一株产乙烯的绿色木霉及其培养方法
阅读：215发布：2020-07-10
专利汇可以提供一株产乙烯的绿色木霉及其培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一株产乙烯的绿色木霉CGMCC No.1918，该菌株的 染色 体DNA中含有乙烯形成酶基因efe。本发明还提供了该菌株的培养方法。本发明利用秸秆类 生物 质 生产乙烯，既能减少乙烯进口为国家节省外汇，同时又能保护环境，在 可持续农业 发展中应用前景广阔。，下面是一株产乙烯的绿色木霉及其培养方法专利的具体信息内容。
1、一株绿色木霉(Trichoderma viride)CGMCC No.1918，其特征在于该菌 株的染色体DNA中含有乙烯形成酶基因efe。
2、根据权利要求1所述的绿色木霉在工业生产乙烯中的应用。
3、根据权利要求1所述的绿色木霉的培养方法，其特征在于它包括以下 步骤：
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中，30℃培养 1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比 1％的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中，试管用棉塞封口，30℃、 200r/min振荡培养48h；
(3)离心收集菌丝体，再将菌丝体转接于液体纤维素诱导培养基中，试 管用胶塞封口，30℃振荡培养36h；
培养过程中所用到的培养基的组成是：
基本培养基：葡萄糖2g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4 0.06g/L，CaCl20.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L， ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl20.0002g/L，pH5.5，余量用水补足；
纤维素诱导培养基：纤维素粉0.5g/L，(NH4)2SO40.5g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.06g/L，CaCl20.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl20.0002g/L，pH5.5，余量用水 补足。
4、根据权利要求1所述的绿色木霉的培养方法，其特征在于它包括以下 步骤：
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中，30℃培养 1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比 10％的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中，30℃静置培养48h，然后 将试管的封口棉塞换成胶塞，继续在30℃静置培养48h；
培养过程中所用到的固体发酵培养基的组成是：麦秸粉72g，麸皮8g， (NH4)2SO42g，水205ml。
技术领域
本发明涉及真菌领域，具体地涉及一种产乙烯的绿色木霉及其培养方法。
背景技术
乙烯是用途最广泛的有机原料，被用来生产塑料、纤维、橡胶等有机化 工产品，这些产品被广泛应用于国民经济的各个部门。因此，乙烯在国民经 济发展中占有重要地位。2004年世界乙烯生产能力为11,000万吨，我国乙烯 消费量为1500万吨，而国内乙烯产量为600万吨，自给率仅为43％。随着我国 经济的持续快速发展，我国对乙烯的需求量持续增加，预计到2010年乙烯需 求量将达到2000万吨以上，其中的60％以上需要进口。而且，乙烯是从石油 中提炼和加工制得的，而石油是一种不能再生的资源，地球上蕴藏的可开采 石油将在40年内耗尽。我国是一个石油资源短缺的国家，同时，我国又是石 油消费大国，目前对进口石油的依存度已超过50％。因此，随着石油资源的 日益枯竭，用生物法生产乙烯以替代石油产品的研究已经迫在眉睫。
事实上，人们很早就知道，乙烯可以由植物合成并排出体外，而且乙烯 是植物产生的五大类植物激素之一，在促进瓜果成熟、性别分化和促进次生 物质的形成等方面都发挥着重要作用。虽然乙烯广泛地存在于多种植物组织 中，但在植物组织中的正常含量是非常小的，通常小于0.1ppm。植物体内乙 烯合成的起始底物是蛋氨酸，中间产物是1-氨基-环丙烷基-1-羧酸 (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，它在ACC合成酶的催化下合 成。微生物合成乙烯有两条途径，但都不同于植物合成：第一条途径是以蛋氨 酸为底物，中间产物是4-甲硫基-2-丁酮酸(2-Keto-4-methylthiobutyric acid， KMBA)；第二条途径是以α-酮戊二酸为底物合成，这种途径中的关键酶是乙 烯形成酶EFE，由efe基因编码，它可以直接将TCA循环中的α-酮戊二酸转 化为乙烯，该途径可以高效地产生乙烯，可达10-7nl/细胞/小时，是KMBA 途径的500-1000倍。
