生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法
阅读：870发布：2020-05-15
专利汇可以提供生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 生物 膜 蛋白质 的提取方法和 电泳 样品的制备方法，提取方法包括以下步骤：对生物膜样品进行预处理以得到沉淀物；将该沉淀物与裂解液和苯甲基磺酰氟溶液混合，在 冰 浴条件下超声裂解，得到样品裂解液；震荡并离心样品裂解液，取上清液并采用TCA‑丙 酮 沉淀法对其进行处理，得到蛋白质样品；制备方法包括以下步骤：使用溶解液溶解蛋白质样品，依次进行超声、涡旋振荡和离心，取上清液得到电泳样品；本发明的方法采用了含有多种去垢剂的裂解液并结合冰浴超声对 微生物 细胞进行破壁，同时采用TCA‑丙酮沉淀法提纯蛋白质，不仅能有效地提取生物膜样品中的全蛋白，还能降低 腐殖质 对蛋白质的掩蔽作用，使电泳的分析结果清晰。，下面是生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种生物膜蛋白质的提取方法，其特征在于：由如下步骤组成：
(1).对生物膜样品进行预处理，得到沉淀物；
(2).将步骤(1)所得沉淀物与裂解液和苯甲基磺酰氟溶液混合，在冰浴条件下超声裂解，得到样品裂解液；
(3).将步骤(2)所得样品裂解液震荡并离心，取上清液，采用TCA-丙酮沉淀法对所述上清液进行处理，得到蛋白质样品；
步骤(1)中的生物膜样品的提取方法为：从蚯蚓生物滤池的滤床内取出带有生物膜的陶粒，用蒸馏水将其上附着的生物膜冲下后，用1mm孔径的筛子筛分以去除杂质颗粒，收集筛下物，以8000rpm的速度于4℃下离心5min以收集生物膜，并将其作为生物膜样品；
步骤(1)中的预处理包括如下步骤：
a.采用浓度为9±1mg/mL的氯化钠溶液洗涤所述生物膜样品，以8000±1000rpm的转速于4±1℃下离心5±1min，收集沉淀；
b.采用磷酸缓冲盐溶液洗涤步骤a所得沉淀，涡旋振荡后以8000±1000rpm的转速于4±1℃下离心5±1min，得到所述沉淀物；
在步骤(2)中，所述裂解液的成分为：50mmol/L pH＝7.4的Tris、150mmol/L的NaCl、1±
0.5wt％的Triton X-100、1±0.5wt％的脱氧胆酸钠和0.1±0.05wt％的SDS，其余成分为去离子水；
在步骤(2)中，所述苯甲基磺酰氟溶液的浓度为100±10mmol/L；
在步骤(2)中，超声的强度为250-300W，超声的时间为20±10个周期，每个周期内连续超声20秒并且停止超声10秒；
在步骤(3)中，所述TCA-丙酮沉淀法包括如下步骤：
a.将所述上清液与三氯乙酸以(9±3)︰(1±1)的体积比混合，于4±1℃下静置，然后离心，得到初级沉淀物；
b.将步骤a所得初级沉淀物用三倍于所述初级沉淀物体积的预冷后的丙酮洗涤，于4±
1℃下静置并离心，得到次级沉淀物；
c.重复步骤b两至三次，最后一次得到的沉淀物不完全吹干，得到蛋白质样品。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：在步骤(3)中，震荡的条件为：以200-
300rpm的速度于4±1℃下进行震荡。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：在步骤(3)中，离心的条件为：以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心30±10min。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：在步骤a中，静置的时间为30±10min，离心的条件为：以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心10±5min。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：在步骤b中，静置的时间为30±10min，离心的条件为：于4±1℃下以13000±1000rpm的转速离心10±5min。
