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细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6的新应用

阅读:757发布:2020-06-02

专利汇可以提供细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6的新应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6的新应用,具体公开的是GmEXPB6基因在促进豆科 植物 生物 固氮、提高氮效率方面的新应用。通过定量PCR结果, 发明人 克隆了一个低磷增强、根瘤高表达的基因GmEXPB6,并证明了GmEXPB6基因编码的蛋白具有促进根瘤膨大、提高根瘤固氮酶活性等功能,过表达GmEXPB6最终提高了转基因复合植株根瘤固氮效率及生物量;发明人的研究将为包括大豆在内的 农作物 氮高效和高产分子育种提供基因资源,以及对发展环境友好型 可持续农业 具有重要的理论和实践意义。,下面是细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6的新应用专利的具体信息内容。

1.细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6在促进豆科植物生物固氮、提高氮效率方面的新应用。
2.根据权利要求1所述的新应用,其特征在于,所述细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6在豆科植物根瘤快速膨大时期表达,并定位于根瘤原基、根瘤皮层、薄壁细胞和成熟维管束
3.根据权利要求1所述的新应用,其特征在于,与大豆转基因复合植株对照相比,过量表达GmEXPB6显著增加了有效根瘤数量和有效根瘤重量,并且显著提高了有效根瘤固氮酶活性,促进了根瘤膨大。
4.根据权利要求1所述的新应用,其特征在于,与大豆转基因复合植株对照相比,过量表达GmEXPB6显著促进了大豆转基因复合植株生长,增加了氮/磷含量和生物量。

说明书全文

细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6的新应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因的新应用,具体涉及细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6在促进豆科植物生物固氮、提高氮效率方面的新应用,属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 氮是植物体内基酸、蛋白质和核酸等的重要组成成分,是植物生长发育所必需的大量营养元素之一。随着农业生产的发展,氮肥的施用量急剧增加。据研究报道,施用氮肥是我国农田土壤氮素来源的主要途径,而植物对氮肥的平均利用率仅40%左右,大部分氮肥被释放到大气或流失到体中,出现增肥不增产的现象(邱建军等,2012)。由于氮肥的大量投入,不仅增加了农业成本、浪费资源,而且会引起水体富营养化,对生态环境构成严重威胁(Vitousek et al.,1997;Giles,2005)。因此,提高植物氮效率,挖掘植物自身的固氮能,是农业生产中解决植物氮素需求的重要途径。
