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一种用于降糖降脂的决明子提取物及其制备与质检方法

阅读:574发布:2021-09-19

专利汇可以提供一种用于降糖降脂的决明子提取物及其制备与质检方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 属于医药领域,公开了一种用于降糖降脂的决明子提取物及其制备与 质量 检测方法。本发明提取物是以决明子为 原料药 材,经 乙醇 水 溶液提取和大孔 树脂 纯化制得的产物。本发明提取物的质量检测方法是包括性状和含量限定检测,含量限定检测采用高效液相色谱法同时测定决明子提取物中2种蒽醌类成分和3种 萘 并吡喃 酮 类成分的含量,方法学考察结果良好。药理实验证明本发明提供的决明子提取物具有良好的降糖降脂功效,可用于制备降糖降脂的药物和保健品。本发明制备方法稳定可靠,质量可控,药效显著,具有良好的开发和应用前景。,下面是一种用于降糖降脂的决明子提取物及其制备与质检方法专利的具体信息内容。

1.一种用于降糖或/和降脂的决明子提取物,它是以决明子为原料药材,经乙醇溶液提取、大孔树脂纯化制备得到的产物,所述的作为原料药材的决明子是豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或/和小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子
2.根据权利要求1所述的决明子提取物,其特征在于,所述的以决明子为原料药材,经乙醇水溶液提取、大孔树脂纯化制备得到的产物,是按以下方法制备得到:取决明子为原料药材,将原料药材粉碎后,加生药质量7-9倍的体积分数为60%-95%乙醇水溶液,浸泡过夜,回流提取1-3次,每次1-3小时,合并滤液,滤液回收溶剂至无醇味,并制成浓度为每毫升药液含0.4-0.8克原生药的浓缩液,过D101大孔树脂柱,用水洗脱,洗脱液弃去;再用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥后即得决明子提取物。
3.根据权利要求2所述的决明子提取物,其特征在于,所述用水洗脱具体为:用4倍柱体积水洗脱;所述用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱具体为:用5-7倍柱体积的体积分数为
90%的乙醇水溶液洗脱。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的决明子提取物,其特征在于,每克决明子提取物相当于21-29克决明子原料药材。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的决明子提取物,其特征在于,每100mg决明子提取物中含决明子苷不少于4.4mg,含红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于3.2mg,含橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不少于4.4mg,含决明子苷C不少于3.3mg,含橙黄决明素不少于2.2mg,且以上五种化合物总含量不少于18.5mg。
6.一种用于降糖或/和降脂的决明子提取物的制备方法,包括以下步骤:取决明子为原料药材,所述的作为原料药材的决明子是豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或/和小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子,将原料药材粉碎后,加7-9倍生药量的60%-95%乙醇水溶液,浸泡过夜,回流提取1-3次,每次1-3小时,合并滤液;滤液回收溶剂至无醇味,并制成浓度为每毫升溶液含0.4-0.8克原生药的浓缩液,过D101大孔树脂柱,用水洗脱,洗脱液弃去;再用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥后即得决明子提取物。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述用水洗脱具体为:用4倍柱体积水洗脱;所述用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱具体为:用5-7倍柱体积的体积分数为90%的乙醇水溶液洗脱。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,每克决明子提取物相当于21-29克决明子原料药材。
9.一种用于降糖降脂的决明子提取物的质量检测方法,包括以下步骤:
分别制备待检测决明子提取物供试品溶液和含有决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷、橙黄决明素的混合对照品溶液,采用高效液相色谱法同时测定决明子提取物中2种蒽醌类成分和3种并吡喃类成分的含量,色谱条件为:采用高效液相色谱仪,以UVD为检测器;以规格5μm,4.6mm×250mm的安捷伦TC-C18为色谱柱;检测波长为280nm;柱温为25℃;流速为1.0ml/min;进样量为10μl;流动相为乙腈-
