本发明涉及重组DNA技术，尤其涉及当与未转基因的同样的植物 相比较时显示出对除草剂具有基本的抗性或基本的耐受性的转基因植 物的生产。本发明还涉及用于该转基因植物的生产或由该转基因植物 产生的核苷酸序列(和其表达产物)。

在经受除草剂时，对除草剂具有基本“耐受性”的植物提供了一 个当与同样经受除草剂的非耐受性的相同的植物相比较时右移的剂量 /响应曲线。这样的剂量/响应曲线具有标示着“剂量”的x轴和标示着 “致死百分率”、“除草效应”等等的y轴。为了产生指定的除草效应， 耐受性植物通常需要至少两倍于非耐受性的相同植物的除草剂。当经 受为了杀死种植了用于商业目的农作物的农田中的杂草而通常为农业 界采用的浓度和使用率的除草剂时，对除草剂具有基本抗性的植物显 示出很少的(如果有的话)坏死、裂解、萎黄病或别的病害。

特别优选的是，植物对于将5-烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(在 下文中为“EPSPS”)作为它们的作用位点的除草剂(在下文中为“草 甘膦”)具有基本的抗性或基本的耐受性，除草剂中N-膦酰基甲基甘 氨酸(和其多种盐)是优秀的例子。

除草剂可以根据通常的有关除草剂施用的技术在种子发芽前或后 施用于含有已经变得对除草剂具有抗性的农作物的农田中。本发明特 别提供了用于这样的耐受或抗除草剂的植物的生产中的核苷酸序列。

根据本发明可以提供一种抗草甘膦的EPSPS酶，其中和野生型 EPSPS相比较，该蛋白质序列经过下述的修饰：第一个位置经过突变 因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过突变因而该位置 的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含保 守区域GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作 GNAGIAMRSL，其中该酶不含有序列 K(A/V)AKRAVVVGCGGKFPVE，其特征在于该酶是稳定的，并拥有 下列序列基元(i)至(viii)中的至少一种，下列序列基元中的X为任意氨 基酸，Z、Z1和Z2为除了指定的那些氨基酸之外的任意氨基酸：

(i)ALLMZAPLA，其中Z不是S或T；

(ii)EIEIZDKL，其中Z不是V；

(iii)FG(V/I)(K/S)ZEH，其中Z不是V；

(iv)AL(K/R)ZLGL，其中Z不是R；

(v)GLXVEZ1DXZ2XXXA(I/V)V，其中Z1不是T和/或Z2不 是E；

(vi)ITPPZ1K(L/V)(K/N)Z2，其中Z1不是K和/或Z2不是T；

(vii)TIZ(D/N)PGCT，其中Z不是N或L；

(viii)(D/N)YFXVLXZXX(K/R)H，其中Z不是R。

一个优选的该酶的实施方案包含基元(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vi)中的 至少两种。于特定的本发明的酶的实施方案之中，基元(i)中Z为A； 基元(ii)中Z为I；基元(iii)中Z为A；基元(iv)中Z为K、T或A；基 元(v)中Z1为R或A或者次优选地为D或E，Z2优选地为V或A或 者次优选地为T；序列基元(vi)中Z1为E或A，Z2为P、I或V；基元 (vii)中Z为R或K；以及基元(viii)中Z为T或S或者次优选地为Q。 特别优选的该酶的实施方案含有一种或多种选自下列的序列：

(i)(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)；

(ii)(I/V)VVGC GG(I/L/Q)FP(V/A/T)E；

(iii)(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)；

(iv)(I/V)VVGCGGKFP(V/A/T)(S/G)；

(v)(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)E；

(vi)(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E；

(vii)(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)(S/G)。

本发明也包含了含有编码本发明的酶的区域的分离多核苷酸，尤 其这样的多核苷酸含有例如SEQ ID No.4或5中描述的序列，或者含 有通过将位于SEQ ID No.4或5序列中的内含子与植物基因组文库中 含有的多核苷酸杂交所得的序列。本发明也包括含有编码叶绿体转运 肽和位于该肽3端的双子叶植物的(dicotyledenous)抗草甘膦的5- 烯醇式丙酮酰莽草酸磷酸合酶(EPSPS)的区域的分离多核苷酸，该 区域位于植物可操作启动子的表达控制之下，但以该启动子相对于该 区域不是异源的和叶绿体转运肽相对于该合成酶不是异源的为条件。

“异源的”表示来自不同的来源，相应地“非异源的”表示出自 相同的来源——但是在基因水平上而不在有机体或组织水平上。例如 CaMV 35S启动子相对于矮牵牛花EPSPS编码序列明显地是异源的， 因为启动子来源于病毒而它所控制表达的序列来源于植物。可是根据 本发明，术语“异源的”有着更狭窄的含义。例如，当其涉及本发明 时，“异源的”表示矮牵牛花EPSPS编码序列相对于如也来源于矮牵 牛花的启动子(不是控制EPSPS基因表达的启动子)是“异源的”。 在这一意义上来说，来源于矮牵牛花EPSPS基因并用于控制同样来源 于矮牵牛花的EPSPS编码序列表达的矮牵牛花启动子相对于该编码 序列是“非异源的”。可是，“非异源的”并不意味着启动子和编码序 列必须一定从同一种和同样的(原始的或祖先)多核苷酸中获得。同 样地，关于转运肽也一样。例如，来源于向日葵的核酮糖二磷酸羧化 酶/氧化酶叶绿体转运肽相对于同样来源于向日葵(同样的植物、组织 或细胞)的EPSPS基因编码序列是“异源的”。来源于向日葵的核酮 糖二磷酸羧化酶/氧化酶转运肽编码序列相对于也来源于向日葵的核 酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶编码序列是“非异源的”，即使两者序列的 来源为可能存在于不同的细胞、组织或向日葵植株中的不同的多核苷 酸。

该多核苷酸最特别优选的形式包含了在转录本的5至3方向上含 有下列组分的构建体：或者(1)：

(i)至少一个转录增强子，其为增强区域，位于从中获得增强子的 序列的转录起始点的上游，而且增强子本身在内源性地含有它的序列 中或当它作为构建体的一部分而异源地存在时不能发挥启动子的作 用；

(ii)来自大豆EPSPS基因的启动子；

(iii)编码大豆EPSPS叶绿体转运肽的大豆基因组序列；

(iv)编码大豆EPSPS的基因组序列；

(v)转录终止子；

其中大豆EPSPS编码序列和野生型序列相比较经过下述的修饰：第一 个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过 突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野 生型酶中包含保守区域GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS序列之中， 以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSLTAAV；或者(2)：

(i)至少一个转录增强子，其为增强区域，位于从中获得增强子的 序列的转录起始点的上游，而且增强子本身在内源性地含有它的序列 中或当它作为构建体的一部分而异源地存在时不能发挥启动子的作 用；

(ii)来自欧洲油菜(Brasicca napus)EPSPS基因的启动子；

(iii)编码欧洲油菜EPSPS叶绿体转运肽的欧洲油菜基因组序列；

(iv)编码欧洲油菜EPSPS的基因组序列；

(v)转录终止子；

其中欧洲油菜EPSPS编码序列和野生型序列相比较经过下述的修饰： 第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置 经过突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到 在野生型酶中包含保守区域GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS序列之 中，以致修饰过的序列读作GNAGIAMRSLTAAV。

本发明的多核苷酸，特别是在刚刚前述的段落中揭示的两个，可 能进一步含有编码叶绿体转运肽/磷酸烯醇丙酮酸合成酶(CTP/PPS) 或叶绿体转运肽/丙酮酸正磷酸二激酶(CTP/PPDK)的序列，该序列 位于植物可操作启动子的表达控制之下。特别优选的是，PPDK蛋白 质序列通过其自身的转运肽在植物内被导向叶绿体，相应地刚刚前述 的句子中的多核苷酸编码这样的非异源组合物。PPDK编码序列可以 来源于单子叶植物或双子叶植物，如此编码的蛋白质可选地为非冷不 稳定的。“非冷不稳定的”表示当在与Usami等人(1995)Plant Mol.Biol.， 27，969-980的条件相似的实验条件下于0摄氏度孵育5分钟，该酶保 留至少50％的活性。这样的“冷稳定的”酶至少要比从F.bidentis中 分离的类似的酶稳定两倍。PPS或PPDK酶造成了作为草甘膦作用位 点并含有EPSPS酶的叶绿体中提高的PEP水平。

多核苷酸的增强区域优选地构成这样一个序列，其3末端位于从 中获得增强子的序列的最近转录起始点上游至少40个核苷酸处。在多 核苷酸的进一步实施方案中，增强区域构成这样一个区域，其3末端 位于所述的最近起始点上游至少60个核苷酸处；在多核苷酸的更进一 步实施方案中，所述的增强区域构成这样一个序列，其3末端位于从 中获得增强子的序列的TATA共有序列第一个核苷酸上游至少10个核 苷酸处。

根据本发明的多核苷酸可能含有两个或更多个转录增强子，它们 在特定的多核苷酸实施方案中可能是串联存在的。

在本发明的多核苷酸中，增强子或第一个增强子(如果有多于一 个增强子存在)的3末端可能位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的 密码子上游约100到约1000核苷酸之间，或者在该区域含有内含子或 别的非翻译序列的情况下，位于5非翻译区中内含子或别的非翻译前 导序列的第一个核苷酸的上游大约100至大约1000个核苷酸之间。在 更优选的多核苷酸实施方案中，增强子或第一个增强子的3末端位于 相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子或者5非翻译区中第一个核 苷酸的上游大约150至大约1000个核苷酸之间；在更进一步优选的实 施方案中，增强子或第一个增强子的3末端可能位于相应于EPSPS转 运肽翻译起始点的密码子上游约300到约950核苷酸之间，或者位于 5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸的上游大 约300至大约950个核苷酸之间。在更加优选的实施方案中，增强子 或第一个增强子的3末端可能位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的 密码子或者5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷 酸的上游大约770至大约790个核苷酸之间。

在另一个本发明的多核苷酸中，增强子或第一个增强子的3末端 可能位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密码子或者5非翻译区中 内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸的上游大约300至大约 380个核苷酸之间；在优选的该另一个多核苷酸的实施方案中，增强 子或第一个增强子的3末端位于相应于EPSPS转运肽翻译起始点的密 码子或者5非翻译区中内含子或别的非翻译前导序列的第一个核苷酸 的上游大约320至大约350个核苷酸之间。

在根据本发明的多核苷酸中，来自EPSPS基因的启动子的上游区 域可能含有至少一个来源于位于启动子转录起始点上游的序列的增强 子，其中所述启动子选自肌动蛋白、rolDFd、S-腺苷高半胱氨酸酶、 组蛋白、微管蛋白、多聚遍在蛋白质与质体蓝素基因和CaMV35S与 FMV35S基因的启动子。

相应地，本发明的多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有 来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增 强区域的增强子，和第二个含有来源于肌动蛋白基因转录起始点上游 的序列的转录增强区域的增强子。

作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有 来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增 强区域的增强子，和第二个含有来源于rolDfd基因转录起始点上游的 序列的转录增强区域的增强子。

作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有 来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增 强区域的增强子，和第二个含有来源于组蛋白基因转录起始点上游的 序列的转录增强区域的增强子。

作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有 来源于CaMV35S或FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增 强区域的增强子，和第二个含有来源于微管蛋白基因转录起始点上游 的序列的转录增强区域的增强子。

作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有 来源于FMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增强 子，和第二个含有来源于CaMV35S启动子转录起始点上游的序列的 转录增强区域的增强子。

作为另一种选择，多核苷酸可能在5至3方向上包含第一个含有 来源于CaMV35S启动子转录起始点上游的序列的转录增强区域的增 强子，和第二个含有来源于FMV35S启动子转录起始点上游的序列的 转录增强区域的增强子。

无论各种增强子以什么样的同一性和并置出现在多核苷酸中，构 成EPSPS叶绿体转运肽翻译起始点的密码子5端的核苷酸可能为优选 的Kozack。这一点意味着什么对于熟练的技术人员来说是相当熟悉 的，而且将会从下面的实施例中变得更加明晰。

特别优选的本发明的多核苷酸实施方案包含编码来源于相对高度 表达的基因(如葡聚糖酶、查耳酮合成酶与核酮糖二磷酸羧化酶/氧化 酶基因)的非翻译5前导序列的序列，所述序列位于编码EPSPS叶绿 体转运肽的序列上游。

本发明的多核苷酸也可能含有位于编码EPSPS叶绿体转运肽的基 因组序列5端的非翻译区中的病毒来源的翻译增强子。本领域中熟练 的技术人员知道这样适合的翻译增强子(例如来源于TMV的Omega 与Omega主要(prime)序列和来源于烟草蚀刻病毒的Omega与 Omega主要序列的同一性)，以及怎样将这样的翻译增强子引入到多 核苷酸中以造成所期望的增长的蛋白质表达结果。

根据本发明的多核苷酸可能进一步包含编码某些蛋白质的区域， 这些蛋白质能够赋予含有它的植物材料至少一种下列农艺上所想要的 特性：对于昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、逆境、干旱(dessication) 和除草剂的抗性。尽管这样的多核苷酸期望除草剂抗性赋予基因而不 是EPSPS，如草甘膦氧化还原酶(GOX)，但是除草剂可能不为草甘 膦，在此情形下抗性赋予基因可以选自编码下列蛋白质的基因：膦丝 菌素乙酰基转移酶(PAT)、羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)、谷胱甘 肽S-转移酶(GST)、细胞色素P450、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、 乙酰乳酸合成酶(ALS)、原卟啉原氧化酶(PPO)、二氢蝶酸合成酶、 多胺转运蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、溴苯腈腈水解酶、八氢番茄 红素去饱和酶(PDS)、从真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)中 可获得的tfdA基因的产物和已知的上述蛋白质的经过诱变或其他修 饰的变体。在多核苷酸提供多重除草剂抗性的情形下，这样的除草剂 可以选自二硝基苯胺除草剂、三唑并-嘧啶、尿嘧啶、苯脲、三酮、异 噁唑、N-乙酰苯胺、噁二唑、triazinone、sulfonanilide、酰胺、酰基 苯胺、isoxaflutole、氟咯草酮、哒草伏和triazolinone类型的除草剂， 以及种子发芽后除草剂选自草甘膦与其盐、草铵膦、黄草灵、灭草松、 双丙氨酰膦、除草定、稀禾定或其他环己二酮、麦草畏、蔓草磷、胺 草唑、苯氧基丙酸、喹禾灵或其他芳氧基-苯氧基丙酸、毒莠定、伏草 隆(fluormetron)、莠去津或其他三嗪、嗪草酮、氯嘧黄隆、绿黄隆、 flumetsulam、氯吡啶磺隆、嘧黄隆(sulfometron)、灭草喹、咪草烟、 异噁酰草胺、咪草啶酸(imazamox)、磺草唑胺、嘧疏苯甲酸钠 (pyrithrobac)、砜嘧磺隆、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、氟黄胺草醚、乙羧 氟草醚、KIH9201、ET751、carfentrazone、mesotrione、磺草酮、百 草枯、敌草快、溴苯腈和噁唑禾草灵。

