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一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用

阅读:128发布:2020-06-15

专利汇可以提供一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用。本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12,保藏号为CGMCC No.5989。所述哈茨木霉HNA-12可用于抑制病原菌、促进辣椒植株生长、防控辣椒植株发生辣椒疫病。本发明在 可持续农业 发展中应用前景广阔。,下面是一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用专利的具体信息内容。

1.哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12,它的保藏编号为CGMCC No.5989。
2.权利要求1所述哈茨木霉HNA-12在抑制病原菌中的应用;所述病原菌为如下生物中的至少一种:铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)。
3.权利要求1所述哈茨木霉HNA-12在促进辣椒植株生长中的应用。
4.权利要求1所述哈茨木霉HNA-12在防控辣椒植株发生辣椒疫病中的应用。
5.一种产品,它的活性成份为权利要求1所述哈茨木霉HNA-12;所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
(1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
(2)促进辣椒植株生长;
(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
6.权利要求1所述哈茨木霉HNA-12在制备产品中的应用;所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
(1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
(2)促进辣椒植株生长;
(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
7.权利要求1所述哈茨木霉HNA-12的孢子液或发酵物。
8.权利要求7所述孢子液或发酵物的应用,所述应用为如下(1)至(3)中的至少一种:
(1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
(2)促进辣椒植株生长;
(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
9.一种产品,它的活性成份为权利要求7所述孢子液或发酵物;所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
(1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
(2)促进辣椒植株生长;
(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
10.权利要求7所述孢子液或发酵物在制备产品中的应用;所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
(1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
(2)促进辣椒植株生长;
(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。

说明书全文

一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用。

背景技术

[0002] 辣椒疫病是一种发生于辣椒上的毁灭性真菌病害,该病害可以导致不同地区的多种作物发病,引起大量的经济损失。辣椒疫病典型的症状特征:植株被侵染后几天就发生根茎部组织腐烂直至大量植株死亡。到目前为止,生产中还没有对辣椒疫病很好的抗性品种。
[0003] 目前,国内外对辣椒疫病的防治中,化学防治占据重要的地位。化学防治成本较高且易污染环境,而且病原物易对杀菌剂产生耐药性甚至抗药性。所以生物防治逐渐成为人们所关注的焦点和热点。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用。
[0005] 本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12,已于2012年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCC No.5989。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12CGMCC No.5989简称哈茨木霉HNA-12。