[0003] 豆科植物与根瘤菌所形成的共生固氮是已知固氮形式中效率最高、固氮量最多的一个体系,在农业生产中发挥着重要的作用(Herridge et al.,2008;Liu et al.,2011)。研究发现,接种根瘤菌可提高豆科作物固氮能力,改善氮营养,促进根系生长,最终提高作物产量(Ferreira et al.,2009)。在美国、巴西等大豆主产国,接种根瘤菌已成为大豆增产的主要措施之一,并进行了大面积的推广和应用,而我国将根瘤菌接种技术应用于农业生产,也取得了良好的效益(汤复跃等,2011;Mendes et al.,2003;Sogut,2006;de Freitas et al.,2012)。根瘤是根瘤菌侵染豆科植物根系所形成的共生器官,亦是生物固氮的场所。因此,根瘤的生长发育对提高豆科植物的氮效率至关重要。已有研究表明,豆科植物会诱导结瘤相关基因的表达进而正调控根瘤的发育过程。过量表达大豆的α受体蛋白激酶1,GmNFR1α,能够增加大豆根瘤数及植株氮含量(Indrasumunar et al.,2011);干涉参与根瘤发育相关基因的表达,会严重抑制结瘤反应,降低根瘤重量及固氮效率(Libault et al.,2010;Kim and Nam,2013;Kim et al.,2013)。说明在农业生产中,可通过遗传学和分子生物学方法分离并克隆控制根瘤生长发育的重要基因,研究其在提高氮利用效率方面的分子机制,通过改变这重要基因的表达进而使植物在较低氮肥水平下保持较高的产量,对生态农业的可持续发展具有深远意义。
[0004] 大豆(Glycine max(L.)Merr)是世界范围内重要的粮食、油料、饲料能源作物。在农业生产中,大豆可以与根瘤菌互利共生形成根瘤,由于根瘤具有生物固氮功能,从而为作物生长提供氮源,充分发挥豆科植物的生物固氮能力,可降低了氮肥投入(Hamdi et al.,1974),对发展环境友好型可持续农业具有重要的实践意义。
[0005] 豆科植物如大豆(Glycine max)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、百脉根(Lotus japonicus)等主要形成有限型根瘤。这类根瘤的原基起始于根系外皮层细胞,没有永久的分生组织,在根瘤发育早期细胞分裂活性消失,因而,根瘤器官的膨大主要依靠细胞的扩张及伸长生长。细胞壁是决定植物细胞状态和限制各种细胞活动的重要结构,细胞壁扩张是植物形态建成的一个重要决定因素,而细胞壁扩张蛋白是一类细胞壁松弛蛋白,可通过打断细胞壁纤维素与半纤维素的非共价键诱导细胞增大。目前,扩张蛋白在根瘤发育方面的研究报道较少,只有两篇文献较详细的阐明了其在豆科植物结瘤过程中的生物学功能。三叶草α-扩张蛋白,MaEXP1,主要定位于根瘤膨胀时的外周皮层细胞,该基因在接种根瘤菌数小时后上调表达,到20天时表达量最高,表明MaEXP1可能参与了三叶草根瘤的生长发育过程(Giordano and Hirsch,2004);通过蛋白印迹及免疫定位的方法,发现在豌豆根瘤质外体及侵染线细胞壁中存在有相关的扩张蛋白(Sujkowska et al.,2007)。然而到目前为止,关于扩张蛋白参与调控大豆根瘤器官膨大的相关研究尚未见报道。

发明内容

[0006] 基于上述研究背景,在大豆基因组测序完成的基础上,发明人通过同源比对确定了大豆的β-扩张蛋白成员。通过定量PCR结果,发明人克隆了一个低磷增强、根瘤高表达的基因GmEXPB6,并证明了GmEXPB6基因编码的蛋白具有促进根瘤膨大、提高根瘤固氮酶活性等功能,过表达GmEXPB6最终提高了转基因复合植株根瘤固氮效率及生物量。
[0007] 发明人的研究将为包括大豆在内的农作物氮高效和高产分子育种提供基因资源。
[0008] 本发明的有益之处在于:此项研究对增加包括大豆在内的农作物根瘤数量和重量、提高植株氮含量及转基因植株的生物量具有重要意义,对发展环境友好型可持续农业也具有重要的实践意义,同时也为高产分子育种提供了基因资源。附图说明
[0009] 图1为GmEXPB6基因表达模式分析;
[0010] 图2为GmEXPB6启动子驱动GUS表达部位的解剖分析;
[0011] 图3为过量、干涉GmEXPB6在高、低磷处理下的表达量检测;
[0012] 图4为过量、干涉GmEXPB6对大豆转基因复合植株结瘤的影响;
[0013] 图5为过量表达GmEXPB6对大豆转基因复合植株生长和氮/磷含量的影响。

