长春花脂质转移蛋白的基因序列
专利汇可以提供长春花脂质转移蛋白的基因序列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种长春花干旱胁迫条件下长春花 叶片 中诱导的新的抗旱基因及其编码产物的 氨 基酸序列。它涉及一种新的基因序列。其特征在于：该基因全长698bp，在33bp处具有起始密码子ATG，401bp处具有终止密码子TAA，在680bp处具有polyA附加 信号 。该序列无内含子，具有369bp完整的开放读码框，编码122个氨基酸。所述的氨基酸序列与 马 铃薯LTP序列的同源性达45％。本 发明 还提供了一种快速得到全长胁迫基因的方法。首先使用适度的干旱处理条件，使 植物 抗旱基因表达富集；然后通过构建全长的cDNA文库及测序，在最短的时间内得到抗干旱胁迫相关的全长基因。获得的抗旱基因直接构建在真核表达载体pCMV质粒上，可使用t3、t7通用引物进行测序。同时，可通过真核 生物 表达来直接进行筛选。本发明从植物cDNA中分离出了脂质转移蛋白的全长基因，该基因具有较强的抗旱功能，同时，对增强植物其它逆境抗性也起到重要的作用。该基因的克隆扩大了植物抗旱研究的基因资源，为运用基因工程技术提高植物抗干旱胁迫及品质改良提供了更加丰富的优良候选基因。，下面是长春花脂质转移蛋白的基因序列专利的具体信息内容。
1.一种编码长春花脂质转移蛋白的核苷酸序列，其特征在于其具有如下的DNA核苷酸及相 应的氨基酸序列：
ggcacgagga tttgtgagca tacaatcaaa taatggcaag atcaaagttg tttatgcaga 60
agcagctact aggactagta attttgatat ggatgttggc atataatcct cggccaagtg 120
aagccttaac gtgtgacgat gtgaacaaca acctcatctc atgtctgagt tacgtcgcag 180
gcggtggaaa ggtgccgaca agctgttgca gtggggtgaa aaatctgctt agtttagcca 240
agactagaaa cgaccggcaa acagcatgct catgcttgaa atctcttgct gttgaagcca 300
ataatgatca acttaagagg gctcaaactg ttccaaagtc ttgttctttg accattcctt 360
ttcctatttc cagagatgtt gattgctcca aggtgaaata ataccttgac gaactctgat 420
gactgcatat atatatatat aaatagtgtc tcattggtaa tatatatgca gtaattttga 480
ttattattat atagagaaag aataaagaat aattatgtgg tcttcctcta agcaagagat 540
ttcaacacaa ttacaagtga aattaaatta tgttgtataa ttaacattac ttaaacttga 600
tgatcatata taatgttatt tcgcattgat gctttattca atggggaaaa taattaattt 660
cgaaataaaa atttaagcta aaaaaaaaaa aaaaaaaa 698
MARSKLFMQKQLLGLVILIWMLAYNPRPSEALTCDDVNNNLISCLSYVAGGGKVPTSCCSGVKNLLSLAKTRNDRQTACS
CLKSLAVEANNDQLKRAQTVPKSCSLTIPFPISRDVDCSKVK
2.一种如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于33bp处具有起始密码子ATG，401bp处 具有终止密码子TAA，在680bp处具有polyA附加信号。该序列无内含子，具有369bp完整 的开放读码框，编码122个氨基酸。
3.一种如权利要求1所述的长春花脂质转移蛋白的核苷酸序列的克隆方法，其特征在于：首 先使用适度的干旱处理条件，使植物抗旱基因表达富集；然后通过构建全长的cDNA文库， 及测序，在最短的时间内得到抗旱相关的全长胁迫基因。获得的抗旱基因直接构建在真核表 达载体pCMV质粒上，可通过真核生物表达来直接进行筛选。基因可以使用t3、t7通用引物 进行测序。