0.1%甲酸溶液,以乙腈为流动相A,0.1%甲酸溶液为流动相B;梯度洗脱条件为0~10min,流动相A为15%;10~60min,流动相A为15%~20%;60~70min,流动相A为20%~25%;70~100min,流动相A为25%~70%;测定各峰面积,计算2种蒽醌类成分和3种萘并吡喃酮类成分的含量。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法,其特征在于,所述的制备待检测决明子提取物供试品溶液的具体方法是:取待检测决明子提取物20mg,置25ml容量瓶中,加甲醇超声使溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液为供试品溶液。
11.根据权利要求9所述的质量检测方法,其特征在于,所述的制备含有决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷、橙黄决明素的混合对照品溶液的具体方法是:分别取化学标准品决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷C、橙黄决明素,称定,置10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成每ml含有决明子苷36μg、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷36μg、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷39μg、决明子苷C30μg、橙黄决明素21μg的混合对照品溶液。
12.根据权利要求9、10或11所述的质量检测方法,其特征在于,每100mg决明子提取物中含决明子苷不少于4.4mg,含红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于3.2mg,含橙黄决明素-
6-O-葡萄糖苷不少于4.4mg,含决明子苷C不少于3.3mg,含橙黄决明素不少于2.2mg,且以上五种化合物总含量不少于18.5mg。
13.权利要求1至4中任一项所述的决明子提取物在制备用于降糖或/和降脂药物或保健品中的应用。
14.一种用于降糖或/和降脂的药物或保健品制剂,其特征在于,含有权利要求1至4中任一项所述的决明子提取物和药学上可接受的载体、添加剂或赋型剂。

说明书全文

一种用于降糖降脂的决明子提取物及其制备与质检方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域,涉及中药材提取物,具体涉及决明子提取物和具有降糖降脂作用提取物之制备方法和质量检测方法,以及在制备医药品和保健品中的应用。

背景技术

[0002] 随着社会经济的快速发展及人们的生活方式的改变,高热量、高脂肪饮食的摄入量增多,患有高血糖、高血脂、高血压的“三高”人群日益增多。高血糖平是由于体内胰岛素产生和功能障碍而导致的,可发展为糖尿病及其并发症;高血脂水平是指体内胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白与高密低脂蛋白等代谢异常,可引起冠心病等心脑血管病。
[0003] 而高血糖高血脂目前尚缺乏根治药物,多以西药为主,但存在低血糖症、胃肠道反应和肝脏不良反应等副作用。临床实践表明,中药治疗高血糖高血脂具有安全经济,副作用小的特点,是筛选降糖降脂药物的宝库。
[0004] 决明子为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子,是我国传统中药,最早记载于《神农本草经》,具有清热明目,润肠通便的功效。现代药理研究表明,决明子具有降压、抗糖尿病、肝保护、肾保护、改善高脂血症、抗化等作用。
[0005] 决明子主要活性成分为蒽醌类、并吡喃类化合物,具有降脂、降压、抗糖尿病等作用。D101大孔树脂在中药提取纯化方面具有广泛运用,它对决明子蒽醌类与萘并吡喃酮类化合物吸附强,可以进行富集纯化。现有决明子提取纯化或含量测定研究多缺少药理活性支持;或者简单水醇提取后即用于药理活性研究,因此服用量较大,有效成分含量低。本发明提供的决明子提取物以主要功效成分为指标,采用现代工艺提取纯化得到,服用量大大减少;并制定了相应的质量标准,有效成分明确;以及通过药理实验确证决明子提取物的功效,因此更为综合地控制与评价决明子提取物,对开发决明子提取物作为保健品和药品应用于医药和市场中具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的任务是提供一种用于降糖和降脂的决明子提取物。
[0007] 本发明的另一个任务是提供这种用于降糖和降脂的决明子提取物的制备方法。