目前，世界各国都在大力开发生物能源，即利用生物质(所谓生物质可理 解为由光合作用产生的所有生物有机体的总称，包括植物、农作物、林产物、 农林产废弃物如秸秆等可再生的原料)为原料生产的能源，包括燃料乙醇、生 物柴油、生物氢气、生物沼气及生物质气化或液化等产生的能源产品，而且 在燃料乙醇、生物氢气、生物沼气等方面已见成效。我国是一个农业大国， 生物质资源非常丰富，每年产秸秆7亿吨，尚未得到充分利用，绝大多数在田 间地头被烧毁。植物纤维原料一般含半纤维素(32％)、纤维素(38％)、木质素 (17％)等。丝状真菌特别是木霉如瑞氏木霉具有很强的分解纤维素和半纤维素 的能力，国内外一直致力于利用木霉及其它一些微生物来转化植物纤维为乙 醇的研究工作，但是用木霉生产乙烯在国内外都没见报道。
本发明是从丁香假单胞菌大豆致病变种中克隆乙烯形成酶基因efe，将该 基因导入到分解纤维素的木霉中，获得产乙烯的木霉。利用该菌株在含纤维 素或植物秸杆的培养基中生产乙烯，为乙烯的生产提供一条新途径。本发明 利用秸秆类生物质生产乙烯，既能减少乙烯进口为国家节省外汇，同时又能 保护环境，在可持续农业发展中应用前景广阔。
事实上，人们很早就知道，乙烯可以由植物合成并排出体外，而且乙烯 是植物产生的五大类植物激素之一，在促进瓜果成熟、性别分化和促进次生 物质的形成等方面都发挥着重要作用。虽然乙烯广泛地存在于多种植物组织 中，但在植物组织中的正常含量是非常小的，通常小于0.1ppm。植物体内乙 烯合成的起始底物是蛋氨酸，中间产物是1-氨基-环丙烷基-1-羧酸 (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，它在ACC合成酶的催化下合 成。微生物合成乙烯有两条途径，但都不同于植物合成：第一条途径是以蛋氨 酸为底物，中间产物是4-甲硫基-2-丁酮酸(2-Keto-4-methylthiobutyric acid， KMBA)；第二条途径是以α-酮戊二酸为底物合成，这种途径中的关键酶是乙 烯形成酶EFE，由efe基因编码，它可以直接将TCA循环中的α-酮戊二酸转 化为乙烯，该途径可以高效地产生乙烯，可达10-7nl/细胞/小时，是KMBA 途径的500-1000倍。
目前，世界各国都在大力开发生物能源，即利用生物质(所谓生物质可理 解为由光合作用产生的所有生物有机体的总称，包括植物、农作物、林产物、 农林产废弃物如秸秆等可再生的原料)为原料生产的能源，包括燃料乙醇、生 物柴油、生物氢气、生物沼气及生物质气化或液化等产生的能源产品，而且 在燃料乙醇、生物氢气、生物沼气等方面已见成效。我国是一个农业大国， 生物质资源非常丰富，每年产秸秆7亿吨，尚未得到充分利用，绝大多数在田 间地头被烧毁。植物纤维原料一般含半纤维素(32％)、纤维素(38％)、木质素 (17％)等。丝状真菌特别是木霉如瑞氏木霉具有很强的分解纤维素和半纤维素 的能力，国内外一直致力于利用木霉及其它一些微生物来转化植物纤维为乙 醇的研究工作，但是用木霉生产乙烯在国内外都没见报道。
本发明是从丁香假单胞菌大豆致病变种中克隆乙烯形成酶基因efe，将该 基因导入到分解纤维素的木霉中，获得产乙烯的木霉。利用该菌株在含纤维 素或植物秸杆的培养基中生产乙烯，为乙烯的生产提供一条新途径。本发明 利用秸秆类生物质生产乙烯，既能减少乙烯进口为国家节省外汇，同时又能 保护环境，在可持续农业发展中应用前景广阔。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一株产乙烯的绿色木霉，本发明的另一目的是提供 该菌株的培养方法，为利用秸秆类生物质生产乙烯以替代石油产品提供有效 的解决途径。
(二)技术方案
本发明所述的绿色木霉(Trichoderma viride)，该菌株已于2007年1月 16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1918。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的染色体DNA中含有乙烯形成酶基 因efe，该菌株的构建过程为：从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)中克隆乙烯形成酶基因(efe)，将其插入到载体pCL-9上形 成重组质粒pCL-9-efe。然后制备绿色木霉的原生质体，将携带潮霉素抗性的 质粒pAN7-1和重组质粒pCL-9-efe共转化绿色木霉的原生质体，在再生培养 基上筛选带有潮霉素抗性的转化子。