技术领域
[0001] 本
发明涉及海洋
微生物的应用技术，具体涉及一种海洋
真菌裂殖壶菌SD116菌株及利用其高密度发酵生产DHA的方法。
背景技术
[0002] 二十二
碳六烯酸(DHA)是一种重要的ω-3多不饱和
脂肪酸，具有促进脑细胞发育、降血脂、保护视
力、抗癌和提高免疫力等重要生理功能，广泛应用在婴幼儿食品及医药行业。另外，DHA还是多种
海水鱼类生长发育所需的必需脂肪酸，可以提高鱼苗的成活率和降低白化病的得病率。
[0003] 生产DHA的传统原料主要为鱼油，但通过鱼油生产DHA存在以下不足：(1)鱼油资源有限，产量不稳定，鱼油产量及品质
波动很大，远远不能满足市场需求。(2)鱼油中DHA含量不高，仅占7％～14％，且很难与大量的EPA和其它结构类似的高度不
饱和脂肪酸分离(3)纯化工艺复杂，生产成本较高，产品得率低。在实际生产过程中，ω-3多不饱和脂肪酸被氢化饱和，降低了其在鱼油中的含量，造成了原料的浪费，也损害了DHA和EPA的品质(4)鱼油易于
氧化，难以应用于
食品添加剂行业。由于鱼油含有很重的且难闻的鱼腥味，即使经过复杂的提纯工艺也难以除去，限制了这类DHA的应用范围。(5)基于DHA等ω-3多不饱和脂肪酸的市场需求的不断增加，将会导致过量捕捞行为的出现，不利于环境资源的保护。因此，寻找DHA商业化生产的替代来源受到了广泛关注。近年来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA 的研究，常用的微生物包括裂殖壶菌、隐甲藻等。 [0004] 裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.)是一种海洋真菌，属于Chromophyta界，Heterokonta ，Thraustochytrialcs目，Thraustochytriaceae科，A urantiochytrium 属。裂殖壶菌具备生长快、抗逆性强、脂类含量高等特点。此外，在它的脂肪酸中C14:0，C16:0，C22:5(DPA)，C22:6(DHA).占总脂肪酸含量的90％左右，具有很高的营养价值并且相对容易分离。
[0005] 目前国内利用裂殖壶菌制备DHA油脂的
专利主要有五篇。其中，专利CN00135338.1，CN200410075426.X，CN200610028869.2和CN 200910061419.7采用简单的培养方法和培养条件的优化，导致生物量均不高，最高仅为42.5g/L，没有实现真正意义上的高密度发酵。专利CN200910033869.5实现了较高的发酵密度，产量达到了70g/L，但细胞内积累的油脂含量不高，仅为31.5g/L。为了使微生物来源的DHA油脂形成明显的价格优势，获得DHA的高产菌株及发酵工艺，获得较高的生物量和油脂含量，是海洋微生物发酵生产DHA工业化推广的关键。
发明内容
[0006] 针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种自主筛选、高产DHA油脂的裂殖壶菌以及利用这种裂殖壶菌高密度发酵生产DHA油脂的方法。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008] 一种裂殖壶菌，其分类命名为裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp)，实验室命名为裂殖壶菌SD116菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：6208，保藏日期2012年6月12日。
[0009] 所述裂殖壶菌是从广东电白水东湾红树林地区收集的腐叶上采用松花粉垂钓法分离得到。通过培养，在光学
显微镜下观察形态及结构发现(图1)：SD116菌体为圆球形或椭球形，直径在5～20微米，胞内有明显的颗粒状物质，细胞主要采用分裂方式进行繁殖。有侧生不等长的双鞭毛。细胞生长前期分裂旺盛，呈现二分裂、四分裂，连在一起。 [0010] 通过培养，提取油脂进行脂肪酸成分检测。从结果中可以看出其主要的长链多不饱和脂肪酸为二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，其中DHA总脂肪酸的含量在
40％左右。饱和脂肪酸主要为十四烷酸和
十六烷酸。因此，该菌脂肪酸组成简单，DHA含量高，具有很好的DHA生产能力。
[0011] 裂殖壶菌Aurantiochytrium sp.SD116菌株具有广盐性，能在0～60g/L的盐浓度下午长，最适盐浓度为10g/L～20g/L；该菌株有嗜酸特性，能在pH4～7范围内生长；此外，该菌株的最适生长
温度为15℃～30℃。
[0012] 一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，以CGMCC No：6208菌株为出发菌株，在液体培养基中高密度发酵，分离得到菌
体细胞，将菌体细胞经
破碎、萃取、精制获得富含DHA的油脂。
[0013] 优选的是，所述高密度发酵方法包括如下步骤：
[0014] ①将保存在甘油管的菌株接入装有50ml
种子培养基的250ml摇瓶中，在20～30℃的遥床中，以150～200rpm的转速，培养24～48h，获得一级种子；