根据本发明的多核苷酸的特殊实施方案提供了对于草甘膦和原卟 啉原氧化酶(PPGO)抑制剂尤其是butafenicil两者的抗性，为此相 应的抗性蛋白质为PPGO或其抗性变体。特别优选的编码这样的除草 剂抗性赋予组合的构建体包含本发明EPSPS编码序列和编码PPDK 或PPS以及抗PPGO抑制剂的PPGO酶的编码序列，这些序列(如 果需要)可通过其自身的转运肽而被导向叶绿体，并且如果蛋白质编 码序列是植物来源而非细菌来源，这些序列可位于非异源启动子的表 达控制之下。

在多核苷酸含有编码杀昆虫蛋白的序列的情形下，这些蛋白质可 能选自来源于Bt的结晶毒素，包括分泌型Bt毒素、蛋白酶抑制剂、 凝集素、致病杆菌(Xenhorabdus)/光杆状菌(Photorhabdus)毒素。 真菌抗性赋予基因可选自编码已知的AFPs、防卫素、几丁质酶、葡聚 糖酶和Avr-Cf9的基因。特别优选的杀昆虫蛋白为cryIAc、cryIAb、 cry3A、Vip1A、Vip1B、Vip3A、Vip3B、半胱氨酸蛋白酶抑制剂和雪 花莲凝集素。在多核苷酸含有细菌抗性赋予基因的情形下，这些基因 可选自编码杀菌肽和techyplesin及其类似物的基因。病毒抗性赋予基 因可选自编码病毒外壳蛋白、运动蛋白、病毒复制酶和已知提供病毒 抗性的反义与核酶序列的基因；然而，逆境、盐和干旱抗性赋予基因 可选自编码谷胱甘肽-S-转移酶与过氧化物酶的基因、构成已知的 CBF1调节序列的序列和已知造成海藻糖积累的基因。

根据本发明的多核苷酸可以经过下述修饰来提高其含有的蛋白质 编码序列的表达：可以除去mRNA不稳定基元和/或偶然拼接区域， 或者使用作物偏爱密码子，以使植物中经如此修饰的多核苷酸的表达 产生相似的蛋白质，该相似的蛋白质与在内源性地含有非修饰多核苷 酸的这样区域的有机体中通过非修饰多核苷酸蛋白质编码区域的表达 而获得的蛋白质具有基本上相似的活性/功能。经修饰的多核苷酸和该 植物中内源性地含有并编码基本上相同的蛋白质的多核苷酸之间的同 一性程度可以达到某一程度，以防止经修饰的和内源的序列之间的共 抑制。在这种情形下，这些序列之间的同一性优选地应该小于大约 70％。

本发明此外还包括含有本发明的多核苷酸的生物或转化载体。因 此，“载体”尤其表示下列中的一种：质粒、病毒、粘粒或者经转化或 转染以致含有该多核苷酸的细菌。

本发明此外还包括用所述的多核苷酸或载体转化的植物材料，以 及已经或将用含有编码某些蛋白质的区域的多核苷酸进一步转化的此 类经转化的植物材料，所述蛋白质能够赋予含有它的植物材料具有至 少一种下列农艺上所想要的特性：对于昆虫、真菌、病毒、细菌、线 虫、逆境、干旱和除草剂的抗性。

本发明此外还包括由从用本发明的多核苷酸转化的材料中再生出 来的植物和产生于用含有编码能够造成叶绿体中磷酸烯醇丙酮酸水平 提高的蛋白质(如磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PPS)或丙酮酸正磷酸二 激酶(PPDK))的序列的多核苷酸转化的材料再生的植物杂交产生的 形态上正常并可育的完整植物。这样的蛋白质通过合适的转运肽而被 导向叶绿体——在PPDK酶的情形下优选地通过自身的肽。

本发明此外还包括包含本发明的多核苷酸的形态上正常并可育的 完整植株，该植株由从用本发明的多核苷酸或载体转化的材料中再生 出来的植物和用含有编码CTP/PPS或CTP/PPDK的区域和/或编码能 够赋予含有它的植物材料具有至少一种下列农艺上所想要的特性(对 于昆虫、真菌、病毒、细菌、线虫、逆境、干旱和除草剂的抗性)的 蛋白质的区域的多核苷酸转化的植物杂交产生。本发明也包括结果形 成的植物的子代，它们的种子和植物体部分。

本发明的植物可以选自农作物、水果和蔬菜，例如canola、向日 葵、烟草、糖甜菜、棉花、玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、饲料甜 菜、西红柿、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、瓜、马铃薯、胡萝 卜、莴苣、甘蓝、洋葱、大豆(soya spp)、甘蔗、豌豆、蚕豆(field bean)、 白杨、葡萄、柑橘、苜蓿、黑麦、燕麦、草坪与饲料用草、亚麻与油 料种子油菜和未特别提及的产坚果植物，它们的子代、种子和植物体 部分。

特别优选的这样的植物包括大豆、canola、芸苔、棉花、糖甜菜、 向日葵、豌豆、马铃薯和饲料甜菜。

本发明此外还包括选择性地控制农田中杂草的方法，该农田里含 有杂草和本发明的植物或其具有除草剂抗性的子代，该方法包含将草 甘膦类型的除草剂以能够控制杂草而又基本上不影响植物的足够的数 量向田中施用。根据这个方法，一种或多种除草剂、杀虫剂、杀真菌 剂、杀线虫剂、杀菌剂和抗病毒剂可以在草甘膦除草剂施用之前或之 后向农田(其中含有植物)中施用。

本发明此外还提供生产对于草甘膦除草剂具有基本的耐受性或基 本的抗性的植物的方法，其包括下列步骤：

(i)用本发明的多核苷酸或载体转化植物；

(ii)选择经如此转化的材料；和

(iii)将经如此选择的材料再生成形态上正常并可育的完整植物。

转化可以包括用任何已知的方法将多核苷酸引入材料中，特别是 采用下列方法：(i)用包裹有多核苷酸的微粒对材料进行弹果(biolistic) 轰击；(ii)用覆盖着含有多核苷酸的溶液的金刚砂纤维对材料进行穿 刺；或者(iii)将多核苷酸或载体引入土壤杆菌(Agrobacterium)中， 并将经如此转化的土壤杆菌和植物材料进行共培养，从而植物材料得 到转化，随后进行再生。对于特定的植物种类可能需要常规修正的植 物转化、选择和再生技术对于熟练的技术人员来说是熟知的。经如此 转化的植物材料可以通过其对草甘膦的抗性来选择。

本发明此外还提供本发明的多核苷酸或载体在对于草甘膦具有基 本的耐受性或基本的抗性的植物组织和/或形态上正常并可育的完整 植物的生产中的用途。

本发明此外还包括选择经过转化从而可以表达目的基因的生物材 料的方法，其中经转化的材料含有本发明的多核苷酸或载体，以及其 中选择程序包含使经转化的材料受到草甘膦或其盐的处理，然后选择 存活的材料。该材料可以是植物来源的，尤其可以来源于选自大豆、 糖甜菜、棉花和芸苔的双子叶植物。

本发明此外还包括再生出含有外源DNA的可育的转化植物的方 法，包括下列步骤：

(a)产生来自该植物的再生组织用于转化；

(b)用该外源DNA转化该再生组织，其中该外源DNA含有选择性 DNA序列，该序列在再生组织中作为选择装置发挥作用；

(c)步骤(b)之后大约1天至60天之间，将从步骤(b)中得来的该再生 组织置于能够使该组织中产生出苗的培养基之中，其中该培养基可能 进一步含有用于选择含有该选择性DNA序列的再生组织的化合物，从 而可以进行经转化的再生组织的鉴定或选择；

(d)在至少一棵苗从步骤(c)的经选择的组织中形成之后，将该苗转移 到能够从该苗中产生出根的第二个培养基之中从而形成植物幼苗，其 中第二个培养基可选地含有该化合物；和

(e)培育该植物幼苗成为可育的转基因植物，其中外源DNA以孟德 尔方式遗传至子代植物中，

其特征在于外源DNA为根据本发明的多核苷酸，或外源DNA所包含 的选择性DNA序列含有根据本发明的多核苷酸，以及该化合物为草甘 膦或其盐。植物可以为上面所指出的双子叶植物——更优选地选自大 豆、canola、芸苔、棉花、糖甜菜、向日葵、豌豆、马铃薯和饲料甜菜， 该再生组织可以由胚胎发生愈伤组织、体细胞胚、未成熟胚等等组成。

本发明也包括含有用于检测本发明的酶或者多核苷酸或其编码的 酶的手段(means)的诊断试剂盒，因此该试剂盒适合于鉴定含有这些的 组织或样品。多核苷酸可以通过技术人员所熟知的PCR扩增来检测， 所用引物可以容易地得自本申请中揭示的酶编码序列。酶本身可以通 过例如在诊断上辨别这些酶所含有的抗原区域的抗体的使用来检测。

经过下列的描述并结合相关的附图与序列表，本发明将会进一步 变得明晰。

序列：

SEQ ID No.1描述了欧洲油菜的基因组DNA

          2      Bn EPSPS5  (PCR引物)

          3      Bn EPSPS3  (PCR引物)

          4      BnF1       (PCR引物)

          5      BnF2       (PCR引物)

          6      BnF3       (PCR引物)

          7      BnF4       (PCR引物)

          8      BnF5       (PCR引物)

          9      BnF6       (PCR引物)

          10     BnF7       (PCR引物)

          11     BnF8       (PCR引物)

          12     BnF9       (PCR引物)

          13     BnF10      (PCR引物)

          14     BnF11      (PCR引物)

          15     BnF12      (PCR引物)

          16     BnXho      (PCR引物)

          17     BnMUTBot   (PCR引物)

          18     BnMUTTop   (PCR引物)

          19     BnNde      (PCR引物)

          20     BnRBSEP    (PCR引物)

          21     Brasr 12   (PCR引物)

          22     Brasr 11   (PCR引物)

          23     Bnapus开始rev

          24     基因组步查1

          25     基因组步查2

          26     CaMV343    (PCR引物)

          27     CaMV46C    (PCR引物)

          28     BnGUSXMa   (PCR引物)

          29     FMV增强子

          30     CaMV35S增强子

          31     大豆基因组EPSPS序列克隆1/14

          32     大豆基因组EPSPS序列克隆1/12

          33     EPSPS 10反向(PCR引物)

          34     EPSPS 4正向 (PCR引物)

          35     含有双突变的SEQ ID No.31

          36     含有双突变的SEQ ID No.32

          37     FMV35S90增强子

          38     FMV35S46增强子

          39     Gm Term Bam(PCR引物)

          40     Gm Term Eco(PCR引物)

          41     BnMUT2PST  (PCR引物)

          42     BnMUTKPN   (PCR引物)

          43     GmRubPac   (PCR引物)

          44     GmRubbot   (PCR引物)

          45     GmRubtop   (PCR引物)

          46     GmRubKpn   (PCR引物)

          47     ZMPPDK1    (PCR引物)

          48     ZMPPDK2    (PCR引物)

          49     ECPPS1     (PCR引物)

          50     ECPPS2     (PCR引物)

          51-65  存在于稳定的本发明EPSPS蛋白质中的基 元

实施例

用于克隆、表达和鉴别本发明的稳定的抗草甘膦EPSP合成酶的 方法将于此处得到描述。

本发明的稳定的抗草甘膦EPSPS是以经过在合适的缓冲液中于37 ℃孵育至少4个小时之后仍保持稳定(保留大于大约80％的催化活性) 为特征的。下面将通过例子说明，酶稳定性实验可以用基本上纯化的、 部分纯化的或粗制的酶提取物制剂(例如后者可作为经遗传工程学方 法改变而表达抗草甘膦EPSPS的转基因植物提取物而容易地获得，或 相似地可作为经遗传工程学方法改变而表达编码抗草甘膦EPSPS的 转基因的微生物提取物而容易地获得)合适地来进行。理想地，测试 抗草甘膦酶的稳定性应以两种方式进行：以纯化的形式；然后将纯化 的蛋白质添加回粗制的植物提取物中从而在更逼真的类植物体内条件 下来测试它们。在这样的提取物中，源自抗草甘膦EPSPS的酶活性能 够容易地通过在一定范围的草甘膦浓度下测试活性而从易受影响的内 源性EPSPS背景中区别出来。在草甘膦的区别浓度(例如0.1mM草 甘膦，存在有0.1mM PEP)下，几乎所有测到的活性均来自抗性酶。

实施例1鉴定稳定的抗草甘膦EPSP合成酶的方法

为了测试抗草甘膦EPSPS的稳定性，该酶的测试溶液(按照下面 的描述于pH～7.0-7.5的缓冲液中和以纯化或部分纯化的形式制备)于 37℃加热4-5个小时。然后将经加热的酶的抗草甘膦活性和a)同样地 制备但保持于冰温下的样品以及b)新鲜制备的同样样品的活性相比 较。

本发明的稳定的抗草甘膦酶通过下列事实来表征，于37℃经过5 小时的孵育，当按照下面的描述进行检测时，它们相对于合适的对照 丧失很少的(如果有的话)其原始的抗草甘膦催化活性(小于20％， 优选地小于15％，更优选地小于10％)。优选地使用基本上纯的酶进 行稳定性实验，尽管当使用粗制的制剂或将纯蛋白质添加到粗制的提 取物中时通常也可以获得非常相似的结果。适合用于酶提取物的检测 和制备的方法在下面得到进一步的详细说明。抗草甘膦EPSPS的稳定 性可以适当地通过各种别的基本上同等的方法(例如将酶于稍微高些 的温度加热更短的时间，或者于更低的温度加热更长的时间，如于25 ℃保持3天)来评测。

