降解木质素纤维素材料的方法
阅读：999发布：2020-07-08
专利汇可以提供降解木质素纤维素材料的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及降解木质素 纤维 素材料的方法，其包括：在至少一种选自仲醇乙 氧 基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、十三烷基乙氧基化物和聚氧乙烯醚的 表面活性剂 存在的条件下，用有效量的一种或多种 纤维素 分解酶处理木质素纤维素材料，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解。本发明也涉及产生有机物质的方法，其包含：(a)在至少一种上述表面活性剂存在的条件下用有效量的一种或多种纤维素分解酶将木质素纤维素材料 糖化 ；(b)用一种或多种 发酵 微 生物 将步骤(a)糖化的木质素纤维素材料发酵；和(c)从发酵物中回收有机物质。，下面是降解木质素纤维素材料的方法专利的具体信息内容。
1.降解木质素纤维素材料的方法，其包括：在至少一种选自仲醇乙氧基化物和脂肪醇乙氧基化物的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶处理木质素纤维素材料，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解。
2.权利要求1的方法，其中所述木质素纤维素材料选自草本物质、农业残余物和林业残余物。
3.权利要求1的方法，其中所述木质素纤维素材料选自城市固体废物。
4.权利要求1的方法，其中所述木质素纤维素材料选自废纸。
5.权利要求1的方法，其中所述木质素纤维素材料选自纸浆和造纸厂残余物。
6.权利要求1的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和beta-葡萄糖苷酶。
7.权利要求1的方法，还包含用有效量的一种或多种选自半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物的酶处理木质素纤维素材料。
8.权利要求1的方法，其中所述方法是预处理方法。
9.权利要求1的方法，其中所述方法包括同时糖化和发酵方法的步骤。
10.权利要求1的方法，其中所述方法包括杂合水解和发酵方法的步骤。
11.权利要求1的方法，还包含回收降解的木质素纤维素材料。
12.产生有机物质、氢、二氧化碳或一氧化碳的方法，其包括：
(a)在至少一种选自仲醇乙氧基化物和脂肪醇乙氧基化物的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶将木质素纤维素材料糖化，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解；
(b)用一种或多种发酵微生物将步骤(a)糖化的木质素纤维素材料发酵；和
(c)从发酵物中回收有机物质、氢、二氧化碳或一氧化碳。
13.权利要求12的方法，其中所述木质素纤维素材料选自草本物质、农业残余物和林业残余物。
14.权利要求12的方法，其中所述木质素纤维素材料选自城市固体废物。
15.权利要求12的方法，其中所述木质素纤维素材料选自废纸。
16.权利要求12的方法，其中所述木质素纤维素材料选自纸浆和造纸厂残余物。
17.权利要求12的方法，其中所述木质素纤维素材料是玉米秸。
18.权利要求12的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和beta-葡萄糖苷酶。
19.权利要求12的方法，还包含用有效量的一种或多种选自半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物的酶处理木质素纤维素材料。
20.权利要求12的方法，其中步骤(a)和(b)在同一容器中同时进行。
21.权利要求12的方法，其中所述有机物质是醇、有机酸、酮或氨基酸。
22.权利要求12的方法，其中所述有机物质是气体。
23.权利要求21的方法，其中所述醇是阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇或木糖醇。
24.权利要求21的方法，其中所述有机酸是乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、
2,5二酮-D-葡糖酸、甲酸、延胡索酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸或木糖酸。
25.权利要求21的方法，其中所述酮是丙酮。
26.权利要求21的方法，其中所述氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
27.权利要求22的方法，其中所述气体是甲烷。
降解木质素纤维素材料的方法
[0001] 本发明申请是基于申请日为2005年1月14日，申请号为“200580008584.6”(国际申请号为PCT/US2005/001273)，发明名称为“降解木质素纤维素材料的方法”的专利申请的分案申请。
[0003] 本 发 明 依 据 能 源 部(Department of Energy)提 供 的NREL 转 包 合 同No.ZCO-30017-02，基本合同DE-AC36-98GO10337，在政府支持下做出。政府在本发明中拥有一定权利。
[0004] 发明背景
技术领域
[0005] 本发明涉及降解木质素纤维素材料(lignocellulosic material)的方法。
背景技术
[0006] 植物中大多数碳水化合物为木质素纤维素的形式，其主要由纤维素、半纤维素、果胶(pectin)和木质素(lignin)组成。木质素纤维素被发现存在于，例如，植物的茎、叶、果皮(hull)、果壳(husk)和穗轴(cob)。这些聚合物的水解释放中性糖的混合物，所述的中性糖包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
[0007] 纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶(endoglucanase)、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、葡糖水解酶(glucohydrolase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开以被纤维二糖水解酶攻击。葡糖水解酶从纤维素聚合物的末端释放葡萄糖的分子。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序地释放纤维二糖的分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性β-1,4-键二聚物。β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。
[0008] 半纤维素是短的支链杂多糖，其由多种己糖(葡萄糖、甘露糖和半乳糖)、戊糖(D-木糖和L-阿拉伯糖)、糖醛酸(uronic酸)、乙酸和其它较小的糖(minorsugar)组成。与纤维素降解相似，半纤维素水解需要多种酶的协同作用(coordinated action)，所述的酶可分为三种主要类别，内作用酶(endo-acting enzyme)，其攻击多糖链中内部的键，外作用酶(exo-acting enzyme)，其直接作用于多糖链的还原性或非还原性末端，和辅助的酶(乙酰酯酶(acetylesterase)和酯酶(esterase)，其水解木质素糖苷键(lignin glycoside bonds))。
[0009] 可使用木质素纤维素材料，诸如木材、草本物质、农业残余物、玉米纤维(corn fiber)、废纸、纸浆和造纸厂残余物等产生乙醇。已知的天然生物体不能快速地而且有效地将木质素纤维素生物质中所有碳水化合物聚合物代谢为乙醇。木质素纤维素原料变为乙醇的转化具有如下的优点：大量原料的简便可用性，避免燃烧原料或将原料埋入土壤(land filling)的合意性，和乙醇燃料的清洁度。纤维素一旦转化为葡萄糖，葡萄糖容易被酵母发酵变为乙醇。
[0010] 然而，商业化的障碍是将木质素纤维素材料转化为葡萄糖和其它可发酵的糖类的酶的成本。本领域中需要改进纤维素分解酶将木质素纤维素材料降解为有用的有机产品或降解为有用终产品的中间物的能力。
[0011] 本发明的目的是改进纤维素分解酶降解木质素纤维素材料的能力。
发明内容
[0012] 本发明涉及降解木质素纤维素材料的方法，其包含：在至少一种选自仲醇乙氧基化物(secondary alcohol ethoxylate)、脂肪醇乙氧基化物(fatty alcohol ethoxylate)、壬基酚乙氧基化物(nonylphenol ethoxylate)、十三烷基乙氧基化物(tridecyl ethoxylate)和聚氧乙烯醚(polyoxyethylene ether)的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶处理木质素纤维素材料，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解。
[0013] 本发明也涉及产生有机物质的方法，其包含：
[0014] (a)在至少一种选自仲醇乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、十三烷基乙氧基化物和聚氧乙烯醚的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶将木质素纤维素材料糖化，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解；
[0015] (b)用一种或多种发酵微生物将步骤(a)糖化的木质素纤维素材料发酵；和[0016] (c)从发酵物中回收有机物质。
[0017] 在优选的实施方案中，所述有机物质是醇。
[0018] 具体地，本发明涉及如下各项：
[0019] 1.降解木质素纤维素材料的方法，其包含：在至少一种选自仲醇乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、十三烷基乙氧基化物和聚氧乙烯醚的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶处理木质素纤维素材料，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解。
[0020] 2.项1的方法，其中所述木质素纤维素材料选自草本物质、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆和造纸厂残余物。
[0021] 3.项1的方法，其中所述木质素纤维素材料是玉米秸。
[0022] 4.项1的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。
[0023] 5.项1的方法，其中所述纤维素裂解酶是纤维素酶。
[0024] 6.项1的方法，其中所述纤维素裂解酶是内切葡聚糖酶。
[0025] 7.项1的方法，其中所述纤维素裂解酶是纤维二糖水解酶。
[0026] 8.项1的方法，其中所述纤维素裂解酶是β-葡萄糖苷酶。
[0027] 9.项1的方法，其中所述表面活性剂是仲醇乙氧基化物。
[0028] 10.项9的方法，其中所述仲醇乙氧基化物表面活性剂具有式C11-15H23-31O(CH2CH2O)xH，其中x为5、9、12或20。
[0029] 11.项1的方法，其中所述表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物。
[0030] 12.项11的方法，其中所述脂肪醇乙氧基化物表面活性剂具有式C16-18H33-37O(CH2CH2O)xH，其中x为50或80。
[0031] 13.项1的方法，其中所述表面活性剂是壬基酚乙氧基化物。
[0032] 14.项13的方法，其中所述壬基酚乙氧基化物表面活性剂具有式C9H19C6H4(CH2CH2O)xOH，其中x为9.3。
[0033] 15.项1的方法，其中所述表面活性剂是十三烷基乙氧基化物。
[0034] 16.项15的方法，其中所述十三烷基乙氧基化物表面活性剂具有式C13-15H27-31O(CH2CH2O)xH，其中x为6.6或8.5。
[0035] 17.项1的方法，其中所述表面活性剂是聚氧乙烯醚。
[0036] 18.项17的方法，其中所述聚氧乙烯醚表面活性剂具有式C12-18H25-37(CH2CH2O)xOCH2CHO，其中x为10、20和23。
[0037] 19.项1的方法，还包含用有效量的一种或多种选自半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物的酶处理木质素纤维素材料。
[0038] 20.项19的方法，其中所述酯酶是脂肪酶、磷脂酶、角质酶或其混合物。
[0039] 21.项1的方法，其中所述方法是预处理方法。
[0040] 22.项1的方法，其中所述方法是同时糖化和发酵方法(SSF)的步骤。
[0041] 23.项1的方法，其中所述方法是杂合水解和发酵方法(HHF)的步骤。
[0042] 24.项1的方法，还包含回收降解的木质素纤维素材料。
[0043] 25.项24的方法，其中所述降解的木质素纤维素材料是糖。
[0044] 26.项24的方法，其中所述糖选自葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖。
[0045] 27.产生有机物质的方法，其包含：
[0046] (a)在至少一种选自仲醇乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、十三烷基乙氧基化物和聚氧乙烯醚的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶将木质素纤维素材料糖化，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解；
[0047] (b)用一种或多种发酵微生物将步骤(a)糖化的木质素纤维素材料发酵；和[0048] (c)从发酵物中回收有机物质。
[0049] 28.项27的方法，其中所述木质素纤维素材料选自草本物质、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆和造纸厂残余物。
[0050] 29.项27的方法，其中所述木质素纤维素材料是玉米秸。
[0051] 30.项27的方法，其中所述一种或多种纤维素分解酶选自纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。
[0052] 31.项27的方法，其中所述纤维素裂解酶是纤维素酶。
[0053] 32.项27的方法，其中所述纤维素裂解酶是内切葡聚糖酶。
[0054] 33.项27的方法，其中所述纤维素裂解酶是纤维二糖水解酶。
[0055] 34.项27的方法，其中所述纤维素裂解酶是β-葡萄糖苷酶。
[0056] 35.项27的方法，其中所述表面活性剂是仲醇乙氧基化物。
[0057] 36.项35的方 法，其 中所述 仲醇 乙氧基 化物 表面活 性剂 具有式C11-15H23-31O(CH2CH2O)xH，其中x为5、9、12或20。
[0058] 37.项的方法27，其中所述表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物。
[0059] 38.项的方法37，其中所述脂肪醇乙氧基化物表面活性剂具有式C16-18H33-37O(CH2CH2O)xH，其中x为50或80。
[0060] 39.项的方法27，其中所述表面活性剂是壬基酚乙氧基化物。
[0061] 40.项的方法39，其中所述壬基酚乙氧基化物表面活性剂具有式C9H19C6H4(CH2CH2O)xOH，其中x为9.3。
[0062] 41.项的方法27，其中所述表面活性剂是十三烷基乙氧基化物。
[0063] 42.项的方法41，其中所述十三烷基乙氧基化物表面活性剂具有式C13-15H27-31O(CH2CH2O)xH，其中x为6.6或8.5。
[0064] 43.项的方法27，其中所述表面活性剂是聚氧乙烯醚。
[0065] 44.项的方法43，其中所述聚氧乙烯醚表面活性剂具有式C12-18H25-37(CH2CH2O)xOCH2CHO，其中x为10、20和23。
[0066] 45.项的方法27，还包含用有效量的一种或多种选自半纤维素酶、酯酶、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶或其混合物的酶处理木质素纤维素材料。
[0067] 46.项的方法45，其中所述酯酶是脂肪酶、磷脂酶、角质酶或其混合物。
[0068] 47.项的方法27，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。
[0070] 49.项的方法48，其中所述醇是阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨醇或木糖醇。
[0071] 50.项的方法48，其中所述有机酸是乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5二酮-D-葡糖酸、甲酸、延胡索酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸或木糖酸。
[0072] 51.项的方法48，其中所述酮是丙酮。
[0073] 52.项的方法48，其中所述氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
[0075] 图1显示pAlLo1的限制性酶切图。
[0076] 图2显示pMJ04的限制性酶切图。
[0077] 图3显示pCaHj527的限制性酶切图。
[0078] 图4显示pMT2188的限制性酶切图。
[0079] 图5显示pCaHj568的限制性酶切图。
[0080] 图6显示pMJ05的限制性酶切图。
[0082] 图8显示特异腐质霉(Humicola insolens)内切葡聚糖酶V的分泌信号序列的DNA序列(SEQ ID NO:30)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)。
[0083] 图9显示pSMai135的限制性酶切图。
[0084] 图10A和10B显示烟曲霉(Aspergillus fumigatus)β-葡萄糖苷酶的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOS:36和37)。将预测的信号肽加下划线并将预测的内含子用斜体表示。
[0085] 图11显示pBANe10的限制性酶切图。
[0086] 图12显示pAlLo2的限制性酶切图。
[0087] 图13显示pEJG97的限制性酶切图。
[0088] 图14显示pMJ06的限制性酶切图。
[0089] 图15显示pMJ09的限制性酶切图。
[0090] 图16显示pJZHEG1的限制性酶切图。
[0091] 图17显示 90(0.1ml/g PCS)对于Celluclast 1.5L在50°C水解PCS(5%)的影响。
[0092] 图18显示 AT80(0.1ml/g PCS)对于Celluclast 1.5L在50°C水解PCS(5%)的影响。
[0093] 图19显示 90(0.2ml/g PCS)对于Celluclast 1.5L在50°C水解PCS(5%)的影响。
[0094] 图20显示 90(0.2ml/g PCS)对于Celluclast 1.5L在55°C水解PCS(5%)的影响。
[0095] 图21显示Celluclast 1.5L(2mg/g PCS)在50°C水解PCS(5%)的 90剂量依赖性。
[0096] 图22显示不同 产品对于Celluclast 1.5L(2mg/g PCS)在50°C水解PCS(5%)的影响。
[0097] 图23显示 90(0.2ml/g PCS)对于补加米曲霉β-葡萄糖苷酶(0.06mg/g PCS)的Celluclast1.5L(2mg/g PCS)和表达米曲霉β-葡萄糖苷酶的里氏木霉(Trichoderma reesei)无细胞培养液(2mg/g PCS)在50°C水解PCS(5%)的影响。
[0098] 图24显示 90(0.1ml/g PCS)在40-65°C对于纯化的里氏木霉纤维二糖水解酶I(2-10mg/g PCS)的乙醇洗涤的/磨碎的PCS(1%)的24小时转化率的影响。
[0099] 图25显示 90(0.1ml/g PCS)在40-65°C对于补加5%烟曲霉β-葡萄糖苷酶(0.1-0.5mg/g PCS)的乙醇洗涤的/磨碎的PCS(1%)的24小时转化率的影响。
[0100] 图26显示 90(0.1ml/g PCS)在40-65°C对于补加20%里氏木霉内切葡聚糖酶I(0.4-4mg/g PCS)和5%烟曲霉β-葡萄糖苷酶(0.1-1mg/g PCS)的纯化的里氏木霉纤维二糖水解酶I(2-20mg/g PCS)的乙醇洗涤的/磨碎的PCS(1%)的24小时转化率的影响。
[0101] 图27显示 90(0.1ml/g PCS)在40-65°C对于补加20%解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)E1cd(0.4-4mg/g PCS)和5%烟曲霉β-葡萄糖苷酶(0.1-1mg/g PCS)的纯化的里氏木霉纤维二糖水解酶I(2-20mg/g PCS)的乙醇洗涤的/磨碎的PCS(1%)的24小时转化率(conversion)的影响。
[0102] 图28显示 (0.05-0.2ml/g纤维素)对于Celluclast 1.5L(1.25-20mg/纤维素)在50°C水解Avicel(1%)的影响。
[0103] 发明详述
[0104] 本发明涉及降解木质素纤维素材料的方法，其包含：在至少一种选自仲醇乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、十三烷基乙氧基化物和聚氧乙烯醚的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶处理木质素纤维素材料，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解。
[0105] 木质素纤维素材料
[0106] 在本发明的方法中，木质素纤维素材料可为含有木质素纤维素的任何材料。木质素纤维素通常存在于，例如，植物的茎、叶、果皮、果壳和穗轴或树的叶、枝和木材。木质素纤维素材料也可为，但不限于，草本物质、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆和造纸厂残余物、
[0107] 在优选的实施方案中，木质素纤维素材料是玉米秸(corn stover)。在另一个优选的实施方案中，木质素纤维素材料是玉米纤维(corn fiber)。在另一个优选的实施方案中，木质素纤维素材料是稻草(rice straw)。在另一个优选的实施方案中，木质素纤维素材料是纸和纸浆加工废物。在另一个优选的实施方案中，木质素纤维素材料是木本或草本植物。
[0108] 木质素纤维素材料可以按原样使用，或使用本领域已知的常规方法进行预处理。例如，物理预处理方法可包括多种类型的磨制(milling)、辐照(irradiation)、汽蒸/蒸汽喷发(steaming/steam explosion)和水热分解(hydrothermolysis)；化学预处理方法可包括稀酸(dilute acid)、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳和pH-控制的水热分解；而生物预处理方法可包括采用溶解木质素的(lignin-solubilizing)微 生 物( 参 见，例 如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,in Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212；Ghosh,P.,Singh,A.,1993,Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.,39:295-333；McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review,in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O., 和 Overend,R.P.,eds.,ACS Symposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC,chapter 15；Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J., 和 Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,ed.,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Olsson,L., 和 Hahn-Hagerdal,B.,19
