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一株产乙烯的绿色木霉及其培养方法

阅读:274发布:2020-07-15

专利汇可以提供一株产乙烯的绿色木霉及其培养方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了一株产乙烯的绿色木霉CGMCC No.1918,该菌株的 染色 体DNA中含有乙烯形成酶基因efe。本发明还提供了该菌株的培养方法。本发明利用秸秆类 生物 质 生产乙烯,既能减少乙烯进口为国家节省外汇,同时又能保护环境,在 可持续农业 发展中应用前景广阔。,下面是一株产乙烯的绿色木霉及其培养方法专利的具体信息内容。

1、一株绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC No.1918,其特征在于该菌 株的染色体DNA中含有乙烯形成酶基因efe。
2、根据权利要求1所述的绿色木霉在工业生产乙烯中的应用。
3、根据权利要求1所述的绿色木霉的培养方法,其特征在于它包括以下 步骤:
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中,30℃培养 1周;
(2)待孢子长成绿色后,刮下孢子并悬浮于无菌中,然后按体积比 1%的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中,试管用塞封口,30℃、 200r/min振荡培养48h;
(3)离心收集菌丝体,再将菌丝体转接于液体纤维素诱导培养基中,试 管用胶塞封口,30℃振荡培养36h;
培养过程中所用到的培养基的组成是:
基本培养基:葡萄糖2g/L,(NH4)2SO4 0.5g/L,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4 0.06g/L,CaCl2 0.06g/L,FeSO4·7H2O 0.0005g/L,MnSO4·H2O 0.00016g/L, ZnSO4·7H2O 0.00014g/L,CoCl2 0.0002g/L,pH5.5,余量用水补足;
纤维素诱导培养基:纤维素粉0.5g/L,(NH4)2SO4 0.5g/L,KH2PO4 1.5 g/L,MgSO4 0.06g/L,CaCl2 0.06g/L,FeSO4·7H2O 0.0005g/L,MnSO4·H2O 0.00016g/L,ZnSO4·7H2O 0.00014g/L,CoCl2 0.0002g/L,pH5.5,余量用水 补足。
4、根据权利要求1所述的绿色木霉的培养方法,其特征在于它包括以下 步骤:
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中,30℃培养 1周;
(2)待孢子长成绿色后,刮下孢子并悬浮于无菌水中,然后按体积比 10%的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中,30℃静置培养48h,然后 将试管的封口棉塞换成胶塞,继续在30℃静置培养48h;
培养过程中所用到的固体发酵培养基的组成是:麦秸粉72g,麸皮8g, (NH4)2SO4 2g,水205ml。