[0006] 所述哈茨木霉HNA-12可用于抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)。
[0007] 所述哈茨木霉HNA-12可用于促进辣椒植株生长。
[0008] 所述哈茨木霉HNA-12可用于防控辣椒植株发生辣椒疫病。
[0009] 本发明还保护一种产品,它的活性成份为所述哈茨木霉HNA-12,所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
[0010] (1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
[0011] (2)促进辣椒植株生长;
[0012] (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
[0013] 本发明还保护哈茨木霉HNA-12在制备产品中的应用;所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
[0014] (1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
[0015] (2)促进辣椒植株生长;
[0016] (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
[0017] 本发明还保护所述哈茨木霉HNA-12的孢子液或发酵物。
[0018] 所述孢子液具体可为5×106个孢子/mL的孢子悬浮液。
[0019] 所述发酵物可为固体发酵物或液体发酵物。
[0020] 所述液体发酵物的制备方法具体如下:收集哈茨木霉HNA-12孢子,接种到含有8
种子培养基的发酵罐中,发酵后得到浓度为2.5×10CFU/mL的液体发酵物(种子液);所述发酵的条件为:溶解浓度20%左右,温度28-30℃,搅拌速度200-250r/min,通气量为
10-15L/min。
[0021] 所述种子培养基(pH6.0-6.5)由溶质和组成;所述溶质在种子培养基中的浓度如下:麦麸2g/100mL、葡萄糖1.0g/100mL、硫酸镁0.5g/100mL、磷酸二氢0.3g/100mL、氯化0.3g/100mL。
[0022] 所述固体发酵物的制备方法具体如下:将所述液体发酵物与固体培养基混合均匀6
(每克混合物中含有1.5×10CFU哈茨木霉HNA-12),然后进行发酵,然后干至7-10%,得到固体发酵物;所述发酵的条件为:温度28-30℃,空气相对湿度95-100%,培养基厚度5-7cm,培养时间5-7天。
[0023] 所述固体培养基是将麦麸和稻壳和水混合得到的,麦麸和稻壳的质量比为7:3,固体培养基的含水量为70%左右,pH6.0-6.5;121℃灭菌30min。
[0024] 所述孢子液或所述发酵物的应用,为如下(1)至(3)中的至少一种:
[0025] (1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
[0026] (2)促进辣椒植株生长;
[0027] (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
[0028] 本发明还保护一种产品,它的活性成份为所述孢子液或所述发酵物;所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
[0029] (1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
[0030] (2)促进辣椒植株生长;
[0031] (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
[0032] 本发明还保护所述孢子液或所述发酵物在制备产品中的应用;所述产品为具有如下(1)至(3)中的至少一种功能的产品:
[0033] (1)抑制病原菌;所述病原菌为如下微生物中的至少一种:马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum);
[0034] (2)促进辣椒植株生长;
[0035] (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
[0036] 本发明提供的哈茨木霉HNA-12,经室内对峙拮抗实验、盆栽防治实验和大田防治试验发现,该菌株对多种病原菌(特别是辣椒疫病菌)具有良好的抑菌效果,并且利用木霉菌制剂防治植物病害具有对人畜无毒、产品无农药残留、不污染环境等优点。本发明在可持续农业发展中应用前景广阔。
[0037] 本发明的社会效益:推广应用生物农药可以保护生态环境平衡发展,提高农产品品质及降低农产品中有害物质残留,增强农产品的市场竞争,增加农民收入,进而增强农业生产的可持续性
[0038] 本发明的经济效益:推广应用生物制剂可减少化学农药的使用量,能提高疫病防治效果,降低防治成本;能有效实现农产品安全生产及显著降低农产品农药残留,提升农产品的经济附加值,扩大我国农副产品外销市场;推进绿色产业的发展,增加农民收入具有重要推进作用。附图说明
[0039] 图1为菌株HNA-12的PDA平板培养形态。
[0040] 图2为菌株HNA-12的分生孢子梗及分生孢子。