96,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech,18:312-331；以及Vallander,L.,和Eriksson,K.-E.L.,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the at,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.,42:63-95)。
96,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production,Enz.Microb.Tech,18:312-331；以及Vallander,L.,和Eriksson,K.-E.L.,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the at,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.,42:63-95)。
[0109] 表面活性剂
[0110] 在本发明的方法中，表面活性剂可为选自仲醇乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、十三烷基乙氧基化物和聚氧乙烯醚的任何表面活性剂。该表面活性剂是外源添加的。
[0111] 在优选的实施方案中，所述表面活性剂是仲醇乙氧基化物。
[0112] 在另一个优选的实施方案中，表面活性剂是脂肪醇乙氧基化物。
[0113] 在另一个优选的实施方案中，表面活性剂是壬基酚乙氧基化物。
[0114] 在另一个优选的实施方案中，表面活性剂是十三烷基乙氧基化物(tridecyl ethoxylate)。
[0115] 在另一个优选的实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯醚。
[0116] 仲醇乙氧基化物表面活性剂具有式C11-15H23-31O(CH2CH2O)xH，其中x为乙氧基化(ethoxylation)的程度。乙氧基化的程度可为至少3到至少50。在优选的实施方案中，仲醇乙氧基化物是烷氧基聚乙烯氧乙醇(alkyloxypolyethyleneoxyethanol)50(x=5)。在另一个优选的实施方案中，仲醇乙氧基化物是烷氧基聚乙烯氧乙醇90(x=9)。在另一个优选的实施方案中，仲醇乙氧基化物是烷氧基聚乙烯氧乙醇120(x=12)。在另一个优选的实施方案中，仲醇乙氧基化物是烷氧基聚乙烯氧乙醇200(x=20)。商业上可用的仲醇乙氧基化物表面TM TM TM TM活性剂的实例包括，但不限于，SOFTANOL 50、SOFTANOL 90、SOFTANOL 120和SOFTANOL
200，可由INEOSOxide,Zwijndrecht,比利时得到。
200，可由INEOSOxide,Zwijndrecht,比利时得到。
[0117] 脂肪醇乙氧基化物具有式C16-18H33-37O(CH2CH2O)xH，其中x是乙氧基化的程度。乙氧基化的程度可为至少11到至少80。商业上可用的脂肪醇乙氧基化物表面活性剂的实例包括，但不限于，Lutensol AT50(x=50)和LutensolAT80(x=80)，可由BASF Corp.,Mount Olive,NJ,美国得到。
[0118] 壬基酚乙氧基化物具有式C9H19C6H4(CH2CH2O)xOH，其中x是乙氧基化的程度。乙氧基化的程度可为至少4到至少70。商业上可用的壬基酚乙氧基化物表面活性剂的实例包括，但不限于，Tergitol NP-9(x=9.3)，可由Dow Chemical Company,Midland,Michigan,美国得到。
[0119] 十三烷基乙氧基化物具有式C13-15H27-31O(CH2CH2O)xH，其中x是乙氧基化的程度。乙氧基化的程度可为至少2到至少50。商业上可用的十三烷基乙氧基化物表面活性剂的实例包括，但不限于，Novell II TDA-6.6(x=6.6)和Novell II TDA-8.5(x=8.5)，可由Sasol,Houston,TX得到。
[0120] 聚氧乙烯醚具有式C12-18H25-37(CH2CH2O)xOCH2CHO，其中x是乙氧基化的程度。乙氧基化的程度可为至少10到至少23。商业上可用的聚氧乙烯醚表面活性剂的实例包括，但不限于，Brij 35(x=23),Brij 56(x=10),Brij 97(x=10),和Brij 98(x=20)，可由Sigma Chemical Co.,St.Loius,MO得到。
[0121] 上面提到的表面活性剂的总结显示于表1。
[0122] 表1
[0123]
[0124]
[0125] AE-醇乙氧基化物,EO-氧化乙烯(ethylene oxide)(CH2CH2O),PO-氧化丙烯(propylene oxide)(CH2CHCH3O),CP-浊点(cloud point),HLB-亲水/亲脂平衡[0126] 纤维素裂解酶
[0127] 在本发明的方法中，纤维素裂解酶可为与将木质素纤维素降解为葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖有关的任何酶。纤维素裂解酶可为多组分酶制剂，例如，纤维素酶，单组分酶制剂，例如，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡糖水解酶、β-葡萄糖苷酶，或多组分酶和单组分酶的组合。纤维素分解酶可具有活性，即，在酸性、中性或碱性pH范围内水解纤维素。
[0128] 纤维素裂解酶可为真菌或细菌来源，其可从已知能够产生纤维素裂解酶的微生物中得到或分离和纯化，所述的微生物例如，腐质霉属(Humicola)、鬼伞属(Coprinus)、梭孢壳属(Thielavia)、镰孢属(Fusarium)、毁丝霉属(Myceliophthora)、枝顶孢霉属(Acremonium)、头孢属(Cephalosporium)、柱顶孢属(Scytalidium)、青 霉属(Penicillium)或曲霉属(Aspergillus)的菌种(参见，例如，EP 458162)，尤其是那些由选自如下菌种的菌株产生的那些：特异腐质霉(重分类为嗜热柱顶孢(Scytalidium thermophilum)，参见例如，美国专利No.4,435,307))、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、Meripilus giganteus、土生 梭 孢 霉 (Thielavia terrestris)、枝 顶 孢 霉 (Acremonium sp.)、Acremonium persicinum、Acremonium acremonium、Acremonium brachypenium、Acremonium dichromosporum、Acremonium obclavatum、Acremonium pinkertoniae、红 灰 枝 顶 孢霉 (Acremonium roseogriseum)、Acremonium incoloratum 和 Acremonium furatum；优选来自如下菌种：特异腐质霉DSM 1800、尖镰孢DSM2672、嗜热毁丝霉CBS 117.65、头孢sp.RYM-202、枝顶孢霉sp.CBS 478.94、枝顶孢霉sp.CBS 265.95、Acremonium persicinum CBS 169.65、Acremonium acremonium AHU 9519、头 孢 sp.CBS 535.71、Acremoniumbrachypenium CBS866.73、Acremonium dichromosporum CBS 683.73、Acremonium obclavatum CBS311.74、Acremonium pinkertoniae CBS 157.70、红灰枝顶孢 霉CBS 134.56、Acremonium incoloratum CBS 146.62和 Acremonium furatum CBS
299.70H。纤维素分解酶也可由木霉属(Trichoderma)(尤其是绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉和康宁木霉(Trichoderma koningii))、嗜碱的芽孢杆菌属(Bacillus)(参见，例如，美国专利No.3,844,890和EP 458162)和链霉菌属(Streptomyces)(参见，例如，EP458162)得到。
299.70H。纤维素分解酶也可由木霉属(Trichoderma)(尤其是绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉和康宁木霉(Trichoderma koningii))、嗜碱的芽孢杆菌属(Bacillus)(参见，例如，美国专利No.3,844,890和EP 458162)和链霉菌属(Streptomyces)(参见，例如，EP458162)得到。
[0129] 本发明的方法中使用的纤维素分解酶可通过将上面提及的微生物菌株在含有合适的碳源和氮源和无机盐的营养培养基中，使用本领域已知的方法发酵来生产(参见，例如，Bennett,J.W.和LaSure,L.(编),More Gene Manipulations in Fungus,Academic Press,CA,1991)。合适的培养基可由商业供应者得到或可根据发表的组合物(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)来制备。适于生长和纤维素酶产生的温度范围和其它条件是本领域中已知的(参见，例如，Bailey，J.E.,和Ollis,D.F.,Biochemical Engineering Fundamentals,McGraw-Hill Book Company,NY，1986)。
[0130] 发酵可为培养细胞导致纤维素裂解酶的表达或分离的任何方法。因此，可将发酵理解为包括摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基中和允许纤维素酶表达或分离的条件下进行的小-或大-规模发酵(包括连续、批式、补料分批或固态发酵)。
[0131] 得到的通过上述方法产生的纤维素分解酶可从发酵培养基中通过常规方法回收，所述方法包括，但不限于，离心、过滤、喷雾-干燥、蒸发或沉淀。然后可通过多种层析方法，例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等将回收的酶进一步纯化。
[0132] 纤维素酶水解羧甲基纤维素(CMC)，由此降低培养混合物的粘度。得到的粘度降低可通过振动粘度计(vibration viscosimeter)(例如，来自Sofraser,法国的MIVI3000)来测定。利用纤维素酶粘度单位(Cellulase Viscosity Unit)(CEVU)测定纤维素酶活性，该酶活性的测定通过测定样品降低羧甲基纤维素(CMC)溶液粘度的能力来定量样品中存在的催化活性的量。此试验在40°C在0.1M磷酸盐pH 9.0缓冲液中，以CMC作为底物(33.3g/L羧甲基纤维素Hercules 7LFD)和大约3.3-4.2CEVU/ml的酶浓度中进行TM
30分钟。相对于公告的酶标准物，如Celluzyme Standard 17-1194(由Novozymes A/S,Bagsvaerd,丹麦得到)计算CEVU活性。
30分钟。相对于公告的酶标准物，如Celluzyme Standard 17-1194(由Novozymes A/S,Bagsvaerd,丹麦得到)计算CEVU活性。
[0133] 适用于本发明的纤维素酶的实例包括，例如，CELLUCLASTTM(可由Novozymes A/TMS得到)和NOVOZYM 188(可由Novozymes A/S得到)。其它商业可得到的包含可使用的TM TM TM TM
纤维素酶的制剂包括CELLUZYME 、CEREFLO 和ULTRAFLO (Novozymes A/S)、LAMINEX 和TM TM
SPEZYME CP(Genencor Int.)和ROHAMENT 7069W( GmbH)。纤维素酶以固体的大约0.001%至大约5.0wt%，更优选固体的大约0.025%至大约4.0wt%，和最优选固体的大约
0.005%至大约2.0wt%的有效量加入。
纤维素酶的制剂包括CELLUZYME 、CEREFLO 和ULTRAFLO (Novozymes A/S)、LAMINEX 和TM TM
SPEZYME CP(Genencor Int.)和ROHAMENT 7069W( GmbH)。纤维素酶以固体的大约0.001%至大约5.0wt%，更优选固体的大约0.025%至大约4.0wt%，和最优选固体的大约
0.005%至大约2.0wt%的有效量加入。
[0134] 如上所述，用于本发明的方法的纤维素分解酶可为单组分的制剂，即，基本上没有其它纤维素酶组分的组分。所述单组分可为重组组分，即，通过克隆编码该单组分的DNA序列随后用该DNA序列转化细胞并在宿主中表达而产生的(参见，例如，WO 91/17243和WO 91/17244)。单组分纤维素分解酶的其它实例包括，但不限于，在JP-07203960-A和WO-9206209中公开的那些。所述宿主优选为异源宿主(酶对于宿主来说是外源的)，但在一些情况下所述宿主也可为同源宿主(酶对于宿主来说是天然的)。单组分纤维素分解酶也可以通过从发酵培养基中纯化所述的酶来制备。
[0135] 用于实施本发明方法的单组分纤维素分解酶的实例包括，但不限于，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、葡糖水解酶和β-葡萄糖苷酶。
[0136] 本文中将术语“内切葡聚糖酶”定义为内-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-(1,3;1,4)-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.No.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose))、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键，混合的β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡萄糖(xyloglucan)，和含有纤维素组分的其它植物原料中的β-1,4键的内水解。为了本发明的目的，内切葡聚糖酶活性根据Ghose,1987,Pure和Appl.Chem.59:257-268的方法，使用羧甲基纤维素(CMC)水解来测定。
[0137] 外-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase)包括纤维二糖水解酶和葡糖水解酶。
[0138] 本文中将术语“纤维二糖水解酶”定义为1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖(cellooligosaccharides)，或任何含有聚合物的β-1,4-连接的葡萄糖中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原性或非还原性末端释放纤维二糖。为了本发明的目的，纤维二糖水解酶活性根据由Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279 和 由 van Tilbeurgh 等 ,1982,FEBS Letters,149:152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters,187:283-288描述的方法来测定。在本发明中，Lever等的方法用于评价玉米秸中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法则用于测定荧光的二糖衍生物的纤维二糖水解酶活性。
[0139] 本文中将术语“葡糖水解酶”定义为1,4-β-D-葡聚糖葡糖水解酶(E.C.3.2.1.74)，其催化1,4-β-D-葡聚糖中1,4-键(O-糖基键)的水解以去除连续的葡萄糖单元。为了本发明的目的，外葡聚糖酶活性根据由Himmel等,1986,J.Biol.Chem.261:12948-12955描述的方法来测定。
[0140] 本文中将术语“β-葡萄糖苷酶”定义为β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解并释放β-D-葡萄糖。为了本发明的目的，β-葡萄糖苷酶活性根据由Venturi等,2002,J.Basic Microbiol.42:55-66描述的基本方法，除了如本文所述采用不同的条件外来测定。一单位的β-葡萄糖苷酶活性定义为在50°C、pH 5、4mM对硝基苯基-β-D-葡萄吡喃糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)作为底物在100mM柠檬酸钠、0.01%Tween-20中每分钟产生1.0μmole的对硝基苯酚(p-nitrophenol)。
[0141] 木质素纤维素材料的加工
[0142] 本发明的方法可用于将木质素纤维素材料加工为许多有用的有机产品、化学品和燃料。除了乙醇之外，能够由木质素纤维素生产的一些物品和专用化学品包括木糖、丙酮、乙酸盐(acetate)、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如，乳酸)、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、乙二醇、糠醛(furfural)、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoates)、顺,顺-粘 康酸(cis,cis-muconic 酸)，和 动物 饲料(Lynd,L.R.,Wyman,C.E., 和Gerngross,T.U.,1999,Biocommodity engineering,Biotechnol.Prog.,15:777-793；Philippidis,G.P.,1996,Cellulose bioconversion technology,in Handbook on Bioethanol:Production 和 Utilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor &
Francis,Washington,DC,179-212;和Ryu,D.D.Y.,和Mandels,M.,1980,Cellulases:biosynthesis and applications,Enz.Microb.Technol.,2:91-102)。可能的合作生产优势延伸超过由可发酵的碳水化合物合成多种有机产品。可将生物加工之后剩余的富含木质素的残基转化为源自木质素的化学品，或用于动力生产。
Francis,Washington,DC,179-212;和Ryu,D.D.Y.,和Mandels,M.,1980,Cellulases:biosynthesis and applications,Enz.Microb.Technol.,2:91-102)。可能的合作生产优势延伸超过由可发酵的碳水化合物合成多种有机产品。可将生物加工之后剩余的富含木质素的残基转化为源自木质素的化学品，或用于动力生产。
[0143] 根据本发明的方法用于加工木质素纤维素材料的常规方法对于本领域的技术人员来说是完全理解的。使用经过配置以根据本发明进行操作的任何常规的生物质加工设备，可实施本发明的方法。
[0144] 所述设备可包括批式搅拌反应器(batch-stirred reactor)、带超滤的连续流搅拌反应器(continuous flow stirred reactor with ultrafiltration)、连续活塞流柱反 应 器(continuous plug-flow column reactor)(Gusakov,A.V.,和 Sinitsyn,A.P.,1985,Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1.A mathematical model for a batch reactor process,Enz.Microb.Technol.,7:346-352)、磨碎反应器(attrition reactor)(Ryu,S.K.,和Lee,J.M.,1983,Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor,Biotechnol.Bioeng.,25:53-65)或具有由电磁场诱导的强搅拌的反应器(Gusakov,A.V.,Sinitsyn,A.P.,Davydkin,I.Y.,Davydkin,V.Y.,Protas,O.V.,1996,Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field,Appl.Biochem.Biotechnol.,56:141-153)。
[0145] 所述常规方法包括，但不限于，糖化、发酵、单独(separate)水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、杂合水解和发酵(HHF)和直接微生物转化(DMC)。
[0146] SHF使用单独的过程步骤以首先用酶将纤维素水解为葡萄糖然后将葡萄糖发酵为乙醇。在SSF中，将葡萄糖的酶法水解和葡萄糖变为乙醇的发酵组合在一个步骤中 (Philippidis,G.P.,1996,cellulose bioconversion technology,in Handbook on Bioethanol：Production 和 Utilization,Wyman,C.E.,ed.,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。SSCF包括多种糖的共发酵(coferementation)(Sheehan,J.,和Himmel,M.,1999,Enzymes,energy and the environment:Astrategic perspective on the U.S.Department of Energy’s research 和 development activities for bioethanol,Biotechnol.Prog.,15:817-827)。HHF包括在同一个反应器中但在不同温度进行的两个单独的步骤，即，高温酶法糖化然后是在发酵菌株能耐受的较低温度进行SSF。DMC将所有三种过程(纤维素酶生产、纤维素水解和发酵)组合在一个步骤 中 (Lynd,L.R.,Weimer,P.J.,van Zyl,W.H., 和 Pretorius,I.S.,2002,Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology,Microbiol.Mol.Biol.Reviews,66:506-577)。
