ETHYL和GZYME G997可来自Genencor International，Inc。

[0078] 在另一个实施方式中本发明将包括添加植酸酶。植酸酶是能从肌醇六磷酸盐释放至少一种无机磷酸盐的酶。植酸酶分类是根据它们对水解开始的肌醇六磷酸盐分子上磷酸酯基团的特定位置的优先选择性(例如，分类为3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的典型实例是肌型-肌醇-六磷酸盐-3-磷酸水解酶(myo-inositol-hexakiphosphate-3-phosphohydrolase)。植酸酶可以从微生物例如真菌和细菌有机体获得。这些微生物中的一些包括例如，曲霉(例如，黑曲霉、土曲霉(A.terrus)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉菌(M.thermophila))、踝节菌属(嗜热篮状菌)、木霉菌某种(里氏木霉)和嗜热真菌(Thermomyces)(WO 99/49740)。植酸酶也可来自青霉菌种，例如大麦柄锈菌(P.hordei)(ATCC No.22053)、桧状青霉(P.piceum)(ATCC No.10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC No.48944)。参见例如USP6,475,762。另外，植酸酶可从孢伏革菌(Peniophora)、大肠杆菌、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、肠杆菌(Enterbacter)和布丘氏菌属 (Buttiauxella)得到。优选地，来自布丘氏菌属的植酸酶是BP-17植酸酶(见美国专利申请11/714,487，其提交于2007年3月
6日，题目是VARIANT BUTTIAUXELLA SP.PHYTASES HAVING ALTEREDPROPERTIES。)商业的植酸酶是可获得的，例如NATUPHOS(BASF)、RONOZYME P(Novozymes A/S)、PHZYME(Danisco A/S，Diversa)和FINASE(AB Enzymes)。测定微生物的植酸酶活性的方法和植酸酶个体的定义已经被Engelen等人的(1994)J.of AOAC International，77：760-764公开。 [0079] 纤维素酶也可以与α淀粉酶和葡糖淀粉酶合并。纤维素酶是水解纤维素(β-1，
4-D-葡聚糖键)和/或其衍生物例如磷酸溶胀纤维素的酶组分。纤维素酶包括外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-糖苷酶(BG)(EC3.2.191、EC3.2.1.4和EC3.2.1.21)的分类。纤维素酶的实例包括来自青霉菌、木霉属、腐质霉属、镰孢菌属、高温单孢菌属(Thermomonospora)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)和曲霉属的纤维素酶。销售用于种子应用的、商业可得的纤维素酶是β-葡聚糖酶，例如ROVABIO(Adisseo)、NATUGRAIN(BASF)、MULTIFECT BGL(Danisco Genencor)和ECONASE(AB Enzymes)。

[0080] 木聚糖酶也可以被包括。木聚糖酶(例如内-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)，其水解木聚糖主链，可以来自细菌源，例如杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、梭菌属、嗜酸栖热菌属(Acidothermus)、小四孢菌属(Microtetrapsora)或高温单胞芽菌属(Thermonospora)。另外木聚糖酶可以来自真菌源，例如曲霉、木霉属、脉孢霉属、腐质霉属、青霉属或镰孢菌属。(见例如EP473 545；USP 5,612,055；WO 92/06209；和WO 97/20920)。商业制剂包括 MULTIFECT 和 FEEDTREAT Y5(Danisco Genencor)、RONOZYME WX(Novozymes A/S) 和NATUGRAIN WHEAT(BASF)。

[0081] 蛋白酶也可以被包括。蛋白酶可以源自杆菌例如解淀粉芽胞杆菌、迟缓芽胞杆菌、藓样芽胞杆菌和枯草杆菌。这些源包括枯草菌溶素，例如可从解淀粉芽胞杆菌和其突变体获得的枯草菌溶素(USP4,760,025)。适合的商业蛋白酶包括MULTIFECT P 3000(Danisco Genencor)和SUMIZYME FP(Shin Nihon)。蛋白酶也可源自真菌源例如木霉属(例如NSP-24)、曲霉属、腐质霉属和青霉属。