生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物处理技术领域，涉及一种生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法。
背景技术
[0002] 许多研究证明，通过传统的分离培养方法鉴定的微生物只占天然环境微生物总数的1％。近年来，新兴的宏蛋白质组学是一种运用蛋白质组技术对特定微生物群落所产生的全部蛋白质进行大规模研究与分析的新技术，也是一种探索微生物群落结构的新策略。通过宏蛋白质组研究能够把微生物群落组成与其生态功能联系起来，从而更好地了解系统中的功能微生物。
[0003] 随着对微生物和环境微生物的宏基因的测序研究的不断深入和发展，对基因表达蛋白质的研究更加重要。尽管宏基因组学研究能够提供很多有价值的数据，其弊端也显现出来：，比如，由于重复基因的出现和基因表达的时空性等原因，造成了微生物的基因表达不能通过宏基因组的研究来解释。此外，微生物对物质的转化主要是通过其分泌的酶来实现的。众所周知，大多数酶的化学本质是蛋白质，因此，在基因组、转录组、蛋白质组、代谢组这4个研究层次中，蛋白质组学是最直接的对特定环境和特定时刻生物功能本质的研究，这种研究具有较大的生物学意义。尽管现在只开展了少数的宏蛋白质组学研究，但是其在环境微生物研究中的巨大作用已经显现出来。
[0004] Wilmes.P.等人在生物强化除磷系统中鉴定出了702个与A.phosphatis有关的蛋白点，并指出在好氧和厌氧环境下，仅有3％的蛋白表达产生显著差别。Lv.F.等人研究纤维素的厌氧消化处理时发现微生物能够对纤维素进行剧烈水解作用，并且检测到了分子生物技术未能检出的具有纤维素分解功能的微生物。Kan等人对Chesapeake海湾海水微生物群落进行研究通过2D电泳发现该海湾不同水域蛋白质组存在较大差异，通过对有表达差异的7种蛋白质谱分析，鉴定出4种新的蛋白质。因此，微生物的蛋白表达是随着时间和空间的变化而变化的动态信息，能够更加直接具体地给出关于微生物活性方面的信息，因而宏蛋白质组学在微生物群落功能分析、代谢与环境相互作用过程中具有更大的潜力。
[0005] 进行宏蛋白质组学分析的关键步骤是实现对样品中蛋白质的有效提取。Taylor等模拟天然环境，对培养的微生物样品进行了两种提取方法的比较。结果显示直接提取法的蛋白质SDS-PAGE图像模糊不可辨，而且蛋白质回收率很低；DGC-EXT提取法的SDS-PAGE图像有6～10条带，说明先收集细胞再提取蛋白法(DGCEXT提取法)优于直接提取法。Wilmes.P.等对活性污泥的蛋白质提取进行了不同细胞破碎法、不同洗涤及裂解缓冲液、不同蛋白沉淀及溶解方法对蛋白提取效果的影响的研究，最终确定了一种适合活性污泥的总蛋白提取方法。Kuhn.R.等人采用了酚提法来提取MBR反应器中活性污泥的蛋白质。苯酚对其中的腐殖质有一定的萃取作用，并对粗提液进行了多次醋酸铵沉淀最终获得了可用于2D电泳分析的蛋白质溶液。由于环境样品的复杂性，目前仍然没有通用的适用于提纯各种环境下微生物总蛋白的方法，尤其是从生物膜或活性污泥等环境中提取蛋白还是有很多的困难。
[0006] 对污水污泥处理中微生物的宏蛋白质组学主要集中于活性污泥。然而，在自然环境下，与活性污泥系统相比，生物膜也是个复杂的生态系统，诸多因素共同影响着污染物的迁移、转化以及微生物的群落结构，目前，对于生物膜系统的研究大都是在实验室可控条件下开展的，需要预先培养或者富集特定微生物。另外，生物膜是复杂的微生物聚集体，食物链长，腐殖化程度明显，生物膜中各种微生物以附着形式生长，在滤料表面繁殖形成致密的生物膜，其结构与微生物种类往往比活性污泥菌胶团更加复杂和多样。而且在生物膜老化的过程中产生的腐殖质会与微生物释放和分泌的蛋白质结合，难以分离导致样品提纯难度大，是这一研究中存在的最大困难。加上蛋白质技术又没有类似于PCR的扩增手段等，对于蛋白质含量低的样品分析更加困难。现有的各种蛋白质提取方法运用于生物膜效果都不尽人意，目前还没有一种提取生物膜总蛋白质的通用有效的方法，这也是导致宏蛋白质组学在环境研究方面的迟滞最重要原因。