所属领域
本发明属于分子生物学、基因工程领域，是编码脂质转移蛋白的基因在长春 花中的首次发现，预知有很强的抗旱功能。
背景技术
nsLTPs是一类小分子可溶性蛋白，在高等植物中占全部可溶性蛋白的4％。 其氨基酸残基和PI在不同的植物中数值是不相同的，其中在植物nsLTPs中分子 量在9～10kDa能够被凝胶层析或SDS-PAGE电泳检测出。从植物中分离纯化到 的nsLTPs分子量比较小。根据分子量的大小，植物nsLTPs可分为两大类，即 nsLTPI1和nsLTP2，分子量分别为9kDa和7kDa。通常，nsLTPI主要存在于植 物的地上部分器官，而nsLTP2主要存在于根部，但两者都存在种子里。在各种 不同的物种中nsLTPs的生化性质不尽相同，如从Nicotiana glauca中分离得到的 NgLTPI基因能够编码一个含有117个氨基酸残基的疏水蛋白，该蛋白含有21个 氨基酸残基的信号肽系列，成熟的NgLTPI分子量为9.2kDa，pI8.3。它具有较高 的热稳定性，能耐100℃高温而结构不发生变化。nsLTPs具有良好的稳定性，在 4℃可贮存数月之久。它在高温下也有较好的稳定性，即使在有变性剂存在情况 下也十分稳定。
第一个编码植物LTP的cDNA是从玉米幼苗构建的基因文库中分离得到的。 目前已从好几种植物中分离鉴定到了nsLTPs基因，这其中有拟南芥、西红柿、 玉米、辣椒、大戟、甘蓝、大麦、胡萝卜、水稻、草莓、绿豆等。它们通常是以 基因家族的形式出现，由几个关系紧密的组分构成。
目前，在多种植物中都有关于LTP蛋白或基因的研究报道。这些基因的表 达或蛋白累积与植物的胁迫抗性正相关。由于植物本身不能移动，对于不良或恶 劣的自然条件，只有改变自身的代谢途径的生长去适应环境的改变。LTP表达的 提高有助于增加植物对各种不良环境的抗性。LTP在保卫细胞中的表达量最高， 而在叶肉细胞和根中表达量很低甚至无法检测到，经干早诱导处理后保卫细胞中 LTPRNA含量增加了四倍多。
经检索未发现任何公开或报道过长春花脂质转移基因及蛋白序列。
发明内容
本发明的第二目的在于提供一种快速获得胁迫相关基因全长序列的方法。
本发明的cDNA分子是通过如下的方法获得的：
首先通过测定植物叶片水势来寻找植物中度胁迫的处理条件。使植物干旱胁 迫下表达蛋白的丰度富集。
其次，采用最适处理材料进行总RNA的提取及mRNA的纯化，用mRNA 进行全长cDNA表达文库的构建。构建后cDNA处于真核表达载体质粒pCMV 上，可直接进行克隆cDNA的表达文库的筛选。
最后，采用3730测序仪，对随机挑选的克隆进行测序。EST标签在与NCBI 数据库进行比对后，对相关克隆测通全长，得到完整的LEA基因的完全编码序 列。
本发明的重要应用价值在于：
该基因在抗旱过程中具有以下优点：LTP表达的提高有助于增加植物对各种 不良环境的抗性。实验表明，LTP在保卫细胞中的表达量最高，而在叶肉细胞和 根中表达量很低甚至无法检测到，经干早诱导处理后保卫细胞中LTP RNA含量 增加了四倍多。植物中由于LTP的存在使植物对不良环境具有很强的抗性和适 应性，以及对病原微生物有抗性，因此，LTP蛋白在提高植物对干旱的抗性中起 重要作用，具体抗旱机制尚待进一步阐明。
附图说明
图1是不同植物来源LTP蛋白的同源性比对图
图2是长春花与马铃薯LTP蛋白的同源性比对图
具体实施方式：
实施例1 长春花抗旱基因晚期胚胎丰富蛋白全长基因的克隆
步骤1，植物材料处理
长春花幼苗播种在珍珠岩中，在光照培养箱中培养，每天浇水，取1个月苗 龄的长春花植株在光培箱中自然脱水，没隔一小时测叶片水势及渗透势，以达 -1.0MPa为标准取材。取叶片液氮速冻，立即放入-70度的超低温冰箱中。
步骤2，总RNA的提取及mRNA的纯化
1.利用Trizol(Gibco)一步法提取总RNA，根据试剂盒说明书步骤进行。对 总RNA定量并进行变性电泳质量分析。
2.mRNA的纯化：利用Oligotex mRNA Purification Kit(Qiagen)从总RNA 中纯化mRNA并进行定量。
步骤3，λZAPExpress cDNA文库的构建(Stratagene)
1.cDNA第一链的合成
(1)冰上建立如下体系：