实施例2检测EPSPS活性和测定动力学常数的方法

一般根据Padgette等人1987(Archives of Biochemistry and Biophysics，258(2)564-573)的放射化学方法用K+作为阳离子平衡离 子的主要种类来进行检测。25℃、pH7.0、含有50mM Hepes(KOH) 且总体积为50μl的试样包含适当稀释于pH7.0并含有10％甘油与 5mM DTT的Hepes中的纯化的酶或植物提取物(见下)，14C PEP作 为变化的底物(用于动力学测定)或者固定在100或250μM，按照说 明莽草酸-3-磷酸(K+盐)为0.75或2mM。可选地，对于粗制的植物 提取物的检测，试样还包含5mM KF和/或0.1mM钼酸铵。通过14C 磷酸烯醇丙酮酸(环己铵+盐)的添加开始进行检测，并于2-10分钟 (优选的为2分钟)后通过含1份乙酸和9份乙醇的50μl溶液的添加 终止检测。在检测终止之后，取20μl溶液上样到synchropak AX100 (25cm×4.6cm)柱上，然后采用0.28M磷酸钾、pH6.5且流速为 0.5ml/min的流动相的等度洗脱进行色谱分析并超过35分钟。在这些 条件之下，对于PEP和EPSP的保持时间根据个别的柱分别为～19和 25分钟。CP 525TR闪烁计数器连接于AX100柱的末端。其装配有 0.5ml流动吸收池，闪烁剂(Ultima FloAP)的流速设定为1ml/min。 将PEP和EPSP相关的峰面积进行积分，从而确定出标记的PEP向 EPSP转化的百分率。表观Km和Vmax值通过使用来自Erithacus Software Ltd.的Grafit 3.09b经简单加权用最小二乘拟合成双曲线 (least squares fit to a hyperbola with simple weighting)来确定。Km 值一般使用8-9种在Km/2至10Km间变化的可变底物的浓度和三重点 来确定。除了特别指出的地方之外，数据点只包括在底物向EPSP的 转化率小于30％的分析之中。

莽草酸-3-Pi(S3P)按照下述方法制备，向pH8.5且含有0.05M 莽草酸、0.0665M ATP(Na盐)、10mM KF、5mM DTT和0.05M MgCl2 6H2O的7ml 0.3M TAPS中加入75μl 77单位(μmol min-1)ml-1 的莽草酸激酶溶液。在室温下24小时后，通过95℃的短暂加热来终 止反应。将反应溶液于pH9的0.01M Tris HCl中作50倍稀释，然后 通过用0-0.34M LiCl2梯度在Dowex 1X8-400上的阴离子交换进行色 谱分析。将S3P部分合并、冻干，然后再溶解于7ml蒸馏水中。然后 加入28ml 0.1M Ba(CH3COOH)2和189ml无水乙醇。将该溶液于4℃ 搅拌过夜。收集结果所得的S3P三钡沉淀，并在30ml 67％乙醇中洗 涤。然后将经洗涤的沉淀溶解于～30ml蒸馏水中。通过加入K2SO4就 可与所要求的一样产生出S3P的K+盐。对于添加硫酸盐的最小过量应 非常小心。除去BaSO4沉淀，再将含有所需的S3P盐的上清液冻干。 将每一种盐称重并用质子NMR分析。如此制备的S3P制剂根据质子 NMR具有大于90％的纯度，根据其重量和31P NMR的积分只含有很 少的残余的硫酸钾。

实施例3适用于EPSPS检测的植物材料提取物的制备

用液氮冷却的研钵和研杵将愈伤组织或植物幼苗材料(0.5-1.0g) 研磨成细的冷冻粉末。该粉末溶解于等体积的合适的经冷却的提取缓 冲液(例如pH7.5且含有1mM EDTA、3mM DTT、1.7mM’pefabloc’ (丝氨酸蛋白酶抑制剂)、1.5mM亮抑蛋白酶肽、1.5mM胃蛋白酶抑 制剂A、10％v/v甘油和1％聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrolidone) 的50mM Hepes/KOH缓冲液)中，再次悬浮，混和并于经冷却的离 心机中离心以沉降下碎片。上清液沿着冷却的Sephadex G25的PD10 柱经过交换而进入pH7.5且含有1mM EDTA、3mM DTT和10％v/v 甘油的25mM Hepes/KOH缓冲液中。蛋白质通过用牛血清白蛋白标 准化的Bradford方法来评估。提取物的一部分冷冻于液氮中；一部分 立即进行检测。

实施例4检测在粗制的植物材料中EPSPS的活性和区别草甘膦抗性 在总活性中的比例的方法

植物提取物的EPSPS检测按照上面描述的方法用0.1mM 14C-PEP 和0.75mM莽草酸-3-Pi在不存在或存在0.1mM N-(膦酰基甲基)甘氨酸 的条件下进行。在这些检测条件下，根据评估，本发明的EPSPS的有 抗性的形式只有小于8.5％被抑制，而敏感的w/t形式基本上完全被抑 制(大于98％)。因此，存在草甘膦(A)的条件下所观测到的活性水 平代表了来源于转基因表达的抗性酶的水平的～92％，而易受影响的 w/t EPSPS的水平等于不存在草甘膦的条件下所观测到的EPSPS活性 的总水平减去Ax的值～1.08。因为本发明的突变型酶的Vmax据评测 仅为例如w/t酶的Vmax的大约三分之一(而且因为对于w/t与突变 型的PEP的Km值据评测为大约20μM或更少)，所以突变型酶多肽 的表达水平相对于内源性的w/t EPSPS的表达水平的比率比以它们的 观测到的相对活性的比率为基础计算的比率高约三倍。EPSPS多肽表 达(突变型+w/t)的总水平也是用蛋白质印迹法来评测的。

实施例5编码成熟的欧洲油菜EPSPS的w/t cDNA在大肠杆菌(E. coli)中的克隆和表达

用来自BRL的Superscript RT按照厂商所提供的建议通过 RT-PCR从温室培育的欧洲油菜植物中分离得到的RNA之中扩增欧 洲油菜EPSPS cDNA。PCR使用来自Stratagene的Pfu turbo聚合酶 按照厂商所提供的方法来进行。基于已知的核苷酸序列(EMBL目录 号X51475)的合适设计的寡核苷酸引物用于扩增反应和逆转录阶段。 使用Invitrogens Zero Blunt TOPO试剂盒将PCR产物克隆进 pCRBlunt II中。插入片段序列用测序法进行确认，并证实该预期的可 读框相当于预期的成熟的叶绿体的欧洲油菜EPSPS蛋白质的可读框， 但有一点不同的是存在一个起始Met。经克隆和证实的EPSPS序列用 本领域所熟知的合适的限制酶切除，然后将经纯化的片段克隆到经同 样消化的pET24a(Novagen)之中。将重组克隆引入到Stratagene提 供的经密码子优化的大肠杆菌RP菌株——BL 21(DE3)之中。在向 发酵罐培养基(补充了100μg/ml卡那霉素的LB)中加入1mM IPTG 后，EPSPS蛋白质在该菌株中得到了表达。以下述方法确定了准确预 知质量的重组蛋白质：(i)以考马斯将细胞提取物的SDS凝胶染色，并 与经考马斯染色的转化了空的pET24a载体的相同的大肠杆菌细胞提 取物的凝胶放在一起比较和(ii)通过使用前面纯化的植物EPSPS蛋白 质的多克隆抗体进行蛋白质印迹法分析。

实施例6抗草甘膦的突变体欧洲油菜EPSPS在大肠杆菌中的克隆和 表达

pCRBlunt中的欧洲油菜EPSPS cDNA用作模板以进行两个PCR， 所使用的引物对被设计为可引入特殊的改变以使结果所得的反应产物 编码经修饰的EPSPS蛋白质，其中第一个位置经过突变因而该位置的 残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser 而不是Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含保守区域 GNAGTAMRPLTAAV的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作 GNAGIAMRSLTAAV。在本领域中，欧洲油菜EPSPS基因的序列是 已知的，以及设计用作影响该诱变的引物的方法是熟知的。

由此产生的PCR产物经凝胶纯化，并使用Invitrogens Zero Blunt TOPO试剂盒克隆进pCRBlunt II中。确认插入片段的DNA序列和其 预测的可读框相当于预测的成熟的叶绿体的欧洲油菜EPSPS蛋白质 (有一点不同的是，存在一个起始Met)的可读框，以及编码了所期 望的改变(于EPSPS序列内在特定位点上T向I和P向S的特定突 变)。经如此克隆和证实的欧洲油菜EPSPS序列用合适的限制酶切除， 然后将经纯化的片段克隆到经同样消化的pET24a(Novagen)之中。 将重组克隆引入到Stratagene提供的经密码子优化的大肠杆菌RP菌 株——BL 21(DE3)之中。在向发酵罐培养基(补充了100μg/ml卡 那霉素的LB)中加入1mM IPTG后，EPSPS蛋白质在该菌株中得到 了表达。以下述方法确定了准确预知质量的重组蛋白质：(i)以考马斯 将细胞提取物的SDS凝胶染色，并与经考马斯染色的转化了空的 pET24a载体的相同的大肠杆菌细胞提取物的凝胶放在一起比较和(ii) 通过使用先前纯化的植物EPSPS蛋白质的多克隆抗体进行蛋白质印 迹法分析。这种欧洲油菜EPSPS突变形式按照这里的描述进行纯化和 鉴别。

实施例7突变体欧洲油菜EPSPS的纯化和鉴别

成熟的突变体欧洲油菜EPSPS蛋白质按下所述于～4℃进行纯化。 将25g湿重的细胞在pH7.5且含有5mM DTT、2mM EDTA和20％v/v 甘油的50ml 0.1M Hepes/KOH缓冲液中进行洗涤。经过低速离心之 后，将细胞沉淀重悬于50ml同样的但还含有2mM’Pefabloc’(丝氨 酸蛋白酶抑制剂)的缓冲液中。使用玻璃匀浆器将细胞均匀地悬浮， 然后使用Constant Systems(Budbrooke Rd，Warwick，U.K.)Basic Z 细胞破裂仪于10000磅/平方英寸破裂细胞。粗制的提取物于～30,000g 离心1小时，并丢弃沉淀。加入鱼精蛋白硫酸盐(鲑精蛋白)至0.2％ 的最终浓度，混和并让溶液静置30分钟。通过于～30,000g离心30分 钟除去沉淀出来的物质。加入Aristar级别的硫酸铵至40％饱和度的 最终浓度，接着搅拌30分钟，然后于～27,000g离心30分钟。沉淀物 重悬于～10ml与用于细胞破裂同样的缓冲液中，再加入硫酸铵使溶液 达到～70％的饱和度，将溶液搅拌30分钟并再次离心以产生出沉淀物， 将该沉淀物重悬于～15ml的S200缓冲液中(含有1mM DTT、1mM EDTA和20％v/v甘油的10mM Hepes/KOH(pH 7.8))。将该溶液过滤 (0.45微米)、上样和经过含有用S200缓冲液平衡的Superdex 200的 K26/60柱进行色谱分析。将基于EPSPS酶活性而检测出的含有EPSPS 的部分合并，并上样到含有20ml用S200缓冲液平衡的HP Q-Sepharose的xk16柱上。该柱用S200缓冲液洗涤，然后EPSPS在 来自同样缓冲液中0.0M至0.2M KCl的线性梯度中洗脱出来。EPSPS 在对应于等于或低于大约0.1M的盐浓度的一个单峰中洗脱出来。将 基于EPSPS酶活性而检测出的含有EPSPS的部分合并，并上样到用 Superdex 75缓冲液(含有2mM DTT、1mM EDTA和10％v/v甘油 的25mM Hepes/KOH(pH 7.5))平衡的Superdex 75的HiLoad xk26/60 柱上。将基于酶活性而鉴定出的含有EPSPS的部分合并，并上样到 1ml用同样的Superdex 75缓冲液平衡的MonoQ柱上。该柱用起始缓 冲液洗涤，EPSPS在来自0.0-0.2M KCl的15ml线性梯度的整个过程 中以一个单峰洗脱出来。在纯化中的这个阶段可获得接近(＞90％)纯 的EPSPS。可选择地，EPSPS可通过交换进入含有1.0M(Aristar) 硫酸铵的Superdex 75缓冲液中并上样到10ml于同样的缓冲液中平衡 的苯基琼脂糖的柱上来进行进一步的纯化。EPSPS在来自1.0-0.0M硫 酸铵的下降的硫酸铵线性梯度的过程的早期以一个单峰洗脱出来。

通过这些方法或相似的方法获得的、并按上面的描述在2mM莽 草酸-3-Pi存在条件下进行检测的经过纯化的欧洲油菜EPSPS的突变 形式具有～5μmol/min/mg的表观Vmax和～25μM的对于PEP的Km。 在40μM PEP时，对于草甘膦钾盐的IC50为～0.6mM。突变体EPSPS 对于草甘膦钾的估计的Ki值为～0.45mM。

实施例8编码欧洲油菜EPSPS的基因组DNA的克隆

编码EPSPS的欧洲油菜基因组DNA片段(SEQ ID No.1)在本领 域中是已知的(Gasser和Klee，1990)。PCR引物BnEPSPS5(SEQ ID No.2)和BnEPSPS3(SEQ ID No.3)用于将EPSPS基因从分离自含 油种子用芸苔(Brassica napus var.Westar)的基因组DNA中扩增出 来。

Pfu聚合酶用于在下列条件下进行PCR：

94℃5分钟

94℃1分钟

55℃30秒

72℃12分钟

将结果所得的3.8Kb产物克隆进pCR4Blunt-Topo，并用下列的引 物测序：M13正向、M13反向(Invitrogen)、BnF1(SEQ ID No.4)、 BnF2(SEQ ID No.5)、BnF3(SEQ ID No.6)、BnF4(SEQ ID No.7)、 BnF5(SEQ ID No.8)、BnF6(SEQ ID No.9)、BnF7(SEQ ID No.10)、 BnF8(SEQ ID No.11)、BnF9(SEQ ID No.12)、BnF10(SEQ ID No.13)、 BnF11(SEQ ID No.14)、BnF12(SEQ ID No.15)。