[0082] 根据本发明可以包括在动物饲料中的另外的酶是α-半乳糖苷酶、果胶酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、环糊精糖基转移酶(CGTases)、半纤维素酶、氧化酶、氧化-还原酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、(E.C.3.2.1.2)和酯酶。

[0083] 在一些优选的实施方式中，选自α淀粉酶、葡糖淀粉酶、植酸酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶的两种或多种酶的组合将被包括。方法步骤

[0084] 在一些实施方式中，包含颗粒状淀粉的磨碎植物材料与水溶液混合以获得浆状物。该浆状物可以具有介于5-60％、10-50％、15-45％、15-30％、20-45％、20-30％以及25-40％之间的DS。该浆状物与外源性植物α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和任选的微生物α-淀粉酶在适当条件下接触，以生产可发酵糖。

[0085] 接触步骤的pH范围介于pH 3.0至7.0之间；也介于pH 3.5至6.5之间；也介于pH 4.0至6.0之间，并且进一步，介于pH 4.0至5.5之间。在温度低于磨碎的植物材料中颗粒状淀粉的淀粉胶凝温度下，该浆状物保持与酶接触。在一些实施方式中，该温度保持介于25℃至75℃之间；在其它实施方式中，该温度保持介于30℃和70℃之间；介于30℃和65℃之间；介于40℃和65℃之间；介于55℃和70℃之间；介于60℃和65℃之间；介于55℃和65℃之间和介于55℃和68℃之间。在进一步实施方式中，温度至少是25℃、30℃、35℃、
40℃、45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃和68℃。在其它实施方式中，该温度不高于65℃、68℃、70℃、73℃、75℃和80℃。

[0086] 可以根据本文方法使用的许多颗粒状淀粉的初始淀粉胶凝温度范围包括大麦(52℃至59℃)、小麦(58℃至64℃)、黑麦(57℃至70℃)、玉米(62℃至72℃)、高直链淀粉玉米(67℃至80℃)、稻米(68℃至77℃)、高梁(68℃至77℃)、马铃薯(58℃至68℃)、木薯(59 ℃至69℃)和甘薯(58℃至72℃)。(J.J.M.Swinkels，STARCHCONVERSION TECHNOLOGY中32-38页，Van Beynum等编著(1985)Marcel Dekker Inc.New York以及The Alcohol Textbook第三版A Reference for the Beverage，Fuel and Industrial Alcohol Industries，Jacques等人编著，(1999)Nottingham University Press，UK)。

[0087] 在所述接触步骤中，浆状物可以被保持与酶接触2小时至240小时；2小时至120小时；5小时至90小时；5小时至72小时；和5小时至48小时的一段时间。

[0088] 用于接触步骤的α-淀粉酶的有效浓度将根据具体方法条件和使用的颗粒状淀粉变化。然而，通常而言，使用的α-淀粉酶的量的范围是0.001至50AAU/g DS、0.01至30AAU/g DS、0.01至10AAU/g DS和0.05至5.0AAU/g DS。

[0089] 在一些实施方式中，在接触步骤和/或发酵步骤中α-淀粉酶的有效剂量是0.01至25SSU/g DS；0.01至15SSU/g DS；0.05至10SSU/gDS；0.1至10SSU/g DS；0.1至10SSU/g DS和0.5至5SSU/g DS。

[0090] 在一些实施方式中，用于接触步骤和/或发酵步骤的葡糖淀粉酶的有效剂量在范围0.01至20GAU/g DS；0.01至15GAU/g DS；0.05至10GAU/g DS；0.1至10GAU/g DS和甚至0.5至5GAU/g DS。

[0091] 接触步骤期间，介于20-95％的颗粒状淀粉被溶解，以产生可发酵糖例如寡糖。在一些实施方式中，大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％和大于90％的淀粉被溶解。在一些实施方式中，溶解的淀粉包含大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％和80％的葡萄糖。