[0008] 本发明的又一个任务是提供这种用于降糖和降脂的决明子提取物的质量检测方法。
[0009] 实现本发明的技术方案是:
[0010] 本发明提供的用于降糖和降脂的决明子提取物,是以决明子为原料药材,经乙醇水溶液提取、大孔树脂纯化制备得到的产物。
[0011] 所述的作为原料药材的决明子是豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或/和小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子。
[0012] 所述的以决明子为原料药材,经乙醇水溶液提取、大孔树脂纯化制备得到的产物,是按以下方法制备得到:取决明子为原料药材,将原料药材粉碎后,加7-9倍生药量的体积分数为60%-95%乙醇水溶液,浸泡过夜,回流提取1-3次,每次1-3小时,合并滤液,滤液回收溶剂至无醇味,并制成浓度为每毫升药液含0.4-0.8克原生药的浓缩液,过D101大孔树脂柱,用水洗脱,洗脱液弃去;再用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥后即得决明子提取物。其中,所述用水洗脱具体可以为:用4倍柱体积水洗脱;所述用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱具体可以为:用5-7倍柱体积的体积分数为90%的乙醇水溶液洗脱。每克决明子提取物相当于21-29克决明子原料药材,每100mg决明子提取物中含决明子苷不少于4.4mg,含红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于3.2mg,含橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不少于4.4mg,含决明子苷C不少于3.3mg,含橙黄决明素不少于2.2mg,且以上五种化合物总含量不少于18.5mg。
[0013] 本发明提供用于降糖和降脂的决明子提取物的制备方法是:
[0014] 取决明子为原料药材,所述的作为原料药材的决明子是豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或/和小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子,将原料药材粉碎后,加7-9倍生药量的60%-95%乙醇水溶液,浸泡过夜,回流提取1-3次,每次1-3小时,合并滤液;滤液回收溶剂至无醇味,并制成浓度为每毫升溶液含0.4-0.8克原生药的浓缩液,过D101大孔树脂柱,用水洗脱,洗脱液弃去;再用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥后即得决明子提取物。其中所述用水洗脱可以为:用4倍柱体积水洗脱;所述用5-7倍柱体积的乙醇水溶液洗脱可以为:用5-7倍柱体积的体积分数为90%的乙醇水溶液洗脱。每克决明子提取物相当于21-29克决明子原料药材。
[0015] 本发明所述的决明子提取物的质量检测方法,即含量限定检测方法,包括以下步骤:
[0016] 分别制备待检测决明子提取物供试品溶液和含有决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷、橙黄决明素的混合对照品溶液,采用高效液相色谱法同时测定决明子提取物中2种蒽醌类成分和3种萘并吡喃酮类成分的含量,色谱条件为:采用高效液相色谱仪,以UVD为检测器;以规格5μm,4.6mm×250mm的安捷伦TC-C18为色谱柱;检测波长为280nm;柱温为25℃;流速为1.0ml/min;进样量为10μl;流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液,以乙腈为流动相A,0.1%甲酸溶液为流动相B;梯度洗脱条件为0~10min,流动相A为15%;10~60min,流动相A为15%~20%;60~70min,流动相A为20%~
25%;70~100min,流动相A为25%~70%;测定各峰面积,计算2种蒽醌类成分和3种萘并吡喃酮类成分的含量,每100mg本发明提供的决明子提取物中含决明子苷不少于4.4mg,含红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不少于3.2mg,含橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不少于4.4mg,含决明子苷C不少于3.3mg,含橙黄决明素不少于2.2mg,且以上五种化合物总含量不少于
18.5mg。
[0017] 本发明提供的决明子提取物的质量检测方法,还可以包括对决明子提取物的性状检测,具体检测方案为:决明子提取物为棕黑色粉末,微有豆腥气,味微苦。