实施例9将突变引入编码BnEPSPS的基因组DNA中

将所期望的Thr-Ile和Pro-Ser突变用含有密码子改变以引入所期 望的氨基酸改变的寡核苷酸引物通过PCR引入到欧洲油菜EPSPS基 因中。引物BnXho(SEQ ID No.16)和BnMUTBot(SEQ ID No.17) 用于扩增来自含油种子用芸苔基因组DNA的EPSPS的所需区域。同 样地，引物BnMutTop(SEQ ID No.18)和BnNde(SEQ ID No.19) 用于扩增来自含油种子用芸苔基因组DNA的附加区域。将1μl的每一 种PCR产物混和，然后让重叠的互补序列退火。产物然后通过用引物 BnXho和BnNde的PCR连接。结果所得的PCR产物经过克隆并测 序以检查包含了双突变。将BnEPSPS克隆中的Xho1/Nde1片段切除 并用含有双突变的经克隆的Xho1/Nde1片段替换。

实施例10用于植物中突变体欧洲油菜EPSPS的表达、并在编码突 变体欧洲油菜EPSPS的基因的上游具有核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶 前导序列的构建体

烟草核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列通过PCR引入到构建 体中。引物BnRBSEP(SEQ ID No.20)和Brasr12(SEQ ID No.21) 用于从作为模板的50ng野生型欧洲油菜基因组DNA中用Pfu-Turbo 聚合酶扩增出产物。将结果所得的PCR产物克隆进pCR4 blunt TOPO 中，克隆通过经定向的限制性消化例如可以用Not1(来自载体)和 Xho1将其切除来进行鉴定。然后核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序 列以Not1/Xho1引入经突变的BnEPSPS克隆之中。

实施例11过基因组步查对欧洲油菜EPSPS启动子(用于植物中 EPSPS的表达)的鉴定

任何植物基因的上游或下游序列的增加的长度可以使用由 Clontech提供和指导的基因组步查试剂盒来获得。根据基因组步查试 剂盒所带的方案中描述的方法使用欧洲油菜基因组DNA和SEQ ID No.22和23(Bras r11和Bnapus开始rev)中所描述的引物来获得欧 洲油菜EPSPS基因的上游序列。

Bras r11(SEQ ID No.22)引物和基因组步查试剂盒中所提供的 AP1引物一起使用，而Bnapus开始rev引物和基因组步查试剂盒所提 供的AP2引物一起使用。产物使用来自Invitrogen的TOPO TA克隆 试剂盒并根据厂商指导克隆进pCR-TOPO中。PCR用M13正向和反 向引物来进行，并使用来自Pharmacia的Ready to Go Beads来确定 哪些克隆含有正确大小的插入片段。许多这些克隆用于制造DNA制备 物，然后这些DNA用于确定插入片段的核苷酸序列。

第二套引物(分别为SEQ ID No.24和25)用于显示如下的进一 步的步查：

与AP1引物一起的基因组步查1(SEQ ID No.24)

与AP2引物一起的基因组步查2(SEQ ID No.25)

除了Clontech的方案所推荐的那些之外还可进行另外的基因组消 化。这些消化包括Alu I、Hae III、Hinc II和Rsa I。然后这些经消化 的DNA进行与按照基因组步查试剂盒所带方案的描述进行的别的消 化同样的处理。这样做是为了增加获得正确的长PCR产物的机会。 PCR产物使用来自Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒并根据制造指 导再次克隆进pCR-TOPO中，然后对于获得自每一个克隆产物并含有 正确大小的插入片段的随机克隆进行序列测定。测定插入片段的序列。 获得欧洲油菜EPSPS翻译起始位点上游大约1kb长的序列，该序列邻 近于所发表的序列。

实施例12用于植物中突变体欧洲油菜EPSPS的表达的构建体

35S增强子用引物CaMV343和CaMV46C(分别为SEQ ID No.26 和27)通过PCR从载体pMJB1(图1)中扩增出来。

将PCR产物克隆进载体pCR4Blunt-TOPO中并测序。按照先前 的实施例中的描述所获得的所期望的启动子用含有Sph1位点的5引 物和BnGUSXma(SEQ ID No.28)从含油种子用芸苔基因组DNA中 扩增出来。

PCR产物直接用Sph1和Xma1进行消化，并以Sph1/Xma1(用 Sph1部分消化)连接到含有35S增强子的pCR4Blunt-TOPO载体之 中。然后将与BnEPSPS启动子融合的CaMV35S增强子用Not1(来 自载体)和Xma1从pCR4Blunt中切除，并克隆进含有烟草核酮糖二 磷酸羧化酶/氧化酶前导序列和突变的欧洲油菜EPSPS基因的 pCR4Blunt载体中。FMV增强子(SEQ ID No.29)或CaMV35S增强 子(SEQ ID No.30)经化学方法合成，并亚克隆进载体pCR4 Blunt TOPO中。以Not1/Sac1将FMV增强子从pCR4-Blunt中切除，并以 Not1/Sac1连接到CaMV35S增强子/欧洲油菜启动子/核酮糖二磷酸羧 化酶/氧化酶前导序列/欧洲油菜EPSPS中。最终的构建体显示在图2 中。整个表达盒可以用EcoR 1切除，并连接到用于植物转化的合适载 体中。

实施例13植物的转化和再生

表达盒用EcoR 1从pFCBnEPSPS载体中切除，并在唯一的EcoR 1限制性位点连接到例如二元载体pBin19中。该含有所需的表达盒的 二元载体采用Holsters等人(1978)所提供的冻融转化法转化到根癌 土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA 4404中。烟草的 转化和整个植物的再生用枯斑三生烟(Nicotiana tabacum var. Samsun)并根据Draper等人(Plant Genetic Transformation， Blackwell Sci.Pub.1989)的方案来进行。转化结果物在含有卡那霉素 的MS-培养基上进行选择。可选择地，pFCBnEPSPS或者别的能够通 过来自大豆的抗草甘膦EPSPS基因的表达在植物中呈递草甘膦抗性 的构建体也可以不采用经描述用于大豆的土壤杆菌介导的技术而直接 引入植物中。

将构建体采用弹果型方法(例如Santarem ER，Finer，J.J(1999)“使 用维持于半固体培养基上的增生性胚胎发生组织的大豆的转化” (Transformation of soyabean(Glycine max(L.)Merrill)using proliferative embryogenic tissue maintained on a semi-solid medium)，In vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 35， 451-455；USP-5,503,998，USP 5830728)或者通过土壤杆菌的感染(例 如USP-5,024,944，USP 5,959,179)转化入可再生的胚胎发生的大豆组 织中。可再生的胚胎发生的大豆组织获取自例如未成熟胚的子叶或别 的合适组织。

增生性胚胎发生组织例如可以维持于半固体培养基上。这样的组 织例如可通过下面的途径获得。长3-4mm的未成熟的合子胚分离自例 如花形成2-3星期后的大豆的豆荚。可以通过“递光”对豆荚中具有 正确长度和成熟度的胚胎的存在进行检查。然后将豆荚消毒。移出未 成熟胚并从每个中除去轴。然后将未成熟胚置于pH7.0且含有维生素 B5、3％蔗糖和40mg/l 2，4-D的“D40-低盐”半固体(0.2％脱乙酰吉 兰糖胶)MS盐培养基之上3-4星期。为了胚的增殖，然后将材料转移 到pH5.7且含有维生素B5、3％蔗糖、20mg/l 2，4-D和0.2％脱乙酰吉 兰糖胶的“D20”MS盐培养基上。选出带有亮绿色的球形的增生性 胚的材料，并于每2-3星期进行传代培养。

选出20-25块/板的组织(于轰击前经传代培养4-5天)，并排列于 含有D20培养基的皿的中央，以用于轰击。组织通过在无菌的罩下暴 露15分钟来干燥15分钟。将包裹有DNA构建体的金微粒(例如用上 面的参考文献中所描述的方法包裹)用大量商业上可获得的枪中的任 何一种两次轰击入D20培养基上的组织中。作为进一步的实施例，使 用PDS1000微粒枪。微粒可以采用与Klein等人(1987)，Nature，327， 70-73所描述的方法相似的方式进行制备和用DNA包裹。可选择地， 例如在微离心管中将60mg金或钨微粒(～1.0μm)于HPLC-等级乙醇 中反复进行洗涤，然后于无菌水中反复进行洗涤。将微粒重悬于1ml 无菌水中，然后在微离心管中分配成50μl等分试样。金微粒储存于4 ℃，钨微粒储存于-20℃。将3mg DNA加入每一个(解冻的)微粒的 等分试样中，并将管子以最高速度涡旋振荡。在维持近持续的涡旋振 荡的同时，加入50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亚精胺。在经过10分 钟进一步的涡旋振荡之后，样品在Eppendorf微离心机中离心5秒， 排除掉上清液，然后将微粒在HPLC-等级乙醇的连续添加中进行洗 涤。将微粒完全重悬于60μl乙醇中，然后以10μl等分试样分配至 PDS1000微粒枪中使用的每一个大载体表面上。PDS1000微粒枪的部 件通过浸泡于70％乙醇中和风干进行表面消毒。将按照上面的描述准 备的、带有排列成2.5cm圆盘的组织的目标平板置于离阻挡屏6cm处。 然后将经适当挑选的裂口盘用于轰击。

轰击后一个星期，将所有的组织块转移到缓冲至pH5.7并含有在 0.05至5mM之间合适的选择性浓度的草甘膦的D20培养基上。再过 3-4星期之后，将所有的组织转移到含有在该浓度范围内增加了浓度的 草甘膦的新鲜D20培养基上。再经过3-4星期之后，挑选出活的组织 并于每3-4星期在含有草甘膦的类似的D20培养基中进行传代培养。 可选择地，在一些除了草甘膦外的别的选择标记也存在的情况下，那 么选择可以按适当的方式进行(例如使用增加浓度的潮霉素)。生长的 部分就这样维持着，并在有足够的组织时可以用PCR进行分析以确认 它们对于所期望的DNA是转基因的。

为了使胚发育和成熟，将组织块置于包含MS盐的M6培养基上， 该MS盐pH5.7并且含有维生素B5、6％麦芽糖和0.2％脱乙酰吉兰 糖胶。6-9个团块于23℃置于高的皿中。3-4星期之后，胚伸长了，可 以将其分离并转移以进行另一轮M6培养基上的培育。4-6星期之后， 胚成为奶油色并可准备进行干燥。将9个这样的奶油色胚置于干燥的 培养皿中，然后用Parafilm封口并放到架子上2-3天。胚应该是有些 软的，而不是“松脆而易碎的”。

经干燥的胚可以通过置于OMS(无生长调节因子的MS培养基) 上进行发芽。在通常发生于一星期内的发芽之后，将植物转移到更大 的盒子中，一旦形成足够的根和苗就可从那时起转移到土壤中。为了 防止真菌污染，用蒸馏水从根部洗去OMS是适宜的。可将植物保持 和生长于高湿和最初24小时光照的条件下。可让植物在24小时光照 条件下生长至大约2英尺高，然后通过转换成16小时光照的状况来促 进植物开花和形成豆荚。收集种子，后代用通常的植物育种方法经培 养、杂交和回交以便将转基因移入所期望的植物背景中。植物可采用 通常的分子生物学方法包括PCR分析、Southern、Western、ELISA 和酶测定技术进行常规分析以确定转基因的存在和表达。

实施例14获得编码稳定的抗草甘膦EPSPS的基因的方法

在本发明的一个实施方案中，例如以此处所述的方法构建了适合 于在大肠杆菌中表达的抗草甘膦EPSPS基因，在其编码序列中，第一 个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，第二个位置经过 突变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野 生型酶中包含下列保守区域GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以 致修饰过的序列读作GNAGIAMRSL。

本发明的稳定的抗草甘膦EPSP合成酶和编码它们的基因然后可 通过下述方法获得：经随机或部分随机诱变(例如用化学和UV诱变) 过程，经使用非校读DNA聚合酶(例如在如XL1 red菌株中)或者 经使用许多“直接进化”方法(例如由Kuchner和Amold(1997)在 TIBTECH，15，523-530中所综述的或由Stemmer(1994)在PNAS，91， 10747-10751中所描述的)中的任何一种来产生大量的变异体，再选择 出表达稳定的且保持草甘膦抗性的EPSPS的基因。选择的合适方法包 括，例如突变基因(如来自弱的组成型启动子)在生长于提高了的温 度(如37-42℃)下的大肠杆菌Aro A菌株中的表达，和选择出那些 最能够在基本培养基(可选地还含有草甘膦)中生长的转化体。可选 择地，在培养基含有选择性浓度的草甘膦的条件下，可以使用非aro A 宿主菌株(优选地如rec A)。熟练的技术人员会认识到许多诱变和选 择的方法可以应用于本发明范围之内。

实施例15稳定的抗草甘膦EPSPS和编码它们的基因

稳定的欧洲油菜EPSPS双突变形式为本发明的一个实施例。熟练 的技术人员会认识到在别的实施例中本发明的这样的EPSPS和编码 它们的基因可以用与上面所描述的相同或相似的方法进行克隆、分离 和鉴别。

在本发明的EPSPS和EPSPS基因序列中，编码序列在第一个位 置经过突变因而该位置的残基为Ile而不是Thr，在第二个位置经过突 变因而该位置的残基为Ser而不是Pro，将这样的突变引入到在野生 型酶中包含下列保守区域GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以致 修饰过的序列读作GNAGIAMRSL。

本发明的EPSPS蛋白质序列的进一步特征在于它们不包含具有 序列K(A/V)AKRAVVVGC GGKFPVE的区域。

本发明的EPSPS蛋白质序列的进一步特征在于它们包含至少一 种以(i)至(viii)列于下的氨基酸序列基元：

(i)ALLMZAPLA，其中Z不是S或T；

(ii)EIEIZDKL，其中Z不是V；

(iii)FG(V/I)(K/S)ZEH，其中Z不是V；

(iv)AL(K/R)ZLGL，其中Z不是R；

(v)GLXVEZ1DXZ2XXXA(I/V)V，其中Z1不是T和/或Z2不是E；

(vi)ITPPZ1K(L/V)(K/N)Z2，其中Z1不是K和/或Z2不是T；

(vii)TIZ(D/N)PGCT，其中Z不是N或L；

(viii)(D/N)YFXVLXZXX(K/R)H，其中Z不是R。

其中X为任意氨基酸以及Z、Z1和Z2为除了指定的那些氨基酸之外的 任意氨基酸。

对于本发明的EPSPS基因和蛋白质，更优选的为蛋白质序列包含 序列基元(i)、(ii)、(iii)、(v)和(vi)中的至少一种，优选地包含这些中的 至少两种。

此外，氨基酸序列基元(i)中Z优选地为A；序列基元(ii)中Z优选 地为I；序列基元(iii)中Z优选地为A；序列基元(iv)中Z优选地为K、 T或A；序列基元(v)中Z1优选地为R或A以及次优选地为D或E， Z2优选地为V或A以及次优选地为T；序列基元(vi)中Z1优选地为E 或A，Z2优选地为P、I或V；序列基元(vii)中Z优选地为R或K； 序列基元(viii)中Z优选地为T或S以及次优选地为Q。