[0007] 目前被宏蛋白质组研究者广泛使用的由Wilmes.P.建立的方法，发明人重复该方法提取生物膜的蛋白质，没有获得理想的效果，表明该方法缺乏较好的通用性。因此提出了新的高效、通用的蛋白质提取方法对宏蛋白质组学研究与应用至关重要。
发明内容
[0008] 为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种生物膜蛋白质的提取方法，该种方法能够对来自于生物膜的蛋白质进行有效提取，其无需对特定的微生物进行预先培养或者富集，同时也能够降低腐殖质对蛋白质的掩蔽作用，使蛋白质能够很好地与腐殖质相脱离。
[0009] 本发明的另外一个目的在于提供一种电泳样品的制备方法，该方法采用上述被提取后的蛋白质制成电泳样品，能够使得该电泳样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测后所成的条带清晰，或者，使该电泳样品经双向电泳(two-dimensional electrophoresis)分离后所成的蛋白质点清晰，为蛋白质组学研究等后续的研究工作打下了良好的基础。
[0010] 为达到上述目的，本发明的解决方案是：
[0011] 一种生物膜蛋白质的提取方法，其包括如下步骤：
[0012] (1).对生物膜样品进行预处理，得到沉淀物；
[0013] (2).将步骤(1)所得沉淀物与裂解液和苯甲基磺酰氟溶液混合，在冰浴条件下超声裂解，得到样品裂解液；
[0014] (3).将步骤(2)所得样品裂解液震荡并离心，取上清液，采用TCA-丙酮沉淀法对上清液进行处理，得到蛋白质样品。
[0015] 其中，步骤(1)中的预处理包括如下步骤：
[0016] a.采用浓度为9±1mg/mL的氯化钠溶液洗涤生物膜样品，以8000±1000rpm的转速于4±1℃下离心5±1min，收集沉淀；
[0017] b.采用磷酸缓冲盐溶液洗涤步骤a所得沉淀，涡旋振荡后以8000±1000rpm的转速于4±1℃下离心5±1min，得到沉淀物。
[0018] 在步骤(2)中，裂解液可以含有1±0.5wt％的Triton X-100、1±0.5wt％的脱氧胆酸钠和0.1±0.05wt％的SDS。
[0019] 在步骤(2)中，苯甲基磺酰氟溶液的浓度可以为100±10mmol/L，超声的强度可以为250-300W，超声的时间可以为20±10个周期，每个周期内连续超声20秒并且停止超声10秒。
[0020] 在步骤(3)中，震荡的条件可以为：以200-300rpm的速度于4±1℃下进行震荡；离心的条件可以为：以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心30±10min。
[0021] 在步骤(3)中，TCA-丙酮沉淀法可以包括如下步骤：
[0022] a.将上清液与三氯乙酸以(9±3)︰(1±1)的体积比混合，于4±1℃下静置，然后离心，得到初级沉淀物；
[0023] b.将步骤a所得初级沉淀物用三倍于初级沉淀物体积的预冷后的丙酮洗涤，于4±1℃下静置并离心，得到次级沉淀物；
[0024] c.重复步骤b两至三次，得到蛋白质样品。
[0025] 其中，在步骤a中，静置的时间可以为30±10min，离心的条件可以为：以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心10±5min。
[0026] 在步骤b中，静置的时间为30±10min，离心的条件为：以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心10±5min。
[0027] 一种电泳样品的制备方法，其包括如下步骤：使用溶解液溶解上述的蛋白质样品，依次进行超声、涡旋振荡和离心，取上清液得到电泳样品。