[0018] 本发明属于医药领域,公开了一种用于降糖降脂的决明子提取物及其制备和质量检测方法。本发明提取物是以决明子为原料药材,经乙醇水溶液提取和大孔树脂纯化制得的产物。本发明提取物的质量检测方法是包括性状和含量限定检测,含量限定检测采用高效液相色谱法同时测定决明子提取物中2种蒽醌类成分和3种萘并吡喃酮成分的含量,即采用高效液相色谱法一次性同时检测5种有效成分的含量,方法学考察结果良好。本发明提供的决明子提取物具有良好的降糖降脂功效,本发明提供的决明子提取物质量检测方法能有效控制决明子提取物及以决明子提取物为活性物质制备的保健品与药剂的质量。药理实验证明本发明提供的决明子提取物具有良好的降糖降脂功效,可用于制备降糖降脂的药物和保健品。本发明制备方法稳定可靠,质量可控,药效显著,具有良好的开发和应用前景。
[0019] 本发明具有如下优点:(1)本发明提供了一种用于降糖降脂的决明子提取物的制备方法,以有效成分橙黄决明素的含量为指标,采用单因素试验与正交优化设计试验,优化出以乙醇水溶液提取,D101大孔树脂纯化的制备方法。本发明制备方法提取效率高,实用性强,适用于决明子提取物工业化生产。(2)本发明提供了一种降糖降脂的决明子提取物的质量检测方法,分别测定了决明子提取物的性状和成分含量。首次采用高效液相色谱法同时测定以下5种成分的含量:决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷C、橙黄决明素,既包含蒽醌类成分又包含萘并吡喃酮类成分,既包括苷类成分又包括苷元成分,较为全面地测定决明子的有效成分。经过方法学考察,本发明含量测定方法的线性、精密度、稳定性、重复性、加样回收率良好,各峰之间分离度良好,对决明子提取物及其保健品与药剂的质量标准的制定具有重要的意义。(3)本发明提供了一种用于降糖降脂的决明子提取物,有效成分蒽醌类化合物与萘并吡喃酮类化合物含量高,服用量大大减少。药理实验确证决明子提取物的功效确切,能够显著降低糖尿病大鼠的空腹血糖,改善口服糖耐量,改善胰岛素抵抗,降低糖化血红蛋白含量,改善血脂代谢紊乱。本发明决明子提取物可应用于降糖降脂的保健品和药剂中,具有良好的开发和应用前景。附图说明
[0020] 图1为决明子提取物纯化制备过程中D101大孔树脂不同溶剂洗脱曲线图:(A)各流分中浸膏质量与(B)各流分中橙黄决明素质量;
[0021] 图2为决明子提取物含量检测的高效液相色谱图:(A)化学对照品与(B)提取物供试品;1.决明子苷,2.红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷,3.橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷,4.决明子苷C,5.橙黄决明素;
[0022] 图3为决明子提取物对糖尿病大鼠血糖的影响;
[0023] 图4为决明子提取物对糖尿病大鼠口服糖耐量的影响;
[0024] 图5为决明子提取物对糖尿病大鼠血脂的影响:(A)总胆固醇,(B)总甘油三酯,(C)高密度脂蛋白胆固醇及(D)低密度脂蛋白胆固醇。

具体实施方式

[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0026] 实施例1
[0027] 本发明决明子提取物的制备工艺优化过程如下:
[0028] 1.1仪器与试药
[0029] Agilent1260高效液相色谱仪,华溪HX-200型高速中药粉碎机(浙江省永康市溪岸五金药具厂),KH5200声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司),HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司),JE602型分析天平(上海浦春计量仪器有限公司),其他为实验室常见仪器。
[0030] 决明子购自武汉市解放大道天一中医医院同仁堂药店,由华中科技大学同济医学院药学院陈家春教授鉴定为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子。标本存于华中科技大学同济药学院生药学教研室。橙黄决明素(批号:160618)购于北京万佳首化生物科技有限公司,D101、AB-8、S-8大孔树脂购自上海树脂厂,乙腈购自Sigma Aldrich(美国),水为双蒸水,其它试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。
[0031] 1.2实验方法与结果
[0032] 1.2.1决明子提取物的提取工艺正交优化
[0033] 取决明子(批号JMZ2016111801)粉末10g,按照正交优化表1,考察提取溶剂(60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇),提取时间和提取次数(60min提3次、20min提2次、120min提1次),料液比(1:6、1:8、1:10)对提取结果的影响。参照2015版中国药典一部中决明子含量测定项下橙黄决明素的测定方法,对提取物进行酸水解后测定橙黄决明素,结果见表2-3,以提取得到的橙黄决明素总质量(mg)为指标,各因素作用大小依次为:乙醇浓度>提取时间和提取次数>料液比,其中乙醇浓度对提取结果有着显著性影响(P<0.05),最优水平为A2B3C2,即最优提取工艺为80%乙醇、120min提1次、料液比1:8。