此外，一些本发明的EPSPS蛋白质序列的特征在于它们包含至少 一种下列的序列：

(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)或

(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E或

(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)或

(I/V)VVGCGGKFP(V/A/T)(S/G)或

(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)E或

(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E或

(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)(S/G)。

此外，本发明的EPSPS序列优选地来源于双子叶植物。

实施例16来源于大豆的稳定的抗草甘膦EPSPS

本发明优选的实施例为这样的EPSPS蛋白质序列和编码它们的 DNA序列，其来自大豆(见例如EPSPS基因SEQ ID No.33和34) 并根据实施例15经过任选的修饰从而产生稳定的抗草甘膦EPSP合成 酶。

特别优选的实施例为来源于大豆并具以下特征的EPSP合成酶基 因：

(a)编码序列在第一个位置经过突变因而该位置的残基为Ile而 不是Thr，在第二个位置经过突变因而该位置的残基为Ser而不是 Pro，将这样的突变引入到在野生型酶中包含下列保守区域 GNAGTAMRPL的EPSPS序列之中，以致修饰过的序列读作 GNAGIAMRSL；

和

(b)DNA编码序列可以依照实施例15进行进一步的修饰，以致 编码的蛋白质含有氨基酸序列基元(ii)、(iii)、(v)和(viii)中的至少 一种，优选的为两种或更多种。

实施例17编码EPSPS的大豆部分长cDNA的克隆

大豆RNA用TrizolTM试剂按由Gibco BRL所描述的方法进行分 离，cDNA第一链使用简并引物EPSPS 10反向(SEQ ID No.35)并按 照厂商提供的方案用Superscript II(Gibco BRL)来合成。在PCR 中，使用经逆转录的大豆cDNA第一链产物作为模板，引物为EPSPS 4正向(SEQ ID No.34)与EPSPS 10反向(SEQ ID No.33)，并根据 厂商提供的方案使用由AmershamPharmaciaTM提供的ready to go PCR beads。

使用下列PCR条件：

1.94℃  3分钟    1个循环

2.94℃  45秒

  50℃  30秒

  72℃  1分钟    25个循环

3.72℃  10分钟   1个循环

将获得的大约1kb的产物根据厂商的建议用TOPO TA克隆试剂 盒(Invitrogen)克隆进pCR2.1中。菌落经随意地挑选出来，并通过 用QIAprep Mini-Prep试剂盒(Qiagen)的质粒制备进行选择以用于 进一步的操作，随后用EcoR I消化以显示出这些克隆中插入片段的大 小。含有所期望的1kb插入片段的克隆继续下面的操作。选择出的克 隆的多核苷酸序列用ABI 377自动测序仪测定。数据库搜索用Blast 算法(Altschul等人，1990)进行，结果表明经测序的克隆的大多数 含有与已知的植物EPSPS序列有高同源性的部分长cDNA。

实施例18编码大豆EPSPS的基因组多核苷酸序列的分离

从Stratagene购买了于Lambda Fix II中构建的大豆基因组文库， 根据厂商方案涂布出1,000,000个克隆。Hybond N+滤膜用于从文库平 板中转印，这些根据AmershamPharmacia和“Molecular Cloning-a laboratory manual”(Sambrook等人，1989)所提供的方案来进行。 DNA向膜上的UV交联用UV Stratalinker(Stratagene)来完成。大 豆EPSPS cDNA探针通过用EcoR I消化含有大豆EPSPS部分长 cDNA序列的克隆和用琼脂糖凝胶电泳纯化1kb产物来制备。探针使 用Ready-To-GoTM DNA标记试剂盒(AmershamPharmacia)用32P dCTP来标记。滤膜在Rapid-Hyb缓冲液(Amersham Pharmacia)中 进行预杂交和杂交。用0.1×SSPE和0.5％SDS于65℃进行洗涤。然 后将滤膜包于Saran wrap内，并按照“Molecular Cloning-a laboratory manual”(Sambrook等人，1989)中的描述在含有增感屏 的盒子内使胶片曝光。

挑出杂交噬菌斑到SM缓冲液中，以低一些的密度再次涂板，并 经过2轮进一步的纯化进行再筛选。用本领域所熟知的方法(Sambrook 等人，1989)从噬斑纯化噬菌体原液中收回噬菌体DNA。收回的噬菌 体DNA用Not1消化，然后将基因组DNA亚克隆进pBluescript中。 结果所得的载体转化入TOP 10大肠杆菌中。结果所得的克隆按照厂 商提供的方案用Genome Priming System(NEB)进行测序。简要地， 选择出足够批次的96 GPS结果物，用QiagenTM Biorobot制备DNA。 DNA用NEB提供的GPS-S和GPS-N引物并用ABI 377自动测序仪 进行测序。序列数据用Seqman(DNASTAR Inc)分析。借助于Blast 算法，编码EPSPS的基因通过与已知EPSPS基因的同源性来鉴定。 在SEQ ID No.37和SEQ ID No.38中给出了含有显示出与已知EPSPS 高度同源性的序列的两个重叠群的序列，将它们分别称为 GmEPSPS1/14和GmEPSPS12。在图3和图4中给出了这些基因的图 解说明。

本领域的熟练技术人员会知道大豆中可能存在别的EPSPS基因， 可以使用与该实施例所描述的相似的一整套方法将这些基因分离出来 并进行核苷酸序列的测定。

实施例19含有大豆EPSPS基因的植物转化载体的产生

FMV35S90(SEQ ID No.37)和FMV35S46(SEQ ID No.38)这 两个增强子组合通过化学方法合成，并用Hind III/Pac 1亚克隆进载 体pTCV1001(图5)。大豆EPSPS终止子和编码序列的一个小区域是 以克隆GmEPSPS1/14为模板用引物GmTermBam(SEQ ID No.39) 和GmTermEco(SEQ ID No.40)通过PCR而获得的。将PCR产物 克隆进pCR4-Blunt-TOPO，并进行测序，然后用Pst 1和EcoR 1切 除，再连接入含有FMV/CaMV35S增强子的pTCV1001载体中。最后， 将GmEPSPS1/14中含有大豆EPSPS基因的大部分的Pac1：BamH1 DNA片段切除，并克隆进含有增强子和终止子的pTCV1001载体中。

实施例20 EPSPS基因中突变的引入

将需要增加对草甘膦抗性的所期望的Thr至Ile和Pro至Ser的突 变用下面的方式插入到构建体中。含有引起所期望的氨基酸突变的核 苷酸改变的引物BnMUT2PST(SEQ ID No.41)和引物BnMUTKPN (SEQ ID No.42)一起在以GmEPSPS1/14为模板使用pfu-TURBO 聚合酶(Stratagene)的PCR中使用。将现在含有所期望的突变的PCR 产物克隆进pCR4-Blunt-TOPO中并测序。然后以Kpn 1和Pst 1将其 切除，并用于替换含有WT序列的pTCV1 001中的构建体内的相应片 段。最终的载体称为pTCVGMEPSPS(图6)。

实施例21 5 UTL的引入

附加的5 UTL，例如那些来自核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶 (Rubisco)小亚基或烟草葡聚糖酶的，可以通过PCR插入构建体中。 另外，围绕AUG翻译起始密码子的序列经优化为共有序列Kozak序 列ACC AUGG。关于SSU核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶前导序列，引 物GmRubPac(SEQ ID No.43)和GmRubbot(SEQ ID No.44)用于 将大豆核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶5 UTL引入到大豆EPSPS基因的 5 UTL中。然后，GmRubTop(SEQ ID No.45)和GmRubKpn(SEQ ID No.46)用于将大豆核酮糖二磷酸羧化酶/氧化酶5 UTL引入大豆 EPSPS基因的第一个外显子中。然后用引物GmRubPac和 GmRubKpn通过PCR将这两个PCR产物连接起来，再将结果所得的 产物克隆进pCR4Blunt-TOPO中并测序。一旦PCR产物的真实性得 到确认，以Pac 1：Kpn 1将其从PCR4载体中切除，并将其用于替换 载体pTCVGMEPSPS中的Pac 1/Kpn 1限制片段。

这些实施例描述了包含两个融合于在编码序列中含有特定的突变 从而能够在植物中产生抗草甘膦EPSPS酶的大豆EPSPS基因的增强 子的DNA序列的构建。本领域的熟练技术人员会知道增强子可以引入 到启动子和转录起始位点上游各种不同距离的位置，从而增强植物细 胞中双突变EPSPS大豆基因转录的速率和/或数量。该距离可能只好 对于每个个别的基因根据经验来确定。这包括制造许多增强子融合在 离双突变EPSPS大豆基因转录起始点不同距离位置上的构建体，和将 这些构建体引入植物材料并检测这些材料对于选择性浓度的草甘膦的 抗性。本领域的熟练技术人员还会知道增强子的选择并不局限于 CaMV35S和FMV增强子，还可能包括来自植物中高度表达的任何基 因的增强子，特别包括来自肌动蛋白基因、遍在蛋白质基因和甘露氨 酸、胭脂氨酸与章鱼氨酸合成酶基因以及源自鸭跖草黄斑驳病毒与别 的植物中表达的植物病毒的基因例如马铃薯病毒Y与X外壳蛋白基因 的增强子。5 UTL的选择可以不局限于大豆核酮糖二磷酸羧化酶/氧化 酶小亚基，来自别的基因的前导序列也可以使用。

实施例22植物的转化和再生

表达盒用Xma 1从pTCVGMEPSPS载体中切除，并在唯一的Xma 1限制性位点连接到二元载体pBin19中。该含有所期望的表达盒的二 元载体采用Holsters等人(1978)所提供的冻融转化法转化到根癌土 壤杆菌菌株LBA 4404中。烟草的转化和整个植物的再生用枯斑三生 烟并根据Draper等人(Plant Genetic Transformation，Blackwell Sci. Pub.1989)的方案来进行。转化的结果物在含有卡那霉素的MS培养 基上进行选择。

可选择地，PTCGMEPSPS或别的能够通过来自大豆的抗草甘膦 EPSPS基因的表达在植物中呈递草甘膦抗性的构建体可以不采用在包 括下列的许多参考文献以及实施例13中所描述用于大豆的土壤杆菌 介导的技术而直接引入植物中：Physiol.Plant.(1990)，79(1)，210-12； USP-5,968,830；WO-0042207和USP-5,959,179。

实施例23转基因植物的分析

转化体的PCR分析

从转化系中获取叶片样品，并根据已知的方法提取出DNA。设计 出针对转基因中特定区域的寡核苷酸引物以便能够在待测植物材料中 进行其检测。

RNA分析

植物中编码转基因的mRNA的存在用RNA印迹杂交法进行检测。 总RNA用Tri-试剂按照厂商(SigmaTM)提供的方案从叶片组织中提 取。印迹用现有的程序制备，并用放射性标记的大豆EPSPS cDNA进 行探查。

蛋白质分析

转基因植物中重组蛋白质的存在按照蛋白质印迹法程序用经标准 方案制备的抗重组大豆EPSPS的抗体来确定。

酶检测

植物中抗性EPSPS的活性通过使用14C放射性标记的底物并用 HPLC检测产物来检测。

除草剂耐受性的测试

在组织培养后，将转基因植物转移到含有John Innes盆栽堆肥 No.3的5英寸的花盆中。让植物在温室中适应环境(大约2星期)， 然后将配制的草甘膦用轨道喷雾器(track spayer)以各种不同的浓度 施用于空气中的组织。用于鉴定那些对草甘膦具有抗性的转基因植物 的视觉评估在施药后21天进行。

实施例24质体定位的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)或磷酸烯醇丙 酮酸合成酶(PPS)的构建体的引入

编码来自玉米的PPDK(EMBL目录号J03901)并含有其自体转 运肽序列的cDNA用引物ZMPPDK1(SEQ ID No.47)和ZMPPDK2 (SEQ ID No.48)通过RT-PCR从玉米组织中扩增出来。将RT-PCR 产物克隆进载体pCR2.1 TOPO中，并测序以检查其真实性。将玉米 PPDK基因作为Nco 1/Kpn 1片段从pCR2.1载体中切除，并连接入经 同样消化的pMJB1(图1)中。然后在进一步的植物转化之前将植物 表达盒亚克隆进pTCVGMEPSPS盒(图6)中。别的PPDK基因例 如编码来自Flaveria brownii(EMBL目录号AAQ94645)或水稻的冷 稳定PPDK的基因可以用相似的策略进行遗传工程改变。同样地，大 肠杆菌中编码PPS(EMBL目录号X59381)的基因用寡核苷酸ECPPS1 (SEQ ID No.49)和ECPPS2(SEQ ID No.50)通过PCR进行扩增。 将PCR产物克隆进含有植物可操作启动子(例如花椰菜花叶病毒35S 启动子)、叶绿体转运信号序列(例如来自核酮糖二磷酸羧化酶/氧化 酶小亚基的序列)和终止子(例如NOS)的植物表达盒之中。

序列表

编码EPSPS的欧洲油菜基因组DNA             (SEQ ID No.1)

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BnEPSPS5(SEQ ID No.2)

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BnEP SPS3(SEQ ID No.3)

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BnF1(SEQ ID No.4)

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BnF2(SEQ ID No.5)

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BnF3(SEQ ID No.6)

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BnF4(SEQ ID No.7)

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BnF5(SEQ ID No.8)

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BnF6(SEQ ID No.9)

gttccatatgttgaaatgac

BnF7(SEQ ID No.10)

tccactctgaatcatcaaat

BnF8(SEQ ID No.11)