说明书全文

技术领域

发明涉及真菌领域,具体地涉及一种产乙烯的绿色木霉及其培养方法。

背景技术

乙烯是用途最广泛的有机原料,被用来生产塑料、纤维橡胶等有机化 工产品,这些产品被广泛应用于国民经济的各个部。因此,乙烯在国民经 济发展中占有重要地位。2004年世界乙烯生产能为11,000万吨,我国乙烯 消费量为1500万吨,而国内乙烯产量为600万吨,自给率仅为43%。随着我国 经济的持续快速发展,我国对乙烯的需求量持续增加,预计到2010年乙烯需 求量将达到2000万吨以上,其中的60%以上需要进口。而且,乙烯是从石油 中提炼和加工制得的,而石油是一种不能再生的资源,地球上蕴藏的可开采 石油将在40年内耗尽。我国是一个石油资源短缺的国家,同时,我国又是石 油消费大国,目前对进口石油的依存度已超过50%。因此,随着石油资源的 日益枯竭,用生物法生产乙烯以替代石油产品的研究已经迫在眉睫。
事实上,人们很早就知道,乙烯可以由植物合成并排出体外,而且乙烯 是植物产生的五大类植物激素之一,在促进瓜果成熟、性别分化和促进次生 物质的形成等方面都发挥着重要作用。虽然乙烯广泛地存在于多种植物组织 中,但在植物组织中的正常含量是非常小的,通常小于0.1ppm。植物体内乙 烯合成的起始底物是蛋酸,中间产物是1-氨基-环丙烷基-1-羧酸 (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC),它在ACC合成酶的催化下合 成。微生物合成乙烯有两条途径,但都不同于植物合成:第一条途径是以蛋氨 酸为底物,中间产物是4-甲硫基-2-丁酸(2-Keto-4-methylthiobutyric acid, KMBA);第二条途径是以α-酮戊二酸为底物合成,这种途径中的关键酶是乙 烯形成酶EFE,由efe基因编码,它可以直接将TCA循环中的α-酮戊二酸转 化为乙烯,该途径可以高效地产生乙烯,可达10-7nl/细胞/小时,是KMBA 途径的500-1000倍。
目前,世界各国都在大力开发生物能源,即利用生物质(所谓生物质可理 解为由光合作用产生的所有生物有机体的总称,包括植物、农作物、林产物、 农林产废弃物如秸秆等可再生的原料)为原料生产的能源,包括燃料乙醇、生 物柴油、生物氢气、生物沼气及生物质气化液化等产生的能源产品,而且 在燃料乙醇、生物氢气、生物沼气等方面已见成效。我国是一个农业大国, 生物质资源非常丰富,每年产秸秆7亿吨,尚未得到充分利用,绝大多数在田 间地头被烧毁。植物纤维原料一般含半纤维素(32%)、纤维素(38%)、木质素 (17%)等。丝状真菌特别是木霉如瑞氏木霉具有很强的分解纤维素和半纤维素 的能力,国内外一直致力于利用木霉及其它一些微生物来转化植物纤维为乙 醇的研究工作,但是用木霉生产乙烯在国内外都没见报道。
本发明是从丁香假单胞菌大豆致病变种中克隆乙烯形成酶基因efe,将该 基因导入到分解纤维素的木霉中,获得产乙烯的木霉。利用该菌株在含纤维 素或植物秸杆的培养基中生产乙烯,为乙烯的生产提供一条新途径。本发明 利用秸秆类生物质生产乙烯,既能减少乙烯进口为国家节省外汇,同时又能 保护环境,在可持续农业发展中应用前景广阔。