[0015] ②将一级种子接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在20～30℃的遥床中，以150～200rpm 的转速，培养24～48h，获得二级种子；
[0016] ③将二级种子液接入装有发酵培养基的
发酵罐中，接种量2～10％(v/v)，通气量0.2～2vvm，搅拌转速200～800rpm，罐温20～30℃，pH 6～7，发酵生产DHA油脂。 [0017] 优选的是，所述种子培养基中，碳源含量为30～60g/L，氮源含量为10～20g/L，
溶剂为
海水和蒸馏水(1∶1，w/w)的混合物。
[0018] 优选的是，所述碳源为
葡萄糖、甘油、果糖、木糖、
蔗糖、麦芽糖、糖蜜、
淀粉糖化液或木质
纤维素糖化液；所述氮源为有机氮源或无机氮源，所述有机氮源为
酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、生肉浸膏、大豆蛋白、谷
氨酸钠或尿素，所述无机氮源为
氯化铵、
硫酸铵、
硝酸铵、硝酸钠、
氨水或硝酸
钾。
[0019] 优选的是，所述发酵培养基中包含如下组分：葡萄糖20～60g/L，酵母提取物5～30g/L，蛋白胨5～20g/L，
磷酸二氢钾0.5～8g/L，
硫酸镁0.5～5g/L，
柠檬酸钠0.5～
5g/L，海水晶5～30g/L，维生素B130～200mg/L，维生素B630～200mg/L，维生素B125～
50mg/L，生物素2～50mg/L。
[0020] 优选的是，所述步骤③中，采用柠檬酸和氨水调节pH 值，所述柠檬酸的浓度为5～20％(w/v)，所述氨水的浓度为5～30％(w/v)；所述发酵步骤还包括补糖操作，保证葡萄糖的浓度为20～60g/L；所述发酵时间为80～110h，发酵结束时葡萄糖浓度不高于
10g/L。
[0021] 优选的是，所述分离方法为离心、过滤或絮凝；所述破碎方法为
挤压破壁或酶解法破壁；所述萃取、精制步骤为利用非极性溶剂回收含DHA的粗油，将所述粗油精炼得到DHA油脂
[0022] 优选的是，所述非极性溶剂为正己烷或正己烷-
乙醇的混合溶剂。 [0023] 优选的是，所述步骤③发酵的方式为分批发酵、补料-分批发酵、连续发酵或半连续发酵
[0024] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种自主筛选的裂殖壶菌高产菌株，并提供了一种利用这种裂殖壶菌高密度生产高产DHA的方法。本发明从元素供应和发酵控制
角度优化菌株发酵条件，实现高密度发酵，最终得到的细胞干重为70.43g/L，获得生物油脂50.1g/L，DHA含量为17.5g/L，占总脂肪酸含量高于35％，且含有β-胡萝卜素，虾青素和角鲨烯 生物活性物质。与专利CN200910033869.5中31.5g/L的油脂含量相比，生物油脂和DHA的产量均提高了将近60％，这将大大提高海洋微生物来源DHA的价格优势，进一步推动海洋微生物发酵生产DHA的工业化
进程。
附图说明
[0025] 图1是裂殖壶菌SD116菌株在显微镜下的形态，a为
光学显微镜下观察，b为透射电锐观察，c为扫描电镜观察；
[0026] 图2是裂殖壶菌SD116菌株批次补料实验结果。
具体实施方式
[0027] 下面结合附图和
实施例对本发明做进一步的说明。具体实施例包括三个部分： [0028] I、裂殖壶菌SD116菌株培养基成分的优化(实施例1，实施例2)； [0029] II、裂殖壶菌SD116菌株发酵条件的优化(实施例3，实施例4)；
[0030] III、裂殖壶菌SD116菌株的发酵试验结果(实施例5)。
[0031] 实施例1：不同碳源和碳源浓度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响 [0032] 在250ml的三角摇瓶中，配置50ml培养基，氮源为酵母提取物20g/L，
盐度为15，分别加入不同的碳源(甘油、葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉)，浓度为60g/L，调pH值为6.0，高压灭菌后，接入5ml预培养的菌种种子液，在空气浴
振荡器上25℃振荡培养5天，振荡转速为180rpm。离心收集菌体，
冷冻干燥至恒重，测其干重；取部分菌体，按常规的氯仿-甲酵法提取油脂并甲脂化，通过GC-MS测定菌体中DHA的百分含量，结果见表1 [0033] 确定碳源种类后，设计不同的碳源浓度，并考察裂殖壶菌SD116菌株的生长情况，分析方法同上，结果见表2。
[0034] 表1不同碳源对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响
[0035]
[0036] 由结果得出，葡萄糖、甘油和果糖是比较理想的碳源。当采用葡萄糖为碳源时，细胞的生物量、油脂含量及DHA含量均达到最大，分别为27.65g/L，54.6％和44.6％。 [0037] 根据实验结果，采用葡萄糖为最优碳源，分别配置不同的浓度15g/L，30g/L，60g/L，90g/L，120g/L和150g/L，研究浓度对SD116菌株生长及油脂积累的影响。 [0038] 表2不同葡萄糖浓度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响 [0039]