具体实施方式

[0014] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[0015] 一、GmEXPB6基因表达模式分析
[0016] 在已公布的大豆基因组数据库中,通过同源比对,预测出大豆细胞壁扩张蛋白家族共有9个成员,通过定量PCR技术,确定GmEXPB6基因为根瘤中强表达的基因。GmEXPB6基因的开放阅读框长度为834bp,编码278个氨基酸的蛋白,属于β类细胞壁扩张蛋白。现有的研究表明,该基因与结瘤膨大密切相关,首先分析了其表达模式。
[0017] 大豆种子HN66用3%(v/v)H2O2表面消毒一分钟,在1/2全营养液润湿的石英砂中催芽萌发5天,继而将幼苗接种根瘤菌1小时后转移到低氮(氮素:530μM NH4NO3+KNO3+Ca(NO3)2·4H2O)营养液中并进行高磷(HP:500μM KH2PO4)、低磷(LP:5μM KH2PO4)处理。分别收获处理第7天的根瘤,第18天的根、茎、叶、花及处理第29天的豆荚和种子并抽提RNA。对于比较分析GmEXPB6在不同生长时期根瘤中的表达量,收获接种根瘤菌后第4天的根系、第7、14、21、30、40天的根瘤及非接种根瘤菌的第7天根系,并抽取相应部位的RNA,反转录成cDNA,进一步用定量PCR检测GmEXPB6的表达模式。大豆的看家基因EF-1a作为内参。用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为:
[0018] 大豆EF-1a基因的引物为:
[0019] EF-1a F:5’-TGCAAAGGAGGCTGCTAACT-3’(SEQ ID NO:1)
[0020] EF-1a R:5’-CAGCATCACCGTTCTTCAAA-3’(SEQ ID NO:2)
[0021] GmEXPB6基因的引物为:
[0022] GmEXPB6F:5’-TATGACTCGGGCAAAGGGTGTG-3’(SEQ ID NO:3)
[0023] GmEXPB6R:5’-TGACCTGAAACTGCCATTGCTCC-3’(SEQ ID NO:4)
[0024] 定量PCR反应程序为:将RNA样品反转录所得cDNA稀释50倍作为定量PCR反应模板。选取适量cDNA原液做梯度稀释为标准曲线的模板。试验中采用20μL反应体系,包括:10μL的2×SYBR Green PCR master mix,各0.6μL的10μM正反向引物,2μL稀释的cDNA,最后用Mili-Q水补至20μL。
[0025] 定量PCR反应条件为:95℃变性1分钟,然后94℃裂解15秒,60℃结合15秒,72℃延伸30秒并进行40次循环。
[0026] 用Rotor-Gene的Real-Time Analysis Software 6.0计算每个样品的表达量。
[0027] 图1为GmEXPB6基因表达模式分析。其中:
[0028] 图1(A)为GmEXPB6在不同组织中的表达;
[0029] 图1(B)为GmEXPB6在不同发育时期根瘤中的表达。
[0030] 图中数据是3个生物学重复的平均值和标准误差。
[0031] 结果表明:
[0032] (1)GmEXPB6在根瘤中的表达量最高,其次在茎,根及花中有少量表达,而叶、豆荚和种子中检测不到GmEXPB6mRNA的积累[图1(A)]。说明该基因与根瘤的形成与发育有关。
[0033] (2)收获高、低磷处理下不同发育时期的根瘤,并对该基因进行表达量检测分析,发现:随着根瘤的生长发育,GmEXPB6的表达在高、低磷条件下均有先增加后降低的趋势,且低磷增强其表达;在根瘤生长到第14天时表达量达到最大值,但随着根瘤的生长时间的延长,其表达量逐渐降低,当根瘤生长到第40天时,几乎检测不到该基因的表达[图1(B)]。GmEXPB6参与了根瘤的器官发育过程。
[0034] 二、GmEXPB6基因的克隆