[0147] “发酵”或“发酵方法”指任何发酵方法或包含发酵步骤的任何方法。发酵方法包括，但不限于，用于生产发酵产物的发酵方法，所述发酵产物包括醇类(例如，阿拉伯糖醇(arabinitol)、丁醇(butanol)、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇(sorbitol)和木糖醇(xylitol))；有机酸(例如，乙酸、醋酮酸(acetonic acid)、己二酸(adipic acid)、抗坏血酸(ascorbic acid)、柠檬酸(citric acid)、2,5-二酮-D-葡糖酸(2,5-diketo-D-gluconic acid)、甲酸(formic acid)、延胡索酸(fumaric acid)、葡糖二酸(glucaric acid)、葡糖酸(gluconic acid)、葡糖醛酸(glucuronic acid)、戊二酸(glutaric acid)、3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid)、衣康酸(itaconic acid)、乳酸、苹果酸(malic acid)、丙二酸(malonic acid)、草酸(oxalic acid)、丙酸、琥珀酸和木糖酸(xylonic acid))；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸)；气体(例如，甲烷、氢(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵方法也包括用于可消耗的醇工业(例如，啤酒和葡萄酒(wine))、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵方法。
[0148] 生产有机物质的方法
[0149] 本发明也涉及产生有机物质的方法，其包含：(a)在至少一种选自仲醇乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、十三烷基乙氧基化物和聚氧乙烯醚的表面活性剂存在的条件下，用有效量的一种或多种纤维素分解酶将木质素纤维素材料糖化，其中所述表面活性剂的存在与表面活性剂的缺乏相比增加了木质素纤维素材料的降解；(b)用一种或多种发酵微生物将步骤(a)糖化的木质素纤维素材料发酵；和(c)从发酵物中回收有机物质。
[0150] 所述有机物质可为从发酵得到的任何物质。在优选的实施方案中，所述有机物质是醇。可理解的是术语“醇”包括含有一个或多个羟基的有机物。在更优选的实施方案中，醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的实施方案中，醇是丁醇。在另一个更优选的实施方案中，醇是乙醇。在另一个更优选的实施方案中，醇是甘油。在另一个更优选的实施方案中，醇是甲醇。在另一个更优选的实施方案中，醇是1,3-丙二醇。在另一个更优选的实施方案中，醇是山梨糖醇。在另一个更优选的实施方案中，醇是木糖醇。参见，例如，Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J., 和 Tsao,G.T.,1999,Ethanol production from renewable resources,in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,T.,ed.,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241；Silveira,M.M.,和 Jonas,R.,2002,The biotechnological production of sorbitol,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400-408；Nigam,P.,和Singh,D.,1995,Processes for fermentative production of xylitol–a sugar substitute,Process Biochemistry,30(2):117-124；Ezeji,T.C.,Qureshi,N. 和Blaschek,H.P.,2003,Production of acetone,butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA 101 和 in situ recovery by gas stripping,World Journal of Microbiology and Biotechnology 19(6):595-603。
[0151] 在另一个优选的实施方案中，有机物质是有机酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是乙酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是醋酮酸(acetonic acid)。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是己二酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是柠檬酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是2,5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是甲酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是延胡索酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是葡糖二酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是葡糖酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是葡糖醛酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是戊二酸。在另一个优选的实施方案中，有机酸是3-羟基丙酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是衣康酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是乳酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是苹果酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是丙二酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是草酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是丙酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是琥珀酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是木糖酸。参见，例如，Chen,R.,和Lee,Y.Y.,1997,Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass,Appl.Biochem.Biotechnol.,63-65:435-448。
[0152] 在另一个优选的实施方案中，有机物质是酮。可以理解的是术语“酮”包括含有一个或多个酮基（moieties）的有机物。在另一个更优选的实施方案中，酮是丙酮。参见，例如，Qureshi和Blaschek,2003,见前文。
[0153] 在另一个优选的实施方案中，有机物质是氨基酸。在另一个更优选的实施方案中，有机酸是天冬氨酸。在另一个更优选的实施方案中，氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选的实施方案中，氨基酸是甘氨酸。在另一个更优选的实施方案中，氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选的实施方案中，氨基酸是丝氨酸。在另一个更优选的实施方案中，氨基酸是苏氨酸。参见，例如，Richard,A.,和Margaritis,A.,2004,Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering,87(4):501-515。
[0154] 在另一个优选的实施方案中，有机物质是气体。在另一个更优选的实施方案中，气体是甲烷。在另一个更优选的实施方案中，气体是H2。在另一个更优选的实施方案中，气体是CO2。在另一个更优选的实施方案中，气体是CO。参见，例如，Kataoka,N.,A.Miya,和K.Kiriyama,1997,Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria,Water Science 和 Technology36(6-7):41-47;和Gunaseelan V.N.in Biomass and Bioenergy,Vol.13(1-2),pp.83-114,1997,Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review。
[0155] 由木质素纤维素材料生产有机物质通常需要四个主要步骤。这四个步骤是预处理、酶法水解、发酵和回收。下面例举的是生产乙醇的方法，但将被理解的是类似的方法可用于生产其它的有机物质，例如，上面描述的物质。
[0156] 预处理.在预处理或预水解步骤中，将木质素纤维素材料加热以破坏木质素和碳水化合物结构，使大多数半纤维素溶解，并使纤维素级分可被纤维素裂解酶接近。直接用蒸气或者在浆液中进行加热，在所述浆液中也可将催化剂加入原料以加速反应。催化剂包括强酸，如硫酸和SO2，或碱，如氢氧化钠。预处理阶段的目的在于促进酶和微生物的透过(penetration)。也可将木质素纤维素生物质进行水热蒸汽喷发预-处理(参见美国专利申请No.20020164730)。
[0157] 糖化.在酶法水解(也称为糖化)步骤中，将如本文所述的酶加入预处理的原料以将纤维素级分转化为葡萄糖和/或其它糖。糖化通常在pH、温度和混合条件受控的搅拌釜反应器(stirred-tank reactor)和发酵罐中进行。糖化步骤可持续多达120小时。糖化可在大约30°C至大约65°C，尤其是大约50°C的温度，和大约4至大约5，尤其是大约pH 4.5的pH进行。为了生产能被酵母代谢的葡萄糖，通过在β-葡萄糖苷酶存在的条件下进行水解。
[0158] 发酵.在发酵步骤中，将作为预处理和酶法水解步骤的结果由木质素纤维素材料释放的糖通过发酵生物，如酵母发酵为乙醇。发酵也可与酶法水解在同样pH、温度和混合条件受控的同一容器中同时进行。当糖化和发酵在同一容器中同时进行时，该过程通常被称为同时糖化和发酵或SSF。
[0159] 任何合适的木质素纤维素底物或原材料可用于本发明的发酵过程。通常根据预期的发酵产品，即，将由发酵得到的有机物质来选择底物，而且采用的方法是本领域已知的。适用于本发明方法的底物的实例，包括含有木质素纤维素的材料，如木材或植物残余物或由加工的木质素纤维素材料得到的低分子糖DP1-3，其可通过发酵微生物代谢，并且其可以通过直接添加到发酵培养基来提供。
[0160] 术语“发酵培养基”将理解为指发酵微生物加入之前的培养基，如，由糖化过程得到培养基，以及用于同时糖化和发酵过程(SSF)的培养基。
[0161] “发酵微生物”指任何适用于所需发酵过程的任何微生物。根据本发明的合适的发酵微生物能够发酵，即，直接或间接将糖，如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或寡糖转化为所需的发酵产物。发酵微生物的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母菌种(Sacchromyces spp.)的菌株，尤其是，酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)。商业可得到的酵母包括，例如，Red /Lesaffre Ethanol Red(可由Red Star/Lesaffre,美国得到)、FALI(可由Burns Philp Food Inc.,美国的分公司Fleischmann’s Yeast得到)、SUPERSTART(可由Alltech得到)、GERT STRAND(可由Gert Strand AB,瑞典得到)和FERMIOL(可由DSM Specialties得到)。
[0162] 在优选的实施方案中，酵母为酵母菌种。在更优选的实施方案中，酵母为酿酒酵母。在另一个更优选的实施方案中，酵母为Saccharomyces distaticus。在另一个更优选的实施方案中，酵母为葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选的实施方案中，酵母为克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。在另一个更优选的实施方案中，酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)。在另一个更优选的实施方案中，酵母为脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)。在另一个优选的实施方案中，酵母为念珠菌属。在另一个更优选的实施方案中，酵母为Candida pseudotropicalis。在另一个更优选的实施方案中，酵母为Candida brassicae.在另一个优选的实施方案中，酵母为Clavispora。在另一个更优选的实施方案中，酵母为Clavispora lusitaniae。在另一个更优选的实施方案中，酵母为Clavispora opuntiae。在另一个优选的实施方案中，酵母为管囊酵母属(Pachysolen)。在另一个更优选的实施方案中，酵母为管囊酵母(Pachysolen tannophilus)。在另一个优选的实施方案中，酵母为酒香酵母属(Bretannomyces)。在另一个更优选的实施方案中，酵母为克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)(Philippidis,G.P.,1996,cellulose bioconversion technology,in Handbook on Bioethanol:Production和Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,179-212)。
[0163] 能有效将葡萄糖发酵为乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)和热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)(Philippidis,1996,见前文)。
[0164] 本领域已知上述多种生物体也可用于生产其它有机物质，如本文所述。
[0165] 在 酿 酒 酵 母 中 (Chen,Z.,Ho,N.W.Y.,1993,Cloning 和 improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl.Biochem.Biotechnol.39-40:135-147；Ho,N.W.Y.,Chen,Z,Brainard,A.P.,1998,Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose 和 xylose,Appl.Environ.Microbiol.,64:1852-1859)，或 在 细 菌 如 大 肠 杆 菌 (Escherichia coli)(Beall,D.S.,Ohta,K.,Ingram,L.O.,1991,Parametric studies of ethanol production fom xylose 和 other sugars by recombinant Escherichia coli,Biotech.Bioeng.38:296-303)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(Ingram,L.O.,Gomes,P.F.,Lai,X.,Moniruzzaman,M.,Wood,B.E.,Yomano,L.P.,York,S.W.,1998,Metabolic engineering of bacteriafor ethanol production,Biotechnol.Bioeng.58:204-214)和运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)(Zhang,M.,Eddy,C.,Deanda,K.,Finkelstein,M., 和 Picataggio,S.,1995,Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenicZymomonas mobilis,Science 267:240-243；Deanda,K.,Zhang,M.,Eddy,C., 和Picataggio,S.,1996,Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering,Appl.Environ.Microbiol.62:4465-4470)中克隆异源基因导致能将己糖和戊糖转化为乙醇的生物体的构建(共发酵)。
[0166] 通常将酵母或其它微生物加入降解的木质素纤维素或水解产物，而发酵进行大约24至大约96小时，如大约35至大约60小时。温度通常为大约26°C至大约40°C，尤其在大约32°C，和在大约pH 3至大约pH 6，尤其是大约pH 4-5。
[0167] 在优选的实施方案中，将酵母或其它微生物施用于降解的木质素纤维素或水解物，而发酵进行大约24至大约96小时，如通常35-60小时。在优选的实施方案中，温度通常为大约26至大约40°C，尤其是大约32°C，而pH通常为大约pH 3至大约pH 6，优选大约pH 4-5。优选将酵母或其它微生物以每ml发酵培养液(fermentation broth)大约5 12 7 10 7
10 至10 ，优选大约10 至10 ，特别是大约5x10 活菌计数的量施用。在乙醇生产阶段的
7 10 8
过程中，酵母细胞计数应优选在大约10 至10 ，尤其是大约大约2x10 的范围内。关于使用酵母发酵的进一步指导可见于，例如，“The Alcohol Textbook”(Editors K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall,Nottingham University Press,United Kingdom 1999)，其在此并入作为参考。
10 至10 ，优选大约10 至10 ，特别是大约5x10 活菌计数的量施用。在乙醇生产阶段的
7 10 8
过程中，酵母细胞计数应优选在大约10 至10 ，尤其是大约大约2x10 的范围内。关于使用酵母发酵的进一步指导可见于，例如，“The Alcohol Textbook”(Editors K.Jacques,T.P.Lyons和D.R.Kelsall,Nottingham University Press,United Kingdom 1999)，其在此并入作为参考。
[0168] 本领域中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，其中没有糖化的保温阶段(holding stage)，这意味着酵母和酶一起加入。
[0169] 对于乙醇生产而言，发酵后将醪液(mash)蒸馏以提取乙醇。根据本发明的方法得到的乙醇可用作，例如，燃料乙醇；饮料乙醇，即，可饮用的中性酒精(potable neutral spirits)，或工业乙醇。
[0170] 发酵刺激物(fermentation stimulator)可与本文描述的任何酶过程组合使用以进一步改进发酵方法，尤其是发酵微生物的性能，诸如，速率增加和乙醇收率。“发酵刺激物”指用于发酵微生物，尤其是酵母的生长的刺激物。优选的用于生长的发酵刺激物包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素(multivitamin)、生物素(biotin)、泛酸(pantothenate)、烟酸(nicotinic acid)、肌醇(meso-inositol)、硫胺素(thiamine)、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸(para-aminobenzoic acid)、叶酸(folic acid)、核黄素(riboflavin)，和维生素A、B、C、D和E。参见，例如，Alfenore等,Improving ethanol production and viability ofSaccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process,”Springer-Verlag(2002)，其在此并入作为参考。矿物质的实例包括能够提供营养的矿物质和矿物质盐，其包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu。
[0171] 回收.从发酵的木质素纤维素材料分离乙醇，并通过蒸馏的常规方法纯化。可得到纯度为多至大约96vol.%乙醇的乙醇，其可被用作，例如，燃料乙醇、饮料乙醇，即，可引用的中性酒精，或工业乙醇。
[0172] 对于其它有机物质来说，可使用本领域已知的任何方法，其包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备等电聚焦)、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、蒸馏或提取。
[0173] 附加的(additional)酶
[0174] 在本发明的方法中，可用一种或多种附加的酶活性补充所述的纤维素裂解酶以改进木质素纤维素材料的降解。优选的附加酶是半纤维素酶、酯酶(例如，脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶)、蛋白酶、漆酶、过氧化物酶，或其混合物。
[0175] 在本发明的方法中，可将附加的酶在发酵前或发酵过程中加入，包括发酵微生物繁殖的过程中或之后。
[0176] 本文所指的酶可源自或得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源。术语“得到”在本文中指酶可分离自天然产生酶作为天然酶(native enzyme)的生物体。术语“得到”在本文中也指酶可在宿主生物体中重组地产生，其中所述重组产生的酶对于宿主生物体来说是天然的或外源的或具有修饰的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一种或多种氨基酸，即，重组产生的酶，其为天然氨基酸序列的突变体和/或片段或通过本领域已知的核酸重排(shuffling)方法产生的酶。包含在天然酶的意义中的是天然变体，而包含在外源酶的意义中的是如通过定点突变或重排重组得到的变体。
[0177] 酶也可以是纯化的。本文中使用的术语"纯化的"涵盖没有来自得到所述酶的生物体的其它组分的酶。术语"纯化的"也涵盖没有来自得到所述酶的天然生物体的组分的酶。酶可以是纯化的，只有少量的其它蛋白质存在。表述“其它蛋白质”具体涉及其它酶。本文使用的术语"纯化的"也指去除其它组分，具体为其它蛋白质和最具体的存在于本发明的酶的来源细胞中的其它酶。酶可为"基本上纯的"，即，没有来自产生所述酶的生物体的其它组分，即，例如，用于重组产生酶的宿主生物体。在优选的实施方案中，酶是至少75%(w/w)，优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，甚至更优选至少98%，或最优选至少99%纯的。在另一个优选的实施方案中，酶是100%纯的。
[0178] 用于本发明的酶可为适用于本文描述的方法的任何形式，诸如，例如，干粉或颗粒、无粉尘颗粒(non-dusting granulate)、液体、稳定液体(stabilized liquid)或受保护的酶(protected enzyme)的形式。可例如，如美国专利Nos.4,106,991和4,661,452中公开的生产颗粒，并可任选地通过本领域中已知的方法涂覆。液体酶制剂可，例如，根据确定的方法，通过加入稳定剂，如糖、糖醇(sugar alcohol)或其它多元醇(polyol)，和/或乳酸或其它有机酸来稳定。受保护的酶可根据EP 238,216中公开的方法制备。
[0179] 半纤维素酶
