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一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法

阅读：0发布：2020-09-25

专利汇可以提供一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法，属于食品微生物技术领域。该方法是将乳酸菌接种至MRS培养基培养，传代培养两代后为工作液；分别配制不同浓度的胆固醇溶液，氮吹后加入邻苯二甲醛溶液，加入浓H2SO4混匀后，静置测定吸光值，绘制胆固醇标准曲线；将工作液接种至MRS-CHOL-THIO培养基中培养，离心取上清液，依次加入乙醇和氢氧化钾溶液，水浴后冷却至室温，加入正己烷和蒸馏水，振荡后静置分层，取正己烷层氮吹，加入邻苯二甲醛溶液，静置后加入浓硫酸，静置测定吸光值，根据胆固醇标准曲线回归方程计算胆固醇质量浓度，并利用公式计算胆固醇脱除率。该方法简单易行，可准确评价乳酸菌去除胆固醇能力。，下面是一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)将乳酸菌接种至MRS培养基，37℃培养18h后，三区划线于MRS固体培养基上，培养后挑取单菌落于MRS培养基中，传代培养两代后为工作液；
2)分别取质量浓度1mg/mL胆固醇储备液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL加入到干净试管中，60℃氮吹，吹尽溶剂后，加入质量浓度0.5mg/mL的邻苯二甲醛溶液2mL，加入浓H2SO4 1mL，混匀后，在室温静置数分钟后，于波长50nm处测定吸光值，以胆固醇质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线；
3)将步骤1)的工作液接种至MRS-CHOL-THIO培养基中，37℃培养24h后，将菌液离心后取1mL上清液，向上清液中依次加入95％乙醇4mL和质量分数为33％的氢氧化钾溶液3mL，混匀后水浴，迅速冷却至室温，加入正己烷7mL，混匀后加入4mL蒸馏水，漩涡振荡后室温静置至分层，取3mL上层正己烷层，60℃氮吹，挥发尽溶剂，加入质量浓度0.5mg/mL的邻苯二甲醛溶液5mL，混匀后静置10min，加入3mL浓硫酸，混匀后静置10min，测定吸光值，根据胆固醇质量浓度与吸光值的标准曲线回归方程计算胆固醇质量浓度，并利用公式计算胆固醇脱除率，公式如下：
胆固醇脱除率(％)＝(1－C1/C0)×100
式中：C0为初始培养基中胆固醇的质量浓度；
C1为菌株接至MRS-CHOL-THIO培养基培养24h后上清液中胆固醇的质量浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MRS培养基的配方为：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾
2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌
15min，4℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MRS-CHOL-THIO培养基的制备方法为：
在MRS培养基中加入100μg/mL胆固醇、0.25％巯基乙酸钠和0.35g/100mL的胆盐，混匀后，
121℃灭菌20min，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述接种的接种量为3％(m/v)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述接种的接种量为2％(m/v)。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述离心是在4℃、5000rpm下离心
10min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述水浴是在60℃水浴15min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述测定吸光值在波长550nm下进行。

说明书全文

一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法，属于食品微生物技术领域。

背景技术

[0002] 胆固醇在体内有多种生理功能，但摄入量过多会引起血脂过高，引发动脉硬化、冠心病等各种心血管疾病，对人类健康造成一定的威胁。随着近些年心血管疾病发病率的逐年攀升，降胆固醇成为研究热点，受到人们的密切关注，因此研究有效降胆固醇方法尤为重要。

[0003] 乳杆菌作为食品安全微生物，经研究发现有降胆固醇的能力，利用乳酸菌降胆固醇可以避免因药物治疗引发的一些副作用，并且可以治疗由降胆固醇药物引起的肠道菌群失调，在临床应用上有一定的优势，同时，乳酸菌还具有多种益生功能，有益于人类机体健康，其降胆固醇功能受到人们的密切关注，利用乳酸菌降胆固醇可以避免药物治疗带来的副作用，并且可以用于缓解由药物治疗引发的肠道菌群失调，在临床应用上有一定的优势。建立一种快速评价乳杆菌体外去除胆固醇的方法，对于相关益生功能菌株的开发具有重要的意义。

发明内容

[0004] 为解决乳酸菌去除胆固醇的体外评价问题，本发明提供了一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法，采用的方案如下：

[0005] 一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法，该方法包括如下步骤：

[0006] 1)将乳酸菌接种至MRS培养基，37℃培养18h后，三区划线于MRS固体培养基上，培养后挑取单菌落于MRS培养基中，传代培养两代后为工作液；

[0007] 2)分别取质量浓度1mg/mL胆固醇储备液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL加入到干净试管中，60℃氮吹，吹尽溶剂后，加入质量浓度0.5mg/mL的邻苯二甲醛溶液2mL，加入浓H2SO4 1mL，混匀后，在室温静置数分钟后，于波长50nm处测定吸光值，以胆固醇质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线；

[0008] 3)将步骤1)的工作液接种至MRS-CHOL-THIO培养基中，37℃培养24h后，将菌液离心后取1mL上清液，向上清液中依次加入95％乙醇4mL和质量分数为33％的氢氧化钾溶液3mL，混匀后水浴，迅速冷却至室温，加入正己烷7mL，混匀后加入4mL蒸馏水，漩涡振荡后室温静置至分层，取3mL上层正己烷层，60℃氮吹，挥发尽溶剂，加入质量浓度0.5mg/mL的邻苯二甲醛溶液5mL，混匀后静置10min，加入3mL浓硫酸，混匀后静置10min，测定吸光值，根据胆固醇质量浓度与吸光值的标准曲线回归方程计算胆固醇质量浓度，并利用公式计算胆固醇脱除率，公式如下：