[0034] 表1 提取工艺正交试验因素水平
[0035]
[0036] 表2 提取工艺正交优化结果直观分析
[0037]
[0038] 表3 提取工艺正交优化结果方差分析表
[0039]
[0040]
[0041] F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00
[0042] 1.2.2决明子提取物的纯化工艺优化
[0043] 1.2.2.1不同树脂筛选
[0044] 取决明子(批号JMZ2017032307)粉末10g,按1.2.1项下最优提取工艺得到提取液,挥干乙醇,加水至0.4g/ml为上样液。分别上D101、AB-8、S-8大孔树脂柱(大孔树脂60g,柱体积(BV)120ml),过夜吸附;水洗、90%乙醇洗各4BV,参照2015版中国药典一部中决明子含量测定项下橙黄决明素的测定方法,对提取物进行酸水解后测定橙黄决明素,以提取得到的橙黄决明素总质量(mg)为指标。水洗脱液中未检出橙黄决明素,90%乙醇洗脱液中橙黄决明素质量结果见表4。发现S-8出现死吸附,D101纯化效果比AB-8好,因此树脂筛选为D101大孔树脂。
[0045] 表4 不同大孔树脂筛选
[0046]
[0047] 1.2.2.2洗脱溶剂筛选
[0048] 取决明子药材(批号JMZ2017021505)80g,按1.2.1项下最优提取工艺得到提取液,挥去乙醇,加水至上样液浓度为0.4g/ml,上大孔树脂柱(D101大孔树脂80g,柱体积(BV)150ml),过夜吸附。以水,50%,70%,95%乙醇,丙酮梯度洗脱,每梯度洗脱700ml(约4BV),参照2015版中国药典一部中决明子含量测定项下橙黄决明素的测定方法,对提取物进行酸水解后测定橙黄决明素,以提取得到的橙黄决明素总质量(mg)为指标。结果如图1所示,水洗脱液中浸膏量高且基本不含指标成分,所以可用水洗除杂,水洗体积4BV。橙黄决明素在
50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇均有洗脱,95%乙醇基本洗脱干净,丙酮中几乎没有残留。考虑到尽可能不丢失有效成分及工业生产中的运用,洗脱浓度定为90%乙醇水溶液,洗脱体积需要进一步优化。
[0049] 1.2.2.3 D101大孔树脂纯化条件的正交优化
[0050] 取决明子(批号JMZ2017032307)粉末10g,按1.2.1项下最优提取工艺得到提取液,按照正交优化表5,考察上样液浓度(0.4g/ml、0.6g/ml、0.8g/ml),上样量(生药量:树脂量2:1、生药量:树脂量1:1、生药量:树脂量1:2),90%乙醇水溶液洗脱体积(5BV、6BV、7BV)对大孔树脂纯化工艺的影响。参照2015版中国药典一部中决明子含量测定项下橙黄决明素的测定方法,对提取物进行酸水解后测定橙黄决明素,以提取得到的橙黄决明素质量(mg)为指标,结果见表6-7,各因素作用大小依次为:上样液浓度>上样量>90%乙醇洗脱体积,最优条件为上样液浓度0.6g/ml,上样量1:1,90%乙醇水溶液洗脱体积6BV。
[0051] 表5 D101正交试验因素水平
[0052]
[0053] 表6 D101正交设计试验结果直观分析
[0054]
[0055]
[0056] 表7 D101正交设计结果方差分析表
[0057]
[0058] F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00
[0059] 根据以上优化实验,最终确定决明子提取物纯化工艺为:上样液浓度0.6g/ml,D101大孔树脂装柱,树脂量与生药量为1:1,过夜吸附,次日先用4BV水洗脱,弃去,再用6BV 90%乙醇水溶液洗脱,保留,真空干燥即得。
[0060] 1.2.3决明子提取物制备工艺验证
[0061] 根据1.2.1与1.2.2项下优化结果得出决明子提取物制备工艺为:决明子药材粉碎后,料液比1:8加80%乙醇水溶液浸泡过夜,回流提取2小时,提取1次,过滤,挥干溶剂至无醇味;将提取液制成0.6g/ml上样液,D101大孔树脂柱装柱,过夜吸附。水洗4BV,弃去;90%乙醇水溶液洗脱6BV,保留,真空干燥即得。取决明子(批号JMZ2017032307)粉末90g,进行三次验证,结果如表8,表明决明子制备工艺稳定可控。
[0062] 表8 制备工艺验证
[0063]
[0064]
[0065] 实施例2
[0066] 本发明决明子提取物的制备操作如下:
[0067] 2.1仪器与试药
[0068] 同1.1。
[0069] 2.2实验方法与结果
[0070] 取三批决明子(JMZ2017122010,JMZ2017122511,JMZ2017122512)药材各1.8kg,粉碎后,8倍量80%乙醇14.4L浸泡过夜,回流提取2h,提取1次,过滤,挥干溶剂至无醇味;将提取液制成浓度为每毫升溶液含有0.6g原生药的浓缩液。D101大孔树脂柱装柱,柱体积2L,过夜吸附。次日水洗8L,弃去洗脱液;90%乙醇水溶液洗脱12L,收集洗脱液,回收溶剂,水浴蒸干,真空干燥后,研细,得到决明子提取物,为棕黑色粉末,有豆腥气,味微苦。决明子提取物平均提取率为4%。见表9。