[0041] 图3为哈茨木霉HNA-12和辣椒疫病菌对峙培养72小时后的照片。
[0042] 图4为哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病菌的重寄生作用。
[0043] 图5为哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病菌的重寄生作用。
[0044] 图6为哈茨木霉HNA-12挥发性代谢物对辣椒疫病菌在平板上的抑制作用。
[0045] 图7为哈茨木霉HNA-12非挥发性代谢物对辣椒疫病菌在平板上的抑制作用具体实施方式
[0046] 以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
[0047] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基):马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂20g,蒸馏水1000ml;121℃灭菌20min后备用。
[0048] 木霉菌半选择性培养基(TSM培养基):MgSO4(7H20)0.2g、K2HPO40.9g、KCl 0.15g、NH4NO31.0g、葡萄糖3.0g、玫瑰红0.15g、60%敌克松可湿性粉剂0.3克、PCNB 0.2g、琼脂20g,蒸馏水950ml;121℃灭菌20min备用。
[0049] 马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans):公众可以从中国农业大学获得;参考文献:Daayf F,Adam L and Fernando WGD(2003)Comparative screening of bacteria for biological control of potato late blight(strainUS-8)using in vitro,detached leaves,and whole plant testing systems.Canadian Journal of Plant Pathology,25:276–284。
[0050] 辣椒疫病菌(Phytophthora capsici):公众可以从中国农业大学获得;参考文献:Ahmed AS,Sanchez CP and Candela ME(2000)Evaluation of induction of systemic resistance in pepper plants(Capsicum annuum)to Phytophthora capsici using Trichoderma harzianum and its relation with capsidiol accumulation.European Journal of Plant Pathology 106:817–824。
[0051] 辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum):公众可以从中国农业大学获得;参考文献:刘丽.刘晓林,刘志恒,等.辣椒根腐病菌生物学特性研究.沈阳农业大学学报,2007,
38(1):54-58。
[0052] 实施例中所用的辣椒品种均为中华红:河北省定州市伯堡蔬菜良种繁育场。
[0053] 实施例中的孢子悬浮液都是收集孢子并重悬于水得到的。
[0054] 实施例1、哈茨木霉HNA-12的获得和鉴定
[0055] 一、菌株HNA-12的获得
[0056] 1、样品采集
[0057] 样品为采集自河南安阳辣椒农作物田间表层根际土壤
[0058] 用取土器材拨开田间3-5cm的表土层,将土壤连同植物的根系一起挖出,用聚乙烯塑料袋装好,带回实验室分离。
[0059] 2、菌株HNA-12的获得
[0060] 将粘附土壤的根系稍风干,轻拍根系,使粘附在上面的土壤脱落,用无菌水梯度稀释,分别吸取0.1mL稀释液滴入TSM培养基平板上,用灭菌的L形涂布棒涂布均匀,置于25-28℃的恒温培养箱中培养3-4天。挑取形态似木霉菌的单菌落转接到PDA平板上进行纯化培养,镜鉴初步认定为木霉菌后编号,并保存到PDA斜面上。
[0061] 获得一株菌株,将其命名为HNA-12。
[0062] 二、菌株HNA-12的鉴定
[0063] 在PDA培养基上20℃培养5d的菌落直径为9.0cm,生长速度很快,蛛丝状至羊毛状,白色,散生光下由于产孢表面呈绿色,背面无色,后期由于产孢量大使菌落呈稍绿色;多分枝的树状分生孢子梗形成相当疏松的菌丛;主枝宽4-5μm,侧枝多,形成金字塔形;侧生瓶梗可达5个,成拟轮状排列或单个沿小侧枝不规则排列;侧生瓶梗基部略缢缩,中部膨大,向上渐狭成瓶梗,5-7×3-3.5μm;顶生的和不典型的瓶梗相对长且纤细,13-18×2.5-3.5μm;瓶梗大多以大度在其载体上着生,有时略弯向顶端;瓶梗孢子呈球状分生孢子头,分生孢子近球形或倒卵形,壁光滑,淡绿色,2.8-3.2×2.5-2.8μm。图1为菌株HNA-12的PDA平板培养形态。图2为菌株HNA-12的分生孢子梗及分生孢子。
[0064] 三、菌株HNA-12的保藏
[0065] 通过步骤二的鉴定,菌株HNA-12属于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。