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BnF9(SEQ ID No.12)

tcatggttgcttaaactcta

BnF10(SEQ ID No.13)

cagcttgtgctgatgttcca

BnF11(SEQ ID No.14)

cgatcatctttgaaaatgtg

BnF12(SEQ ID No.15)

ctctctgttttgattccata

BnXho(SEQ ID No.16)

cgcatcagcctcgagcttcttcgtg

BnMUTBot(SEQ ID No.17)

ggtgagtgaacgcatggctattcctgcat

BnMutTop(SEQ ID No.18)

atgcaggaatagccatgcgttcactcacc

BnNde(SEQ ID No.19)

catttcaacatatggaacagatatc

BnRBSEP(SEQ ID No.20)

cccgggatattggaagttaaaggaaaagagagaaagagaaatctttctgtctaagtgtaattaaccatggcgcaatctagcagaatctg

c

Brasr12(SEQ ID No.21)

ggacgtggaaacagaagctg

Brasr11(SEQ ID No.22)

tctcaaaccgaaagatgcag

Bnapus开始rev(SEQ ID No.23)

ggttgaagcacaatctctgaagcttccatgg

基因组步查1        (SEQ ID No.24)

gatcttgggtcattttaatgggccttctaac

带有AP1引物

基因组步查2       (SEQ ID No.25)

aaataaacccattaaccactaatgaaaaagggat

带有AP2引物

CaMV343(SEQ ID No.26)

gcggagctcgagacttttcaacaaaggg

CaMV46C(SEQ ID No.27)

atcccgggaagcatgcgaaggatagtgggattgtg

BnGUSXma(SEQ ID No.28)

cgcccgggattgaatttbaaagc

FMV增强子(SEQ ID No.29)

tctagagcagctggcttgtggggaccagacaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagcatctttgcctttatt

gcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactaatgcgta

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CaMV35S增强子(SEQ ID No.30)

tgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaag

gaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatgga

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taagggatgacgcacaatcccactatccttc gcaagacccttc

编码EPSPS的大豆基因组DNA                     (SEQ ID No.31)

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含有双突变的SEQ ID No.31             (SEQ ID No.35)

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含有双突变的SEQ ID No.32             (SEQ ID No.36)

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ctcaagggtacgcttgggagtgggggtttttagagggaaaagggaaggagggcaaacttttaattcctaataaatattctcttttttgatttt

tttttaaataaaacaaataaacttatagattagcatacacttaatgtcctaatcttttatttatttgcatgagtttttttcttttatattctttctgtttct

gttttctttcttcagtgtctcttgtctttccttaattccttatcaataccttgtttatttttgaaaacttaattttcctcatttttttaacttataggctata

ctatagtatgtataactattcaaataaatagtagaaaatgtttcaaatattccccagaactgtttcagtgaacaaagttcaagccagaaaaa

agaagtatatcttcttgtgaagagtagtctcaagtggttaattgtcaaattgtatcattttagaatacaaaattagaagtggtttgattagtttat

acgaacgattatttaaatagggttgatgatgtggttaattactgatcatatgtgaagactgtgagtcgatgaccagcccagtgcagtcattt

taaattccattattttttaatttgtgcttatgttaaactttgtccttctttcaaagggagatgtaaaatttgctgaagttcttgaaaagatgggagc

taaggttacatggtcagagaacagtgtcacygttwctggaccrccacragattyttctggtcraaaagtcttgcraggcattgatgtcaat

atgaacaagatgccagatgttgccatgacwcttgcygttgtygcactatttgctaatggtcmmactrcyatmagagatggtatggttt

agctgtttgtttgtgttcaagagcttgttttaacaaattgttttttttaattatggttaatgaaattattataattacactaatattgaaattggatca

ctaaccatgtgaaatgcttgaatttttagcttgaaaacttcttttgtggacaatttttcttttatctatggattgtggggcatctatgttgttccttt

aagcttcgtacaacctggtctgtgggctggtccagtccttcttactcatgacagtcttttgcagtaaactggttaaacttgggtgacctgttg

acccacccagattggcctgttctttttaaataaaacttggctacttataagatttcaacatgatacttgaatgatcacccttactctaaaggcc

attatctgttcagttatgttcttcttcttcttattatttttaatttatattattatccaacgatctgatctttgaacatgatgctggacaatcatcaaag

ctagtttggttacatcatataataccttttttttcatatattatttttcccatagtatatttttgtgtttttttttcatacaatattattctgaaaaaaactt

gtttcgtttttttcctggcttgaatgctatttcaatgactgggccttattattttctggtttaggttatacaactgtcctccaattgacttttgaatg

cttcaatagttttcttcttaatcatggaaggcactagagtgcatattgaatatgttagaacatggaaggcttaaatatctttttagtctttgcaat

ttaacgtttttttgcttttagtccttgcaaaattataatttttttttagtcctgactaattatgtttgttttgtttttgagggcgagccctggtgcagc

ggtaaagttgtgccttggtgacttgttggtcatgggttcgaatccggaaacagcctctttgcatatgcaagggtaaggctgcgtacaatat

ccctcccccataccttcgcatagcgaagagcctctgggcaatggggtagaaaaagaagaatgctttagataacactttttttgttactgtt

caaagcactatctaaagtgctttgaggactaaacacaaaacaaacataatttgcaaggactgaaaaacaaaaaaataattttgcaagga

caaaaaaacaaaaaaaaaaaacaaaattgcaaggaccaaaaatatatttaaaccaacatgaaattatggtataaaaccattcatatgtctt

catctaatagcttaagcttttgggatagttggttaacaatatggtattagagtcttatgatttttaggtggtctttgagttcaatccttgctgctc

ccagttctagttaatttctttttggtccacttcaaataaaaaggttgaatttaagggtaaggcagctggacctgcgcattaatcatgtgtcagg

ctcaaagggcttttgtatggggggcatgtttggaatataatatagaatcattcatgtggtttcacctatcaaggacaactctagtttttgtcat

acttgtattattacagtgtctaaactagacatgatctttttccggaaggaaatttaacttaaaaggaacttagatgcttcttgttctgtgatcttt

atttgtttattttttccaatctttttaacaattgaaaggttttagttgtatccaatctttttatacatttggactatctaccatatcatttagcaaacttg

tttgctgctcagattctcctttggactatctaccatatcatttagcaaacctgttcactgctcagattctcatttattctttgtttcctctatttttca

gtggcaagttggagagttaaagagactgagaggatgatagcaatctgcacagaactcagaaaggtgagtgtcttgctaattcctttatg

gtttcgatattactggactttttacatctcactgacctactctgtcttggtatttcagctaggagcaacagttgaagaaggtcctgattactgt

gtgattactccacctgagaaattgaatgtcacagctatagacacatatgatgaccacagaatggccatggcattctctcttgctgcttgtg

gggatgttccagtaaccatcaaggatcctggttgcaccaggaagacatttccygactactttgaagtccttgagaggttmacaaagca

ctaagcattttgtacattgagtaggaagagagagagagataaatactcacaaaacagtgagtatatgcatggcttgcttttgtttcttaaca

ttcccttgtaagaacttgagataatttgtattgttggaaagagctattgattctgttgtatcaaagtaatttaatttccagtacagacttggctct

attcctcatatgtggtggtgtacattgcatctttgcatttgatcccatttctattgggataggaccatacctttttttgtttattattcaagtcaaac

ttagcagataatatgtggtgaccagaaaatagtctagctagcaaatagacctgtgattgcatgtttgaattcaggacttcaggacatttaat

taatgagtgacaatgttaaaaagctcgccaacaggagttgacacatctgattgagtcttctattaacactaactgtaacttgagtttgattat

cagattcctcctgttggtaggtaatatgtaaatttcactatatatttaccgaggttggtggtcttacttgactttgaagaggtgagtgtaattta

aacttttatatcaaaaaaagattgctaaaagcttgagtggcatgcaacaaatagcaatgaaagaatgactatggccttgggaaccaaatg

gccacgtaccacttttccaccaacttgagagccctggtcctggatgatgcccctttttttttttcatttctttgacaataaagaaagttcttattc

ttggcaattgcaagtcgtttgtggaagtcacatgaaattcaccataggcttcattgttcaaatcctttagtcactaactaaaggctggaccta

tgcaagaattttggctactcttataaatgctgtgcggcaaagactacggaaaaatataaattattgcatatctagaggtgaggttcattgct

cccatccatttttccaagaactaaaatatatataaattattaatatgatattacattgaaaaataatatttttcttttaaatatgtgatcataagttta

attttaagtctattcatacgaaaaaaatatttattagaaaagattaatttattaaatggatctcaatattttaagaaattaacttttagctctcaac

caacagatgatttgagttaaaaaaatgtatatataaactattgcatatctgctgatttttgtttgtaacaccaataagtgggcattttactaaat

ccatgtgacaatgtactgaatgttttagaatacagtctggtttgataataaaacgtgcataaagtccagcttatgttaactcttaattcatgga

aaatgatgatatgcgaattgaaagaaagaaaaccataatgtaagtgcagttttctctctcttttttaatattattcaatatcagattgcacatg

ggaaggggtattggctcatgtgggatattagtttttgtcccttacctaaaaagagagaaaagagaaaaataacaatttaaaaagagtacca

ccgctaccacctttttcgcttttaaatttttgttctgttttcactactctttcatgcgttgtttgttggcttctgatagtgacgaatatgatataatga

ttttatgttgggaaaaaagtgccatgtaaattctagagattgaaattttagcatcaaattatttattttatcaccttttaaaatttgttgcatgtga

aagaatttgaagctctccaacaaggaaataacacttcaatccttagagtcatcctctagatcccaaaagaatgtgatgtttatacacattag

tatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatagggtttatattatattaatgagtgatgtacgaggac

ggtggtgacactatatggccaaaacaagtgtaatataattatttttttttctcaagtattactctatccttgaatattattagtcttaaatcttcaa

gcaccttgtgaacgaagcaatcttgtcc

FMVS35S90增强子      (SEQ ID No.37)

aagcttcccgggccggccgcagctggcttgtggggaccagacaaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagc

atctttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccac

tcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaactcgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattcca

ttgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccat

cgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaacca

cgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcttaattaa

FMV35S46增强子      (SEQ ID No38)

aagcttcccgggccggccgcagctggcttgtggggaccagacaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagc

atctttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccac

tcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaactcgagaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaagaatatca

aagatacagtctcagaagaccagagggctattgagacttttcaacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagct

atctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaagatggcttctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaaga

tgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaa

gcaagtggattgatgttaattaa

GmTerm Bam(SEQ ID No.39)

ctgcagggatcctggttgcaccaggaag

GmTermEco(SEQ ID No.40)

gaattcccgggtatggtgaatttcatgtg

BnMUT2PST(SEQ ID No.41)

gacttctcgggtaccatcacattgc

BnMUTkpn(SEQ ID No.42)

cacctgcagcaaccacagctgctgtcaaagaacgcattgcaataccagcatttcc

GmRubPac(SEQ ID No.43)

aatttaattaattcataaatatgttac

GmRubbot(SEQ ID No.44)

ggtcttctccttcttagttctcaactacttgttcttctgctgccagatttcaattttccttaaagttgtgaac

GmRubtop(SEQ ID No.45)

atctggcagcagaagaacaagtagttgagaactaagaaggagaagaccatggcccaagtgagcagagtgcac

GmRubKpn(SEQ ID No.46)

ggcaatgtgatggatcccgagaag

ZMPPDK1(SEQ ID No.47)

gcgccatggcggcatcggtttccaggg

ZMPPDK2(SEQ ID No.48)

gcgggtacctcagacaagcacctgagctgcagc

ECPPS1(SEQ ID No.49)

gcggcatgcccaacaatggctcgtc

ECPS2(SEQ ID No.50)

gcggatccttatttcttcagttcagcca

EPSPS基元(SEQ ID No.51)

ALLMZAPLA，其中Z不是S或T

EPSPS基元(SEQ ID No.52)

EIEIZDKL，其中Z不是V

EPSPS基元(SEQ ID No.53)

FG(V/I)(K/S)ZEH，其中Z不是V

EPSPS基元(SEQ ID No.54)

AL(K/R)ZLGL，其中Z不是R

EPSPS基元(SEQ ID No.55)

GLXVEZ1DXZ2XXXA(I/V)V，其中Z1不是T和/或Z2不是E

EPSPS基元(SEQ ID No.56)

ITPPZ1K(L/V)(K/N)Z2，其中Z1不是K和/或Z2不是T

EPSPS基元(SEQ ID No.57)

TIZ(D/N)PGCT，其中Z不是N或L

EPSPS基元(SEQ ID No.58)

(D/N)YFXVLXZXX(K/R)H，其中Z不是R

EPSPS基元(SEQ ID No.59)

(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)

EPSPS基元(SEQ ID No.60)

(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E

EPSPS基元(SEQ ID No.61)

(I/V)VVGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)(S/G)

EPSPS基元(SEQ DI No.62)

(I/V)VVGCGGKFP(V/A/T)(S/G)

EPSPS基元(SEQ ID No.63)

(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)E

EPSPS基元(SEQ ID No.64)

(I/V)VEGCGG(I/L/Q)FP(V/A/T)E；

EPSPS基元(SEQ ID No.65)

(I/V)VEGCGGKFP(V/A/T)(S/G).