[0028] 其中，溶解液中含有7mol/L的尿素和2mol/L的硫脲。超声的时间可以为20±5min；涡旋振荡的时间可以为30min以上；离心的条件可以为以13000±1000rpm的速度于4±1℃下离心30±10min。
[0029] 由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0030] 首先，本发明采用含有多种去垢剂的裂解液裂解微生物细胞并同时辅以冰浴条件下的超声裂解，因此能够充分地破碎微生物细胞，使微生物的全蛋白能够溶出细胞，故所得到的样品裂解液中含有微生物的全蛋白。
[0031] 其次，本发明采用TCA-丙酮沉淀法提纯蛋白质，能够有效去除样品裂解液中的腐殖质，降低了腐殖质对电泳的干扰，使提纯后的蛋白质经SDS-PAGE检测后的条带清晰，并且经双向电泳分离后的蛋白质点清晰，有利于后继的分析。
[0032] 此外，现有技术先对生物膜样品进行实验室预先培养或者富集，然后再提取蛋白质，而本发明采用非培养方式直接提取蛋白质，也即直接从微生物生长的自然环境中提取蛋白质，因此能够准确反映微生物在自然环境下的特性，能够最大限度地避免实验室培养或富集对微生物表达的蛋白质种类以及蛋白质表达水平的影响。
[0035] 图2为本发明实施例的从蚯蚓生物滤池中的某一处的生物膜提取而成的蛋白质样品的双向电泳图谱。
具体实施方式
[0036] 本发明提供了一种生物膜蛋白质的提取方法和电泳样品的制备方法。
[0037] <生物膜蛋白质的提取方法>
[0038] 本发明的生物膜蛋白质的提取方法采用非培养方式对自然界中的微生物蛋白质进行提取，其包括如下步骤：
[0039] (1).对生物膜样品进行预处理，得到沉淀物；
[0040] (2).将步骤(1)所得沉淀物与裂解液和100mmol/L的苯甲基磺酰氟溶液混合，置于冰浴上并不断搅拌，使微生物与裂解液充分接触，待沉淀物分散开后，在冰浴条件下以250-300W的强度进行20±10次超声裂解，每次超声视为一个周期，每个周期内连续超声20秒并且停止超声10秒，待液体变得均匀后停止超声，得到样品裂解液；
[0041] (3).将步骤(2)所得样品裂解液转入摇床中，以200-300rpm的速度于4±1℃下震荡20±5min并以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心30±10min，取上清液，采用TCA-丙酮沉淀法对上清液进行处理，得到蛋白质样品。
[0042] 其中，在步骤(1)中，预处理过程包括如下步骤：
[0043] a.采用浓度为9±1mg/mL的氯化钠溶液(0.9±0.1％(w/v))涡旋震荡洗涤生物膜样品，以洗去胞外多糖物质，从而降低生物膜样品的粘稠度，之后以8000±1000rpm的转速于4±1℃下离心5±1min，收集沉淀；
[0044] b.采用1X磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤步骤a所得沉淀，涡旋振荡后以8000±1000rpm的转速于4±1℃离心5±1min，得到沉淀物。
[0045] 在步骤(2)中，裂解液的成分及每种成分的浓度如下所示：50mmol/L的Tris(pH＝7.4)、150mmol/L的NaCl、1±0.5wt％的Triton X-100、1±0.5wt％的脱氧胆酸钠和0.1±
0.05wt％的SDS。其余成分为去离子水。
0.05wt％的SDS。其余成分为去离子水。
[0046] 在步骤(3)中，TCA-丙酮沉淀法包括如下步骤：
[0047] a.将上清液与三氯乙酸(TCA)以(9±3)︰(1±1)的体积比混合，于4±1℃下静置30±10min，然后以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心10±5min，得到初级沉淀物；