[0071] 表9 决明子提取物的制备
[0072]
[0073] 综合三批决明子提取物的性状和提取率,其标准定为:决明子提取物为棕黑色粉末,微有豆腥气,味微苦;每克提取物相当于21-29克决明子药材。
[0074] 实施例3
[0075] 本发明决明子提取物的含量测定方法如下:
[0076] 3.1仪器与试药
[0077] 对照品决明子苷(批号:20161216),决明子苷C(批号:20161215)购于成都昂赛思生物科技有限公司,红莲霉素-6-O-β-D-龙胆二糖苷(批号:MUST-18030212)购于成都曼思特生物科技有限公司,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷(批号:101712)购于江苏永健医药科技有限公司,其他仪器与试药同1.1。
[0078] 3.2实验方法与结果
[0079] 3.2.1供试品溶液的制备
[0080] 取2.2项下决明子提取物(JMZ2017122010)20mg,精密称定,置25ml容量瓶中,加甲醇超声使溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
[0081] 3.2.2对照品溶液的制备
[0082] 分别取决明子标准品决明子苷、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷C、橙黄决明素适量,精密称定,置10ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配成每ml含有决明子苷36μg、红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷36μg、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷39μg、决明子苷C 30μg、橙黄决明素21μg的混合对照品溶液。
[0083] 3.2.3色谱条件
[0084] 采用高效液相色谱,以UVD为检测器;以规格为5μm,4.6mm×250mm的安捷伦TC-C18作为色谱柱;以乙腈为流动相A,0.1%甲酸溶液为流动相B;梯度洗脱的条件为0~10min,流动相A为15%;10~60min,流动相A为15%~20%;60~70min,流动相A为20%~25%;70~100min,流动相A为25%~70%;流速为1.0ml/min,柱温为25℃,进样量为10μl,检测波长为
280nm。对照品图和样品图见图2。
[0085] 3.2.4线性关系
[0086] 取3.2.2项下混合对照品溶液,分别进样4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl,按3.2.3项下色谱条件测定各峰面积,以峰面积为纵坐标(Y),进样量(μg)为横坐标(X),绘制标准曲线,结果见表10。
[0087] 表10 线性关系
[0088]
[0089] 3.2.5精密度
[0090] 取3.2.2项下混合对照品溶液,连续进样6次,按3.2.3项下色谱条件测定各峰面积,计算其RSD,结果见表11。5种对照品的RSD分别为决明子苷0.38%,红链霉素-6-O-β-龙胆二糖苷0.33%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷0.32%,决明子苷C 0.33%,橙黄决明素0.36%。表明仪器的精密度良好。
[0091] 表11 精密度试验
[0092]
[0093] 3.2.6稳定性
[0094] 按3.2.1项下操作制备供试品溶液,在第0h,2h,4h,6h,8h,12h,24h进样,按3.2.3项下色谱条件测定各峰面积,计算其RSD,结果见表12。各峰RSD分别为决明子苷1.40%,红链霉素-6-O-β-龙胆二糖苷0.83%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷0.84%,决明子苷C 0.77%,橙黄决明素0.69%。表明供试品在24h内稳定性良好。
[0095] 表12 稳定性试验
[0096]
[0097] 3.2.7重复性
[0098] 按3.2.1项下操作平行制备6份供试品溶液,进样。按3.2.3项下色谱条件测定各峰面积,计算其含量及RSD,结果见表13。其RSD分别为决明子苷1.35%,红链霉素-6-O-β-龙胆二糖苷1.41%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷1.46%,决明子苷C 1.45%,橙黄决明素1.49%。表明重复性良好。
[0099] 表13 重复性试验
[0100]
[0101]
[0102] 3.2.8回收率试验