[0035] 首先,以大豆根瘤cDNA为模板,用上游特异引物和下游特异引物扩增GmEXP6包含ORF(834bp)在内的884bp长度(包含UTR)的片段。其中,
[0036] 上游特异引物为:
[0037] 5’-AGCTTATGGCTCTTACACCTCAACGTGC-3’(SEQ ID NO:5)
[0038] 下游特异引物为:
[0039] 5’-ACGCGTTTGGGTAGCTACACCCTACAGGCT-3’(SEQ ID NO:6)。
[0040] 然后,测序比对,获得GmEXPB6编码序列。
[0041] 三、GmEXPB6基因启动子克隆、载体构建及组织表达定位分析
[0042] 启动子分析表达载体的构建:按照常规方法,提取大豆叶片或根部基因组DNA,以大豆基因组DNA为模板,用上游特异引物和下游特异引物扩增GmEXPB6启动子2323bp片段,PCR片段回收测序无误后,通过PstⅠ和Bgl II对回收片段及目的载体进行双酶切后,将GmEXPB6基因连接到目的载体pCAMBIA3301。其中,
[0043] 上游特异引物为:
[0044] 5’-CTGCAGCACTGAACACAAAGGAGGGGATT-3’(SEQ ID NO:7)
[0045] 下游特异引物为:
[0046] 5’-AGATCTGTAAGAGCCATGTTATCACAGCCAC-3’(SEQ ID NO:8)。
[0047] 对于GmEXPB6组织表达定位分析,通过农杆菌介导的大豆下胚轴注射转化法获得转基因毛状根后,将主根剪掉,保留从愈伤组织处长出来的毛状根,将毛状根浸泡在根瘤菌菌液中1小时后移入水培,水培营养液全为上述低氮处理。根系生长一周后,开始有根瘤出现时。为确定GmEXPB6基因在大豆根瘤生长不同阶段的组织表达部位,分别收获接种根瘤菌处理4、7、14、21和30天的根瘤进行GUS染色分析,基因表达的组织定位可进一步通过石蜡切片进行观察。
[0048] 参见图2,GmEXPB6启动子驱动GUS的表达部位分析,其中:
[0049] 图2(A)为体式显微镜下观察根瘤中不同发育时期的GUS染色图,标尺为100μm;
[0050] 图2(B)、(C)、(D)、(E)分别为GmEXPB6启动子驱动GUS的转基因根瘤第4天、第14天、第14天、第30天的切片图,标尺为100μm;
[0051] 图2(F)为第14天根瘤的切片的放大图,标尺为100μm。
[0052] NP代表根瘤原基;NVB代表根瘤维管束;Pa代表薄壁细胞;EN代表皮层细胞。
[0053] 结果表明:
[0054] (1)GmEXPB6在不同生长时期的根瘤中均有表达[图2(A)]。
[0055] (2)GmEXPB6主要在根瘤原基、皮层细胞、薄壁细胞及维管束中定位[图2(B)至图2(F)]。
[0056] 四、过量、干涉表达GmEXPB6载体构建
[0057] 过量表达载体的构建:以大豆根瘤cDNA为模板,用上游特异引物和下游特异引物扩增GmEXPB6包含ORF(834bp)在内的884bp长度(包含UTR)的片段,PCR片段回收测序无误后,通过HindⅢ和MluⅠ对片段及目的载体进行双酶切后,将GmEXPB6基因连接到目的载体pYLRNAi。其中,
[0058] 上游特异引物为:
[0059] 5’-AGCTTATGGCTCTTACACCTCAACGTGC-3’(SEQ ID NO:5)
[0060] 下游特异引物为:
[0061] 5’-ACGCGTTTGGGTAGCTACACCCTACAGGCT-3’(SEQ ID NO:6)。