[0040] 由表2可以看出，当葡萄糖浓度小于120g/L时，不会抑制SD116菌株的生长，最 葡萄糖浓度为60～90g/L，此时，裂殖壶菌SD116的生物量及油脂含量都明显高于其他组别
[0041] 实施例2：不同氮源及氮源浓度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响 [0042] 在250ml的三角摇瓶中，配置50m培养基，采用葡萄糖为碳源，浓度60g/L，盐度为15，分别加入浓度为20g/L的有机氮源(酵母提取物、蛋白胨和胰蛋白胨)和5g/L的无机氮源(尿素、
醋酸铵和硝酸钠)，调节pH值为6.0，高压灭菌后，接入5ml预培养的菌种种子液，在空气浴振荡器上25℃振荡培养5天，振荡转速为180rpm。分析方法同上，实验结果见表3。
[0043] 表3不同氮源对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响
[0044]
[0045] 由表3可知，酵母提取物和蛋白胨能较好的促进SD116菌株生长和油脂积累，并且采用酵母提取物为氮源时，细胞内获得的DHA含量较高达到总脂肪酸的43.3％。 [0046] 分别设计不同的酵母提取物浓度(5g/L，10g/L，15g/L，20g/L和25g/L)，检测其对SD116菌株生长及油脂积累的影响。结果见表4。
[0047] 表4不同酵母提取物浓度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响 [0048]
[0049] 从表4可以得出结论，浓度为15～20g/L的酵母提取物可以促进裂殖壶菌SD116的生长和油脂积累。
[0050] 实施例3：不同温度和盐度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响 [0051] 裂殖壶菌的生长和油脂积累会受到温度和盐度的影响。实验采用优化的碳源、氮源和浓度，设计不同温度(20～37℃)和盐度(0～60)，实验方法和分析方法同以上实施例。
[0052] 表5不同温度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响
[0053]
[0054]
[0055] 从表5可以看出，温度越低，裂殖壶菌SD116菌株的DHA含量越高，说明低温有利于DHA的积累；当温度在25～28℃时，SD116菌株的生长量最大，达到了29.56g/L，但当温度高于30℃时，裂殖壶菌的生物量和油脂含量均迅速下降。
[0056] 表6不同盐度对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响
[0057]
[0058] 从表6可以看出，裂殖壶菌SD116菌株具有广盐性。它甚至能在
淡水中生长(生物量10.1g/L)；其中最适宜的盐度为15，此时生物量达到28.2g/L，胞内油脂含量为53.9％，DHA含量为40.2％。
[0059] 实施例4：不同pH值对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响 [0060] 在250ml的三角瓶中加入浓度为60g/L的葡萄糖和20g/L的酵母提取物，控制盐度为15，分别调PH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0，以找出最适合该菌生长及DHA积累的pH值。高压灭菌后，接入5ml预培养的种子液，按实施例1中所述的方法进行测定。 [0061] 表7不同pH值对裂殖壶菌SD116菌株生长和油脂积累的影响
[0062]
[0063] 从表7可以看出，该菌能适应较宽范围的pH环境，但接近中性的pH值利于细胞的生长和DHA的积累。最优pH为6.0～7.0之间，此时生物量达到29g/L，胞内油脂含量约为50％，DHA含量大于43％。
[0064] 实施例5：裂殖壶菌SD116菌株的批次补料发酵试验
[0065] 将保存在甘油管的菌株接入装有50ml种子培养基的250ml摇瓶中，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养24～48h，获得一级种子；将一级种子接入装有100ml种子培养基的500ml摇瓶中，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养
24～48h，获得二级种子；
[0066] 向5L
生物反应器中加入3.5L经过优化的培养基，接入活化的二级种子液，接种量为10％。发酵过程中，前72小时温度保持在28℃，然后下降到20℃，并在该温度下培养30小时。通过搅拌转速(从300～800rpm)和通气比(1.2～2.0vvm，vvm为每分钟单位培养基内通入的空气量)联动，使发酵液中溶解氧保持在20％以上。自动添加2M NaOH或14％柠檬酸使pH值保持在6.5。
[0067] 发酵结束后，5L发酵罐获得裂殖壶菌的产量为70.43g/L，获得生物油脂50.1g/L，DHA含量为17.5g/L(图2)。