5.0μL 10×buffer 3.0μLdNTP Mix，2.0μL Link-Primer 12.5μL DEPC-H2O， 1.0μLRNAsin，混匀，加入mRNA 5μg，加入1.5μL反转录酶。
(2)轻轻混匀，42℃温育1hr。
2.cDNA第二链的合成
(1)在第一链反应体系中顺序加入：20μL 10×buffer，6.0μL dNTP Mix，116μL DEPC-H2O，2.0μL RNAseH(1.5U/μL)，11.0μL DNA polymerase I(9.0U/μL)
(2)置16℃水浴保温2.5hr。
3.cDNA末端补平
(1)冰上加如下试剂：23μL dNTP Mix，2.0μL pfu DNA pol(2.5U/μL)。
(2)72℃温育30min。
(3)用200μL酚/氯仿抽提一次，室温高速离心2min，转上清于另一新管中。
(4)用等体积氯仿抽提一次，转上清于另一新管中。
(5)加20μL 3mol/L NaAc，400μL 100％乙醇，混匀，-20℃过夜。
(6)4℃ 16000g离心60min，收集cDNA沉淀。
(7)加500μL 70％乙醇轻轻洗。
(8)全速离心2min，室温下抽真空使沉淀干燥。
(9)沉淀重悬于9.0μL EcoR I adapters中。4℃保温至完全溶解。
4.EcoR I衔接子的连接
(1)顺序加入：1.0μL 10×buffer(Ligase Buffer)。
1.0μL 10mmol/L rATP
1.0μL T4DNA ligase(4U/μL)
4℃连接2天。
(2)70℃水浴30min，以灭活Ligase。
5.EcoR I连接子末端的磷酸化。
(1)室温离心2s并放置5min，加入：
1.0μL 10×Ligase Buffer
2.0μL 10mmol/L rATP
5.0μL sterile H2O
2.0μL T4 Kinase(5U/μL)
37℃保温30min。
(2)70℃加热30min灭活Kinase
6.Xho I消化
加入下列成分：
28.0μL Xho I buffer
3.0μL Xho I(40U/μL)
37℃保温1.5hr。
7.载体连接
7.1使用Wizard SV Gel and PCR CLEAN System kit(Promega) 回收cDNA片段，对回收的cDNA进行EB定量。
7.2 cDNA与ZAP Express Vector连接
在1.5ml离心管中加入：
2.0μL重悬cDNA
0.5μL 10×ligase buffer
0.5μL 10mM rATP
1.0μL ZAP Express Vector
0.5μL ddH2O
T4 DNA ligase(4U/uL)0.5μL，
4℃连接2天。
8.λ重组DNA的体外包装
(1)加入目的DNA 100ng至包装蛋白中，混匀，离心汇于管底。
(2)22℃温育2hr后，加入500μL SM Buffer，在加20μL氯仿，轻轻混匀。
9.λ噬菌体的转染
9.1噬菌体文库滴度的测定
(1)划线培养XL1-blue MRF’，37℃过夜，培养基为LB(含12.5μg/ml Tet)。
(2)接种至LB broth，30℃，200rpm过夜摇(OD＜1)，1000×g离心收集菌 体，加10mmol/L MgSO4重悬菌体至OD600＝0.5。
(3)在上述包装体系中各取1.0μL做一系列稀释，即1→10-2→10-4，各取1.0μL 稀释液于宿主菌中，吸附15min后，加3mL顶层琼脂，迅速铺在提前育温至37℃ 的底层琼脂，待凝固后37℃过夜倒置培养。
(3)待噬菌斑长出后，计算滴度。经检测，初级文库的库容达到1×106pfu/ml。
9.3噬菌体文库的扩增
(1)宿主菌制备同前。
(2)铺好板后37℃过夜倒置培养。噬菌斑不超过1～2mm。
(3)用4mL SM Buffer涂盖菌板，4℃贮存过夜。
(4)吸出SM Buffer于无菌管中，在加1mL SM Buffer洗菌板一次，吸到管中 加氯仿至终浓度5％，混匀置室温培养15min，500g离心10min，移走细胞碎 片。
(5)转上清于另一管中，加氯仿至终浓度0.3％，4℃存放。
(6)测滴度。经扩增，文库的滴度达1×108pfu/ml
10噬菌体文库的体内剪切
(1)划线培养XL1-blue MRF’和XLOLR菌于LB培养基(含12.5μg/ml Tet). 挑单菌落接种至50mL LB broth，30℃，200rpm过夜培养。