然后通过PCR扩增筛选整合有乙烯形成 酶基因(efe)的转化子，并通过气相色谱来确定乙烯产量，其中乙烯产量最高 的转化子即为绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的生物学特点是：除染色体上携带 有乙烯形成酶基因(efe)外，在形态上与其他木霉类似，在生活史中有菌丝和 分生孢子，主要靠无性繁殖。该真菌依靠自身产生的纤维素酶来分解植物纤 维。木霉产生的纤维素酶是由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶 三个主要成分所组成。以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量表征 纤维素酶系总的糖化能力，它反映了三类酶组分的协同作用，通称滤纸酶活 (FPA)，在50℃、pH4.5的条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶 量定义为一个酶活力单位(U)。固态发酵88小时，测得本发明所述的绿色 木霉(T.viride)CGMCC No.1918的滤纸酶活力为26292U/g干曲(干曲表示发 酵培养基的干重)。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养方法包括以下步骤：
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中，30℃培养 1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比 1％的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中，试管用棉塞封口，30℃、 200r/min振荡培养48h；
(3)离心收集菌丝体，再将菌丝体转接于液体纤维素诱导培养基中，试 管用胶塞封口，30℃振荡培养36h；
培养过程中所用到的培养基的组成是：
基本培养基：葡萄糖2g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4 0.06g/L，CaCl2 0.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L， ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl2 0.0002g/L，pH5.5，余量用水补足；
纤维素诱导培养基：纤维素粉0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.06g/L，CaCl2 0.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl2 0.0002g/L，pH5.5，余量用水 补足。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养还可采用如下方法：
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中，30℃培养 1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比 10％的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中，30℃静置培养48h，然后 将试管的封口棉塞换成胶塞，继续在30℃静置培养48h；
培养过程中所用到的固体发酵培养基的组成是：麦秸粉72g，麸皮8g， (NH4)2SO4 2g，水205ml。其中，麦秸粉是通过将小麦秸秆经F120型粉碎 机(购自上海树立仪器仪表公司)粉碎至40目制得的，麸皮购自中国农业科 学院畜牧所。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918可应用于工业生产乙烯。
(三)有益效果
本发明提供了一种产乙烯的绿色木霉及其培养方法，该菌株可利用纤维 素生产乙烯，以减少乙烯的进口，实现乙烯供应的可持续发展，同时拉动农 业及其他相关行业的经济发展，产生巨大的经济和社会效益。
1.经济效益分析：地球上的生物质资源极为丰富，据估计，地球每年 经光合作用所产生的干物质有2000亿吨，木质纤维素是这些植物光合产物中 超过一半的主成分，在木材、秸秆、农林产品加工副产品、畜禽粪便中都含 有大量的木质纤维素。其中，秸秆是世界上产量最大的固体废弃物。据统计 我国作物秸秆产量每年达7亿吨以上，相当于3.5亿吨标煤，占全国年商品 能源消费量的30％，按2006年标煤市场价格计算，废弃秸秆的直接经济损失 高达1200亿元。然而，2004年我国60％以上的乙烯需要进口，进口乙烯量为 900万吨，预计到2010年乙烯进口量将达1200万吨以上。同时，目前生产 的乙烯都是从石油中提炼和加工制得的，而石油是一种不能再生的资源，地 球上蕴藏的可开采石油将在40年内耗尽。因此，如能利用全国每年20％的作 物秸秆生产乙烯，则会有效降低乙烯的进口，为乙烯的生产开辟一条新途径， 还可带动其它相关环保产业的发展，为“三农”开辟一条新的生产和致富门 路。