[0062] 干涉载体的构建:以大豆根瘤cDNA为模板,用上游特异引物和下游特异引物扩增442bp目的片段,用BamHⅠ和HindⅢ分别酶切PCR产物和目的载体pYLRNAi,回收442bp产物纯化后连接载体,转化大肠杆菌Top10F’(由刘耀光研究员实验室惠赠,具体描述见文献:Wang et al.,2006,The Plant Cell),测序无误后,用上游特异引物和下游特异引物扩增反向片段,用PstⅠ和MluⅠ双酶切反向片段和带有正向片段的载体后,将反向片段连接到包含有正向片段的目的载体pYLRNAi中,转化大肠杆菌DH10B,测序无误后转化发根农杆菌K599(由澳大利亚昆士兰大学豆科综合研究中心惠赠,保存于华南农业大学根系生物学研究中心实验室,具体描述见文献Kereszt A,et al.,2007),用于农杆菌介导的大豆下胚轴注射法进行毛根转化。其中,
[0063] 上游特异引物为:
[0064] 5’-GGATCCCGTGCATTATCTCAACTACCCATCC-3’(SEQIDNO:9)
[0065] 下游特异引物为:
[0066] 5’-AAGCTTTCTCATCTTGACCTGAAACTGCCA-3’(SEQIDNO:10)。
[0067] 五、大豆转基因复合植株的获得
[0068] 将构建好的表达载体质粒(过量/干涉表达载体)转化至发根农杆菌K599中,采用农杆菌介导的大豆下胚轴注射法获得转基因复合植株(根部为转基因毛状根、地上部为非转基因),后续的表型鉴定均使用此株系。空载体对照:按照上述方法,将具有相似骨架的pCAMBIA1305.2(CAMBIA,具体描述见:http://www.cambia.org/)表达载体同样方法转化大豆,获得转空载对照株系(CK)。
[0069] 六、大豆转基因复合植株的检测
[0070] 采取毛状根侧根部分样品并提取RNA,反转录成cDNA。过量、干涉GmEXPB6的转基因毛根筛选标记为潮霉素,可用潮霉素抗性基因(Hyg)检测毛根的真假,而对照株系可用GUS染色方法得以确定。保留一条转基因根系进行接种根瘤菌及高(500μM)、低磷(10μM)处理砂培试验。收获生长7天的根瘤,提取RNA,进一步用定量PCR检测过量表达及干涉的效果,定量PCR试验中以大豆看家基因以上述所述EF-1a为参照基因,相对表达量为目的基因GmEXPB6的表达量与看家基因表达量的比值。
[0071] 定量PCR步骤:
[0072] (1)Hyg基因的引物为:
[0073] Hyg F:5’-GCTGTTATGCGGCCATTGTC-3’(SEQ ID NO:11)
[0074] Hyg R:5’-GACGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’(SEQ ID NO:12);
[0075] 大豆EF-1a基因的引物同上;
[0076] GmEXPB6基因的引物同上。
[0077] (2)反应体系:
[0078] 2×SYBR Green PCR master mix:10μL
[0079] 上游引物.(10μmol/L):0.6μL
[0080] 下游引物.(10μmol/L):0.6μL
[0081] Mili-Q水:补至20μL
[0082] 稀释的cDNA:2μL。
[0083] (3)反应条件:
[0084]
[0085] 经过抗性基因的检测及定量PCR确认得到有效的不同转基因株系。
[0086] 图3为过量、干涉GmEXPB6在高、低磷处理下的表达量检测。
[0087] 其中:
[0088] 图3(A)为PCR检测阳性植株;
[0089] 图3(B)为定量PCR检测GmEXPB6相对表达量(相对表达量为目的基因GmEXPB6的表达量与大豆看家基因EF-1a表达量的比值)。
[0090] Hyg表示载体上潮霉素抗性基因。
[0091] CK表示空载体对照;OX表示过量GmEXPB6转基因复合植株;RNAi表示干涉GmEXPB6转基因复合植株。
[0092] 试验数据是四个生物学重复的平均值和标准误。
[0093] 七、过量、干涉GmEXPB6对大豆转基因复合植株结瘤的影响
[0094] 收获接种根瘤菌50天的不同转基因株系并测定相关生理指标,包括:根瘤干重、根瘤数、根瘤大小和根瘤固氮酶活性等,其中根瘤大小为单个根瘤的干重(根瘤大小=根瘤干重/根瘤数)。生物量:将根部的根瘤摘下计数后,用万分之一天平称取鲜重,所有样品在105℃烘箱杀青30分钟后置于75℃烘干至恒重,称取干重。