[0103] 分别取已知含量(含决明子苷5.47%、红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷4.56%、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷5.66%、决明子苷C 4.00%、橙黄决明素2.78%)的决明子提取物9份,每份约10mg,精密称定,置于25ml容量瓶中,精密量取并加入3.2.2项下混合对照品溶液8.9ml各三份,11.1ml各三份,13.3ml各三份,按3.2.1项下操作制备供试品溶液,分别进样,按3.2.3项下色谱条件测定各峰面积,计算回收率及RSD,结果见表14。决明子苷、红镰霉素-
6-O-β-龙胆二糖苷、橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷、决明子苷C、橙黄决明素的平均回收率分别为99.93%,97.66%,98.53%,100.00%,97.56%,RSD分别为2.68%,1.93%,1.78%,
1.65%,1.72%,表明方法加样回收结果良好。
[0104] 表14 回收率试验
[0105]
[0106]
[0107]
[0108] 3.2.9样品含量测定
[0109] 分别取2.2项下三批决明子提取物,按3.2.1项下操作制备供试品溶液,按3.2.3项下色谱条件测定各峰面积,计算含量,结果见表15。决明子提取物各成分的平均含量为决明子苷5.07%,红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷3.79%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷5.17%,决明子苷C 3.79%,橙黄决明素2.50%。
[0110] 表15 决明子提取物含量测定(n=3)
[0111]
[0112] 综合三批含量测定结果,决明子提取物含量限度规定为:含决明子苷不得少于4.4%,红莲霉素-6-O-β-龙胆二糖苷不得少于3.2%,橙黄决明素-6-O-葡萄糖苷不得少于
4.4%,决明子苷C不得少于3.3%,橙黄决明素不得少于2.2%。以上五种化合物总含量不得少于18.5%。
[0113] 实施例4
[0114] 本发明决明子提取物对STZ诱导的糖尿病大鼠的降脂降糖作用如下:
[0115] 4.1仪器与试药
[0116] 血糖仪(Bayer,德国);Ultra2糖化血红蛋白仪(Primus,美国);全自动生化分析仪(Beckman coulter,美国)。决明子提取物(批号JMZ2017122010)。链脲佐菌素(STZ),戊巴比妥钠购自Sigma Aldrich(美国)。盐酸二甲双胍片购于中美上海施贵宝公司。高脂高糖饲料(D12451)购于武汉鼠来宝生物科技有限公司。大鼠胰岛素试剂盒购于武汉贝茵莱生物科技有限公司。其他仪器与试药同1.1。
[0117] 4.2实验动物
[0118] Wistar大鼠,雄性,180-220g/只,由湖北省疾病预防控制中心提供。本实验遵循《湖北省实验动物管理条例》的指导方针。动物实验方案经华中科技大学同济医学院实验动物伦理委员会批准。
[0119] 大鼠购入后适应性饲养1周,期间自由饮水、饮食,室温控制在(22±2)℃,湿度60%左右,光照12h和黑暗12h循环。适应性喂养后,大鼠分为两大组:一组(10只)继续以普通饲料喂养,一组(50只)以高脂高糖饲料喂养,喂养2周后,高脂高糖饲料组大鼠在禁食不禁水12小时后,腹腔注射STZ 40mg/kg(柠檬酸钠缓冲溶液溶解,pH 4.5);正常组大鼠腹腔注射柠檬酸钠缓冲溶液。两周后禁食不禁水10小时,尾尖取血测血糖,血糖值(FBG)
11.1mmol/L的大鼠选取为糖尿病大鼠。
[0120] 4.2实验方法与结果
[0121] 4.2.1决明子提取物对糖尿病大鼠血糖的影响
[0122] 4.2.1.1决明子提取物对糖尿病大鼠空腹体重、空腹血糖的影响
[0123] 35只糖尿病大鼠随机分为5组,每组7只;正常组7只。灌胃体积5ml/kg。实验过程中,正常组大鼠以普通饲料喂养,糖尿病大鼠以高脂高糖饲料喂养。
[0124] 1)正常组:给予0.1%CMC-Na溶液;2)模型组:给予0.1%CMC-Na溶液;3)阳性药组:给予二甲双胍150mg/(kg·d);4)决明子提取物低剂量组:给予决明子提取物27mg/(kg·d);5)决明子提取物中剂量组:给予决明子提取物54mg/(kg·d);6)决明子提取物高剂量组:给予决明子提取物81mg/(kg·d)。
[0125] 给药前0天,给药后7、14、21、28、35、42、49、56天,禁食10小时,称重,测空腹血糖(FBG),结果见表16-17、图3。
[0126] 如表16所示,给药8周后,模型组大鼠体重下降,其余各组体重均有所上升(P<0.01),表明糖尿病大鼠体重减轻的症状得到改善。
[0127] 表16 决明子提取物对糖尿病大鼠体重的影响(n=7)
[0128]
[0129] 所有结果均以平均数±标准差表示,采用t检验评价显著性差异,**P<0.01,*0.01≤P<0.05,与模型组相比。