                               序列表

<110>Syngenta Limited

<120>抗除草剂植物

<130>PPD50594/WO

<140>PCT/GB01/04131

<141>2001-09-14

<150>GB0023911.1

<151>2000-09-29

<150>GB0027693.1

<151>2000-11-13

<150>GB0023910.3

<151>2000-09-29

<160>70

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3836

<212>DNA

<213>欧洲油菜

<400>1

gcatgcagat cttaaaggct cttttccagt ctcacctacc aaaactataa gaaaatccac      60

ttgctgtctg aaatagccga cgtggataaa gtacttaaga cgtggcacat tattattgac     120

tactagaaaa aaaactcata caccatcgta ggagttgggg ttggtgaaga atttgatggg     180

tgcctctccc ccccccactc accaaactca tgttctttgt aaagccgtca ctacaacaac     240

aaaggagacg acagttctat agaaaagctt tcaaattcaa tcaatggcgc aatctagcag     300

aatctgccat ggcgtgcaga acccatgtgt tatcatctcc aatctctcca aatccaacca     360

aaacaaatca cctttctccg tctccttgaa gacgcatcag cctcgagctt cttcgtgggg     420

attgaagaag agtggaacga tgctaaacgg ttctgtaatt cgcccggtta aggtaacagc     480

ttctgtttcc acgtccgaga aagcttcaga gattgtgctt caaccaatca gagaaatctc     540

gggtctcatt aagctacccg gatccaaatc tctctccaat cggatcctcc ttcttgccgc     600

tctatctgag gtacatatac ttgcttagtg ttaggccttt gctgtgagat tttgggaact     660

atagacaatt tagtaagaat ttatatataa tttttttaaa aaaaatcaga agcctatata     720

tatttaaatt tttccaaaat ttttggaggt tataggctta tgttacacca ttctagtctg     780

catctttcgg tttgagactg aagaatttta ttttttaaaa aattattata gggaactact     840

gtagtggaca acttgttgaa cagtgatgac atcaactaca tgcttgatgc gttgaagaag     900

ctggggctta acgtggaacg tgacagtgta aacaaccgtg cggttgttga aggatgcggt     960

ggaatattcc cagcttcctt agattccaag agtgatattg agttgtacct tgggaatgca    1020

ggaacagcca tgcgtccact caccgctgca gttacagctg caggtggcaa cgcgaggtaa    1080

ggttaacgag ttttttgtta ttgtcaagaa attgatcttg tgtttgatgc ttttagtttg    1140

gtttgttttc tagttatgta cttgatgggg tgcctagaat gagggaaaga cctataggag    1200

atttggttgt tggtcttaag cagcttggtg ctgatgttga gtgtactctt ggcactaact    1260

gtcctcctgt tcgtgtcaat gctaatggtg gccttcccgg tggaaaggtg atcttcacat    1320

ttactctatg aattgtttgc agcagtcttt gttcatcaca gcctttgctt cacattattt    1380

catcttttag tttgttgtta tattacttga tggatcttta aaaaggaatt gggtctggtg    1440

tgaaagtgat tagcaatctt tctcgattcc ttgcagggcc gtgggcatta ctaagtgaaa    1500

cattagccta ttaaccccca aaatttttga aaaaaattta gtatatggcc ccaaaatagt    1560

ttttaaaaaa ttagaaaaac ttttaataaa tcgtctacag tcccaaaaat cttagagccg    1620

gccctgcttg tatggtttct cgattgatat attagactat gttttgaatt ttcaggtgaa    1680

gctttctgga tcgatcagta gtcagtactt gactgccctc ctcatggcag ctcctttagc    1740

tcttggagac gtggagattg agatcattga taaactgata tctgttccat atgttgaaat    1800

gacattgaag ttgatggagc gttttggtgt tagtgccgag catagtgata gctgggatcg    1860

tttctttgtc aagggcggtc agaaatacaa gtaatgagtt cttttaagtt gagagttaga    1920

ttgaagaatg aatgactgat taaccaaatg gcaaaactga ttcaggtcgc ctggtaatgc    1980

ttatgtagaa ggtgatgctt ctagtgctag ctacttcttg gctggtgctg ccattactgg    2040

tgaaactgtt actgtcgaag gttgtggaac aactagcctc caggtagttt atccactctg    2100

aatcatcaaa tattatactc cctccgtttt atgttaagtg tcattagctt ttaaattttg    2160

tttcattaaa agtgtcattt tacattttca atgcatatat taaataaatt ttccagtttt    2220

tactaattca ttaattagca aaatcaaaca aaaattatat taaataatgt aaaattcgta    2280

atttgtgtgc aaatacctta aaccttatga aacggaaacc ttatgaaaca gagggagtac    2340

taattttata ataaaatttg attagttcaa agttgtgtat aacatgtttt gtaagaatct    2400

aagctcattc tctttttatt ttttgtgatg aatcccaaag ggagatgtga aattcgcaga    2460

ggttcttgag aaaatgggat gtaaagtgtc atggacagag aacagtgtga ctgtgactgg    2520

accatcaaga gatgcttttg gaatgaggca cttgcgtgct gttgatgtca acatgaacaa    2580

aatgcctgat gtagccatga ctctagccgt tgttgctctc tttgccgatg gtccaaccac    2640

catcagagat ggtaaagcaa aaccctctct ttgaatcagc gtgttttaaa agattcatgg    2700

ttgcttaaac tctatttggt caatgtagtg gctagctgga gagttaagga gacagagagg    2760

atgattgcca tttgcacaga gcttagaaag gtaagtttcc ttttctctca tgctctctca    2820

ttcgaagtta atcgttgcat aactttttgc ggtttttttt tttgcgttca gcttggagct    2880

acagtggaag aaggttcaga ttattgtgtg ataactccac cagcaaaggt gaaaccggcg    2940

gagattgata cgtatgatga tcatagaatg gcgatggcgt tctcgcttgc agcttgtgct    3000

gatgttccag tcaccatcaa ggatcctggc tgcaccagga agactttccc tgactacttc    3060

caagtccttg aaagtatcac aaagcattaa aagacccttt cctctgatcc aaatgtgaga    3120

atctgttgct ttctctttgt tgccactgta acatttatta gaagaacaaa gtgtgtgtgt    3180

taagagtgtg tttgcttgta atgaactgag tgagatgcaa tcgttgaatc agttttgggc    3240

cttaataaag ggtttaggaa gctgcagcga gatgattgtt tttggtcgat catctttgaa    3300

aatgtgtttg tttgagtaat ttttctaggg ttgagttgat tacactaaga aacacttttt    3360

gattttctat tacacctata gacacttctt acatgtgaca cactttgttg ttggcaagca    3420

acagattgtg gacaattttg cctttaatgg aaaggacaca gttgtggatg ggtgatttgt    3480

ggacgattca tgtgtggtta ggtgatttgt ggacggatga tgtgtagatg agtgatgagt    3540

aatgtgtgaa tatgtgatgt taatgtgttt atagtagata agtggacaaa ctctctgttt    3600

tgattccata aaactataca acaatacgtg gacatggact catgttacta aaattatacc    3660

gtaaaacgtg gacacggact ctgtatctcc aatacaaaca cttggcttct tcagctcaat    3720

tgataaatta tctgcagtta aacttcaatc aagatgagaa agagatgata ttgtgaatat    3780

garscggaga gagaaatcga agaagcgttt accttttgtc ggagagtaat gaattc        3836

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>引物

<400>2

gcatgcagat cttaaaggct cttttccagt c                                     31

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>引物

<400>3

gaattcatta ctctccgaca aaaggtaaac gc                                    32

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>4

gcgcaatcta gcagaatctg                                                  20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>5

tccttcttgc cgctctatct                                                  20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>6

gcgttgaaga agctggggct                                                  20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>7

acctatagga gatttggttg                                                  20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>8

actaagtgaa acattagcct                                                  20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>9

gttccatatg ttgaaatgac                                                  20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>10

tccactctga atcatcaaat                                                  20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>11

gtaagaatct aagctcattc                                                  20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>12

tcatggttgc ttaaactcta                                                  20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>13

cagcttgtgc tgatgttcca                                                  20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>14

cgatcatctt tgaaaatgtg                                                  20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>15