[0180] 可通过多种真菌和细菌进行半纤维素的酶法水解。与纤维素降解类似，半纤维素水解需要许多酶的协同作用。可将半纤维素酶分成三种基本类型：攻击多糖链内内部键的内-作用酶(endo-acting enzyme)，对多糖链的还原性或非还原性末端起作用的外-作用酶(exo-acting enzyme)，和附属酶，水解木质素糖苷键的乙酰酯酶(acetylesterase)和酯酶，如香豆酸(coumaric acid)酯酶和阿魏酸酯酶(Wong,K.K.Y.,Tan,L.U.L., 和 Saddler,J.N.,1988,Multiplicity ofβ-1,4-xylanase in microorganisms:Functions and applications,Microbiol.Rev.52:305-317；Tenkanen,M.,和Poutanen,K.,1992,Significance of esterases in the degradation of xylans,in Xylans and Xylanases,Visser,J.,Beldman,G.,Kuster-van Someren,M.A.,和Voragen,A.G.J. 编,Elsevier,New York,NY，203-212；Coughlan,M.P.,和Hazlewood,G.P.,1993,Hemicellulose and Hemicellulases,Portland,London,UK；Brigham,J.S.,Adney,W.S.,和Himmel,M.E.,1996,Hemicellulases:Diversity and applications,in Handbook on Bioethanol:Production和Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor&Francis,Washington,DC,119-141)。
[0181] 半纤维素酶包括木聚糖酶(xylanase)、阿拉伯呋喃糖酶(arabinofuranosidase)、乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)、葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase)、内-半乳聚糖酶(endo-galactanase)、甘露聚糖酶(mannanases)、内或外阿拉伯糖酶、外-半乳聚糖酶(exo-galactanse)和其混合物。内-作用半纤维素酶和附属酶的实例包括内阿拉伯聚糖酶(endoarabinanase)、内阿拉伯糖半乳聚糖酶(endoarabinogalactanase)、内切葡聚糖酶、内甘露聚糖酶(endomannanase)、内木聚糖酶(endoxylanase)和feraxan内木聚糖酶。外-作用半纤维素酶和附属酶的实例包括α-L-阿拉伯糖苷酶、β-L-阿拉伯糖苷酶、α-1,2-L-岩藻糖苷酶(α-1,2-L-fucosidase)、α-D-半乳糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-木糖苷酶、外葡萄糖苷酶、外切纤维二糖水解酶(exocellobiohydrolase)、外甘露二糖水解酶(exomannobiohydrolase)、外甘露聚糖酶(exomannanase)、外木聚糖酶(exoxylanase)、木聚糖α-葡糖醛酸糖苷酶和松柏苷β-葡萄糖苷酶(coniferinβ-glucosidase)。酯酶的实例包括乙酰酯酶(乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶)和芳基酯酶(香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶)。
[0182] 优选地，半纤维素酶是外-作用半纤维素酶，而且更优选在低于pH 7的酸性条件下具有水解半纤维素的能力的外-作用半纤维素酶。适用于本发明的半纤维素酶的实例包TM括VISCOZYME (可由Novozymes A/S,丹麦得到)。将半纤维素酶以固体的大约0.001%至大约5.0wt.%，更优选固体的大约0.025%至大约4.0wt.%，并最优选固体的大约0.005%至大约2.0wt.%的有效量加入。
[0183] 木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)可由任何合适的来源得到，所述的来源包括真菌的和细菌的生物体，如曲霉属、Disporotrichum、青霉属、脉孢菌属、镰孢属(Fusarium)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、嗜热霉属(Thermomyces)和芽孢杆菌属。优选的商业可得到的含有木聚糖酶的制剂包括 BIOFEEDBIO-FEED L、
PENTOPAN BG 和 HC(Novozymes A/S)；和 和
CP(Genencor Int.)。
PENTOPAN BG 和 HC(Novozymes A/S)；和 和
CP(Genencor Int.)。
[0184] 酯酶
[0185] 可用于木质素纤维素的生物转化的酯酶包括乙酰酯酶如乙酰半乳聚糖酯酶、乙酰甘露聚糖酯酶和乙酰木聚糖酯酶，和水解木质素糖苷键的酯酶，如香豆酸酯酶和阿魏酸酯酶。
[0186] 如本文使用的，“酯酶”也称为羧酸脂水解酶，指作用于酯键上的酶，并包括根据酶命名法(Enzyme Nomenclature)(分别为Enzyme Nomenclature 1992,Academic Press,San Diego,California,with Supplement 1(1993),Supplement 2(1994),Supplement3(1995),Supplement 4(1997)和Supplement 5,in Eur.J.Biochem.223:1-5,1994；Eur.J.Biochem.232:1-6,1995；Eur.J.Biochem.237:1-5,1996；Eur.J.Biochem.250:1-6,1997,和Eur.J.Biochem.264:610-650,1999)归类于EC 3.1.1羧酸脂水解酶的酶。酯酶的非限制性实例包括芳基酯酶(arylesterase)、三酰甘油脂肪酶(triacylglycerol lipase)、乙酰酯酶、乙酰胆碱酯酶(acetylcholin esterase)、胆碱酯酶、托品酯酶(tropin esterase)、果胶酯酶、甾醇酯酶、叶绿素酶(chlorophyllase)、L-阿拉伯糖酸内酯酶(L-arabinonolactonase)、葡糖酸内酯酶(gluconolactonase)、尿内酯酶(uronolactonase)、鞣酸酶(tannase)、棕榈酸视黄酯酯酶(retinyl-palmitate esterase)、羟基丁酸酯-二聚物水解酶(hydroxybutyrate-dimer hydrolase)、酰基甘油脂肪酶(acylglycerol lipase)、3-氧代己二酸烯醇内酯酶(3-oxoadipate enol-lactonase)、1,4-内酯酶、半乳糖脂肪酶、4-吡哆醇内酯酶(4-pyridoxolactonase)、酰基肉毒碱水解酶(acylcarnitine hydrolase)、氨基酰基-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖酸内酯酶、6-磷酸葡糖酸内酯酶、磷脂酶A1、6-乙酰葡糖脱酰酶(6-acetylglucose deacetylase)、脂蛋白脂肪酶、二氢香豆素脂肪酶(dihydrocoumarin lipase)、柠檬素-D-环内酯酶(limonin-D-ring-lactonase)、类固醇内酯酶(steroid-lactonase)、三乙酸内酯酶(triacetate-lactonase)、放线菌素内酯酶(actinomycin lactonase)、苔色酸缩酚酸水解酶(orsellinate-depside hydrolase)、头孢菌素-C脱乙酰基酶(cephalosporin-C deacetylase)、氯原酸水解酶(chlorogenate hydrolase)、alpha-氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酯酶(4-methyloxaloacetate esterase)、羧甲烯丁烯羟酸内酯酶(carboxymethylenebutenolidase)、脱氧柠檬酸A-环内酯酶(deoxylimonate A-ring-内酯酶)、2-乙酰基-1-烷基甘油磷酸胆碱酯酶(2-acetyl-1-alkylglycerophosphocholine)、镰 孢 氨 酸-C鸟 氨 酸 酯酶 (fusarinine-Cornithinesterase)、芥 子 碱 酯 酶(sinapine esterase)、蜡 酯 水 解 酶 (wax-ester hydrolase)、大戟二 萜醇二 酯水 解酶(phorbol-diester hydrolase)、磷 脂酰 肌醇脱 酰基 酶(phosphatidylinositol deacylase)、唾液酸O-乙酰酯酶(sialateO-acetylesterase)、乙酰氧基丁基并噻吩脱乙酰基酶(acetoxybutynylbithiophene deacetylase)、乙酰水杨酸盐脱乙酰基酶(acetylsalicylate deacetylase)、乙酸甲基繖酮脱乙酰基酶(methylumbelliferyl-acetate deacetylase)、2-吡 喃 酮 -4,6-二 羧 化 物 内 酯酶(2-pyrone-4,6-dicarboxylate lactonase)、N-乙酰半乳糖氨基聚糖脱乙酰基酶(N-acetylgalactosaminoglycan deacetylase)、保 幼 激 素 酯 酶 (juvenile-hormone esterase)、双(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯酯酶(bis(2-ethylhexyl)phthalate esterase)、蛋白-谷氨酸酯甲基酯酶(protein-glutamate methylesterase)、11-顺式-棕榈酸视黄酯水解酶(11-cis-retinyl-palmitate hydrolase)、所有-反式-棕榈酸视黄酯水解酶(all-trans-retinyl-palmitate hydrolase)、L-鼠李糖-1,4-内酯酶(L-rhamnono-1,4-lactonase)、5-(3,4-.双乙酸基丁-1-基)-2,2'-并噻吩脱酰基酶(5-(3,4-diacetoxybut-1-ynyl)-2,2'-bithiophene deacetylase)、脂肪-酰基-乙基-酯合酶(fatty-acyl-ethyl-ester synthase)、木质-1,4-内酯酶(xylono-1,4-lactonase)、N-乙酰基葡糖胺基磷脂酰肌醇脱酰基酶(N-acetylglucosaminylphosphatidylinositol deacetylase)、西曲酸酯苯甲基酯酶(cetraxate benzylesterase)、乙酰基烷基甘油乙酰基水解酶(acetylalkylglycerol acetylhydrolase)和乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterase)。
[0187] 用于本发明的优选的酯酶是脂肪分解酶(lipolytic enzyme)，诸如，脂肪酶(分类为EC 3.1.1.3、EC 3.1.1.23和/或EC 3.1.1.26)和磷脂酶(分类为EC 3.1.1.4和/或EC 3.1.1.32，其包括分类为EC 3.1.1.5的溶血磷脂酶(lysophospholipase))。其它优选的酯酶是角质酶(分类为EC 3.1.1.74)。
[0188] 可将酯酶以有效量加入从而得到预期的优势以改进发酵微生物的性能，例如，改变发酵微生物内部和/或外部，或发酵微生物的细胞膜中的脂质组成/浓度，以在发酵过程中产生溶质进入和/或移出发酵微生物的运动中的改进，和/或以提供更多可代谢的能量来源(诸如，例如，通过将组分，如，来自谷物底物的油转化为发酵微生物有用的组分，例如，不饱和的脂肪酸和甘油)，以增加乙醇收率。有效量的酯酶的实例是大约0.01至大约400LU/g DS(干固体(Dry Solid))。优选地，以大约0.1至大约100LU/g DS，更优选大约
0.5至大约50LU/g DS，和甚至更优选大约1至大约20LU/g DS的量使用酯酶。使用本领域已知的标准方法，下文可获得酯酶量的进一步优化。
0.5至大约50LU/g DS，和甚至更优选大约1至大约20LU/g DS的量使用酯酶。使用本领域已知的标准方法，下文可获得酯酶量的进一步优化。
[0189] 一个脂肪酶单位(LU)是以三丁酸甘油酯(tributyrin)作为底物和阿拉伯树胶(gum arabic)作为乳化剂，在30℃、pH 7.0(磷酸盐缓冲液)，每分钟释放1.0μmol的可滴定的脂肪酸的酶量。
[0190] 在优选的实施方案中，酯酶是脂肪分解酶，更优选脂肪酶。如本文中使用的，“脂肪分解酶”指脂肪酶和磷脂酶(包括溶血-磷脂酶)。脂肪分解酶优选是微生物来源的，尤其是细菌、真菌或酵母来源。使用的脂肪分解酶可源自任何来源，包括，例如，犁头霉属(Absidia)的菌株，尤其是Absidia blakesleena和伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)，无色杆菌属(Achromobacter)的菌株，尤其是解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)，气单孢菌属(Aeromonas)的菌株，链格孢属(Alternaria)的菌株，尤其是Alternaria brassiciola，曲霉属(Aspergillus)的菌株，尤其是黑曲霉、米曲霉、烟曲霉(Asoergillus fumigatus)和黄曲霉(Aspergillus flavus)，无色杆菌属的菌株，尤其是解毒无色杆菌，短梗霉属(Aureobasidium)的菌株，尤其是出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，芽孢杆菌的菌株，尤其是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，白僵菌属(Beauveria)的菌株，索丝菌属(Brochothrix)的菌株，尤其是热杀索丝菌(Brochothrix thermosohata)，念珠菌属(Candida)的菌株，尤其是Candida cylindracea(皱落念珠菌(Candida rugosa))、Candida paralipolytica和Candida antarctica，色杆菌属(Chromobacter)的菌株，尤其是粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)，鬼伞属(Coprinus)的菌株，尤其是灰盖鬼伞(Coprnus cinerius)，镰孢属(Fusarium)的菌株，尤其是禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、Fusarium solani pisi、大刀粉红镰孢(Fusarium roseum culmorum)和Fusarium venenatum，Geotricum的菌株，尤其是Geotricum penicillatum，汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，尤其是异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，腐质霉属(Humicola)的菌株，尤其是Humicola brevispora、Humicola brevis var.thermoidea和特异腐质霉，Hyphozyma的菌株，乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株，尤其是完全乳杆菌(Lactobacillus curvatus)，绿僵菌属(Metarhizium)的菌株，毛霉属(Mucor)的菌株，拟青霉属(Paecilomyces)的菌株，青霉属(Penicillium)的菌株，尤其是圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillium crustosum)和扩展青霉(Penicillium expansum)，假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株，尤其是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(同义词洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、Pseudomonas mephitica lipolytica、产碱假单胞菌、植物假单胞菌(Pseudomonas plantari)、类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutze)和Pseudomonas wisconsinensis，丝核菌属(Rhizooctonia)的菌株，尤其是立枯丝核菌(Rhizooctonia solani)、根毛霉属(Rhizomucor)的菌株，尤其是曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)，根霉属(Rhizopus)的菌株，尤其是日本根霉(Rhizopus japonicus)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)和Rhizopus nodosus，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)的菌株，尤其是红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，红酵母属(Rhodotorula)的菌株，尤其是红酵母(Rhodotorula glutinis)，掷孢酵母属(Sporobolomyces)的菌株，尤其是Sporobolomyces shibatanus，嗜热霉属(Thermomyces)的菌株，尤其是细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)(以前称为Humicola lanuginosa)，Thiarosporella的菌株，尤其是Thiarosporella phaseolina，木霉属(Trichoderma)的菌株，尤其是Trichoderma harzianum和里氏木霉，和/或轮枝孢属(Verticillium)的菌株。
[0191] 在优选的实施方案中，所述的脂肪分解酶源自如下菌属的菌株：曲霉属、无色杆菌属、芽孢杆菌属、念珠菌属、色杆菌属、镰孢属、腐质霉属、Hyphozyma、假单胞菌属、根毛霉属、根霉属或嗜热霉属。
[0192] 在更优选的实施方案中，脂肪分解酶是脂肪酶。本文中可应用脂肪酶在例如，由谷物底物产生的发酵培养基(包括发酵酵母)中修饰甘油三酸酯(triglyceride)油和脂肪的结构和组成的能力。脂肪酶催化不同类型的甘油三酸酯转化，如水解、酯化和酯交换(transesterification)。合适的脂肪酶包括酸性、中性和碱性脂肪酶，如本领域中公知的，虽然酸性脂肪酶(如，例如，脂肪酶G AMANO 50，可由Amano得到)与中性或碱性脂肪酶相比，看起来在脂肪酶的较低浓度更有效。优选用于本发明的脂肪酶包括Candida antarcitca脂肪酶和Candida cylindracea脂肪酶。更优选的脂肪酶是纯化的脂肪酶，如Candida antarcitca脂肪酶(脂肪酶A)、Candida antarcitca脂肪酶(脂肪酶B)、Candida cylindracea脂肪酶和沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶。
[0193] 脂肪酶可为EP 258,068-A中公开的一种或可为脂肪酶变体如WO00/60063或TMWO 00/32758中公开的变体，在此并入作为参考。优选的商业脂肪酶包括LECITASE 、TM TM TM
LIPOLASE 和LIPEX (可由Novozymes A/S,丹麦得到)和G AMANO 50(可由Amano得到)。
LIPOLASE 和LIPEX (可由Novozymes A/S,丹麦得到)和G AMANO 50(可由Amano得到)。
[0194] 优选以大约1至大约400LU/g DS，优选大约1至大约10LU/g DS，和更优选大约1至大约5LU/g DS的量加入脂肪酶。
[0195] 在本发明的其它优选实施方案中，酯酶是角质酶。角质酶是能够降解角质(cutin)的酶。角质酶可源自任何来源。在优选的实施方案中，角质酶源自曲霉属的菌株，尤其是米曲霉，链格孢属的菌株，尤其是Alternaria brassiciola，镰孢属的菌株，尤其是腐皮镰孢(Fusarium solani)、Fusarium solani pisi、大刀粉红镰孢或Fusarium roseum sambucium，长蠕孢属(Helminthosporum)的菌株，尤其是麦根腐长蠕孢(Helminthosporum sativum)，腐质霉属的菌株，尤其是特异腐质霉，假单胞菌属的菌株，尤其是门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，丝核菌属(Rhizoctonia)的菌株，尤其是立枯丝核菌，链霉菌(Streptomyces)的菌株，尤其是疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)，或单格孢属(Ulocladium)，尤其是Ulocladium consoriale。在最优选的实施方案中，角质酶源自特异腐质霉的菌株，尤其是菌株特异腐质霉DSM 1800。特异腐质霉角质酶在WO 96/13580中描述，其在此并入作为参考。角质酶可为变体如WO00/34450和WO 01/92502中公开的变体中的一个，其在此并入作为参考。优选的角质酶变体包括WO 01/92502的实施例2中列出的变体，其在此明确地并入作为参考。有效量的角质酶为大约0.01至大约400LU/g DS，优选大约0.1至大约100LU/g DS，而且更优选大约1至大约50LU/g DS。使用本领域已知的标准方法，下文可获得角质酶量的进一步优化。
[0196] 在另一个优选的实施方案中，酯酶是磷脂酶。如本文使用的，术语“磷脂酶”是对于磷脂具有活性，例如，水解活性的酶。磷脂，如卵磷脂(lecithin)或磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)，由以两个脂肪酸在外部的(sn-1)位置和中间的(sn-2)位置酯化的甘油和以磷酸在第三个位置酯化的甘油组成。可将磷酸酯化为氨基醇。可区分几种类型的磷脂酶活性，包括磷脂酶A1和A2，其(分别在sn-1和sn-2位)水解一个脂肪酰基以形成溶血磷脂(lysophospholipid)；和水解溶血磷脂中残余的脂肪酰基的溶血磷脂酶(或磷脂酶B)。磷脂酶C和磷脂酶D(磷酸二酯酶(phosphodiesterases))分别释放二酰基甘油(diacyl glycerol)或磷脂酸(phosphatidic acid)。
[0197] 术语“磷脂酶”包括具有磷脂酶活性的酶，例如，磷脂酶A(A1或A2)，磷脂酶B活性，磷脂酶C活性，或磷脂酶D活性。如本文中使用的术语“磷脂酶A”旨在涵盖具有磷脂酶A1和/或磷脂酶A2活性的酶。也可通过具有其它活性的酶来提供磷脂酶活性，如，例如，具有磷脂酶活性的脂肪酶。磷脂酶活性可，例如，来自具有磷脂酶副活性(side activity)的脂肪酶。在其它实施方案中，通过基本上只具有磷脂酶活性的酶来提供磷脂酶酶活性，而且其中磷脂酶酶活性不是副活性。