[0066] 哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12,已于2012年04月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCC No.5989。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12CGMCC No.5989简称哈茨木霉HNA-12。
[0067] 实施例2、哈茨木霉HNA-12对病原菌的抑制作用
[0068] 实验组:在同一PDA平板上接种哈茨木霉HNA-12菌饼和病原菌菌饼进行对峙培养(两个菌饼中心的垂直距离为3cm,两个菌饼的直径均为5mm);以只接种病原菌菌饼的PDA平板作为对照组;25℃黑暗培养一定时间后测量病原菌的菌落直径(最长直径和最短直径的平均值)并计算抑制率。抑制率=(对照组病原菌的菌落直径-实验组病原菌的菌落直径)/对照组病原菌的菌落直径*100%。每种致病菌设置三个重复处理,对照设置三个重复处理,结果取平均值。
[0069] 病原菌分别为辣椒疫病菌、马铃薯晚疫病菌和辣椒根腐病菌。
[0070] 结果见表1(三次试验的平均值)。哈茨木霉HNA-12和辣椒疫病菌对峙培养72小时后的照片见图3。结果表明,哈茨木霉HNA-12对各个病原菌均具有抑制作用。
[0071] 表1各个培养时间后哈茨木霉HNA-12对各个病原菌的抑菌率(%)
[0072]病原菌 24小时 36小时 48小时 60小时 72小时 84小时
辣椒疫病菌 20.5 42.1 47.6 56.7 66.5 75.0
马铃薯晚疫病菌 15.5 42.5 54.5 59.8 69.2 74.3
辣椒根腐病菌 15.4 31.3 50.5 65.3 69.7 72.5
[0073] 实施例3、哈茨木霉HNA-12的温室生防效果实验
[0074] 辣椒种子经55℃温汤浸种30min后催芽,挑选长势一致的发芽种子播种于培养钵,每钵20粒;在温室中(25-30℃)培养直至辣椒植株长出4片真叶,分组进行如下操作(每组3个培养钵):
[0075] 实验组:每株辣椒接种10mL哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL)和10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤;
[0076] 对照组:每株辣椒接种10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
[0077] 接种孢子悬浮液30天后调查发病率(辣椒疫病分级调查标准见表2)并计算病情指数。
[0078] 表2辣椒疫病分级调查标准
[0079]病级 分级标准
0 健康,根茎处无症状,腐烂面积小于1%;
1 根茎基部有水浸状病斑,或暗绿小病斑,腐烂部分环绕茎周1-25%;
2 根茎基部腐烂褐色,腐烂部分环绕茎周26-50%;
3 根茎基部腐烂褐色至深褐色,腐烂部分环绕茎周51-75%,稍有缢缩;
4 根茎基部腐烂深褐至黑色,腐烂部分环绕茎周76-89%,明显缢缩;
5 根茎基部腐烂黑色,腐烂部分环绕茎周90%以上,严重缢缩。
[0080]
[0081]
[0082]
[0083] 结果见表3(三次试验的平均值)。结果表明,哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病具有显著的生防效果。
[0084] 表3哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病的温室防治效果
[0085]处理 病株率(%) 病情指数 相对防效(%)
实验组 15.1 1.6 64.0
对照组 39.5 4.5 -----
[0086] 实施例4、哈茨木霉HNA-12对辣椒植株的促生能力
[0087] 辣椒种子经55℃温汤浸种30min后催芽,挑选长势一致的发芽种子播种于培养钵,每钵20粒;在温室中(25-30℃)培养直至辣椒植株长出4片真叶,分组进行如下操作(每组3个培养钵):6
[0088] 实验组1:每株辣椒接种10mL哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(孢子浓度为5×10 个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤;
[0089] 实验组2:每株辣椒接种10mL水;接种方式为将水用注射器注入根围土壤;6
[0090] 实验组3:每株辣椒接种10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×10 个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
[0091] 接种孢子悬浮液30天后测量辣椒植株的株高、干重及鲜重。结果见表4(三次试验的平均值)。结果表明,哈茨木霉HNA-12可以促进辣椒植株生长。
[0092] 表4哈茨木霉HNA-12对辣椒植株的促生作用
[0093]
[0094] 实施例5、哈茨木霉HNA-12的大田防治效果试验
[0095] 辣椒种子经55℃温汤浸种30min,然后分别进行如下处理:6