[0092] 在一些实施方式中，包含可发酵糖的醪液可被进一步转化为最终产品例如高果糖糖。在其它实施方式中，可发酵糖用发酵微生物发酵。所述接触步骤和所述发酵步骤可以同时在同一个反应容器中进行或连续进行。概括地，发酵方法描述在The Alcohol Textbook第三版，AReference for the Beverage，Fuel and Industrial Alcohol Industries，Jacques等编著(1999)Nottingham University Press，UK中。

[0093] 在一些优选的实施方式中，醪液被用酵母菌发酵，其温度范围在15至40℃、20至38℃和25至35℃；pH范围为pH 3.0至6.5；pH 3.0至6.0；pH 3.0至5.5；pH 3.5至5.0和pH 3.5至4.5，时间为5小时至120小时，优选12小时至120小时和更优选从24至90小时，以生产醇产品，优选为乙醇。

[0094] 酵母菌细胞通常以每毫升发酵培养基104至1012活酵母菌数的量提供，优选10710
至10 。除了发酵微生物(例如酵母菌)外，发酵还将包括营养素、任选的酸和另外的酶。
在一些实施方式中，除了上述原料外，发酵培养基将包含补充物，其包括但不仅限于维生素(例如维生素H、叶酸、烟酸、核黄素)、辅助因子以及常量营养物和微量营养物及盐(例如(NH4)2SO4；K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。

[0095] 在一些优选的实施方式中，磨碎的植物材料包括大麦、高粱，玉米和其组合物，并且接触和发酵步骤同时进行，pH范围在3.5至5.5，温度范围为30-45℃，以及时间为48至90小时，其中至少50％的淀粉被溶解。
回收醇和其它最终产品

[0096] 本发酵方法的优选最终产品是醇产品，优选为乙醇。根据所述方法产生的最终产品可以从发酵培养基中分离和/或精制。用于分离和精制的方法是已知的，例如，使培养基经过萃取、蒸馏和柱层析。在一些实施方式中，最终产品通过将培养基通过高效液相色谱(HPLC)分析而直接鉴定。

[0097] 在进一步的实施方式中，醪液可以通过例如离心分离被分离为液相和固相，并且最终产品例如醇和固体被回收。所述醇可以通过方法例如蒸馏和分子筛脱水或超滤进行回收。

[0098] 在一些实施方式中，乙醇的收率按体积计将大于8％、10％、12％、14％、16％和18％。根据本发明方法获得的乙醇可以作为燃料乙醇、饮用乙醇或工业乙醇使用。 [0099] 在进一步的实施方式中，最终产品可以包括发酵联产品，例如干酒糟(DDG)和干酒糟加可溶物(DDGS)，其可以被用作动物饲料。

[0100] 在进一步的实施方式中，通过使用本领域已知的适合的发酵微生物，发酵最终产品可以包括但不限于丙三醇、1，3-丙二醇、葡糖酸、 2-酮-D-葡糖酸、2，5-二酮-D-葡糖酸、2-酮-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸和其衍生物。更具体而言，当乳酸是所需的最终产品时，乳杆菌某种(Lactobacillus sp.)(干酪乳杆菌(L.casei))可以被使用；当丙三醇或1，3-丙二醇是所需的最终产品时，大肠杆菌可以被使用；以及当2-酮-D-葡糖酸、2，5-二酮-D-葡糖酸和2-酮-L-古洛糖酸是所需的最终产品时，Pantoea citrea可以被用作发酵微生物。上述列举的仅仅是实例，本领域技术人员将知道可以适合用于获得所需最终产品的许多发酵微生物。
实验