[0198] 磷脂酶可为任何来源，例如，动物来源(例如，哺乳动物，例如，牛或猪胰(porcine pancreas))，或蛇毒(snake venom)或蜂毒(bee venom)。可替换地，磷脂酶可为微生物来源，例如，来自丝状真菌、酵母或细菌，如曲霉属，例如，泡盛曲霉(A.awamori)、臭曲霉(A.foetidus)、日本曲霉(A.japonicus)、黑曲霉(A.niger)或米曲霉(A.oryzae)，网柄菌属(Dictyostelium)，例如，盘基网柄菌(D.discoideum)；镰孢属(Fusarium)，例如，大刀镰孢(F.culmorum)、禾本科镰孢(F.graminearum)、异孢镰孢(F.heterosporum)、腐皮镰孢(F.solani)、尖镰孢(F.oxysporum)或(F.venenatum；毛霉属(Mucor)，例如，爪哇毛霉(M.javanicus)、大毛霉(M.mucedo)或细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢菌属(Neurospora)，例如，粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，例如，微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如，少根根霉(R.arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)、匍枝根霉(R.stolonifer)；核盘菌属(Sclerotinia)，例如，大豆核盘菌(S.libertiana)；毛癣菌属(Trichophyton)，例如，红色毛癣菌(T.rubrum)；Whetzelinia，例如，W.sclerotiorum；芽孢杆菌属(Bacillus)，例如，巨大芽孢杆菌(B.megaterium)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如，弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如，产气肠杆菌(E.aerogenes)或阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华氏菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如，草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E.coli)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如，肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；变形菌属(Proteus)，例如，普通变形菌(P.vulgaris)；普罗威登斯菌属(Providencia)，例如，斯氏普罗威登斯菌(P.stuartii)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如，液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如，弗氏志贺氏菌(S.flexneri)；
链霉菌属(Streptomyces)，例如，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；或耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。
链霉菌属(Streptomyces)，例如，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；或耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。
[0199] 优选的商业磷脂酶包括LECITASETM和LECITASETM ULTRA(可由Novozymes A/S,丹麦得到)。
[0200] 磷脂酶的有效量为大约0.01至大约400LU/g DS，优选大约0.1至大约100LU/g DS，并更优选大约1至大约50LU/g DS。使用本领域已知的标准方法，下文可获得磷脂酶量的进一步优化。
[0201] 蛋白酶
[0202] 在本发明的其它优选实施方案中，将至少一种表面活性剂和至少一种碳水化合物产生酶与至少一种蛋白酶组合使用。可使用蛋白酶，例如，来消化蛋白以产生游离的氨基氮(free amino nitrogen)(FAN)。所述游离的氨基酸起到酵母营养物的作用，从而增强酵母的甚至，并因此增加乙醇的生产。
[0203] 可通过在至少一种蛋白酶存在的条件下繁殖发酵微生物来产生用于发酵过程的发酵微生物。虽然不限于任何一种操作的理论，但相信当发酵微生物后续用于发酵过程时，在含有有效量的至少一种蛋白酶的情况下繁殖发酵微生物与不加蛋白酶在相同条件下繁殖的发酵微生物相比缩短了发酵微生物的迟滞时间(lag time)。相信蛋白酶在繁殖过程中的作用是直接或间接分别导致在发酵过程中对于发酵微生物有害或有益基因的抑制或表达，从而缩短了迟滞时间并得到更快的发酵循环。
[0204] 蛋白酶是本领域公知的并指催化切割肽键的酶。合适的蛋白酶包括真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，蛋白酶的特征在于在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力。合适的酸性真菌蛋白酶包括源自如下菌属的真菌蛋白酶：曲霉属、毛霉属、根霉属、念珠菌属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、Enthomophtra、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)。特别预期的是源自如下的蛋白酶：黑曲霉(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan28:216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan 28:66)、泡盛曲霉(Hayashida等,1977,Agric.Biol.Chem.42:927-933、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)或米曲霉；和源自微小毛霉(Mucor pusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
[0205] 细菌蛋白酶不是酸性蛋白酶，其包括商业可得到的产品ALCALASETM和TMNEUTRASE (可由Novozymes A/S得到)。其它蛋白酶包括来自Genencor Int,Inc.,美国TM
的GC106和来自Novozymes A/S的NOVOZYM 50006。
的GC106和来自Novozymes A/S的NOVOZYM 50006。
[0206] 优选地，蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，如，例如，Handbook ofProteolytic Enzymes,Edited by A.J.Barrett,N.D.Rawlings和 J.F.Woessner,Academic Press,San Diego,1998,Chapter 270)中所述。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，由Berka等,1990,Gene 96:313；Berka 等,1993,Gene 125:195-198; 和 Gomi 等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100公开的那些。
[0207] 过氧化物酶
[0208] 具有过氧化物酶活性的其它化合物可为任何过氧化物酶(EC 1.11.1.7)，或具有由其中获得的过氧化物酶活性，显示过氧化物酶活性的任何片段。
[0209] 优选地，过氧化物酶由植物(例如，辣根(horseradish)或大豆过氧化物酶)或微生物如真菌或细菌产生。
[0210] 一些优选的真菌包括属于丝孢纲(class Hyphomycetes)、半知菌亚门(subdivision Deuteromycotina)的菌株，例如，镰孢属、腐质霉属、木霉属、漆斑菌属(Myrothecium)、轮枝孢属(Verticillum)、Arthromyces、卡尔黑霉属(Caldariomyces)、单隔孢属(Ulocladium)、Embellisia、支孢属(Cladosporium)或Dreschlera，尤其是尖镰孢(DSM 2672)、特异腐质霉、Trichoderma resii、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)(IFO 6113)、黄萎轮枝孢菌(Verticillum alboatrum)、大丽花轮枝孢菌(Verticillum dahlie)、Arthromyces ramosus(FERMP-7754)、Caldariomyces fumago、 纸 单 隔 孢(Ulocladium chartarum)、Embellisia alli或Dreschlera halodes。
[0211] 其它优选的真菌包括属于担子菌纲(class Basidiomycetes)、担子菌亚门(subdivision Basidiomycotina)的菌株，例如，鬼伞属(Coprinus)、Phanerochaete、革盖菌属(Coriolus)或栓菌属(Trametes)，尤其是Coprinus cinereus f.microsporus(IFO8371)、长根鬼伞(Coprinus macrorhizus)、Phanerochaete chrysosporium(例如NA-12)或栓菌属(以前称为多孔菌属(Polyporus))，例如，T.versicolor(例如PR428-A)。
[0212] 其它优选的 真菌包括属 于Mycoraceae纲、接合菌亚 门(subdivision Zygomycotina)的菌株，例如，根霉属(Rhizopus)或毛霉属(Mucor)，尤其是冻土毛霉(Mucor hiemalis)。
[0213] 一些优选的细菌包括放线菌目(order Actinomycetales)的菌株，例如类球形链霉菌(Streptomyces spheroides)(ATTC 23965)、热紫链霉菌(Streptomyces thermoviolaceus)(IFO 12382)或 轮 枝 链 霉 菌 轮 枝 亚 种 (Streptoverticillum verticillium ssp.Verticillium)。
[0214] 其它优选的细菌包括类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、Rhodomonas palustri、乳链球菌(Streptococcus lactis)、Pseudomonas purrocinia(ATCC15958)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(NRRL B-11)和芽孢杆菌菌株，例如，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(ATCC 12905)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
[0215] 其它优选的细菌包括属于粘球菌属(Myxococcus)的菌株，例如，变绿粘球菌(M.virescens)。
[0216] 过氧化物酶也可为通过如下方法产生的一种，所述方法包括在培养基中在允许过氧化物酶表达的条件下培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，所述DNA载体携带编码过氧化物酶的DNA序列以及用于表达编码过氧化物酶的DNA序列的DNA序列，和从培养物中回收过氧化物酶。
[0217] 在优选的实施方案中，重组产生的过氧化物酶是源自鬼伞菌种的过氧化物酶，尤其是根据WO 92/16634的长根鬼伞或灰盖鬼伞(C.cinereus)。
[0218] 在本发明中，具有过氧化物酶活性的化合物包含过氧化物酶和源自细胞色素(cytochrome)、血红蛋白(haemoglobin)或过氧化物酶的过氧化物酶活性片段。
[0219] 一个过氧化物酶单位(POXU)是在如下条件下每分钟催化转化1μmole过氧化氢的酶量，所述条件为在30°C，在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.0、0.88mM过氧化氢，和1.67mM2,2'-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate))(ABTS)。反应60秒(混合后15秒)之后在418nm改变的吸光度，其-1 -1
应在0.15至0.30的范围内。为了计算活性，使用36mM cm 的氧化的ABTS的吸光系数和每2μmole氧化的ABTS转化1μmole H2O2的化学计量学。
应在0.15至0.30的范围内。为了计算活性，使用36mM cm 的氧化的ABTS的吸光系数和每2μmole氧化的ABTS转化1μmole H2O2的化学计量学。
[0220] 漆酶
[0221] 在本发明中，漆酶和与漆酶有关的酶包括分类为EC 1.10.3.2的任何漆酶，分类为EC 1.10.3.1的任何儿茶酚氧化酶(catechol oxidase)，分类为EC 1.3.3.5的任何胆红素氧化酶(bilirubin oxidase)，或分类为EC 1.14.18.1的任何单酚单加氧酶(monophenol monooxygenase)。
[0222] 上面提及的酶可为微生物的，即，得自细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，或它们可源自植物。
[0223] 来自真菌的合适的实例包括得自如下菌株的漆酶：曲霉属，脉孢菌属，例如，粗糙脉孢菌，柄孢壳属(Podospora)，葡萄孢属(Botrytis)，金钱菌属(Collybia)，层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)，例如，T.villosa和T.versicolor，丝核菌属(Rhizooctonia)，例如，立枯丝核菌，鬼伞属，例如，灰盖鬼伞(C.cinereus)、毛头鬼伞(C.comatus)、费赖斯鬼伞(C.friesii)和褶纹鬼伞(C.plicatilis)，小脆柄菇属(Psathyrella)，例如，黄盖小脆柄菇(P.condelleana)，斑褶菇属(Panaeolus)，例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus)，毁丝霉属(Myceliophthora)，例如，嗜热毁丝霉(M.thermophila)，Schytalidium，例如，S.thermophilum，多孔菌属，例如，P.pinsitus，密孔菌属(Pycnoporus),例如，朱红密孔菌(P.cinnabarinus)，射脉菌属(Phlebia)，例如，辐射射脉菌(P.radita)(WO 92/01046)，或革盖菌属，例如，毛革盖菌(C.hirsutus)(JP 2-238885)。
[0224] 来自包含漆酶的细菌的合适的实例得自芽孢杆菌的菌株。
[0225] 优选得自鬼伞属、毁丝霉属、多孔菌属，密孔菌属、柱顶孢属或丝核菌属的漆酶；尤其是得自灰盖鬼伞、嗜热毁丝霉、Polyporus pinsitus、朱红密孔菌、嗜热柱顶孢或立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的漆酶。
[0226] 商业可得到的漆酶是NS51001(Polyporus pinsitius漆酶，可由NovozymesA/S,丹麦得到)和NS51002(嗜热毁丝霉漆酶，可由Novozymes A/S,丹麦得到)。
[0227] 漆酶或与漆酶有关的酶也可为通过如下方法产生的一种，所述方法包括在培养基中在允许漆酶表达的条件下培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，所述DNA载体携带编码漆酶的DNA序列以及用于表达编码漆酶的DNA序列的DNA序列，和从培养物中回收漆酶。
[0228] 漆酶活性(LACU)由需氧条件下在pH 5.5氧化syringaldazin来测定。产生的紫(violet)颜色在530nm用光度计测定。分析条件为19mM syringaldazin,23mM乙酸盐缓冲液,pH 5.5，30°C，1分钟反应时间。一个漆酶单位(LACU)是上述条件下每分钟催化1.0μmole syringaldazin转化的酶量。
[0229] 漆酶活性(LAMU)由需氧条件下在pH 7.5氧化syringaldazin来测定。产生的紫颜色在530nm用光度计测定。分析条件为19mM syringaldazin,23mMTris/马来酸盐pH7.5，30°C，1分钟反应时间。一个漆酶单位(LAMU)是上述条件下每分钟催化1.0μmole syringaldazin转化的酶量。
[0230] 通过如下实施例进一步描述本发明，所述实施例不应看作对本发明的范围的限制。
[0231] 实施例
[0232] 材料
[0233] 使用的化学品如缓冲液和底物是至少试剂级的商业产品。
[0234] 菌株
[0235] 里 氏 木 霉 RutC30(ATCC 56765；Montenecourt 和 Eveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)，其 源 自 里 氏木 霉 Qm6A(ATCC 13631；Mandels和 Reese,1957,J.Bacteriol.73:269-278)，被用作表达米曲霉β-葡萄糖苷酶的宿主。
[0236] 大 肠 杆 菌 菌 株 TOP 10 细 胞 (Invitrogen,Carlsbad,California) 和Epicurian coli SURE电 穿 孔 -感 受 态 细 胞 (electroporation-competent cell)(Stratagene,LaJolla,CA)用于质粒的增殖。
[0237] 米曲霉JaL250菌株(WO 99/61651)用于表达烟曲霉β-葡萄糖苷酶。烟曲霉PaHa34用作家族GH3Aβ-葡萄糖苷酶的来源。
[0238] 培养基和缓冲溶液
[0239] YP培养基由每升10g的酵母提取物和20g的细菌用蛋白胨(bactopeptone)组成。
[0240] COVE选择平板由每升342.3g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10mM乙酰胺、15mM CsCl2和25g Noble琼脂组成。
[0241] COVE2平板由每升30g蔗糖、20ml COVE盐溶液、10mM乙酰胺、10mM尿苷和25g Noble琼脂组成。
[0242] COVE盐溶液由每升26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4和50ml的COVE痕量金属溶液(trace elements solution)组成。
[0243] COVE 痕 量 元 素 溶 液 由 每 升 0.04g NaB4O7·10H2O、0.4g CuSO4·5H2O、1.2gFeSO4·7H2O、0.7g MnSO4·H2O、0.8g Na2MoO2·2H2O和10g ZnSO4·7H2O组成。
[0244] 纤维素酶-诱导培养基(Cellulase-inducing media)由每升20g Arbocel B800-天然纤维素纤维(J.Rettenmaier USA LP，Schoolcraft,Michigan)、10g玉米浆固体(corn steep solid)(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、1.45g(NH4)2SO4、2.08gKH2PO4、0.28g CaCl2、0.42g MgSO4·7H2O、0.42ml里氏木霉痕量元素溶液和2滴pluronic酸；用10N NaOH调pH至6.0组成。
[0245] 里氏木霉痕量元素溶液由每升216g FeCl3·6H2O、58g ZnSO4·7H2O、27gMnSO4·H2O、10g CuSO4·5H2O、2.4g H3BO3和336g柠檬酸组成。
[0246] PEG缓冲液由每升500g PEG 4000(BDH,Poole,England)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH 7.5(过滤除菌)组成。
[0247] STC由每升1M山梨醇、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH 7.5(过滤除菌)组成。
[0248] YPD培养基，由每升10g酵母提取物、20g细菌用蛋白胨和40ml 50%葡萄糖组成。
[0249] 酵母选择培养基，由每升6.7g酵母氮碱基(yeast nitrogen base)、0.8g完全补充混合物(complete supplement mixture)(CSM,Qbiogene,Inc.,Carlsbad,CA;缺少尿嘧啶(uracil)并含有40mg/ml的腺嘌呤(adenine))、5g酪蛋白氨基酸(casmino acid)(无氨基酸)、100ml 0.5M琥珀酸盐(succinate)pH 5.0、40ml50%葡萄糖、1ml 100mM CuSO4、50mg氨苄青霉素和25mg氯霉素(chloramphenicol)组成。
[0250] 酵母筛选平板培养基由每升补加20g细菌用琼脂和150mg 5-溴-4-氯-3-吲哚 -β-D-吡 喃 葡 萄 糖 苷 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside)(X-Glc,INALCO SPA,Milano,意大利)但缺少氨苄青霉素和氯霉素的酵母选择培养基组成。
[0251] 马铃薯右旋糖培养基由每升39克的马铃薯右旋糖(Difco)组成。
[0252] PDA平板由每升39克的马铃薯右旋糖琼脂组成。
[0253] MDU2BP培养基由每升45g麦芽糖、1g MgSO4·7H2O、1g NaCl、2gK2SO4、12g KH2PO4、7g酵母提取物、2g尿素和0.5ml AMG痕量金属溶液，pH至5.0组成。
[0254] AMG痕量金属溶液，由每升14.3g ZnSO4·7H2O、2.5g CuSO4·5H2O、0.5gNiCl2·6H2O、13.8g FeSO4·7H2O、8.5g MnSO4·H2O和3g柠檬酸组成。
[0255] CIM培养基由每升20g纤维素、10g玉米浆固体、1.45g(NH4)2SO4、2.08g KH2PO4、0.28g CaCl2、0.42g MgSO4·7H2O和0.42ml痕量金属溶液,pH至6.0组成。
[0256] 痕量金属溶液由每升41.2mg FeCl3·6H2O、11.6mg ZnSO4·7H2O、5.4mgMnSO4·H2O、2.0mg CuSO4·5H2O、0.48mg H3BO3和67.2mg柠檬酸组成。
[0257] Β-葡萄糖苷酶活性试验
[0258] Β-葡萄糖苷酶活性在环境温度下在25μl的粗培养物上清液中测定，以1:10稀释于50mM琥珀酸盐pH 5.0中，使用200μl 0.5mg/ml对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)(pnpBDG)在50mM琥珀酸盐pH 5.0中作为底物。温育15分钟后，通过加入100μl 1M Tris-HCl pH8.0终止反应并在405nm用分光光度计读出吸光度。黑曲霉β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188,Novozymes A/S,Bagsverd,丹麦)用作酶标准物。
[0259] 内切葡聚糖酶活性试验
[0260] 内切葡聚糖酶对于羧甲基纤维素(CMC,5mg/ml)的比活性通过测定在50°C在50mM乙酸钠pH 5.0中在还原糖(RS)浓度的线性增加的范围内的水解初始速率随时间变化来测定。水解在无搅拌而存在0.5mg/ml BSA的条件下进行。比活性表示为国际单位(IU)每mg蛋白。一个IU定义为在水解的初始阶段一分钟内水解的糖苷键的μmol。将酶稀释以便于给出酶浓度与测定的活性之间的线性关系。
[0261] 羧甲基纤维素(型号7L2,Hercules Inc.,Wilmington,DE)具有0.7的平均的取代度(degree of substitution)(DS)。6.25mg/ml CMC在50mM乙酸钠pH 5.0中的溶液通过将CMC缓慢加入剧烈振荡的缓冲液，然后在连续搅拌下加热到大约60°C直到完全溶解来制备。
[0262] 纤维二糖水解酶活性试验