[0048] b.将步骤a所得初级沉淀物用三倍于初级沉淀物体积的预冷到-20℃后的丙酮洗涤，用玻璃棒轻轻搅动初级沉淀物，以使该初级沉淀物与丙酮充分接触，以去除多余的三氯乙酸，之后在4±1℃下静置30±10min，以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心10±5min，得到次级沉淀物；
[0049] c.重复步骤b两至三次，将最后一次得到的沉淀物置于超净台中吹至半干状态，得到纯化后的蛋白质样品。
[0050] 其中，在步骤b中，初级沉淀物用预冷后的丙酮洗涤并且于4±1℃下静置30±10min，目的是低温延时处理可以有效去除粗提液中的腐殖质，降低腐殖质对电泳的影响。
[0051] 在步骤c中，最后一次得到的沉淀物不能完全吹干，否则可能影响到后继的溶解。
[0052] 现有技术的生物膜蛋白质提取方法采用先在实验室预先培养或者富集特定的微生物，然后再提取其中蛋白质。因为实验室条件与真实环境在微生物的资源竞争、环境条件、捕食等因素有较大的不同，所以实验室条件下培养的微生物的特性并不能反映其在真实自然条件下的活性与生理机能，故本发明的生物膜蛋白质的提取方法不需要预先培养或富集特定的微生物而直接从微生物生长的真实环境中直接提取蛋白质，属于非培养方式的蛋白质提取方法，其能够适用于提取生物膜中的微生物的蛋白质。发明人经过实验证实，本发明的方法也能够适用于提取活性污泥中的微生物的蛋白质。
[0053] <电泳样品的制备方法>
[0054] 本发明的电泳样品的制备方法利用经过上述方法提取后的蛋白质制备电泳样品，所得到的电泳样品能够得到清晰的电泳图谱，非常适于电泳分析，其包括如下步骤：
[0055] 取由本发明的生物膜蛋白质的提取方法得到的适量蛋白质样品，加入适量溶解液，超声辅助溶解20±5min，涡旋振荡30min以上，直至肉眼无法观察到蛋白质颗粒为止，使蛋白质完全溶解在溶解液中，以13000±1000rpm的转速于4±1℃下离心30±10min，取上清液得到电泳样品，所得到的电泳样品可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，也可以用双向电泳(two-dimensional electrophoresis)检测。
[0056] 其中，溶解液的配制方法为：称取尿素4.2g，硫脲1.52g，然后使用去离子水定容至10ml即可。溶解液中尿素的浓度为7mol/L，硫脲的浓度为2mol/L。
[0057] 溶解液对经过本发明的生物膜蛋白质的提取方法提取的蛋白质样品的溶解能力强，在超声的助溶作用下，可大大增强蛋白质的溶解效果。
[0058] 以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
[0059] 实施例一
[0060] 本实施例提供了一种生物膜蛋白质的提取方法，包括如下步骤：
[0061] (1)、从蚯蚓生物滤池的滤床内取出带有生物膜的陶粒，用蒸馏水将其上附着的生物膜冲下后，用1mm孔径的筛子筛分以去除杂质颗粒，收集筛下物，以8000rpm的速度于4℃下离心5min以收集生物膜，并将其作为生物膜样品；
[0062] (2)、称取4g生物膜样品至50mL离心管内，加入30mL浓度为0.9％(w/v)的氯化钠溶液(NaCl)，涡旋震荡以洗去微生物胞外的多糖物质，然后以8000rpm的转速于4℃下离心5min，收集沉淀；
[0063] (3)、用1×PBS洗涤步骤(2)所得沉淀，涡旋震荡后，以8000rpm的速度于4℃下离心5min，收集沉淀物；
[0064] (4)、向盛有步骤(3)所得沉淀物所在的离心管内中加入10mL裂解液，100μL 100mM的苯甲基磺酰氟溶液(PMSF)，将离心管置于冰浴上，用细玻璃棒不断搅动，使生物膜中微生物能与裂解液充分接触；
[0065] (5)、待步骤(4)中的沉淀物分散开后，在冰浴条件下进行超声裂解，超声强度为250-300W，每次超声处理20s后停顿10s，进行20次，直至液体均匀后停止超声，得到样品裂解液；
[0066] (6)、将含有样品裂解液的离心管转入摇床中，以200-300rpm的速度摇动，于4℃下震荡20min，随后以13000rpm的转速在4℃下离心30min；