[0096] 实验组1:将种子用哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(5×10 个/mL)浸泡10min后播种育苗,培养至长出7片真叶后移栽到大田,再过10天后每株辣椒浇灌200毫升哈茨木霉6
HNA-12孢子悬浮液(5×10 个/mL);
[0097] 实验组2:将种子用福美双溶液(0.02g/mL)浸泡10min后播种育苗,培养至长出7片真叶后移栽到大田,再过10天后每株辣椒浇灌200毫升福美双溶液(0.02g/mL);
[0098] 对照组:将种子用水浸泡10min后播种育苗,培养至长出7片真叶后移栽到大田,再过10天后每株辣椒浇灌200毫升水。
[0099] 统计发病率和病情指数,方法同实施例3。
[0100] 第一年度试验的结果见表5(三次试验的平均值),第二年度试验的结果见表6(三次试验的平均值)。结果表明,哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病具有显著的生防效果。
[0101] 表5哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病的田间防治效果(第一年度试验)[0102]
[0103] 表6哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病的田间防治效果(第二年度试验)[0104]
[0105] 实施例6、哈茨木霉HNA-12的根部定殖实验
[0106] 辣椒种子经55℃温汤浸种30min后催芽,挑选长势一致的发芽种子播种于培养钵,每钵20粒;在温室中(25-30℃)培养直至辣椒植株长出4片真叶,分组进行如下操作(每组3个培养钵):
[0107] 实验组1:每株辣椒接种10mL哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤;
[0108] 实验组2:每株辣椒接种10mL哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL)和10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
[0109] 接种孢子悬浮液30天后采用平板稀释法(TSM培养基)检测根际土壤中哈茨木霉HNA-12的含量,结果见表7(三次试验的平均值)。
[0110] 表7每克根际土壤中哈茨木霉HNA-12的含量(CFU)
[0111]处理 7天 14天 28天
实验组1 4.5×106 5.5×105 3.5×103
实验组2 3.5×105 2.8×104 4.5×102
[0112] 实施例7、哈茨木霉HNA-12能促进辣椒植株的光合荧光效应
[0113] 辣椒种子经55℃温汤浸种30min后催芽,挑选长势一致的发芽种子播种于培养钵,每钵20粒;在温室中(25-30℃)培养直至辣椒植株长出4片真叶,分组进行如下操作(每组3个培养钵):
[0114] 实验组1:每株辣椒接种10mL哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤;
[0115] 实验组2:每株辣椒接种10mL哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个6
/mL)和10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×10 个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤;
[0116] 实验组3:每株辣椒接种10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤;
[0117] 实验组4:每株辣椒接种10mL水;接种方式为将水用注射器注入根围土壤。
[0118] 接种孢子悬浮液30天后查辣椒植株的光合及荧光变化情况。结果见表8(三次试验的平均值)。
[0119] 表8哈茨木霉HNA-12对辣椒植株的光合及荧光影响
[0120]处理 A gs Fv/Fm ΦPSII Fv′/Fm′ qp
实验组1 15.76 0.77 0.81 0.34 0.57 0.63
实验组2 10.83 0.33 0.78 0.18 0.42 0.47
实验组3 0.80 0.041 0.71 0.07 0.34 0.19
实验组4 18.10 0.69 0.79 0.32 0.52 0.60
[0121] 实施例8、哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病菌的重寄生能力
[0122] 在PDA平板上对峙培养哈茨木霉HNA-12和辣椒疫病菌,用5mm的打孔器取菌丝,将其分别接种于PDA平板上的lcm×3cm玻璃纸条两端,25℃对峙培养。当两菌丝接触后,在电镜下观察哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病菌菌丝的重寄生作用。