[0263] 根 据 由 Deshpande 等 (Deshpande,M.V.,Eriksson,K.-E.,Pettersson,L.G.,1984,An assay for selective determination of exo-1,4-β-glucanases in a mixture of cellulolytic enzymes,Anal.Biochem.138:481-487) 描 述 的 方法测定纤维二糖水解酶活性，将所述方法改进为96-孔微板形式。在50mM乙酸钠pH 5.0中在40°C水解30分钟后，由2.5mM对-硝基苯基-β-D-纤维二糖糖苷(p-nitrophenyl-β-D-cellobioside)(PNPC,Cat.#5754,Sigma,St.Louis,MO) 产 生 的对-硝基苯酚(PNP)的浓度在405nm(A405)在分光光度计上测定。水解之前，将酶稀释于
50mM乙酸钠pH 5.0以给出指定条件下小于8%的PNPC转化率。
50mM乙酸钠pH 5.0以给出指定条件下小于8%的PNPC转化率。
[0264] 酶
[0265] Celluclast 1.5L由Novozymes A/S,Bagsverd,丹麦得到。纤维素酶样品中的蛋白浓度通过如PCS Protein Assay Reagent Kit (Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)的使用说明中所述的BCA Microplate Assay测定。在测定浓度之前，将一些样品通过Bio Spin 6柱(BioRad Laboratories,Hercules,CA)根据制造商的说明进行脱盐(desalt)。
[0266] 在水解实验之前，使用带有Biomax-5膜(5000NMWL；Millipore,Bedford,MA)的Centricon Plus-20离心过滤器，将(根据WO 02/095014在米曲霉中重组生产的)米曲霉β-葡萄糖苷酶，(在米曲霉中重组生产的)烟曲霉β-葡萄糖苷酶，和(在米曲霉中重组生产的)里氏木霉内切葡聚糖酶I脱盐并交换入50mM乙酸钠pH 5.0缓冲液中。
[0267] 在每次实验前，由贮存在-20°C的储备酶溶液制备新鲜的酶稀释物。
[0268] 实施例1：构建pAlLo1表达载体
[0269] 通过修饰pBANe6(美国专利6,461,837)来构建表达载体pAlLo1，所述的pBANe6包含来自黑曲霉中性alpha-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase)的基因的启动子(NA2-tpi启动子)，黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶终止子序列(AMG终止子)，和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶(acetamidase)基因(amdS)的杂合体。pBANe6的修饰通过首先通过定点突变在来自amdS选择标记的位置2051、2722和3397bp消除三个Nco I限制位点来进行。将所有的改变设计为“沉默的”，保留amdS基因产物的实际蛋白序列不变。这三个位点的去除以GeneEditor Site-Directed Mutagenesis Kit(Promega,Madison,WI)，根据制造商的说明，使用如下引物(加下划线的核苷酸表示改变的碱基)同时进行：
[0270] AMDS3NcoMut(2050):
[0271] 5’-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3’(SEQ ID NO:1)
[0272] AMDS2NcoMut(2721):
[0273] 5’-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3’(SEQ ID NO:2)
[0274] AMDS1NcoMut(3396):
[0275] 5’-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3’(SEQ ID NO:3)
[0276] 然后使用QuickChange Mutagenesis Kit(Stratagene,La Jolla,CA)，将包含所有三个预期的序列改变的质粒进行定点突变，以消除位于AMG终止子的末端在位置1643的Nco I限制位点。如下引物(加下划线的核苷酸表示改变的碱基)用于突变：
[0277] 突变AMG终止子序列的上游(upper)引物:
[0278] 5’-CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3’(SEQ ID NO:4)[0279] 突变AMG终止子序列的下游(lower)引物:
[0280] 5’-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3’(SEQ ID NO:5)[0281] 修饰pBANe6的最后步骤是使用QuickChange Mutagenesis Kit和如下引物(underlined nucleotides represent the changed bases)在多接头的一开始添加新的Nco I限制位点以得到pAlLo1(图3)。
[0282] 突变NA2-tpi启动子的上游引物:
[0283] 5’-CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3’(SEQ ID NO:6)[0284] 突变NA2-tpi启动子的下游引物:
[0285] 5’-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3’(SEQ ID NO:7)[0286] 实施例2：构建pMJ04表达载体
[0287] 使用下面显示的引物993429(反义)和993428(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNA中PCR扩增所述里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1终止子来构建表达载体pMJ04。所述反义引物设计为在5’-末端有Pac I位点并在有义引物的5’-末端有Spe I位点。
[0288] 引物993429(反义):
[0289] 5’-AACGTTAATTAAGGAATCGTTTTGTGTTT-3’(SEQ ID NO:8)
[0290] 引物993428(有义):
[0291] 5’-AGTACTAGTAGCTCCGTGGCGAAAGCCTG-3’(SEQ ID NO:9)
[0292] 扩 增 反 应 (50μl) 由 1X ThermoPol 反 应 缓 冲 液 (New England Biolabs,Beverly,MA)、0.3mM dNTPs、100ng里氏木霉RutC30基因组DNA(其使用DNeasy Plant Maxi Kit,QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA分离)、0.3μM引物993429、0.3μM引物993428和2单位的Vent聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)组成。所述反应在Eppendorf Mastercycler 5333(Hamburg,德国)中温育，其程序为在94°C 30秒、55°C
30秒和72°C 30秒的30个循环(15分钟最终延伸)。所述反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液分离，其中从所述凝胶上切除229bp产物条带并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)根据制造商的说明来纯化。
30秒和72°C 30秒的30个循环(15分钟最终延伸)。所述反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上使用40mM Tris碱-20mM乙酸钠-1mM EDTA二钠(TAE)缓冲液分离，其中从所述凝胶上切除229bp产物条带并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)根据制造商的说明来纯化。
[0293] 将 得 到 的PCR 片 段 用Pac I 和Spe I 消 化 并 使 用 Rapid Ligation Kit(Roche,Indianapolis,IN)连接入用相同的限制性内切酶消化的pAlLo01中，以产生pMJ04(图2)。
[0294] 实施例3：构建pCaHj568表达载体
[0295] 由pCaHj170(美国专利No.5,763,254)和pMT2188构建表达质粒pCaHj568。质粒pCaHj170包含特异腐质霉内切葡聚糖酶5(Cel45A)编码区。质粒pMT2188构建如下：用下面显示的引物142779和142780由pCaHj483(WO 98/00529)PCR扩增pUC19复制起点。引物142780将BbuI位点引入PCR片段。
[0296] 142779:
[0297] 5’-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC-3’(SEQ ID NO:10)
[0298] 142780:
[0299] 5’-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC-3’(SEQ ID NO:11)
[0300] 按 照 制 造 商 的 说 明， 将 Expand PCR System(Roche Molecular Biochemicals,Basel,瑞士)用于此次和后续的PCR扩增。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，将1160bp片段分离并使用Jetquick Gel Extraction Spin Kit(Genomed,Wielandstr,德国)纯化。
[0301] URA3基因由常用的酿酒酵母克隆载体pYES2(Invitrogen,Carlsbad,CA)使用下面的引物140288和142778进行扩增。引物140288将Eco RI位点引入PCR片段。
[0302] 140288:
[0303] 5’-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT-3’(SEQ ID NO:12)
[0304] 142778:
[0305] 5’-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT-3’(SEQ ID NO:13)
[0306] 在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，将1126bp片段分离并使用Jetquick Gel Extraction Spin Kit纯化。
[0307] 通过混合将两个PCR片段融合并使用上面显示的引物142780和140288通过重叠方法剪接(overlap method splicing)(Horton等,1989,Gene 77:61-68)进行扩增。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物，将2263bp片段分离并使用Jetquick Gel Extraction Spin Kit纯化。
[0308] 用EcoRI和BbuI消化得到的片段并与用相同的酶消化pCaHj483的最大片段连接。连接化合物用于转化通过Mandel和Higa,1970,J.Mol.Biol.45:154的方法制成感受态-的pyrF 大肠杆菌菌株DB6507(ATCC 35673)。在每升补加1g酪蛋白氨基酸、500μg硫胺素和10mg卡那霉素的固体M9培养基(Sambrook等,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)上选择转化体。由一个转化体分离质粒并命名pCaHj527(图3)。
[0309] 将pCaHj527上存在的NA2/tpi启动子通过简单的PCR方法进行定点突变。使用突变引物141223将核苷酸134–144由GTACTAAAACC转变为CCGTTAAATTT：
[0310] 引物141223:
[0311] 5’-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC-3’(SEQ ID NO:14)[0312] 使 用 突 变 引 物141222 将 核 苷 酸423-436 由ATGCAATTTAAACT 转 变 为CGGCAATTTAACGG：
[0313] 引物141222:
[0314] 5’-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC-3’(SEQ ID NO:15)[0315] 得到的质粒命名为pMT2188(图4)。
[0316] 将特异腐质霉内切葡聚糖酶5编码区由pCaHj170作为BamHI-SalI片段转移到以BamHI和Xho I消化的pMT2188中，以产生pCaHj568(图5)。
[0317] 实施例4:构建pMJ05表达载体
[0318] 使用下面显示的引物HiEGV-F和HiEGV-R，通过由pCaHj568PCR扩增915bp特异腐质霉内切葡聚糖酶5编码区来构建表达载体pMJ05。
[0319] HiEGV-F(有义):
[0320] 5’-AAGCTTAAGCATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQ ID NO:16)
[0321] HiEGV-R(反义):
[0322] 5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO:17)
[0323] 扩 增 反 应 (50μl) 由 l×ThermoPol Reaction Buffer、0.3mM dNTPs、10ngpCaHj568质粒、0.3μM HiEGV-F引物、0.3μM HiEGV-R引物和2个单位的VentDNA聚合酶组成。所述的反应在Eppendorf Mastercycler 5333中温育，其程序如下：5个循环，每个94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后是25个循环，每个94℃30秒、65℃30秒和
72℃120秒(5分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离反应产物，其中从所述的凝胶上切除937bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
72℃120秒(5分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离反应产物，其中从所述的凝胶上切除937bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0324] 使用此937bp纯化的片段作为模板DNA，使用如下引物进行后续扩增：
[0325] HiEGV-R(反义):5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO:18)[0326] HiEGV-F-overlap( 有 义 ):5’-ATGCGTTCCTCCCCCCTCC-3’(SEQ ID NO:19)
[0327] 斜体表示的引物序列与17bp的里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子同源，而加下划线的引物序列与29bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶5编码区同源。所述启动子和所述编码序列之间的36bp重叠部分，允许将包含里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子的994bp片段与包含特异腐质霉内切葡聚糖酶5开放阅读框的918bp片段精确融合。
[0328] 扩增反应(50μl)由l×ThermoPol Reaction Buffer、0.3mM dNTPs、1μl的937bp纯化的PCR片段、0.3μM HiEGV-F-overlap引物、0.3μM HiEGV-R引物和2个单位的Vent DNA聚合酶组成。所述的反应在Eppendorf Mastercycler5333中温育，其程序如下：5个循环，每个94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后是25个循环，每个94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(5分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除945bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0329] 进行单独的PCR来扩增里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子序列，其由来自里氏木霉RutC30基因组DNA的基因的ATG起始密码子的994bp上游延伸，使用下列的引物(有义引物设计为在其5’-末端具有SalI限制位点)：
[0330] TrCBHIpro-F(有义):
[0331] 5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO:20)
[0332] TrCBHIpro-R(反义):
[0333] 5’-GATGCGCAGTCCGCGGT-3’(SEQ ID NO:21)
[0334] 扩增反应(50μl)由l×ThermoPol Reaction Buffer、0.3mM dNTPs、100ng的里氏木霉RutC30基因组DNA、0.3μM TrCBHIpro-F引物、0.3μMTrCBHIpro-R引物和2个单位的Vent DNA聚合酶组成。所述的反应在Eppendorf Mastercycler 5333中温育，其程序如下：30个循环，每个94℃30秒、55℃30秒和72℃120秒(5分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除998bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0335] 此998bp纯化的PCR片段用作模板DNA，使用下列引物进行后续扩增：
[0336] TrCBHIpro-F:
[0337] 5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO:22)
[0338] TrCBHIpro-R-overlap:
[0339] 5’-GGAGGGGGGAGGAACGCAT 3’(SEQ ID NO:23)
[0340] 斜体表示的序列与17bp的里氏木霉cbh1启动子同源，而加下划线的引物序列与29bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶5编码区同源。所述启动子和所述编码序列之间的36bp重叠部分，允许将包含里氏木霉Cel7A启动子的994bp片段与包含特异腐质霉内切葡聚糖酶5开放阅读框的918bp片段精确融合。
[0341] 扩增反应(50μl)由l×ThermoPol Reaction Buffer、0.3mM dNTPs、1μl的998bp纯化的PCR片段、0.3μM TrCBHlpro-F引物、0.3μMTrCBHlpro-R-overlap引物和2个单位的Vent DNA聚合酶组成。所述的反应在Eppendorf Mastercycler 5333中温育，其程序如下：5个循环，每个94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后是25个循环，每个
94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(5分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除1017bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(5分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除1017bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0342] 所述的1017bp里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子PCR片段和945bp特异腐质霉内切葡聚糖酶5PCR片段用作模板DNA，使用如下引物进行后续扩增，以精确地将994bp里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子与918bp特异腐质霉内切葡聚糖酶5编码区使用重叠PCR(overlappingPCR)进行融合。
[0343] TrCBHIpro-F:
[0344] 5’-AAACGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATC-3’(SEQ ID NO:24)
[0345] HiEGV-R:
[0346] 5’-CTGCAGAATTCTACAGGCACTGATGGTACCAG-3’(SEQ ID NO:25)
[0347] 扩 增 反 应 (50μl) 由 l×ThermoPol Reaction Buffer、0.3mM dNTPs、0.3μMTrCBHlpro-F引物、0.3μM HiEGV-R引物和2个单位的Vent聚合酶组成。所述的反应在Eppendorf Mastercycler 5333中温育，其程序如下：5个循环，每个94℃30秒、50℃30秒和72℃60秒，然后是25个循环，每个94℃30秒、65℃30秒和72℃120秒(5分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除1926bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0348] 将得到的1926bp片段，使用ZeroBlunt TOPO PCR Cloning Kit根据制造商的使用说明，克隆到pCR-Blunt-II-TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。将得到的质粒用Not I和Sal I消化，将1926bp片段纯化并连接到也用同样的两种限制酶消化的pMJ04中，以产生pMJ05(图6)。
[0349] 实施例5：构建pSMai135
[0350] 米曲霉β-糖苷酶编码区(WO 2002/095014,大肠杆菌DSM 14240,缺少推定的信号序列,参见图7,SEQ ID NOs:26和27)从Lys-20到TAA终止密码子，以pJaL660(WO2002/095014)作为模板，以下面显示的引物993728(有义)和引物993727(反义)进行PCR扩增。斜体表示的序列与20bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶V信号序列同源，而加下划线的序列则与22bp的米曲霉β-糖苷酶编码区同源。将Spe I位点设计在反义引物的5’末端。
[0351] 引物993728:
[0352] 5’- AGGATGATCTCGCGTACTCCC-3’(SEQ ID NO:28)
[0353] 引物993727:
[0354] 5’-GACTAGTCTTACTGGGCCTTAGGCAGCG-3’(SEQ ID NO:29)
[0355] 扩增反应(50μl)由Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTPs、10ng的pJaL660、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、1mM MgCl2和2.5个单位的Pfx聚合酶组成。所述的反应在Eppendorf Mastercycler 5333中温育，其程序如下：30个循环，每个94℃60秒、55℃60秒和72℃180秒(15分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除2523bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0356] 进行单独的PCR扩增以扩增1000bp的里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子和63bp推定的内切葡聚糖酶5信号序列(ATG起始密码子至Ala-21,图8,SEQ ID NOs:30(DNA序列)和31(推导的氨基酸序列)；DNA序列的登记号AAB03660)，使用下面显示的引物