[0067] (7)、取步骤(6)所得上清液为粗提液，按粗提液与100％(w/v)的三氯乙酸(TCA)体积比为9：1的比例加入100％(w/v)的三氯乙酸，在4℃下静置30min，随后以13000rpm的转速于4℃离心10min，得到初级沉淀物；
[0068] (8)、取步骤(7)中的初级沉淀物，用3倍于该初级沉淀物体积的-20℃预冷后的丙酮洗涤，用玻璃棒轻轻搅动该初级沉淀物，使该初级沉淀物与丙酮充分接触，以便去除多余的三氯乙酸，之后在4℃下静置30min，并以13000rpm的转速于4℃下离心10min，得到次级沉淀物；
[0069] (9)、重复步骤(8)两次，将最后一次得到的沉淀物置于超净台中吹至半干状态，获得纯化后的蛋白质样品。
[0070] 其中，在步骤(2)中，所称取的生物膜样品的质量为4g，实际上，在实施例的方法中，生物膜样品的质量为4-6g均可。
[0071] 在步骤(7)中，100％(w/v)的三氯乙酸的配制方法为：取容量为500g的未开封的TCA瓶，在其内加入227mL去离子水，全部溶解后即成为100％(w/v)的三氯乙酸。
[0072] 实施例二
[0073] 本实施例提供了一种电泳样品的制备方法，包括如下步骤：
[0074] (1)、挑取80mg实施例一所得蛋白质至1.5mL离心管，加入1mL溶解液，置于超声清洗机内，超声辅助溶解20min，随后涡旋震荡30min以上，直至肉眼无法观察到蛋白质固体颗粒为止，使蛋白质完全溶解在溶解液中；
[0075] (2)、将步骤(1)所得溶液以13000rpm的转速在4℃下离心30min，取上清液得到电泳样品。
[0076] 上述的电泳样品进行SDS-PAGE电泳的步骤如下所述：
[0077] 将步骤(2)所得电泳样品稀释2-5倍作为SDS-PAGE电泳的待测样品，所用分离胶的浓度为10％，浓缩胶的浓度为5％，上样量为每孔15-20μL，设置初始电压80V，15min后，调至120V，持续电泳75min，用成像系统进行成像，成像结果如图1所示。图1表明，本发明的蛋白质提取方法能够很好地实现了微生物全蛋白质的获取，使得电泳后的条带清晰，分离效果好。
[0078] 上述的电泳样品进行双向电泳的步骤如下所述：
[0079] <1>.选取pH 4-7的7cm IPG胶条，取步骤(11)所得电泳样品置于水化盘上主动水化12h，然后放入等电聚焦仪中，第一向电泳的参数设置为S1：50V线性30min；S2：500V快速30min除盐；S3：4000V线性3h升压；S4：4000V快速20000Vh聚焦；S5：500V快速任意时间保持。
等电聚焦结束后，进行胶条平衡各10min，随后进行SDS-PAGE电泳(即第二向电泳)，SDS-PAGE电泳凝胶浓度为10％，电压120V持续电泳75min；
等电聚焦结束后，进行胶条平衡各10min，随后进行SDS-PAGE电泳(即第二向电泳)，SDS-PAGE电泳凝胶浓度为10％，电压120V持续电泳75min；
[0080] <2>.电泳结束后将凝胶放入盛有超纯水的染色盘中，加入固定液进行固定30min，可使用摇床进行均匀晃动，转速为40rpm/min；(固定液配方：50％v/v乙醇，10％v/v冰乙酸，其余为水)
[0082] <4>.加入脱色液进行脱色，摇床转速为6040rpm/min，15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止，结果如图2所示。(脱色液配方：25％v/v乙醇，10％v/v冰乙酸，其余为水)
[0083] 从图2中可以看出，蛋白质点分离效果好，分离的蛋白质点清晰，说明该蛋白质提取方法可很好的用于蛋白质后续的分离和鉴定分析，提取方法有效。
[0084] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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