[0101] 以下实施例提供用于说明和进一步阐明本发明的某些优选实施方式和方面，并且不被解释为限制其范围。实际上，这些教导可被考虑用于进一步优化在此描述的方法系统。 [0102] 在以下的公开和实验部分，应用以下缩写：GA(葡糖淀粉酶)；AnGA(从黑曲霉获得的葡糖淀粉酶)；HGA(源自灰色腐殖霉的葡糖淀粉酶，见WO 2005/052148的SEQ ID NO：3)；STARGEN 001(葡糖淀粉酶和α-淀粉酶混合物，Genencor International，Inc.)；TrGA(源自木霉属的葡糖淀粉酶，见US 2006/0094080的SEQ ID NO：4)；大麦AA(大麦α-淀粉酶，为1.7AAU/mg，从Sigma购买(SigmaA2771-1MU)；wt％(重量百分数)；℃(摄氏度)；
H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；
mg(毫克)；kg(千克)；μL(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；
mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；W/V(重量/体积)；W/W(重量/重量)；V/V(体积/体积)；Genencor(Genencor International，Inc.，Palo Alto，CA)；MT(公吨)；和ETOH(乙醇)。
以下分析用于下述实施例：

[0103] α-淀粉酶的活性表达为α-淀粉酶单位(AAU)并通过淀粉水解速率测定酶活性，如碘染色能力的下降速率所反映的，其通过分光光度计测量。一个AAU细菌α-淀粉酶活性是在标准条件下每分钟水解10mg淀粉所需的酶的量。

[0104] 【104】α-淀粉酶活性也被测定为可溶淀粉单位(SSU)，其基于在pH4.5、50℃下可溶马铃薯淀粉底物(4％DS)被等分酶样品水解的程度。还原糖含量使用如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426428中所述的DNS方法测定。一个单位酶活性(SSU)等价于在特定培养条件下每分钟释放的1mg葡萄糖的还原力。

[0105] 【105】葡糖淀粉酶活性使用周知的测定法测定，其基于葡糖淀粉酶催化水解对硝基苯基-α-D-葡糖吡喃苷(PNPG)为葡萄糖和对硝基苯酚的能力。在碱性pH下，对硝基苯酚形成与葡糖淀粉酶活性成比例的黄色，并且该黄色在400nm下监测且与标准酶对比，测定为GAU。

[0106] 【106】一个“葡糖淀粉酶活性单位”(GAU)是生产1gm还原糖的酶的量，计算为在pH 4.2和60℃下每小时来自可溶淀粉底物(4％DS)的葡萄糖。

[0107] 【107】白利氏糖度——给定温度下总的溶解固体含量的量度，用折光计测定。 [0108] 【108】总淀粉含量的测定：酶-酶淀粉液化和糖化方法被用于测定总淀粉含量。在典型分析中，2g的干样品置于100毫升Kohlraucsh烧瓶中，45毫升的pH 7.0的MOPS缓冲液被加入。浆状物被充分搅拌30分钟。1.0毫升SPEZYME FRED(1∶50，在水中稀释)(Genencor)被加入并被加热至沸腾3-5分钟。烧瓶被置于保持在121℃的高压灭菌器中15分钟。此后，烧瓶被置于95℃水浴中，并且1毫升的1∶50稀释的SPEZYME FRED被加入，并培养45分钟。pH被调节至pH 4.2，并且温度降低至60℃。接着，加入20毫升pH 4.2的醋酸盐缓冲液。糖化通过添加1.0毫升的1∶100稀释的OPTIDEX L-400(Genencor)并在
60℃下继续培养18小时进行。酶反应通过在95℃下加热10分钟终止。总糖组成通过HPLC分析测定，使用葡萄糖作为标准。在室温下未经酶处理的样品的水萃取引起的溶解淀粉水解产物被从总糖中减去。大麦面粉的淀粉和水分含量通过外部分析(Rock River Labs，Watertown，WI)被进一步确认。由此，知道了总淀粉含量、溶解为乙醇的总淀粉，淀粉转化为乙醇的百分率％可以进行计算(溶解的淀粉× 100/总淀粉)。

[0109] 样品的乙醇和糖类测定使用HPLC方法测定，如下：1.5毫升Eppendorf离心管装满发酵罐醪液，并被冰冷却10分钟；该样品管在Eppendorf桌上离心机上离心1分钟；0.5毫升上清液样品转移至含0.05毫升1.1N H2SO4的试管，并使其静置5分钟；5.0毫升的水被加入试管，并且然后所述样品通过0.2μm Nylon Syringe滤器被过滤至HPLC小瓶；进行HPLC测定。HPLC条件包括：