2.社会效益分析：本发明直扣“三农”、能源和环境三大主题，消除作 物秸秆就地焚烧的污染，将秸秆类废弃物转变成生物乙烯，变废为宝，可以 大幅度提高生态指标及生活环境质量，极大地缓解能源危机压力，实现我国 可持续发展的战略。
本发明所述的绿色木霉(T.viride)，该菌株已于2007年1月16日被保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编 号为CGMCC No.1918。
附图说明
图1是重组质粒pCL-9-efe的质粒酶切图谱；
图2是PCR验证整合有乙烯形成酶基因的转化子的电泳图，图中，M 表示λDNA/Hind III+EcoR I mark，1表示整合有乙烯形成酶基因的转化子的 PCR产物，2表示作为正对照的质粒pCL-9-efe的PCR产物。
本发明的目的是提供一株产乙烯的绿色木霉，本发明的另一目的是提供 该菌株的培养方法，为利用秸秆类生物质生产乙烯以替代石油产品提供有效 的解决途径。
(二)技术方案
本发明所述的绿色木霉(Trichoderma viride)，该菌株已于2007年1月 16日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1918。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的染色体DNA中含有乙烯形成酶基 因efe，该菌株的构建过程为：从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)中克隆乙烯形成酶基因(efe)，将其插入到载体pCL-9上形 成重组质粒pCL-9-efe。然后制备绿色木霉的原生质体，将携带潮霉素抗性的 质粒pAN7-1和重组质粒pCL-9-efe共转化绿色木霉的原生质体，在再生培养 基上筛选带有潮霉素抗性的转化子。然后通过PCR扩增筛选整合有乙烯形成 酶基因(efe)的转化子，并通过气相色谱来确定乙烯产量，其中乙烯产量最高 的转化子即为绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的生物学特点是：除染色体上携带 有乙烯形成酶基因(efe)外，在形态上与其他木霉类似，在生活史中有菌丝和 分生孢子，主要靠无性繁殖。该真菌依靠自身产生的纤维素酶来分解植物纤 维。木霉产生的纤维素酶是由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶、β-葡萄糖苷酶 三个主要成分所组成。以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量表征 纤维素酶系总的糖化能力，它反映了三类酶组分的协同作用，通称滤纸酶活 (FPA)，在50℃、pH4.5的条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶 量定义为一个酶活力单位(U)。固态发酵88小时，测得本发明所述的绿色 木霉(T.viride)CGMCC No.1918的滤纸酶活力为26292U/g干曲(干曲表示发 酵培养基的干重)。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养方法包括以下步骤：
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中，30℃培养 1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比 1％的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中，试管用棉塞封口，30℃、 200r/min振荡培养48h；
(3)离心收集菌丝体，再将菌丝体转接于液体纤维素诱导培养基中，试 管用胶塞封口，30℃振荡培养36h；
培养过程中所用到的培养基的组成是：
基本培养基：葡萄糖2g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4 0.06g/L，CaCl2 0.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L， ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl2 0.0002g/L，pH5.5，余量用水补足；
纤维素诱导培养基：纤维素粉0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.06g/L，CaCl2 0.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoCl2 0.0002g/L，pH5.5，余量用水 补足。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养还可采用如下方法：