发明内容

(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一株产乙烯的绿色木霉,本发明的另一目的是提供 该菌株的培养方法,为利用秸秆类生物质生产乙烯以替代石油产品提供有效 的解决途径。
(二)技术方案
本发明所述的绿色木霉(Trichoderma viride),该菌株已于2007年1月 16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称 CGMCC,保藏编号为CGMCC No.1918。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的染色体DNA中含有乙烯形成酶基 因efe,该菌株的构建过程为:从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)中克隆乙烯形成酶基因(efe),将其插入到载体pCL-9上形 成重组质粒pCL-9-efe。然后制备绿色木霉的原生质体,将携带潮霉素抗性的 质粒pAN7-1和重组质粒pCL-9-efe共转化绿色木霉的原生质体,在再生培养 基上筛选带有潮霉素抗性的转化子。然后通过PCR扩增筛选整合有乙烯形成 酶基因(efe)的转化子,并通过气相色谱来确定乙烯产量,其中乙烯产量最高 的转化子即为绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的生物学特点是:除染色体上携带 有乙烯形成酶基因(efe)外,在形态上与其他木霉类似,在生活史中有菌丝和 分生孢子,主要靠无性繁殖。该真菌依靠自身产生的纤维素酶来分解植物纤 维。木霉产生的纤维素酶是由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶 三个主要成分所组成。以滤纸为底物经纤维素酶解后生成还原糖的量表征 纤维素酶系总的糖化能力,它反映了三类酶组分的协同作用,通称滤纸酶活 (FPA),在50℃、pH4.5的条件下,每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶 量定义为一个酶活力单位(U)。固态发酵88小时,测得本发明所述的绿色 木霉(T.viride)CGMCC No.1918的滤纸酶活力为26292U/g干曲(干曲表示发 酵培养基的干重)。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养方法包括以下步骤:
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中,30℃培养 1周;
(2)待孢子长成绿色后,刮下孢子并悬浮于无菌水中,然后按体积比 1%的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中,试管用塞封口,30℃、 200r/min振荡培养48h;
(3)离心收集菌丝体,再将菌丝体转接于液体纤维素诱导培养基中,试 管用胶塞封口,30℃振荡培养36h;
培养过程中所用到的培养基的组成是:
基本培养基:葡萄糖2g/L,(NH4)2SO4 0.5g/L,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4 0.06g/L,CaCl2 0.06g/L,FeSO4·7H2O 0.0005g/L,MnSO4·H2O 0.00016g/L, ZnSO4·7H2O 0.00014g/L,CoCl2 0.0002g/L,pH5.5,余量用水补足;
纤维素诱导培养基:纤维素粉0.5g/L,(NH4)2SO4 0.5g/L,KH2PO4 1.5 g/L,MgSO4 0.06g/L,CaCl2 0.06g/L,FeSO4·7H2O 0.0005g/L,MnSO4·H2O 0.00016g/L,ZnSO4·7H2O 0.00014g/L,CoCl2 0.0002g/L,pH5.5,余量用水 补足。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养还可采用如下方法:
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中,30℃培养 1周;
(2)待孢子长成绿色后,刮下孢子并悬浮于无菌水中,然后按体积比 10%的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中,30℃静置培养48h,然后 将试管的封口棉塞换成胶塞,继续在30℃静置培养48h;
培养过程中所用到的固体发酵培养基的组成是:麦秸粉72g,麸皮8g, (NH4)2SO4 2g,水205ml。其中,麦秸粉是通过将小麦秸秆经F120型粉碎 机(购自上海树立仪器仪表公司)粉碎至40目制得的,麸皮购自中国农业科 学院畜牧所。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918可应用于工业生产乙烯。
(三)有益效果
本发明提供了一种产乙烯的绿色木霉及其培养方法,该菌株可利用纤维 素生产乙烯,以减少乙烯的进口,实现乙烯供应的可持续发展,同时拉动农 业及其他相关行业的经济发展,产生巨大的经济和社会效益。
1.经济效益分析:地球上的生物质资源极为丰富,据估计,地球每年 经光合作用所产生的干物质有2000亿吨,木质纤维素是这些植物光合产物中 超过一半的主成分,在木材、秸秆、农林产品加工副产品、畜禽粪便中都含 有大量的木质纤维素。其中,秸秆是世界上产量最大的固体废弃物。据统计 我国作物秸秆产量每年达7亿吨以上,相当于3.5亿吨标,占全国年商品 能源消费量的30%,按2006年标煤市场价格计算,废弃秸秆的直接经济损失 高达1200亿元。然而,2004年我国60%以上的乙烯需要进口,进口乙烯量为 900万吨,预计到2010年乙烯进口量将达1200万吨以上。同时,目前生产 的乙烯都是从石油中提炼和加工制得的,而石油是一种不能再生的资源,地 球上蕴藏的可开采石油将在40年内耗尽。因此,如能利用全国每年20%的作 物秸秆生产乙烯,则会有效降低乙烯的进口,为乙烯的生产开辟一条新途径, 还可带动其它相关环保产业的发展,为“三农”开辟一条新的生产和致富门 路。
2.社会效益分析:本发明直扣“三农”、能源和环境三大主题,消除作 物秸秆就地焚烧的污染,将秸秆类废弃物转变成生物乙烯,变废为宝,可以 大幅度提高生态指标及生活环境质量,极大地缓解能源危机压力,实现我国 可持续发展的战略。