[0095] 图4为过量、干涉GmEXPB6对大豆转基因复合植株结瘤的影响。其中:
[0096] 图4(A)为根瘤表型;
[0097] 图4(B)为根瘤数;
[0098] 图4(C)为根瘤干重;
[0099] 图4(D)为根瘤大小;
[0100] 图4(E)为根瘤固氮酶活性。
[0101] 大豆转基因复合植株接种根瘤菌后分别进行高(500μM KH2PO4)低(10μM KH2PO4)磷处理50天。
[0102] CK表示空载体对照;OX表示过量GmEXPB6转基因复合植株;RNAi表示干涉GmEXPB6转基因复合植株。
[0103] 试验数据是四个生物学重复的平均值和标准误。
[0104] 星号表示同一性状在OX或RNAi株系与对照CK株系之间的显著性差异:
[0105] *表示显著水平0.01<ρ≤0.05时,差异显著;
[0106] **表示显著水平0.001<ρ≤0.01时,差异显著性介于显著与极显著之间;
[0107] ***表示显著水平ρ≤0.001时,差异极显著;
[0108] ns:表示差异不显著。
[0109] 结果显示:过表达GmEXPB6在高、低磷条件下,均显著促进了根瘤膨大,增加了有效根瘤数量、有效根瘤干重和根瘤固氮酶活性,而干涉GmEXPB6显著抑制了大豆根瘤膨大,减少了有效根瘤数。
[0110] 八、过量、干涉GmEXPB6对大豆转基因复合植株生长和氮/磷含量的影响[0111] 植株生物量测定:百分之一天平称量地上部和根部样品鲜重,所有样品在105℃烘箱杀青30分钟后置于75℃烘干至恒重,称取干重。
[0112] 植株氮、磷测定:植株氮和磷含量采用连续流动分析仪(型号为SAN++,产自荷兰)测定,首先称取植株样品0.2g左右,加入5mL浓硫酸消解后用蒸馏水定容致50mL,并将样品稀释4倍制成待测液。待测液流经流动分析仪后将比色信号输入电脑,并由Flow Access软件计算结果。
[0113] 植株养分含量用单位植株氮、磷量表示,计算公式为:
[0114] 氮含量(mg/plant)=氮浓度(mg/g)×植株干重(g/plant)
[0115] 磷含量(mg/plant)=磷浓度(mg/g)×植株干重(g/plant)
[0116] 图5为过量、干涉GmEXPB6对大豆转基因复合植株生长和氮/磷含量的影响。其中:
[0117] 图5(A)为植株鲜重增加量;
[0118] 图5(B)为植株氮含量;
[0119] 图5(C)为植株磷含量。
[0120] 大豆转基因复合植株接种根瘤菌后分别进行高(500μM KH2PO4)低(10μM KH2PO4)磷处理50天。
[0121] CK表示空载体对照;OX表示过量GmEXPB6转基因复合植株;RNAi表示干涉GmEXPB6转基因复合植株。
[0122] 试验数据是四个生物学重复的平均值和标准误。
[0123] 星号表示同一性状在OX或RNAi株系与对照CK株系之间的显著性差异:
[0124] *表示显著水平0.01<ρ≤0.05时,差异显著;
[0125] ns表示差异不显著。
[0126] 结果表明:过量表达GmEXPB6由于促进了根瘤膨大,增加了有效根瘤数量,进而促进了高、低磷条件下的植株氮、磷含量和生物量。
[0127] 综上所述,细胞壁扩张蛋白基因GmEXPB6具有调控大豆根瘤器官膨大的功能。过量表达GmEXPB6能够显著增加有效大根瘤的数量和重量,显著提高根瘤固氮酶的活性,最终提高植株氮效率和生物量从而达到节肥高产的效果,对发展环境友好型可持续农业具有重要的理论和实践意义。
[0128] 需要说明的是,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
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