(1)将所述的绿色木霉的孢子或菌丝接种于PDA培养基中，30℃培养 1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比 10％的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中，30℃静置培养48h，然后 将试管的封口棉塞换成胶塞，继续在30℃静置培养48h；
培养过程中所用到的固体发酵培养基的组成是：麦秸粉72g，麸皮8g， (NH4)2SO4 2g，水205ml。其中，麦秸粉是通过将小麦秸秆经F120型粉碎 机(购自上海树立仪器仪表公司)粉碎至40目制得的，麸皮购自中国农业科 学院畜牧所。
绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918可应用于工业生产乙烯。
(三)有益效果
本发明提供了一种产乙烯的绿色木霉及其培养方法，该菌株可利用纤维 素生产乙烯，以减少乙烯的进口，实现乙烯供应的可持续发展，同时拉动农 业及其他相关行业的经济发展，产生巨大的经济和社会效益。
1.经济效益分析：地球上的生物质资源极为丰富，据估计，地球每年 经光合作用所产生的干物质有2000亿吨，木质纤维素是这些植物光合产物中 超过一半的主成分，在木材、秸秆、农林产品加工副产品、畜禽粪便中都含 有大量的木质纤维素。其中，秸秆是世界上产量最大的固体废弃物。据统计 我国作物秸秆产量每年达7亿吨以上，相当于3.5亿吨标煤，占全国年商品 能源消费量的30％，按2006年标煤市场价格计算，废弃秸秆的直接经济损失 高达1200亿元。然而，2004年我国60％以上的乙烯需要进口，进口乙烯量为 900万吨，预计到2010年乙烯进口量将达1200万吨以上。同时，目前生产 的乙烯都是从石油中提炼和加工制得的，而石油是一种不能再生的资源，地 球上蕴藏的可开采石油将在40年内耗尽。因此，如能利用全国每年20％的作 物秸秆生产乙烯，则会有效降低乙烯的进口，为乙烯的生产开辟一条新途径， 还可带动其它相关环保产业的发展，为“三农”开辟一条新的生产和致富门 路。
2.社会效益分析：本发明直扣“三农”、能源和环境三大主题，消除作 物秸秆就地焚烧的污染，将秸秆类废弃物转变成生物乙烯，变废为宝，可以 大幅度提高生态指标及生活环境质量，极大地缓解能源危机压力，实现我国 可持续发展的战略。
本发明所述的绿色木霉(T.viride)，该菌株已于2007年1月16日被保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编 号为CGMCC No.1918。
附图说明
图1是重组质粒pCL-9-efe的质粒酶切图谱；
图2是PCR验证整合有乙烯形成酶基因的转化子的电泳图，图中，M 表示λDNA/Hind III+EcoR I mark，1表示整合有乙烯形成酶基因的转化子的 PCR产物，2表示作为正对照的质粒pCL-9-efe的PCR产物。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的构建
用PCR法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv. glycinea)(该菌株购自中国农业科学院植物保护研究所)中克隆乙烯形成酶 基因efe(该基因序列见报道Fukuda H，Ogawa T，Ishihara K，et al.Molecμlar cloning in Escherichia coli，expression，and nucleotide sequence for the gene for the ethylene-forming enzyme of Pseudomonas syringae pv.phaseolicola PK2. Biochemical and Biophysical Research Communications，1992，188：826-832.)。
PCR所用引物的序列为：上游引物P1：5’-ccccgcggatgaccaacctacagactttc-3’ (划线处为Sac II位点)，下游引物P2：5’-tatcccgggaactcatgagcctgtcgcg-3’(划线 处为Sma I位点)。
PCR条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸 1min，30个循环，最后72℃延伸10min。所用PCR仪型号是PTC200(MJ公司 生产)。
然后将PCR产物插入到用Sac II和Sma I(均购自TaKaRa公司)消化的载 体pCL-9(购自华美公司)上形成重组质粒pCL-9-efe，重组质粒pCL-9-efe的 质粒酶切图谱见附图1。