993724(有义)和引物993729(反义)。斜体表示的引物序列与20bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶5信号序列同源，而加下划线的引物序列与22bp的米曲霉β-糖苷酶编码区同源。
质粒pMJ05，其包括在里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子控制下的特异腐质霉内切葡聚糖酶5编码区，被用作模板以产生包含里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子/特异腐质霉内切葡聚糖酶5信号序列片段的1063bp片段。42bp的重叠部分，在里氏木霉Cel7A启动子/特异腐质霉内切葡聚糖酶5信号序列和所述的米曲霉编码序列之间共享，以提供所述启动子和2523bp米曲霉β-糖苷酶的ATG起始密码子之间的正确连接。
993724(有义)和引物993729(反义)。斜体表示的引物序列与20bp的特异腐质霉内切葡聚糖酶5信号序列同源，而加下划线的引物序列与22bp的米曲霉β-糖苷酶编码区同源。
质粒pMJ05，其包括在里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子控制下的特异腐质霉内切葡聚糖酶5编码区，被用作模板以产生包含里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子/特异腐质霉内切葡聚糖酶5信号序列片段的1063bp片段。42bp的重叠部分，在里氏木霉Cel7A启动子/特异腐质霉内切葡聚糖酶5信号序列和所述的米曲霉编码序列之间共享，以提供所述启动子和2523bp米曲霉β-糖苷酶的ATG起始密码子之间的正确连接。
[0357] 引物993724:
[0358] 5’-ACGCGTCGACCGAATGTAGGATTGTTATCC-3’(SEQ ID NO:32)
[0359] 引物993729:
[0360] 5’-GGGAGTACGCGAGATCATCCTT -3’(SEQ ID NO:33)
[0361] 扩增反应(50μl)由Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTPs、10ng/μl pMJ05、6.4μM引物993728、3.2μM引物993727、1mM MgCl2和2.5个单位的Pfx聚合酶组成。所述反应在Eppendorf Mastercycler 5333中温育，其程序如下：30个循环，每个94℃60秒、60℃60秒和72℃240秒(15分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除1063bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0362] 所纯化的重叠片段用作模板，使用前面描述的引物993724(有义)和引物993727(反义)进行扩增，以将包含里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1启动子/特异腐质霉内切葡聚糖酶5信号序列的1063bp，与米曲霉β-糖苷酶的2523bp，通过重叠PCR进行精确地融合。
[0363] 扩增反应(50μl)由Pfx扩增缓冲液、0.25mM dNTPs、6.4μM引物993724、3.2μM引物993727、1mM MgCl2和2.5个单位的Pfx聚合酶组成。所述的反应在Eppendorf Mastercycler 5333中温育，其程序如下：30个循环，每个94℃60秒、60℃60秒和72℃240秒(15分钟最终延伸)。在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离所述的反应产物，其中从所述的凝胶上切除3591bp产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0364] 所得到的3591bp片段用Sal I和Spe I消化，并连接到用同样的限制酶消化的pMJ04中，以产生pSMai135(图9)。
[0365] 实施例6：里氏木霉中米曲霉β-葡萄糖苷酶的表达
[0366] 将编码与特异腐质霉内切葡聚糖酶5分泌信号(图8,SEQ ID NOs:30(DNA序列)和31(推导的氨基酸序列))连接的成熟米曲霉β-葡萄糖苷酶酶的质粒pSMai135通过PEG-介导的转化导入里氏木霉RutC30。该表达质粒包含构巢曲霉amdS基因以使转化体能在作为唯一氮源的乙酰胺上生长。
[0367] 使用由Penttila等,1987,Gene 61:155-164改进的方法进行原生质体制备和转化。简单地，在27°C和90rpm在25ml补加2%(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的YP培养基中将里氏木霉RutC30培养17小时。使用Millipore’s Vacuum Driven Disposable Filtration System(Millipore,Bedford,MA)通过过滤收集菌丝体，并用去离子水洗涤两次和用1.2M山梨醇洗涤两次。通过如下方法产生原生质体：将洗涤的菌丝体悬浮于含有每ml 15mg Glucanex(NovozymesA/S,Bagsverd,丹麦)和每ml 0.36单位的壳多糖酶(chitinase)(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO)的20ml 1.2M山梨醇中并在34°C及90rpm轻微振荡下温育15-25分钟。通过在400xg离心7分钟收集原生质体并用冷的1.2M山梨醇洗涤两8
次。原生质体使用血细胞计数器计数并重悬于STC至1X10 原生质体每ml的终浓度。将过量的原生质体贮存于-80°C的Cryo 1°C Freezing Container(Nalgene,Rochester,NY)。
次。原生质体使用血细胞计数器计数并重悬于STC至1X10 原生质体每ml的终浓度。将过量的原生质体贮存于-80°C的Cryo 1°C Freezing Container(Nalgene,Rochester,NY)。
[0368] 将用Pme I消化的大约7μgpSMai135加入100μl的原生质体溶液并轻微混合，然后加入260μl PEG缓冲液，混合并在室温温育30分钟。然后加入STC(3ml)，混合并使用构巢曲霉amdS选择将转化溶液涂布在COVE平板上。将该平板在28°C温育5-7天。将转化体在COVE2平板上传代培养(sub-culture)并在28°C生长。
[0369] 随机选择含有米曲霉β-葡萄糖苷酶基因的67个转化体(SMA135-01至SMA135-67)并在含有25ml纤维素酶-诱导培养基的125ml带挡板的摇瓶中在28°C和200rpm培养7天。将里氏木霉RutC30作为对照。接种7天后移出培养液样品，在微型离心机中以15,700xg离心5分钟，并将上清液转移到新管中。将样品贮存在4°C直到酶试验。如上所述，使用对-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物测定上清液的β-葡萄糖苷酶活性。
[0370] 许多SMA135转化体显示的β-葡萄糖苷酶活性比里氏木霉RutC30显示的活性高几倍。转化体SMA135-04产生最高的β-葡萄糖苷酶活性，该活性比里氏木霉RutC30作为对照产生的β-葡萄糖苷酶活性高7倍。
[0371] 使用带有Criterion System(BioRad,Hercules,CA)的Criterion Tris-HCl(5%溶解(resolving))凝胶(BioRad,Hercules,CA)进行SDS聚丙烯酰胺电泳。将5μl的7天上清液(参见上文)悬浮于2X浓度的Laemmli Sample Buffer(BioRad,Hercules,CA)并在存在5%β-巯基乙醇的条件下煮沸3分钟。将上清样品上样在聚丙烯酰胺凝胶上并以1XTris/Glycine/SDS作为电泳缓冲液(BioRad,Hercules,CA)进行电泳。将得到的凝胶用BioRad的Bio-Safe Coomassie Stain染色。
[0372] 67个里氏木霉SMA135转化体中的26个产生大约110kDa的蛋白质，其在宿主菌株里氏木霉RutC30中是不可见的。里氏木霉转化体SMA135-04产生最高水平的β-葡萄糖苷酶。
[0373] 实施例7:在里氏木霉中通过发酵产生重组米曲霉β-葡萄糖苷酶
[0374] 对里氏木霉菌株SMA135-04进行发酵以产生大量的米曲霉β-葡萄糖苷酶。里氏木霉RutC30(宿主菌株)作为对照。使用如Mandels和Weber,1969,Adv.Chem.Ser.95:391-413)所述的标准条件在2%纤维素上进行发酵。发酵进行165小时，此时将最终的发酵培养液离心并将上清液贮存于-20°C直到使用较早前所述的方法进行β-葡萄糖苷酶活性试验。
[0375] 测定的里氏木霉SMA135-04发酵样品中的Β-葡萄糖苷酶活性比里氏木霉RutC30中的活性高大约8倍。
[0376] 实施例8：在烟曲霉基因组序列中鉴定β-葡萄糖苷酶家族GH3A基因[0377] 使用来自棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶蛋白质序列(登记号P48825)作为查询序列，进行烟曲霉部分基因组序列(Altschul等,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)的Blast搜索(The Institute for Genomic Research,Rockville,MD)。基于与查询序列在氨基酸水平的高度相似性，将几个基因鉴定为推定的家族GH3A同源物。选择一个大约3000bp的基因组区用于进一步研究，该区与查询序列在氨基酸水平具有大于70%的同一性。
[0378] 实施例9：烟曲霉基因组DNA的提取
[0379] 烟曲霉在带挡板的摇瓶中的250ml马铃薯葡萄糖(potato dextrose)培养基中在37°C和240rpm下生长。通过过滤收获菌丝体，在TE(10mM Tris-1mMEDTA)中洗涤两次，并在液氮下冷冻。将冷冻的菌丝体通过研钵和杵研磨成细粉，将其重悬于含有10mM Tris、
100mM EDTA、1%Triton X-100、0.5M胍-HCl和200mM NaCl的pH 8.0缓冲液中。以20mg/升的浓度加入无DNase的RNase A并将裂解物在37°C温育30分钟。通过离心去除细胞碎片，并使用Qiagen Maxi 500柱(QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)分离DNA。将所述的柱子在10ml QBT中平衡，用30ml QC洗涤，并用15ml QF洗脱(所有缓冲液都来自QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)。将DNA在异丙醇中沉淀，在70%乙醇中洗涤，并通过离心回收。将所得的DNA重悬于TE缓冲液中。
100mM EDTA、1%Triton X-100、0.5M胍-HCl和200mM NaCl的pH 8.0缓冲液中。以20mg/升的浓度加入无DNase的RNase A并将裂解物在37°C温育30分钟。通过离心去除细胞碎片，并使用Qiagen Maxi 500柱(QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)分离DNA。将所述的柱子在10ml QBT中平衡，用30ml QC洗涤，并用15ml QF洗脱(所有缓冲液都来自QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)。将DNA在异丙醇中沉淀，在70%乙醇中洗涤，并通过离心回收。将所得的DNA重悬于TE缓冲液中。
[0380] 实施例10：构建pAlLo2表达载体
[0381] 将pAILol(实施例1)的amdS基因同构巢曲霉pyrG基因进行交换。将质粒pBANe10(图11)用作pyrG基因的来源。pBANe10的序列分析显示，pyrG标记包含于Nsi I限制性酶切片段中，而且不包含Nco I或Pac I限制位点。由于amdS两翼也有Nsi I限制性酶切位点，交换选择标记的策略为Nsi I限制性酶切片段的简单交换。将来自pAILol和pBANe10的质粒DNA用限制酶Nsi I消化，并使用标准方法通过琼脂糖凝胶电泳纯化该产物。将来自含有pyrG基因的pBANe10的Nsi I片段连接到pAILol的骨架上以取代原始的含有amdS基因的Nsi I DNA片段。重组的克隆通过限制性消化进行分析以确定它们是否具有正确的插入片段和正确的方向。选择具有以逆时针方向转录的pyrG基因的克隆。所述的新质粒命名为pAILo2(图12)。
[0382] 实施例11：克隆家族GH3A β-葡萄糖苷酶基因并构建米曲霉表达载体[0383] 设计下面显示的两个合成的寡核苷酸引物以由实施例9中制备的基因组DNA来PCR扩增编码家族GH3Aβ-葡萄糖苷酶的烟曲霉基因。使用InFusion Cloning Kit(BD Biosciences,Palo Alto,CA)以将该片段直接克隆到表达载体pAILo2中，而不需限制性消化和连接。
[0384] 正向引物:5’-ACTGGATTTACC -3’(SEQ ID NO:34)
[0385] 反向引物:5’-AGTCACCTCTAGTTA -3’(SEQ ID NO:35)
[0386] 粗体字母表示编码序列。剩余的序列与pAlLo2的插入位点同源。
[0387] 将50皮摩尔的每种上述引物用于含有如下组分的PCR反应中：100ng烟曲霉基因组DNA，1X Pfx扩增缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)，1.5μl 10mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物，2.5单位的Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)，1μl 50mM MgSO4和2.5μl 10X pCRx增强溶液(Enhancer solution)(Invitrogen,Carlsbad,CA)，总体积50μl。扩增条件为94°C 2分钟的一个循环；30个循环，每个94°C 15秒，55°C30秒，和68°C 3分钟。然后加热块(block)进入4°C保温循环(soak cycle)。
[0388] 在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离反应产物，其中从所述的凝胶上切除3kb产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0389] 然后将该片段使用Infusion Cloning Kit克隆到pAILo2表达载体中。所述的载体用限制性内切酶Nco I和Pac I(使用制造商指定的条件)进行消化。所述片段通过凝胶电泳和QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化。基因片段和消化的载体在反应中连接在一起，得到表达质粒pEJG97(图13)，其中家族GH3Aβ-葡糖苷酶基因的转录在NA2-tpi启动子的控制之下。该连接反应(50μl)由1×InFusion缓冲液(BD Biosciences,Palo Alto,CA)、1×B SA(BD Biosciences,Palo Alto,CA)、1μl的Infusion酶(1:10稀释)(BD Biosciences,PaloAlto,CA)、150ng用Nco I和Pac I消化的pAlLo2和50ng的烟曲霉β-葡糖苷酶纯化的PCR产物组成。所述的反应在室温温育30分钟。使用1μl的反应转化大肠杆菌XLl0 Solopac Gold细胞(Stratagene,La Jolla,CA)。含有pEJG97质粒的大肠杆菌转化体通过限制性消化进行检测，并且使用BioRobot 9600(QIAGEN,Inc.,Valencia,CA)制备质粒DNA。
[0390] 实施例12：表征编码家族GH3A β-葡萄糖苷酶的烟曲霉基因组序列[0391] 来自pEJG97的烟曲霉β-葡糖苷酶基因的DNA测序，使用染料-终止子化学(Giesecke等,1992,Journal of Virology Methods 38:47-60)和引物步移(primer walking)策略以Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL自动DNA测序仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystems,Inc.,Foster City，CA)进行。仔细检查核苷酸序列数据的质量并借助于PHRED/PHRAP软件(University of Washington,Seattle,WA)将所有序列进行相互比较。
[0392] 基于与来自棘孢曲霉、黑曲霉和川地曲霉(Aspergillus kawachii)的同源基因的相似性，构建烟曲霉序列的基因模型。所述的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)在图10中显示。所述的基因组片段编码863个氨基酸的多肽，其被62、55、58、63、58、58、63和51bp的8个内含子中断。所述基因的%G+C含量为54.3%。使用SignalP软件程序(Nielsen等,1997,Protein Engineering 10:1-6)，预测了19个残基的信号肽。预测的成熟蛋白包含844个氨基酸，具有91.7kDa的分子量。
[0393] β-葡糖苷酶序列的比较比对(comparative alignment)使用Clustal W方法TM(Higgins,1989,C4BI055:151-153)，使用具有同一性表和下述多个比对参数的LASERGENE TM
MEGALIGN 软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)进行测定：缺口罚10分和缺口长度罚10分。
配对比对参数为Ktuple=1，缺口罚分=3，窗口(window)=5和对角线(diagonal)=5。所述的比对显示，所述烟曲霉β-葡糖苷酶基因的推导的氨基酸序列，与棘孢曲霉(登记号P48825)、黑曲霉(登记号O00089)和川地曲霉(登记号P87076)的β-葡糖苷酶的推导的氨基酸序列，分享78%、76%和76%的同一性。
MEGALIGN 软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)进行测定：缺口罚10分和缺口长度罚10分。
配对比对参数为Ktuple=1，缺口罚分=3，窗口(window)=5和对角线(diagonal)=5。所述的比对显示，所述烟曲霉β-葡糖苷酶基因的推导的氨基酸序列，与棘孢曲霉(登记号P48825)、黑曲霉(登记号O00089)和川地曲霉(登记号P87076)的β-葡糖苷酶的推导的氨基酸序列，分享78%、76%和76%的同一性。
[0394] 实施例13：在米曲霉JaL250中表达烟曲霉家族GH3A β-葡萄糖苷酶基因[0395] 米 曲 霉 JaL250 原 生 质 体 根 据 Christensen 等 ,1988,Bio/Technology6:1419-1422的方法制备。5μg的pEJG97(以及pAILo2作为载体对照)用于转化米曲霉JAL250。
[0396] 用pEJG97转化米曲霉JaL250得到大约100个转化体。将10个转化体分离到单独的PDA平板。
[0397] 将10个转化体中的5个汇合的PDA平板用5ml的0.01%Tween 20洗涤，并单独地接种到125ml玻璃摇瓶中的25ml MDU2BP培养基中，并在34℃、250rpm培育。培育5天后，根据制造商的说明使用8-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)分析来自每个培养物的0.5μl上清。所述培养物的SDS-PAGE图样显示，转化体中的一个(命名为转化体1)具有大约130kDa的主条带。
[0398] 将(在PDA上生长的)转化体1的汇合的平板用10ml的0.01%Tween 20洗涤并接种入含有400ml MDU2BP培养基的2升Fernbach中以产生培养液用于表征所述的酶。所述摇瓶在第5天收获并使用0.22μm GP Express plus Membrane(Millipore,Bedford,MA)过滤。
[0399] 在水解实验之前，使用具有Biomax-5膜(5000NMWL；Millipore,Bedford,MA)的Centricon Plus-20离心过滤器将(在米曲霉中重组产生的)米曲霉β-葡萄糖苷酶脱盐并交换到50mM乙酸钠pH 5.0缓冲液中。
[0400] 实施例14：构建pMJ09
[0401] 通过使用下面显示的引物993696(反义)和993695(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNA中PCR扩增所述里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbh1)启动子来构建表达载体pMJ06。所述反义引物设计为在有义引物的5’-末端具有Sal I位点并在反义引物的5’-末端具有Nco I位点。
[0402] 引物993695(有义):
[0403] 5’-ACTAGTCGACCGAATGTAGGATTGTT-3’(SEQ ID NO:38)
[0404] 引物993696(反义):
[0405] 5’-TGACCATGGTGCGCAGTCC-3’(SEQ ID NO:39)
[0406] 扩增反应(50μl)由1XThermoPol反应缓冲液、0.3mM dNTPs、100ng里氏木霉RutC30基因组DNA(其使用QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit制备)、0.3μM引物993696、0.3μM引物993695和2单位的Vent聚合酶组成。所述反应在Eppendorf Mastercycler
5333中温育，其程序为：30个循环，每个循环94°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒的(15分钟最终延伸)。
5333中温育，其程序为：30个循环，每个循环94°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒的(15分钟最终延伸)。
[0407] 在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离反应产物，其中从所述凝胶上切除988bp产物条带并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit根据制造商的说明来纯化。
[0408] 将得到的PCR片段用Nco I和Sal I消化并使用Rapid Ligation Kit连接入用相同的限制性内切酶消化的pMJ04以产生pMJ06(图14)。
[0409] 通过使用下面显示的引物993843(反义)和99344(993844)(有义)从里氏木霉RutC30基因组DNA中PCR扩增所述里氏木霉Cel7A纤维二糖水解酶1基因(cbh1)终止子来构建表达载体pMJ09。所述反义引物设计为在5’-末端具有PacI和Spe I位点并在有义引物的5’-末端具有PvuI位点。
[0410] 引物993844(有义):
[0411] 5’-CGATCGTCTCCCTATGGGTCATTACC-3’(SEQ ID NO:40)
[0412] 引物993843(反义):
[0413] 5’-ACTAGTTAATTAAGCTCCGTGGCGAAAG-3’(SEQ ID NO:41)
[0414] 扩增反应(50μl)由1X ThermoPol反应缓冲液、0.3mM dNTPs、100ng里氏木霉RutC30基因组DNA(其使用QIAGEN DNeasy Plant Maxi Kit提取)、0.3μM引物993844、0.3μM引物993843和2单位的Vent聚合酶组成。所述反应在Eppendorf Mastercycler