[0123] 对峙培养4天后,哈茨木霉HNA-12菌落能完全覆盖辣椒疫病菌菌落,并大量产生绿色孢子。在电镜下观察到木霉菌对辣椒疫病菌有明显的寄生现象,寄生方式多样,以缠绕、平行生长及穿插等方式寄生于病菌菌丝上,并产生木霉分生孢子,使病菌菌丝变形,最后使病菌丝断裂、瓦解。哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病菌的重寄生作用见图4和图5。
[0124] 实施例9、哈茨木霉HNA-12代谢物的检测
[0125] 一、哈茨木霉HNA-12的非挥发性代谢物的检测
[0126] 实验组:在PDA平板培养基上平铺直径略大于l0cm的双层无菌玻璃纸膜片,在平板中央接种直径为5mm的哈茨木霉HNA-12菌饼,25℃恒温培养至菌落直径达5cm;揭去玻璃纸膜片,在平板中央接种直径为5mm辣椒疫病菌菌饼,25℃恒温培养;
[0127] 对照组:在PDA平板培养基中央接种直径为5mm辣椒疫病菌菌饼,25℃恒温培养。
[0128] 从接种开始计时,培养一定时间后测量菌落直径并计算抑制率,方法同实施例2。结果见表9。
[0129] 哈茨木霉HNA-12挥发性代谢物对辣椒疫病菌在平板上的抑制作用见图6。
[0130] 二、哈茨木霉HNA-12的挥发性代谢物的检测
[0131] 实验组:在PDA平板中央接种直径为5mm的哈茨木霉HNA-12菌饼,25℃恒温培养至菌落直径达5cm;在其上方蒙上双层直径略大于10cm的圆形无菌玻璃纸,上方对扣一个相等大小、中央接种直径为5mm的辣椒疫病菌菌饼,25℃恒温培养;
[0132] 对照组:在PDA平板中央上方蒙上双层直径略大于10cm的圆形无菌玻璃纸,上方对扣一个相等大小、中央接种直径为5mm的辣椒疫病菌菌饼,25℃恒温培养。
[0133] 从接种开始计时,培养一定时间后测量菌落直径并计算抑制率,方法同实施例2。结果见表9。
[0134] 哈茨木霉HNA-12非挥发性代谢物对辣椒疫病菌在平板上的抑制作用见图7。
[0135] 表9哈茨木霉HNA-12的代谢物对辣椒疫病菌的抑制率(%)
[0136]处理类型 24h 48h 72h
非挥发性代谢物 41.00 46.00 52.14
挥发性代谢物 8.30 13.70 19.93
[0137] 实施例10、哈茨木霉HNA-12的培养
[0138] 一、固体培养物的制备
[0139] 1、斜面菌种
[0140] 采用固体PDA培养基,将哈茨木霉HNA-12接种到斜面PDA培养基上,在培养箱中28℃条件下培养3-4天。
[0141] 2、茄瓶菌种
[0142] 采用固体PDA培养基,将试管斜面培养基中的哈茨木霉HNA-12接种到茄瓶内PDA培养基上,于28℃条件下,在摇床上培养3-4天。
[0143] 3、液体菌种
[0144] 种子培养基(pH6.0-6.5)由溶质和水组成;所述溶质在种子培养基中的浓度如下:麦麸2g/100mL、葡萄糖1.0g/100mL、硫酸镁0.5g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、氯化钙0.3g/100mL;121℃湿热灭菌30min。
[0145] 将茄瓶中的哈茨木霉HNA-12孢子用无菌水冲下,接种到中型发酵罐中(含种子培8
养基),培养得到浓度为2.5×10CFU/mL的种子液。发酵过程保持溶解氧浓度20%左右,温度28-30℃,搅拌速度200-250r/min,通气量为10-15L/min。
[0146] 4、固体培养基培养
[0147] 固体培养基是将麦麸和稻壳和水混合得到的,麦麸和稻壳的质量比为7:3,固体培养基的含水量为70%左右,pH6.0-6.5;121℃灭菌30min。
[0148] 将1体积份步骤3得到的种子液与9体积份固体培养基混合均匀(每克混合物中6
含有1.5×10CFU哈茨木霉HNA-12),接种完毕后转移到固体培养室内培养。培养室温度控制在28-30℃,空气相对湿度控制在95-100%,培养基厚度为6cm(5-7cm均可),培养时间为
6天(5-7天均可)。培养完毕后,将培养物自然风干,成品含水量控制在7-10%,得到哈茨木霉HNA-12固体培养物。
[0149] 二、固体培养物的应用
[0150] 辣椒种子经55℃温汤浸种30min后催芽,挑选长势一致的发芽种子播种于培养钵,每钵20粒;在温室中(25-30℃)培养直至辣椒植株长出4片真叶,分组进行如下操作(每组3个培养钵):
[0151] 实验组:每株辣椒接种10mL固体培养物溶液(将0.1g固体培养物溶于10mL水得6
到的)和10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×10 个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤;
[0152] 对照组:每株辣椒接种10mL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5×106个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。
[0153] 接种孢子悬浮液30天后调查发病率并计算病情指数(方法同实施例3)。
[0154] 实验组的发病率8.5%,病情指数为1.2。对照组的发病率为45%,病情指数为6.3。
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