(2)1000×g离心收集XL1-blue MRF’和XLOLR cells，用10mM MgSO4重悬 至OD600＝1。
(3)在离心管中加入100倍于初级库的噬菌体量。按10∶1(cells-to-lambda phage)加入宿主菌XL1-blue在按(10∶1 helper phage-to-cells ratio)加入辅助噬菌 体。
(4)37℃吸附15min，加20ml NZY broth with supplements，37℃摇培3hr， 65℃热激20min，1000×g离心10min，转上清于另一管中。
(5)测滴度：取上清1.0μL分别加到200μL XLOLR菌中，37℃吸附15min， 再加200μL NZY broth 37℃摇培45min。
(6)从中取出100μL铺LB(50μg/ml，kana)37℃过夜培养，得到菌落。
11应用PCR反应体系检测平均插入片段的长度
取载体引物，挑单克隆进行PCR验证插入片断，PCR反应条件为：
95.0℃预变性5min，然后94.0℃变性30s，50.0℃模板退火30s，72.0℃延伸2min， 共30个循环，最后，72.0℃最终延伸7min，反应结束后，取PCR产物在1％ 琼脂糖凝胶上进行电泳检测。经检验，平均插入片断长为1.2kb。
步骤4，采用3730测序仪进行测序(ABI)
采用T7引物进行单向测序，每个反应可达800-1200bp。得到的EST序列进 入NCBI进行比对后，对干旱胁迫相关基因质粒测通，得到全长基因序列。
实施例2 长春花LTP的序列信息与同源性分析
以下部分为克隆的长春花LTP蛋白的核苷酸序列：
ggcacgagga tttgtgagca tacaatcaaa taatggcaag atcaaagttg tttatgcaga 60
agcagctact aggactagta attttgatat ggatgttggc atataatcct cggccaagtg 120
aagccttaac gtgtgacgat gtgaacaaca acctcatctc atgtctgagt tacgtcgcag 180
gcggtggaaa ggtgccgaca agctgttgca gtggggtgaa aaatctgctt agtttagcca 240
agactagaaa cgaccggcaa acagcatgct catgcttgaa atctcttgct gttgaagcca 300
ataatgatca acttaagagg gctcaaactg ttccaaagtc ttgttctttg accattcctt 360
ttcctatttc cagagatgtt gattgctcca aggtgaaata ataccttgac gaactctgat 420
gactgcatat atatatatat aaatagtgtc tcattggtaa tatatatgca gtaattttga 480
ttattattat atagagaaag aataaagaat aattatgtgg tcttcctcta agcaagagat 540
ttcaacacaa ttacaagtga aattaaatta tgttgtataa ttaacattac ttaaacttga 600
tgatcatata taatgttatt tcgcattgat gctttattca atggggaaaa taattaattt 660
cgaaataaaa atttaagcta aaaaaaaaaa aaaaaaaa 698
全编码序列为从33位的atg到401位的taa。第680位具有polyA附加信号。 其编码的122个氨基酸序列为：
MARSKLFMQKQLLGLVILIWMLAYNPRPSEALTCDDVNNNLISCLSYVAGGG
KVPTSCCSGVKNLLSLAKTRNDRQTACSCLKSLAVEANNDQLKRAQTVPKSC
SLTIPFPISRDVDCSKVK
本发明从长春花中分离该基因，即从新的物种中分离该基因，因而具有创新 性；长春花属耐干旱、耐盐碱植物，因而预知该基因有更强的抗旱、耐盐碱功能， 有更新的实用价值。
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