[0110] 乙醇系统：柱：Phenomenex Rezex 有机酸柱 (RHM-Monosaccharide)#00H0132-KO(等同于Bio-Rad 87H)；柱温度：60℃；流动相：0.01N H2SO4；流速：0.6mL/min；检测器：RI；及注射体积：20μL。

[0111] 糖类系统：柱：Phenomenex Rezex糖类(RCM-Monosaccharide)#00H-0130-KO(等同于Bio-Rad 87H)；柱温度：70℃；流动相：Nanopure DI H2O；流速：0.8mL/min；检测器：RI；注射体积：10μL(3％DS物质)。柱分离基于糖的分子量，其标记为DP1(葡萄糖)；
DP2(二糖)；DP3(三糖)和DP＞3(聚合度大于3的寡糖)。
实施例1
从磨细的大麦谷粒的颗粒状淀粉进行淀粉水解和乙醇生产

[0112] 大麦谷粒从Whole Foods采购并被磨细(0.5mm筛)为面粉。大麦面粉的水分含量是11.1％。大麦面粉的淀粉含量为57.9％。32g磨细的大麦和68g水被加至250上螺扣瓶。该浆状物被调节至pH4.2并且尿素(Bio-Rad)被加入400ppm。在1U/g DS的底物下，该浆状物受各种酶处理。200ul的10％酵母菌被作为最后组分加入。该浆状物在水浴32℃下培养，并且通过搅拌片温和搅拌(100ppm)。在总共72小时期间大约每12小时取样。样品(约8ml)在3500rpm下被离心30分钟，并且收集2毫升上清液储存在-80℃，用于HPLC测定。

[0113] 图1说明大麦颗粒状淀粉的水解，其通过乙醇随时间的产生测定，与使用真菌α-淀粉酶(STARGEN 001)对比，添加外源性植物 α-淀粉酶改善了该水解。表1样品大麦AA 32U(mg) GA 32U(uL) 组合的酶％淀粉转化为乙溶解的总淀(mg) 醇粉％
STARGEN 001 N/A N/A 65.3 50.8 65
大麦AA+AnGA 19 61.3 N/A 64.8 82
大麦AA+TrGA 19 57.3 N/A 79.4 100
大麦AA+HGA 19 84 N/A 72.5 94
无大麦AA+HGA N/A 84 N/A 61.3 78
灭活的大麦AA+ 19(50uL的1N H2SO4并沸腾 84 N/A 58.4 74
HGA 5min)

[0114] 图2说明在谷粒面粉中发现的内源植物α-淀粉酶是活性的，但没有足够的浓度以有效水解其自身的淀粉用于进一步发酵。乙醇生产在酸/热灭活α-淀粉酶和未加入外源性大麦α-淀粉酶的对照之间几乎没有区别。这些结果确认外源性加入的大麦α-淀粉酶的作用。与依靠存在于磨细大麦种子面粉内的内源α-淀粉酶的未添加反应相比，加入外源性大麦α-淀粉酶增加了20％(v/v)的乙醇产生。加入外源性大麦α-淀粉酶而没有葡糖淀粉酶得到约8％(v/v)乙醇产生。当既不加入外源性大麦α-淀粉酶也不加入其它淀粉水解酶时，仅1％(v/v)乙醇在发酵期间产生。注意此图也表示两种葡糖淀粉酶之间活性的不同。

[0115] 上文说明书中提及的所有出版物和专利并入本文作为参考。对于本领域的技术人员来说，对本发明的描述方法和系统的各种修改和变化将是显而易见的，这不背离本发明范围和精神。虽然本发明相关于特定的优选实施方式而描述，但应该理解，要求保护的本发明不应当不恰当地受限于这些特定实施方式。事实上，对本领域技术人员而言显而易见的实施本发明的所述方式的各种修改意图包含在本发明范围内。

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