接着制备绿色木霉(该菌株购自中国农业科学院植物保护研究所)的原 生质体(制备原生质体的方法具体参见：Penttila M，et al.A versatile transformation system for the cellμlolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene，1987，61：155-164.)，然后将携带潮霉素抗性的质粒pAN7-1(购自华美公 司)和重组质粒pCL-9-efe共转化绿色木霉的原生质体(共转化的方法具体参 见：Penttila M，et al.A versatile transformation system for the cellμlolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene，1987，61：155-164.)。
然后在再生培养基上筛选带有潮霉素抗性的转化子，再生培养基的配方 为：葡萄糖2g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4 0.06g/L，CaCl2 0.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoGl2 0.0002g/L，琼脂2g/L，pH5.5，添加1mol/L的山梨醇0.8 mol作渗透压稳定剂，余量用水补足，临用时加入潮霉素B至终浓度为 250μg/ml。
再通过PCR扩增筛选整合有乙烯形成酶基因(efe)的转化子，鉴定的结果 见附图2。并通过气相色谱来确定乙烯产量(气相色谱测定乙烯产量的方法见 实施例2)，其中乙烯产量最高的转化子即为绿色木霉(T.viride)CGMCC No. 1918。
实施例2绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养及乙烯产量测定
一、培养：
(1)将所述的绿色木霉的孢子接种于PDA培养基中，30℃培养1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比1％ 的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中，试管用棉塞封口，30℃、 200r/min振荡培养48h；
(3)离心收集菌丝体(离心机型号TGL-16H，购自珠海黑马医学仪器 有限公司，离心参数为10000rpm 1min)，再将菌丝体转接于液体纤维素诱导 培养基中，试管用胶塞封口，30℃振荡培养36h。
二、乙烯产量测定：
取试管内顶端气体100μl进行气相色谱分析：所用气相色谱仪型号为 HP6890(美国HP公司生产)，色谱柱为HP-PLOT/Al2O3，规格： 15m×0.53mm×15μm(内膜厚度)，柱内温度70℃，载气为N2(28.5ml/min)，氢焰 离子检测器。
测定结果为：测得峰面积的平均值为145.9，经摇床发酵36h绿色木霉(T. viride)CGMCC No.1918转化纤维素粉生成乙烯的量为2.075μl/h/g干菌体。
实施例3绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养及乙烯产量测定
一、培养：(1)将所述的绿色木霉的菌丝接种于PDA培养基中，30℃培 养1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比10％ 的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中，30℃静置培养48h，然后将试 管的封口棉塞换成胶塞，继续在30℃静置培养48h。
二、乙烯产量测定：测定方法及所用仪器、仪器参数设定同实施例2，测 定结果为：测得峰面积的平均值为176.7，经固体发酵48h绿色木霉(T.viride) CGMCC No.1918直接转化麦秸生成乙烯的量为0.059μl/h/g湿曲(湿曲表示 发酵培养基的湿重)。
实施例1绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的构建
用PCR法从丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv. glycinea)(该菌株购自中国农业科学院植物保护研究所)中克隆乙烯形成酶 基因efe(该基因序列见报道Fukuda H，Ogawa T，Ishihara K，et al.Molecμlar cloning in Escherichia coli，expression，and nucleotide sequence for the gene for the ethylene-forming enzyme of Pseudomonas syringae pv.phaseolicola PK2. Biochemical and Biophysical Research Communications，1992，188：826-832.)。