5333中温育，其程序为：30个循环，每个94°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒的(15分钟最终延伸)。所述反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离，其中从所述凝胶上切除473bp产物条带并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit根据制造商的说明来纯化。
5333中温育，其程序为：30个循环，每个94°C 30秒、55°C 30秒和72°C 60秒的(15分钟最终延伸)。所述反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离，其中从所述凝胶上切除473bp产物条带并使用QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit根据制造商的说明来纯化。
[0415] 将得到的PCR片段用PvuI和Spe I消化并使用Rapid Ligation Kit连接入用PacI和Spe I消化的pMJ06中，以产生pMJ09(图15)。
[0416] 实施例15：家族7里氏木霉内切葡聚糖酶(eg1)基因的克隆、表征和表达[0417] 设计下面显示的两个合成的寡核苷酸引物以从由里氏木霉RutC30通过使用Cells-to-cDNA Kit(Ambion,Austin,TX)根据制造商的说明制备的cDNA中PCR扩增编码推定的家族7内切葡聚糖酶的里氏木霉基因。
[0418] 正向引物:5'-CTTCACCATGGCGCCCTCAGTTACACTGC-3'(SEQ ID NO:42)[0419] 反向引物:5’-GCCGTTAATTAAGGCAAGTCAACGCTCTAAAGG-3’(SEQ ID NO:43)[0420] 将50皮摩尔的每种上述引物用于含有如下组分的PCR反应中：100ng里氏木霉cDNA，1X Pwo扩增缓冲液(Roche,Indianapolis,IN)，4μl 10mM的dATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物，2.5单位的Pwo DNA聚合酶(Roche,Indianapolis,IN)，终体积50μl。扩增条件为94°C 2分钟的一个循环；35个循环，每个94°C 15秒，55°C 30秒，和72°C 2分钟。
然后加热块进入4°C保温循环。
然后加热块进入4°C保温循环。
[0421] 在1.0%琼脂糖凝胶上使用TAE缓冲液分离反应产物，其中从所述的凝胶上切除1.5kb产物条带，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)，根据制造商的使用说明进行纯化。
[0422] 然后将该片段克隆到pAILo2中。片段和载体都用限制性内切酶Nco I和Pac I消化。然后通过凝胶电泳和Qiaquick凝胶纯化进行纯化。消化的基因片段和载体在反应中连接在一起，得到表达质粒pJZHEG1(图16)，其中eg1基因的转录在TAKA启动子的控制之下。该连接反应(40μl)由1×连接缓冲液(Roche,Indianapolis,IN)、1X DNA稀释缓冲液(Roche,Indianapolis,IN)、5.0单位的T4DNA连接酶(Roche,Indianapolis,IN)、100ng用Nco I和Pac I消化的pAlLo2和100ng里氏木霉eg1PCR产物组成。所述的反应在室温温育30分钟。使用1μl的反应转化大肠杆菌XLl0Solopac Gold细胞(Stratagene,LaJolla,CA)。含有pJZHEG1质粒的大肠杆菌转化体通过限制性消化进行检测，并且使用BioRobot 9600(QIAGEN,Inc.,Valencia，CA)制备质粒DNA。
[0423] 来自pJZHEG1的里氏木霉eg1的DNA测序，使用染料-终止子化学根据制造商的说明，以Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377XL自动DNA测序仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystems,Inc.,Foster City，CA)进行。仔细检查核苷酸序列数据的质量并借助于PHRED/PHRAP软件(University of Washington,Seattle,WA)将所有序列进行相互比较。eg1序列的比较比对使用Clustal W方法(Higgins,1989,C4BI055:151-153)，及Vector NTI软件(InfoMax,San Francisco,CA)进行测定。所述的比对显示，所述里氏木霉eg1基因的推导的氨基酸序列，与里氏木霉EG1(登记号AAA34212,Penttila等,1986,Gene45:253-263)的推导的氨基酸序列是同一的。
[0424] 米曲霉JaL250原生质体根据Christensen等,1988,见上文的方法制备。5μg的pJZHEG1(以及pAILo2作为载体对照)用于转化米曲霉JaL250。
[0425] 用pJZHEG1转化米曲霉JaL250得到大约40个转化体。将20个转化体分离到单独的PDA平板。将每个用5ml的0.01%Tween 20洗涤，并单独地接种到125ml玻璃摇瓶中的25ml MDU2BP培养基中，并在34℃、250rpm培育。培育5天后，根据制造商的说明使用8-16%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)分析来自每个培养物的0.5μl上清。所述培养物的SDS-PAGE图样显示，转化体中的一个(命名为转化体9)具有大约58kDa的主条带。
[0426] 将(在PDA上生长的)转化体9的汇合的平板用10ml的0.01%Tween 20洗涤并接种入含有400ml MDU2BP培养基的2升Fernbach中以产生培养液用于表征所述的酶。所述摇瓶在第5天收获并使用0.22μm GP Express plus Membrane(Millipore,Bedford,MA)过滤。如本文所述测定内切葡聚糖酶活性。
[0427] 在水解实验之前，使用具有Biomax-5膜(5000NMWL；Millipore,Bedford,MA)的Centricon Plus-20离心过滤器将(在米曲霉中重组产生的)里氏木霉内切葡聚糖酶I脱盐并交换到50mM乙酸钠pH 5.0缓冲液中。
[0428] 实施例16：制备预处理的玉米秸
[0429] 玉米秸在美国能源部国家可再生能源实验室(U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory)(NREL)使用稀硫酸预处理。如下条件用于预处理：1.4wt%硫酸（sufuric acid）在165°C和107psi处理8分钟。预处理的玉米秸(PCS)中的水溶性固体含有56.5%纤维素、4.6%半纤维素和28.4%木质素。纤维素和半纤维素通过两阶段硫酸水解及使用NREL标准分析方法#002通过高性能液相色谱进行糖的后续分析来测定。木质素则在使用NREL标准分析方法#003用硫酸水解纤维素和半纤维素级分之后通过重量分析来测定。在酶法水解之前，用大体积的DDI水在玻璃过滤器中洗涤PCS。水洗的PCS的干重为24.54%。
[0430] 实施例17：制备木质的残余物(lignacious residue)
[0431] 通过将5%PCS与(在里氏木霉中重组产生的)米曲霉β-葡萄糖苷酶的无细胞过滤发酵液以10mg每g PCS在恒定搅拌下在900-ml反应中在pH 5.0、50°C温育6天来制备木质的残余物。水解后，通过在3836xg离心10分钟除去液体水解物，并将固体富含木质素的残余物用250ml去离子水洗涤四次。然后将残余物在250ml去离子水中在恒定搅拌下在65°C温育5天以使任何残余的吸附的酶失活。在用去离子水附加洗涤之后，如上所述离心，得到去离子水中大约100ml 15%的木质残余物的悬浮液。
[0432] 实施例18：糖分析
[0433] 使用8-通道吸液器(pipettor)在具体的时间点从PCS水解反应中移出20μl等分试样，并加入MultiScreen HV 96-孔过滤板(Millipore,Bedford,MA)中的180μl碱性混合物(102mM Na2CO3加58mM NaHCO3)以终止反应。将样品真空过滤入其它平底微板以去除PCS残基。适当稀释后，使用对羟基苯甲酸酰肼(p-hydroxybenzoic acid hydrazide)(PHBAH) 试 验 (Lever M.,1973,Colorimetric and fluorometric carbohydrate determination with p-hydroxybenzoicacid hydrazide,Biochemical Medicine7:274-281)以微板形式将滤液用于还原糖(RS)的分析。
[0434] 将稀释样品 的90-μl等分试样置于96- 孔圆锥底的微板 (Corning Inc.,Acton,MA,Costar,澄清的聚碳酸酯)的每个孔中。通过将2%氢氧化钠中的60μl1.25%PHBAH加入每个孔开始试验。将不加盖的平板在定制的加热块上在95°C加热10分钟。在将微板冷却到室温之后，将35μl去离子水加入每个孔。从每孔中移出
100-μl等分试样并转移到平底96-孔板(Corning Inc.,Acton,MA,Costar,介质结合的(medium binding)聚苯乙烯)。使用a SpectraMAX MicroplateReader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测定在410nm(A410)的吸光度。使用标准曲线将A410值翻译为葡萄糖当量(glucose equivalent)。
100-μl等分试样并转移到平底96-孔板(Corning Inc.,Acton,MA,Costar,介质结合的(medium binding)聚苯乙烯)。使用a SpectraMAX MicroplateReader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测定在410nm(A410)的吸光度。使用标准曲线将A410值翻译为葡萄糖当量(glucose equivalent)。
[0435] 以与样品同样处理的6个葡萄糖标准(0.005、0.010、0.025、0.050、0.075和0.100mg/ml)得到标准曲线。葡萄糖标准通过用去离子水稀释10mg/ml葡萄糖储液来制备。
[0436] 使用如下方程式计算纤维素转化为还原糖的程度(水解收率,%)：
[0437] RS收率(%)=RS(mg/ml)*100*162/(纤维素(mg/ml)*180)=
[0438] =RS(mg/ml)*100/(纤维素(mg/ml)*1.111)
[0439] 在此方程式中，RS是以葡萄糖当量测定的溶液中还原糖的浓度(mg/ml)，而因子1.111反映了纤维素到葡萄糖的转化中的增重。
[0440] 实施例19：使用 90非离子表面活性剂在50°C增强由PCS生产糖
[0441] PCS(5%w/v以干重为基础)通过以0.6mg每g PCS补加脱盐的并且缓冲液交换的(在米曲霉中重组产生的)米曲霉β-葡萄糖苷酶的Celluclast 1.5L(2.5,5,10,和20mg/g PCS)的水解在50mM乙酸钠pH 5.0、10-ml体积中、间歇搅拌下在50°C进行。在不同的时间点取样并如实施例18分析还原糖。以2.5和5mg每g PCS含有Celluclast 1.5L的反应补加0.5%v/v 90(0.1ml/g PCS)，并将结果与无表面活性剂的对照反应相比较。
[0442] 如表2和图17所示的结果说明， 90的加入在温育125小时后使还原糖的水解收率(hydrolysis yield)增加，与2.5mg Celluclast/g PCS的反应从70%增加到86%(改进23%)，而与5mg Celluclast/g PCS的反应从83%增加到94%(改进14%)。使用 90，与无表面活性剂的反应相比可能使酶装载量(enzyme loading)减小一半(reduce by a factor of two)，同时得到相同的125小时水解收率。
[0443] 表2. 90和 AT80(0.1ml/g PCS)对于Celluclast 1.5L在50°C水解PCS(5%)的影响。
[0444]
[0445] 实施例20：使用 AT80非离子表面活性剂在50°C增强由PCS生产糖
[0446] 重复实施例19，除了以0.1ml/g PCS(0.5%v/v)使用 AT80。
[0447] 如表2和图18所示的结果说明， AT80的加入增加了还原糖的125-小时水解收率，与2.5mg Celluclast/g PCS的反应从70%增加到82%(改进17%)，而与5mg Celluclast/gPCS的反应从83%增加到90%(改进9%)。
[0448] 实施例21：使用 90非离子表面活性剂在50°C和55°C增强由PCS生产糖
[0449] 重复实施例19，除了包括Celluclast 1.5L的附加装载量(1.25mg/g PCS)，以0.2ml/g PCS(1.0%v/v)使用 90，和水解在50°C和55°C两个温度进行。将
90加入含有1.25,2.5,和5mg Celluclast 1.5L每g PCS的反应中，并将结果与无表面活性剂的对照反应相比较。结果显示于表3和图19和20中。
90加入含有1.25,2.5,和5mg Celluclast 1.5L每g PCS的反应中，并将结果与无表面活性剂的对照反应相比较。结果显示于表3和图19和20中。
[0450] 在50°C， 90的加入与无表面活性剂的反应相比，增加了还原糖的120-小时水解收率。图19显示存在 90的情况下，与无表面活性剂的反应相比，酶装载量可减小一半同时保持相同的水解收率。
[0451] 在55°C， 90显示比在50°C更显著的改进。 90在55°C的加入与无表面活性剂的反应相比，使还原糖的120-小时水解收率增加了36-59%。图
20显示存在 90的情况下，与无表面活性剂的反应相比，低四倍的(four times lower)酶装载量能得到可比较的还原糖水解收率。
20显示存在 90的情况下，与无表面活性剂的反应相比，低四倍的(four times lower)酶装载量能得到可比较的还原糖水解收率。
[0452] 表3. 90(0.2ml/g PCS)对于Celluclast 1.5L在50°C和55°C水解PCS(5%)的影响。
[0453]
[0454]
[0455] 实施例22:Celluclast 1.5L在50°C水解PCS的 90剂量依赖性。
[0456] 重复实施例19，除了将 90以0.05,0.1,0.2,0.3,和0.4ml/g PCS与2mg Celluclast 1.5L每gPCS一起加入反应中，并将脱盐的并且缓冲液交换的(在米曲霉中重组产生的)米曲霉β-葡萄糖苷酶以3%的Celluclast装载量(0.6mg/g PCS)加入。
[0457] 结果显示于表4和图21。 90的最佳装载量为0.1ml每g PCS，其对应于0.5%v/v的 90浓度。
[0458] 表4.Celluclast 1.5L(2mg/g PCS)在50°C水解PCS(5%)的 90剂量依赖性。
[0459]
[0460] 实施例23：使用不同的 90产品在50°C增强由PCS生产糖
[0461] 重复实施例22，除了以0.2ml每g PCS(1.0%v/v)将具有增加的乙氧基化程度和增加的亲水/亲脂平衡(HLB)值的不同 产品， 50、90、120或200，与2mgCelluclast 1.5L每g PCS一起加入反应。
[0462] 图22显示所述 产品表现相似，与无表面活性剂的反应相比，使最终的还原糖的水解收率增加17-30%。
[0463] 实施例24： 90对于Celluclast 1.5L和表达米曲霉β-葡萄糖苷酶的里氏木霉发酵培养液在50°C水解PCS的影响。重复实施例22，除了以0.2ml每g PCS(1.0%v/v)将 90与以0.06mg每g PCS补加脱盐的并且缓冲液交换的(在米曲霉中重组产生的)米曲霉β-葡萄糖苷酶的Celluclast 1.5L(2mg/g PCS)一起加入反应，或与2mg每gPCS的(在里氏木霉中重组产生的)米曲霉β-葡萄糖苷酶的无细胞的过滤发酵培养液一起加入反应。
[0464] 无 90时，两种酶表现相似。图23显示 90的加入提供了两种酶可比较的改进效果(boosting effect)。
[0465] 实施例25: 90对于里氏木霉CBHI在40-65°C水解PCS的增强的影响
[0466] 由Celluclast 1.5L使用 等,2000,Cellulose 7:189-209描述的方法分离并纯化里氏木霉纤维二糖水解酶I(CBHI)至均质(homogeneity)。
[0467] 通过纯化的里氏木霉CBHI(2,5,和10mg/g PCS)水解乙醇-洗涤的/磨碎的PCS(1%w/v以干重为基础)在50mM乙酸钠pH 5.0、0.5-ml体积中，在间歇搅拌下在40°C、50°C、55°C、60°C和65°C进行。在不同的时间点取样并如实施例18所述分析还原糖。以2mg/g PCS含有里氏木霉CBHI的反应补加0.1%v/v 90(0.1ml/g PCS)，并将结果与无表面活性剂的对照反应操作进行比较。
[0468] 结果显示于图24。在55°C， 90的加入，与无表面活性剂的反应相比，使还原糖的24-小时水解收率增加94%(从6.1%至11.9%)。在不存在 90的情况下，得到可比较的水解收率需要高2.5倍的酶装载量(5mg/g PCS)。
[0469] 实施例26： 90对于(里氏木霉CBHI加烟曲霉β-葡萄糖苷酶)混合物在40-65°C水解PCS的增强的影响
[0470] 重复实施例25，除了里氏木霉CBHI以5%的CBHI蛋白装载量(0.1、0.25和0.5mg/g PCS)补加脱盐的并且缓冲液交换的(在米曲霉中重组产生的)烟曲霉β-葡萄糖苷酶。
[0471] 如图25所示的结果说明，在55°C， 90的加入，与无表面活性剂的反应相比，使还原糖的24-小时水解收率增加115%(从9.8%至21.1%)。在不存在90的情况下，得到可比较的水解收率需要高2.5倍的酶装载量(5mg/g PCS)。
[0472] 实施例27： 90对于里氏木霉CBHI加里氏木霉EGI加烟曲霉β-葡萄糖苷酶混合物在40-65°C水解PCS的增加的影响
[0473] 重复实施例25，除了里氏木霉CBHI(2、5、10和20mg/g PCS)以20%的CBHI蛋白装载量(0.4、1、2和4mg/g PCS)补加脱盐的并且缓冲液交换的里氏木霉内切葡聚糖酶I(EGI；在米曲霉中重组产生的)和以5%的CBHI蛋白装载量(0.1、0.25、0.5和1.0mg/g PCS)补加脱盐的并且缓冲液交换的(在米曲霉中重组产生的)烟曲霉β-葡萄糖苷酶。
[0474] 结果显示于图26。在55°C， 90的加入，与无表面活性剂的反应相比，使还原糖的24-小时水解收率增加132%(从11.9%至27.6%)。得到的水解收率，高于不存在 90的情况下使用高2.5倍的酶装载量(5mg/g PCS)所得到的水解收率(27.6%对21.3%)。
[0475] 实施例28： 90对于里氏木霉CBHI加解纤维热酸菌E1cd加烟曲霉β-葡萄糖苷酶混合物在40-65°C水解PCS的增强的影响
[0476] 重复实施例27，除了使用由NREL得到的细菌内切葡聚糖酶解纤维热酸菌E1cd取代真菌内切葡聚糖酶里氏木霉EGI。解纤维热酸菌E1cd根据美国专利No.5,275,944由浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)TK24表达。通过将浅青紫链霉菌-表达的酶进行蛋白水解处理(proteolytic treatment)以去除纤维素-结合区域来产生此酶的截短形式(truncated form)(Baker等,1995,in Enzymatic Degradation of Insolble Polysaccharides,Saddler，J.N.和Penner,M.H.编,ACSSeries 618,American Chemical Society，Washington,DC,113-141)。
[0477] 如图27所示的结果说明，在55°C， 90的加入，与无表面活性剂的反应相比，使还原糖的24-小时水解收率增加70%(从22.2%至37.7%)。得到的水解收率，高于不存在 90的情况下使用高2.5倍的酶装载量(5mg/g PCS)所得到的水解收率(37.7%对33%)。
[0478] 实施例29: 90对于Celluclast 1.5L在50°C水解Avicel的影响
[0479] 通过以0.6mg每g纤维素补加脱盐的并且缓冲液交换的(在米曲霉中重组产生的)米曲霉β-葡萄糖苷酶的Celluclast 1.5L(1.25、2.5、5、10和20mg/g纤维素)水解微晶纤维素(microcrystalline cellulose)Avicel PH101(1%w/v以干重为基础,FMC Corporation,Philadelphia,PA)在50mM乙酸钠pH 5.0、1-ml体积中在间歇搅拌下在50°C进行。在不同的时间点取样并如实施例18所述分析还原糖。以1.25、2.5和5mg/g纤维素含有Celluclast 1.5L的反应以0.05、0.1和0.2ml/g纤维素补加 90，并将结果与无表面活性剂的对照反应进行比较。
[0480] 图28显示在上述条件下 90对于Avicel的水解不具有显著的改进效果。
[0481] 实施例30：使用非离子表面活性剂在50°C增强由PCS生产糖
[0482] 通过2mg每g PCS的米曲霉β-葡萄糖苷酶(recombinantly produced in里氏木霉)的无细胞的过滤发酵培养液水解水洗的/磨碎的PCS(5%w/v以干重为基础)在存在如表5所示的多种非离子表面活性剂(0.1ml/gPCS)的条件下在2-ml体积中在间歇搅拌下、在pH 5.0、50°C进行71小时。在不同的时间点取样并如实施例18所述分析还原糖。将结果与无表面活性剂的对照反应进行比较。
[0483] 表5显示表面活性剂的加入将还原糖的71-小时水解收率从60%(无表面活性剂)增加到63-72%(改进4-19%)。
[0484] 表5.非离子表面活性剂(0.1ml/g PCS)对于含有表达的米曲霉β-葡萄糖苷酶(2mg/g PCS)的里氏木霉发酵培养液在50°C水解PCS(5%)的影响
[0485]
[0486]
[0487] 生物材料保藏
[0488] 依据布达佩斯条约的条款，下述的生物材料已经保藏于农业研究机 构 保 藏 中 心，北 方 区 研 究 中 心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)，1815 University Street,Peoria,Illinois,61604，并给出了下述的保藏号：
[0489] 保藏物(Deposit) 保藏登记号 保藏日期
[0490] E.coli TOP10(pEJG113) NRRL B-30695 2003年10月17日[0491] 该菌株于下述条件下保藏：确保在本专利申请未决期间，由专利与商标委员依据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授权的人能够获得该培养物。所述保藏物为所保藏菌株的基本上纯的培养物。在提交了该主题申请的副本，或其后续文本的国家，依据该外国专利法律的要求，可以获得该保藏物。然而，应当理解，保藏物的获得并不构成对实施本发明的许可，实施本发明是对政府行为所授予的专利权的侵犯。
[0492] 在此描述并要求的本发明不局限于本文公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案旨在作为本发明的某些方面的说明。任何等同的实施方案确定地包含在本发明的范围内。实际上，除去在这里显示和描述的那些之外，对本发明前述的说明书的各种更改，对于本领域的那些技术人员是显而易见的。这样的更改也确定地落在所附权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包含定义的本公开为准。
[0493] 在此引用各种参考文献，其公开整体地并入作为参考。
[0494] 关于微生物保藏的说明
[0495] （细则13之二）
[0496]
[0497] PCT/RO/134表（1992年7月）
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