[0009] 胆固醇脱除率(％)＝(1－C1/C0)×100

[0010] 式中：C0为初始培养基中胆固醇的质量浓度；

[0011] C1为菌株接至MRS-CHOL-THIO培养基培养24h后上清液中胆固醇的质量浓度。

[0012] 优选地，所述MRS培养基的配方为：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。

[0013] 优选地，所述MRS-CHOL-THIO培养基的制备方法为：在MRS培养基中加入100μg/mL胆固醇、0.25％巯基乙酸钠和0.35g/100mL的胆盐，混匀后，121℃灭菌20min，4℃保存备用。

[0014] 优选地，步骤1)所述接种的接种量为3％(m/v)。

[0015] 优选地，步骤1)所述接种的接种量为2％(m/v)。

[0016] 优选地，步骤3)所述离心是在4℃、5000rpm下离心10min。

[0017] 优选地，步骤3)所述水浴是在60℃水浴15min。

[0018] 优选地，步骤3)所述测定吸光值在波长550nm下进行。

[0019] 本发明的有益效果：

[0020] 本发明提供了一种乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法，该方法简单易行，可以准确评价乳酸菌去除胆固醇的能力。附图说明

[0021] 图1为胆固醇标准曲线。

[0022] 图2为实验菌株胆固醇脱除率。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

[0024] 实施例1：

[0025] 一、材料与方法

[0026] 1、MRS培养基

[0027] 用于培养乳酸菌，培养基的配方如下：蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，柠檬酸氢二铵2.6g，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL；MRS培养基的制备方法为：按照上述配方准确称取上述试剂定容于1000mL蒸馏水中，混匀后，pH调至5.8，121℃灭菌15min，4℃保存备用。

[0028] 2、MRS-CHOL-THIO培养基

[0029] 在MRS培养基中加入100μg/mL胆固醇、0.25％巯基乙酸钠和0.35g/100mL的胆盐，混匀后，121℃灭菌20min，4℃保存备用。

[0030] 3、0.5mg/mL邻苯二甲醛溶液

[0031] 准确称取0.05g邻苯二甲醛，定容于100mL冰醋酸中，避光4℃保存备用。

[0032] 4、胆固醇储备液

[0033] 准确称取胆固醇标准品0.05g定容于50mL无水乙醇中，即1mg/mL胆固醇溶液，置于4℃保存备用。

[0034] 二、乳酸菌去除胆固醇的体外评价方法

[0035] 1、分别取25株乳酸菌，以3％的接种量接种至MRS培养基，37℃培养18h后，三区划线于MRS固体培养基上，培养后挑取单菌落于MRS培养基中，传代培养两代后为工作液，工作液与80％无菌甘油以3:1比例保种，-80℃保存备用。

[0036] 2、分别取质量浓度1mg/mL胆固醇储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL加入到干净试管中，60℃氮吹，吹尽溶剂后，加入质量浓度0.5mg/mL的邻苯二甲醛溶液2mL，缓慢加入浓H2SO4 1mL，混匀后，在室温静置数分钟后，于波长50nm处测定吸光值。以胆固醇质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制胆固醇标准曲线。

[0037] 胆固醇标准曲线如下图1所示，线性回归方程为：y＝0.0074x+0.0044，相关系数R2＝0.9951，说明线性关系较好，标准曲线可用于胆固醇浓度测定。

[0038] 3、将2乳酸菌活化两代后的工作液以2％的接种量接种至MRS-CHOL-THIO培养基中，37℃培养24h后，分别将菌液于4℃，5000rpm离心10min，取1mL上清液于干净试管中，依次加入95％乙醇4mL和质量分数为33％的氢氧化钾溶液3mL，混匀后，60℃水浴15min，迅速冷却至室温，加入正己烷7mL，混匀后加入4mL蒸馏水，漩涡振荡后室温静置至分层。取3mL上层正己烷层，60℃氮吹，挥发尽溶剂，加入质量浓度0.5mg/mL的邻苯二甲醛溶液5mL，混匀后静置10min，缓慢加入3mL浓硫酸，混匀后静置10min，于波长550nm处测定吸光值。根据胆固醇质量浓度与吸光值的标准曲线回归方程计算胆固醇质量浓度，并利用公式计算胆固醇脱除率。公式如下：

[0039] 胆固醇脱除率(％)＝(1－C1/C0)×100

[0040] 式中：C1为菌株接至MRS-CHOL-THIO培养24h后上清液中胆固醇的质量浓度；C0为初始培养基中胆固醇的质量浓度。

[0041] 三、胆固醇脱除率比较

[0042] 以25株乳酸菌为研究对象，包括干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、乳明串珠菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌。利用邻苯二甲醛法测定菌株对胆固醇的脱除率。结果如图2所示。

[0043] 由图2可以看出，25株乳酸菌均有一定的降胆固醇能力，但对胆固醇的脱除率各不相同。胆固醇脱除率反映了菌株体外降胆固醇能力，脱除率越大说明菌株体外降胆固醇能力越强。其中，胆固醇脱除率小于20％的有5株菌；胆固醇脱除率在20％-30％之间的有11株菌，占25株菌中比重相对较大；胆固醇脱除率在30％-40％之间的有6株菌；胆固醇脱除率大于40％的有3株菌，分别为植物乳杆菌TD109、植物乳杆菌TD113、嗜酸乳杆菌NCFM，胆固醇脱除率分别为47.89±5.59％、43.39±5.92％、40.63±3.92％。可以选取胆固醇脱除率最高的植物乳杆菌TD109作为后续实验研究对象。

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