PCR所用引物的序列为：上游引物P1：5’-ccccgcggatgaccaacctacagactttc-3’ (划线处为Sac II位点)，下游引物P2：5’-tatcccgggaactcatgagcctgtcgcg-3’(划线 处为Sma I位点)。
PCR条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸 1min，30个循环，最后72℃延伸10min。所用PCR仪型号是PTC200(MJ公司 生产)。
然后将PCR产物插入到用Sac II和Sma I(均购自TaKaRa公司)消化的载 体pCL-9(购自华美公司)上形成重组质粒pCL-9-efe，重组质粒pCL-9-efe的 质粒酶切图谱见附图1。
接着制备绿色木霉(该菌株购自中国农业科学院植物保护研究所)的原 生质体(制备原生质体的方法具体参见：Penttila M，et al.A versatile transformation system for the cellμlolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene，1987，61：155-164.)，然后将携带潮霉素抗性的质粒pAN7-1(购自华美公 司)和重组质粒pCL-9-efe共转化绿色木霉的原生质体(共转化的方法具体参 见：Penttila M，et al.A versatile transformation system for the cellμlolytic filamentous fungus Trichoderma reesei.Gene，1987，61：155-164.)。
然后在再生培养基上筛选带有潮霉素抗性的转化子，再生培养基的配方 为：葡萄糖2g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4 0.06g/L，CaCl2 0.06g/L，FeSO4·7H2O 0.0005g/L，MnSO4·H2O 0.00016g/L，ZnSO4·7H2O 0.00014g/L，CoGl2 0.0002g/L，琼脂2g/L，pH5.5，添加1mol/L的山梨醇0.8 mol作渗透压稳定剂，余量用水补足，临用时加入潮霉素B至终浓度为 250μg/ml。
再通过PCR扩增筛选整合有乙烯形成酶基因(efe)的转化子，鉴定的结果 见附图2。并通过气相色谱来确定乙烯产量(气相色谱测定乙烯产量的方法见 实施例2)，其中乙烯产量最高的转化子即为绿色木霉(T.viride)CGMCC No. 1918。
实施例2绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养及乙烯产量测定
一、培养：
(1)将所述的绿色木霉的孢子接种于PDA培养基中，30℃培养1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比1％ 的接种量将孢子悬液接种于液体基本培养基中，试管用棉塞封口，30℃、 200r/min振荡培养48h；
(3)离心收集菌丝体(离心机型号TGL-16H，购自珠海黑马医学仪器 有限公司，离心参数为10000rpm 1min)，再将菌丝体转接于液体纤维素诱导 培养基中，试管用胶塞封口，30℃振荡培养36h。
二、乙烯产量测定：
取试管内顶端气体100μl进行气相色谱分析：所用气相色谱仪型号为 HP6890(美国HP公司生产)，色谱柱为HP-PLOT/Al2O3，规格： 15m×0.53mm×15μm(内膜厚度)，柱内温度70℃，载气为N2(28.5ml/min)，氢焰 离子检测器。
测定结果为：测得峰面积的平均值为145.9，经摇床发酵36h绿色木霉(T. viride)CGMCC No.1918转化纤维素粉生成乙烯的量为2.075μl/h/g干菌体。
实施例3绿色木霉(T.viride)CGMCC No.1918的培养及乙烯产量测定
一、培养：(1)将所述的绿色木霉的菌丝接种于PDA培养基中，30℃培 养1周；
(2)待孢子长成绿色后，刮下孢子并悬浮于无菌水中，然后按体积比10％ 的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中，30℃静置培养48h，然后将试 管的封口棉塞换成胶塞，继续在30℃静置培养48h。
二、乙烯产量测定：测定方法及所用仪器、仪器参数设定同实施例2，测 定结果为：测得峰面积的平均值为176.7，经固体发酵48h绿色木霉(T.viride) CGMCC No.1918直接转化麦秸生成乙烯的量为0.059μl/h/g湿曲(湿曲表示 发酵培养基的湿重)。
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