本发明所述的绿色木霉(T.viride),该菌株已于2007年1月16日被保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编 号为CGMCC No.1918。
附图说明
图1是重组质粒pCL-9-efe的质粒酶切图谱;
图2是PCR验证整合有乙烯形成酶基因的转化子的电泳图,图中,M 表示λDNA/Hind III+EcoR I mark,1表示整合有乙烯形成酶基因的转化子的 PCR产物,2表示作为正对照的质粒pCL-9-efe的PCR产物。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的构建
用PCR法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv. glycinea)(该菌株购自中国农业科学院植物保护研究所)中克隆乙烯形成酶 基因efe(该基因序列见报道Fukuda H,Ogawa T,Ishihara K,et al.Molecμlar cloning in Escherichia coli,expression,and nucleotide sequence for the gene for the ethylene-forming enzyme of Pseudomonas syringae pv.phaseolicola PK2. Biochemical and Biophysical Research Communications,1992,188:826-832.)。
PCR所用引物的序列为:上游引物P1:5’-cc cccgcggatgaccaacctacagactttc-3’ (划线处为Sac II位点),下游引物P2:5’-tat cccgggaactcatgagcctgtcgcg-3’(划线 处为Sma I位点)。
PCR条件是:94℃预变性5min,94℃变性30s,62℃退火30s,72℃延伸 1min,30个循环,最后72℃延伸10min。所用PCR仪型号是PTC200(MJ公司 生产)。
然后将PCR产物插入到用Sac II和Sma I(均购自TaKaRa公司)消化的载 体pCL-9(购自华美公司)上形成重组质粒pCL-9-efe,重组质粒pCL-9-efe的 质粒酶切图谱见附图1。
接着制备绿色木霉(该菌株购自中国农业科学院植物保护研究所)的原 生质体(制备原生质体的方法具体参见:Penttila M,et al.A versatile transformation system for the cellμlolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene,1987,61:155-164.),然后将携带潮霉素抗性的质粒pAN7-1(购自华美公 司)和重组质粒pCL-9-efe共转化绿色木霉的原生质体(共转化的方法具体参 见:Penttila M,et al.A versatile transformation system for the cellμlolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene,1987,61:155-164.)。
然后在再生培养基上筛选带有潮霉素抗性的转化子,再生培养基的配方 为:葡萄糖2g/L,(NH4)2SO4 0.5g/L,KH2PO4 1.5g/L,MgSO4 0.06g/L,CaCl2 0.06g/L,FeSO4·7H2O 0.0005g/L,MnSO4·H2O 0.00016g/L,ZnSO4·7H2O 0.00014g/L,CoCl2 0.0002g/L,琼脂2g/L,pH5.5,添加1mol/L的山梨醇0.8 mol作渗透压稳定剂,余量用水补足,临用时加入潮霉素B至终浓度为 250μg/ml。
再通过PCR扩增筛选整合有乙烯形成酶基因(efe)的转化子,鉴定的结果 见附图2。并通过气相色谱来确定乙烯产量(气相色谱测定乙烯产量的方法见 实施例2),其中乙烯产量最高的转化子即为绿色木霉(T.viride)CGMCC No. 1918。
实施例2绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养及乙烯产量测定
一、培养:
(1)将所述的绿色木霉的孢子接种于PDA培养基中,30℃培养1周;
(2)待孢子长成绿色后,刮下孢子并悬浮于无菌水中,然后按体积比1% 的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中,试管用棉塞封口,30℃、 200r/min振荡培养48h;
(3)离心收集菌丝体(离心机型号TGL-16H,购自珠海黑医学仪器 有限公司,离心参数为10000rpm 1min),再将菌丝体转接于液体纤维素诱导 培养基中,试管用胶塞封口,30℃振荡培养36h。
二、乙烯产量测定:
取试管内顶端气体100μl进行气相色谱分析:所用气相色谱仪型号为 HP6890(美国HP公司生产),色谱柱为HP-PLOT/Al2O3,规格: 15m×0.53mm×15μm(内膜厚度),柱内温度70℃,载气为N2(28.5ml/min),氢焰 离子检测器。
测定结果为:测得峰面积的平均值为145.9,经摇床发酵36h绿色木霉(T. viride)CGMCC No.1918转化纤维素粉生成乙烯的量为2.075μl/h/g干菌体。 实施例3绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养及乙烯产量测定
一、培养:(1)将所述的绿色木霉的菌丝接种于PDA培养基中,30℃培 养1周;
(2)待孢子长成绿色后,刮下孢子并悬浮于无菌水中,然后按体积比10% 的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中,30℃静置培养48h,然后将试 管的封口棉塞换成胶塞,继续在30℃静置培养48h。
二、乙烯产量测定:测定方法及所用仪器、仪器参数设定同实施例2,测 定结果为:测得峰面积的平均值为176.7,经固体发酵48h绿色木霉(T.viride) CGMCC No.1918直接转化麦秸生成乙烯的量为0.059μl/h/g湿曲(湿曲表示 发酵培养基的湿重)。
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