[0130] 血糖是糖尿病最重要的检测指标。如表17、图3所示,与正常组相比,模型组大鼠的血糖一直在上升(P<0.01);与模型组相比,阳性药组在给药第14天时空腹血糖开始下降(P<0.05),决明子提取物中剂量组和高剂量组在第28天时空腹血糖开始下降(P<0.05),决明子低剂量组在第42天开始下降(P<0.01),表明决明子提取物对糖尿病大鼠有一定降血糖作用。
[0131] 表17 决明子提取物对糖尿病大鼠空腹血糖的影响
[0132]
[0133] 所有结果均以平均数±标准差表示,采用t检验评价显著性差异,**P<0.01,*0.01≤P<0.05,与模型组相比。
[0134] 4.2.1.2决明子提取物对糖尿病大鼠口服糖耐量(OGTT)的影响
[0135] 口服葡萄糖耐受实验(OGTT)是一种糖负荷实验,用以衡量机体对摄入葡萄糖后的血糖调节能力。给药52天后,禁食12小时,进行口服葡萄糖耐量(OGTT)实验。结果如表18、图4所示,与正常组相比,模型组大鼠糖负荷后1小时达到峰值,之后略有下降,各时段血糖值和曲线下面积与正常组相比具有显著性差异(P<0.01);与模型组相比,阳性药组与决明子提取物组大鼠糖负荷0.5小时达到峰值,之后持续下降,各组血糖值与模型组相比有显著性差异(P<0.01);与模型组相比,阳性药组曲线下面积下降了51.6%,决明子提取物各组分别下降19.2%、30.9%、35.8%,有显著性差异(P<0.01),表明决明子提取物能提高糖尿病大鼠对葡萄糖的耐受量。
[0136] 表18 决明子提取物对糖尿病大鼠口服糖耐量的影响(n=6)
[0137]
[0138] 所有结果均以平均数±标准差表示,采用t检验评价显著性差异,**P<0.01,*0.01≤P<0.05,与模型组相比。
[0139] 4.2.1.3决明子提取物对糖尿病大鼠空腹胰岛素(FINS),胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和糖化血红蛋白(HbA1c)的影响
[0140] 胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)是评判胰岛素抵抗的重要指标,其计算公式为:HOMA-IR=FINS(μIU/ml)×FBG(mmol/L)/22.5。糖化血红蛋白(HbA1c)是血液中携带氧的血红蛋白与血糖结合的产物,其浓度与血糖浓度成正比。糖化血红蛋白可反映体内一段时间整体的血糖水平,被推荐为糖尿病诊断的重要指标。
[0141] 给药60天后,禁食10小时,称重,用戊巴比妥钠45mg/kg麻醉,心脏取血。一部分血液4℃静置2小时后,4500转每分钟离心10分钟取血清,一部分置于含EDTA的采血管中,用于生化指标的测定。取适量血清,ELISA法测定大鼠FINS;取适量全血,用糖化仪检测HbA1c。如表19所示,与正常组相比,模型组大鼠的血清胰岛素含量降低、胰岛素抵抗指数升高、糖化血红蛋白含量升高,有显著性差异(P<0.01);与模型组相比,阳性药与决明子提取物各组的血清胰岛素含量升高、胰岛素抵抗指数降低、糖化血红蛋白含量降低,均有极显著性差异(P<0.01),体现决明子提取物的抗糖尿病活性。
[0142] 表19 决明子提取物对糖尿病大鼠胰岛素抵抗指数及糖化血红蛋白的影响(FBG,FINS,n=7;HbA1c,n=6)
[0143]
[0144] 所有结果均以平均数±标准差表示,采用t检验评价显著性差异,**P<0.01,*0.01≤P<0.05,与模型组相比。
[0145] 4.2.2决明子提取物对糖尿病大鼠血脂的影响
[0146] 二型糖尿病常伴有脂质代谢紊乱。取部分血清,用全自动生化仪检测总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。结果如表20所示,与正常组相比,模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C升高,HDL-C降低,有显著性差异(P<0.01),表明模型组大鼠血脂代谢紊乱;与模型组相比,阳性药组、决明子提取物组大鼠血清中TC、TG、LDL-C显著降低,HDL-C显著升高(P<0.01);与阳性药组相比,决明子提取物高剂量组大鼠血清中TG的含量有显著性差异(P<0.01);提示给药组对糖尿病大鼠血脂代谢的改善作用,决明子提取物高剂量组的效果较好。
[0147] 表20 决明子提取物对糖尿病大鼠血脂的影响(n=7)
[0148]
[0149] 所有结果均以平均数±标准差表示,采用t检验评价显著性差异,**P<0.01,*0.01≤P<0.05,与模型组相比;##P<0.01,#0.01≤P<0.05,与阳性药组相比。
[0150] 综上所述,药理实验表明决明子提取物具有良好的降糖降脂功效,可作为保健品或药品应用于高血糖高血脂的治疗中,具有良好的开发和市场前景。
[0151] 本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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