ctctctgttt tgattccata                                                  20

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>16

cgcatcagcc tcgagcttct tcgtg                                            25

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<400>17

ggtgagtgaa cgcatggcta ttcctgcat                                        29

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<400>18

atgcaggaat agccatgcgt tcactcacc                                        29

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>19

catttcaaca tatggaacag atatc                                            25

<210>20

<211>90

<212>DNA

<213>引物

<400>20

cccgggatat tggaagttaa aggaaaagag agaaagagaa atctttctgt ctaagtgtaa      60

ttaaccatgg cgcaatctag cagaatctgc                                       90

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>21

ggacgtggaa acagaagctg                                                  20

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>22

tctcaaaccg aaagatgcag                                                  20

<210>23

<211>31

<212>DNA

<213>引物    

<400>23

ggttgaagca caatctctga agcttccatg g                                     31

<210>24

<211>31

<212>DNA

<213>引物

<400>24

gatcttgggt cattttaatg ggccttctaa c                                     31

<210>25

<211>34

<212>DNA

<213>引物

<400>25

aaataaaccc attaaccact aatgaaaaag ggat                                  34

<210>26

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>26

gcggagctcg agacttttca acaaaggg                                         28

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>引物

<400>27

atcccgggaa gcatgcgaag gatagtggga ttgtg                                 35

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>引物

<400>28

cgcccgggat tgaatttbaa agc                                              23

<210>29

<211>209

<212>DNA

<213>增强子

<400>29

tctagagcag ctggcttgtg gggaccagac aaaaaaggaa tggtgcagaa ttgttaggcg      60

cacctaccaa aagcatcttt gcctttattg caaagataaa gcagattcct ctagtacaag     120

tggggaacaa aataacgtgg aaaagagctg tcctgacagc ccactcacta atgcgtatga     180

cgaacgcagt gacgaccaca aaagagctc                                       209

<210>30 

<211>309

<212>DNA

<213>增强子

<400>30

tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat      60

ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg     120

cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc     180

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt     240

ggattgatgtgatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca      300

agacccttc                                                             309

<210>31

<211>15941

<212>DNA

<213>大豆

<400>31

aaaaaatacc ttttagtaaa ataagagcgt ragatcaatc agacgttttc tctttgggac      60

ttctcattct taattgaatt gacaataact aaagtgaaac taaggctaaa atcaactcgc     120

ctagtcaagc tcgtccacaa aaataggttt ttgaaagttt accatgtcag tttcttacta     180

agtaaaaaag gatcatttgt aaggtccaac gccttaaaat gatcaccctt caaagtaaaa     240

gaatcacttg tttcacgcat aagtaagaac tacgtaggtc tgatttcctc tccaaaggag     300

ggtacgtagg agcaaaagcc ccgcttttgt cgaccttaaa aaataaaaag aaacaaaagt     360

taaggtaaca caatttccac aattctagaa ataaggttgt tgtctttcga gacaaacgta     420

agaggtgcta ataccttcct caaacgtaaa tacaactccc gaacttagaa ttttcatttt     480

gaccggtttc cttcggtttt cccgacgttt tccacaaata aacgttggtg gcgactccgc     540

gcatctttcc tcctttggaa agcgcaccca tgagcctcgc cctcgctcgc ccgcgaaggg     600

cacgttgcga cactaggtta ataagaagtt tagtccacat atctatggac ctcttaaggt     660

gattatcaaa gtggaagtgg tgacctacat gttggcccta ccagcttatt cgtatattta     720

cccccatcaa ccatgtatct cagctgaaac atgctatcaa tccaaatgtt atcagaggaa     780

catgagctgc atgttcaacc agaagtagtt ctagtcttaa tacaaatgtc aaatggcaca     840

agtgagattt tgaatttctg atgttgtaaa aatctcagga catgaatact attgggaagc     900

aattattcat acttcaccaa tccaaactga cccaaaattc tcaaatcaca tgaaagcaaa     960

aatgcatata acacgaagaa taagaagaag aggaactaac ctggggtttc gatgattaaa    1020

gcgttgttgt tgatgatgaa aacgatgatt atggagagaa attgttgttg aatggtgaaa    1080

ttgttataga aagagaacga agatagagaa aaagatatat agatttttca aggctcaaac    1140

cctaaaatca ccatgagaga gaacaaagat tgagaaacct acaaccacta tgagagagaa    1200

tgagcagaac agaagcgtga gatagagaac gagagttaag gtgcgagagg acacgaagaa    1260

caaaaggtgt gagagaaaga acaaaggagc ctacggtgtg agatgagaga atttgaaatt    1320

cttaccattt aggtggaatt tcaattctac aattttattc tattaaaatt attttaaaaa    1380

atgatgtcat tttaaattct ttaaaatctc atatccaaca actgaattat gatagaggta    1440

tttcaaattc acttaaaaaa attatcttat ttaaataccc catccaaaca tagcgaaatg    1500

ttcatgagaa ggatcaagtg gtttggaaac atagtactaa tggtgtttat acagttcatg    1560

gaatccttga tagataattt aaaggttgct ggaaattgga tgaaggtgtg gagattaaat    1620

attcttccaa aaataaagcg ttttatttgg agagtgttgt gtggttgtct cccctgtagg    1680

caaaagcttc gatgtaaagg agttcaatgt ccaataacct atgctttcta tccctcgatt    1740

attgaaaatg aatgacacat tttatttggt tgaaatcaag aaataagcat gtggcaagca    1800

acgggtattt gacaattcat agaacaaaag gtgaatgcag caaaagaatt aatgaactcc    1860

ttttcgatct acttggatca ctacatggag atattatcaa caaatttgat gttactttat    1920

ggagcagttg gaattcttgg aatgacaaga tatgaaatga acataccaac cctcctcttg    1980

tttctgtttc ggtttctatg cagtattttg ttgaatggca aagtgcaagg taatatgctc    2040

ctcaacatca attaacaaat gttcatgaca tctcttacca gctccaactt ggggacgttt    2100

gacaaacacc accgtcaagt ttccttaaat gcaacattaa tgttgctcat ttcaaggagg    2160

agaatagttt tggtgtcggc atgatactcc atcaaggaag attcgtcaaa gctcactcac    2220

gttttcgaca tgggtcgaca tgggttacct gacccaaagg ctgaggctta ggcttgggtt    2280

tgcttcaagt attgatctgg gcccagacta ttggtttaca taatatcatt tttgaaaacc    2340

taacatctaa aactcaaggt tgtttagagg tgcgccattc caaaataaga ttatcctatt    2400

tgtgcatgaa tgcgaccaac tatctcctgt ttcagcatta taaagtataa acaacaaact    2460

tctttaatca agggactaaa agatattgga catacaagct aaaagtgata gaatttgaga    2520

aaacaaatat tgacaacaat attcaagagg acactaaaac ataattctca aatttttttt    2580

gtttatttaa aataaagtgg ttcattaggt agctcttgaa aaaaaaaagt gattaacatg    2640

ctagtacatg ttaaaaaaag tgaataatat tctattataa gtaaagagga ataatttatc    2700

gatgtctcat ttttgagata gttcaccgaa gccaattttt ttactttttt ctcttcaatc    2760

aattttattt tgttaatagt tgtcattgtg gatggattat aataattttg aaatgattta    2820

aaatgagata tatattaata aatttaatta attcataaat atgttactaa atataaattt    2880

catggtatac tcaggacggt tataacggaa atcaaataaa taataaaata gaataatatt    2940

aatttgcagt aaaaagaata atattaattt attctgttta cactatgtat aacgaaatta    3000

aatatattca tttaatatga ttttattttt ctttaattta aaaacatgaa ttatttgttt    3060

cttattttat taccattttg ttcacttctc aattaataaa ataaaaatat attctacaat    3120

tatagtaaaa aggtttaatt ttatataatg ttagcataca gatttttctc tattaactaa    3180

ttaattaaaa attatcctta ttttaaggaa attaaaaatt atcatatata tataagtttt    3240

aaattaatta tcttatatat gtaccaaaaa gttttaaagc aattattata aaaattaata    3300

aatttatcat ataaaataat ttataattaa attttaaatt atcaattcat taaattaaat    3360

tatttaaaat ttttgaatga taatataata attttatcct ctactaagtc ccaacgtttc    3420

ctattttatt ccacttttag caataaattt tgtcataaac acttataaca aaaaaagtaa    3480

gtaaaaaata aaaaaaagtt tttcaataaa gtataaacta atttgtataa acttttagaa    3540

aaaataaagt tatacattga taatataaat tttttacata attatccgat caactcatta    3600

tatatgataa atttattgat tttttaaaat aattatctta aaataattta aacaatgatt    3660

tgcaattaga tgataatata aaattatttt acacactaca tgtattaaac tcaaactttt    3720

atatattagt ttttctaaaa actaattttt aactcaaaaa aaatgttact tataattttc    3780

ttatcttctt tttttataag tattttttaa gaaatttatt gaaacatgac catgcttggg    3840

tcaataatac tactctctta gacaccaaac aacccttccc aaactataat ctaatccaaa    3900

agccatcatt cattttcctt ggtaggtaaa gttccaagac cttcaccaac tttttcactc    3960

aattgttttg gtgtaagcaa ttcgacatgt gttagtgtta gttggcaacc aaaaatccct    4020

ttatgtgact caatccaaca accactcaca ccaccaaccc ccataaccat ttctcacaat    4080

acccttcatt tacacattat catcaccaaa aataaataaa aaaaacctct catttcagag    4140

agagagagag agacttcaca gaccaaagtg cagagaacaa caaagttcac aactttaagg    4200

aaaattgaaa tggcccaagt gagcagagtg cacaatcttg ctcaaagcac tcaaattttt    4260

ggccattctt ccaactccaa caaactcaaa tcggtgaatt cggtttcatt gaggccacgc    4320

ctttgggggg cctcaaaatc tcgcatcccg atgcataaaa atggaagctt tatgggaaat    4380

tttaatgtgg ggaagggaaa ttccggcgtg tttaaggttt ctgcatcggt cgccgccgca    4440

gagaagccgt caacgtcgcc ggagatcgtg ttggaaccca tcaaagactt ctcggtacc     4500

atcacattgc cagggtccaa gtctctgtcc aatcgaattt tgcttcttgc tgctctctct    4560

gaggtgaagt ttatttattt atttatttgt ttgtttgttg ttgggtgtgg gaataggagt    4620

ttgatgtgta gagtggattt tgaatatttg attttttttt gtattattct gtgaaaatga    4680

agcatcatgt cccatgaaag aaatggacac gaaattaagt ggcttatgat gtgaaatgag    4740

gatagaaatg tgtgtagggt tttttaatgg gtagcaataa gcatattcaa tatctggatt    4800

gatttggacg tttctgtata aaggagtatg ctagcaatgt gttaatgtat ggcttgctaa    4860

aatactccta aaaatcaagt gggagtagta tacatatcta cagcaaatgt attaggtgag    4920

gcatttggct tctctattgt aaggaacaaa taatatcagt taatgtgaaa atcaatggtt    4980

gatattccaa tacattcatg atgtgttatt tatatgtacc taatattgac tgttgttttt    5040

ctccgcaatg accaagatta tttattttat cctctaaagt gactaattga gttgcttact    5100

ttagagaagt tggacccatt aggtgagagc gtggggggaa ctaatcttga atatacaatc    5160

tgagtcttga ttatccaagt atggttgtat gaacaatgtt agctctagaa gataaaccct    5220

cccccaaaac acaaattaga atgacatttc aagttccatg tatgtcactt tcattctatt    5280

atttttacaa cttttagtta cttaacagat gtcttgttca gcataaatta taatttattc    5340

tgtttttttt tagggaacaa ctgttgtaga caacttgttg tatagtgagg atattcatta    5400

catgcttggt gcattaagga cccttggact gcgtgtggaa gatgacaaaa caaccaaaca    5460

agcaattgtt gaaggctgtg ggggattgtt tcccactagt aaggaatcta aagatgaaat    5520

caatttattc cttggaaatg ctggtactgc aatgcgtcct ttgacagcag ctgtggttgc    5580

tgcaggtgga aatgcaaggt ctgttttttt ttttttgttc agcataatct ttgaattgtt    5640

cctcgtataa ctaatcacaa cagagtacgt gttcttcttc ctgttataat ctaaaaatct    5700

catccagatt agtcatcctt tcttcttaaa aggaaccttt aattatcaat gtatttattt    5760

aatatttaaa ttagcttgtc aaagtctagc atatacatat tttgattata ttctgagaaa    5820

tgcacctgag ggtgttcctc atgatctact tcaacctctg ttattattag attttctatc    5880

atgattactg gtttgagtct ctaagtagac catcttgatg ttcaaaatat ttcagctacg    5940

tacttgatgg ggtgccccga atgagagaga ggccaattgg ggatttggtt gctggtctta    6000

agcaacttgg tgcagatgtt gattgctttc ttggcacaaa ctgtccacct gttcgtgtaa    6060

atgggaaggg aggacttcct ggcggaaagg tatggtttgg atttcattta gaataaggtg    6120

gagtaacttt cctggatcaa aattctaatt taagaagcct ccctgttttc ctctctttag    6180

aataagacta agggtaggtt taggagttgg gttttggaga gaaatggaag ggagagcaat    6240

ttttttcttc ttctaataaa tattctttaa tttgatacat tttttaagta aaagaatata    6300

aagatagatt agcataactt aatgttttaa tcttttattt atttttataa atattatata    6360

cctgtctatt taaaaatcaa atatttgtcc tccattccct ttcccttcaa aacctcagtt    6420

ccaaatatac cgtagttgaa ttatattttg gaaggcctat tggttggaga cttttccttt    6480

tcagagatta tccctcacct ttattatagc ctttctattt ttaaacttca tatagacgcc    6540

attcttgttt taaaaaacac taagttttct tttagttata ccttcccctc cttattctct    6600

ccaaagtaaa tattgtagca agtgttggtt gatccattgt gaatcttatt atcctattta    6660

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cagctccttt agctcttggt gatgtggaaa ttgagattgt tgataaactg atttctgttc    6780

catatgttga aatgactctg aagttgatgg agcgttttgg agtttctgtg gaacacagtg    6840

gtaattggga taggttcttg gtccatggag gtcaaaagta caagtaggtt tctatgtttt    6900

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ggtctcctgg caatgctttt gttgaaggtg atgcttcaag tgccagttat ttactagctg    7020

gtgcagcaat tactggtggg actatcactg ttaatggctg tggcacaagc agtttacagg    7080

tattcatgaa tgacactatc ttctattatc ttttatttta tagcttacac tatcattcct    7140

aattcaaccc ccttcttttc tctttcccct cactcccaaa atagagctta tcattgtatc    7200

cttaatagct cttttatgtg ctgtttcatc tcttgagcag attctacatg attatccttt    7260

ttagtgaact tttttgtctt ttaaataatt gatatcatca tttgaacttg cacatcatct    7320

ctatccttcc tcattttatt atatttcatt aagagtgata aaattacatt gtcaagtaaa    7380

gcaagttagc gtatcagata atgatgcttc gattgcagaa ttggtgaaag cttgcacaat    7440

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ctttttgtct aaaacttctt ttgcacttaa acatgaatta gagagttagg atgaacaata    7560

gtaacagaca caaagcttat ttctagacca cccagtggtg aagacgaagc agcatgagtg    7620

agattaatgg cagcatctga ttgaagcttc ttttggtatt attggagatg aaatcttgag    7680

ccaaattagg gcttttgcct cctcaatagc cattggttca aaattgcttt caataaaatg    7740

attacagaat caaattctta agaaagacct tcaagaacaa catcaagatg tttcctgtgc    7800

aaaacaggct cacctacaaa agagtgtcta caagcacctt tacacttgga aaaaattcct    7860

taactgaaca attgccaaga gtcatgttgc aaacttgaga ttggagttga ttagatttgg    7920

tgtgtgtgag attctggaaa tgagcatgaa gttttttgca aagctcataa aatgaatgca    7980

gccaagaatc ctagatagga ttgaatttga gagagaggct tgaagtcaag ataaccgcaa    8040

ctgatcttgc tgttcccatg ctgcatagga ctcgttgatt ctaccaagat aacaatcttc    8100

tgtggtgaga atatgagtgg gaattgtcag gcaacaaaga aaatgaaggc tatgagcctt    8160

tgttaaggtg cagagagaaa acagaaaatg aagaacttgt gtattgaagg aattgaaaag    8220

ccaattacaa ttgtgttgca gagagatatt tatagttctg aagtgtataa ctaactaaac    8280

agaatgctac caacctagag gcagttgaga attgctccct tattacaata ctctcacagc    8340

cttgatgata ggcttgattt gctgccaccg aagaagaaca ttattgttgg agagtttttc    8400

agtgattgca tcagagaaag ttacaagtgt gattggagat gaaggacttg cggtcgtcga    8460

aggttaagtg ttaagtggtg gaatgtgtat cggaggtggt tgcctagccc aagaagctgg    8520

ttgcagtgga agcggatgcg gcagaagcca tgggttcaga tcagaactat gttctagata    8580

ccatattagg gttagctttc aagagaaaac ttatgaaact gaactgtaaa ctgttgtatt    8640

attgattagc tgatctagta gtgatggaag cttgcttgcg aagcttctat ggaggctgga    8700

tcattgagct tcaatgaggt ccttcaatgg tgatttttca ccatggagat gcagcggaag    8760

ataaatgaag aggtgagagg aggcgtcatc cactaggaaa taaactatgg aagaaggagc    8820

ttcaccacca agagagtgtc ttggataaga agcttagaga ggaagcttca atggaggaat    8880

agaaagagag agggggaaca aaaaattgaa ggaggaaaag agggagagaa gttgaacttt    8940

gaagtgtgtc tcacaagact cattcattaa agttacaaca agtgttacac atgcttctat    9000

ttatagtcta ggtaacttcc ttgagaagct agaacttaac tacacacacc tctctaataa    9060

ctaagataac ctccttgaga aatttccttg agaagcttcc ttaagaagat tcctagagaa    9120

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aaactctata ctactagaat ggtcaaaata caaggtccaa aagaaggaaa aacctattct    9360

aatatttaca aagagagtgg acccaacctt agtccatggg ctcagaaatc taccctgagg    9420

ttcatgggaa tcctagggtc ttctttagta gctctagtcc aattttcttg gagtcttcta    9480

tccaatatcc ttgggggtag gattgcatca tgtagtacaa gagaggggaa tatatataca    9540

gttgtaagtt gtaactacct aatcaaaccc aactgactca ccatacacag aaaaacaatg    9600

tacaaaggat aatagaaaaa ctgaaactga gatatactca ttacatagaa gaattacatg    9660

atgaatctga aaattttaat tgggaaactg aggacaataa caaggctttc agagttcatt    9720

ttgacaatag gtaaattatg gacttcaact tagacctcaa gggtatgctt gggagtgggg    9780

ttttagagga aaaggggaag gagggaaatt ttttaattct agtaaatatt ctctattttg    9840

attaattttt aaaataaaac aaataaactt atagattagc attcacttaa tgtcctgatc    9900

ttttatttgt ttcatgaagt tttttatagc ctttctgttt ctgttaaaag aaattggagg    9960

gtgttcataa tctatatgcc catatatatg tattgtcctg ttgtctgtgt ttctgttttc   10020

tttctttagt gtctcgcctt tccttaattc cttatcaaca ccttgtttat ttttgaaaac   10080

ttaaatgtcc tcattttttt tacctgtact ataactttcc aaacaaatag tagaaaatgt   10140

ttcaaatatt ccccagaact gtttcagtga acaaagttca agccagaaaa aaagcaagca   10200

gaggctaaag aagtatatct tattgtgaag agtaatctca attggttaat tatcgaattg   10260

tatcatttta caatagaaaa ttagaagtgg gttgattagt ttatacgaac aattatttaa   10320

atagggttga tggtgtggtt aattactgat catatgttaa gactatgagt cgatgaccag   10380

cctcagtgca gtcattttaa gttccattat tttttaattg tgcttatgtt taactttgtc   10440

cttcttttaa agggagatgt aaaatttgct gaagttcttg aaaagatggg agctaaggtt   10500

acatggtcag agaacagtgt cactgtttct ggaccaccac gagatttttc tggtcgaaaa   10560

gtcttgcgag gcattgatgt caatatgaac aagatgccag atgttgccat gacacttgct   10620

gttgttgcac tatttgctaa tggtcccact gctataagag atggtatggt ttagctgttt   10680

gtttttgctc aagagcttgt tttcacatat ttgtggtcaa gagcggttta gctgtttttt   10740

tttttaaatt gtggttaatg aaattattat aattatacta atattgaaat tggatcacta   10800

accatgtgaa atgcttgaat ttttagcttg aaaacttctt ttgtggatga tttttctttt   10860

atctatgtag tgtggggcat ctatgttgtt cctttaagct ttgtgtcata gttgtacaac   10920

ctggtctgtg ggctggtcca gttcttactc atgactgtct tttgcagcaa actggttaaa   10980

cttgggtgac ctgttgaccc acccagattg gcctgttctt ttttaaataa aactccaaaa   11040

ggctacttat aagatttcaa catgatactt gaatgaccac ccttacttta aaggtcatta   11100

tgccatcaga ccccttgatt ctctgttcag ttatgttctt attcttatta ttttttaatt   11160

tatattatta tccaacgatc tgatctttgt acatgatgct ggacaatcat caaagctagt   11220

ttggttacat catataatac cttttttttc ataaattatt ttttcccata atatatttat   11280

atgtattttt ttaatacaat attctgggga aatttttttt ttctgttttc ttttttctgg   11340

tttgaatact atttcaatga ctgggcctta ttattttctg gtttgggtta tacaactgtc   11400

ctttgatgta cttttgaatg cttcaatagt atttttcata atcatggaag gcactagagt   11460

gcagtgcata ttgcacaagg ttctttaatg gcatcttgaa tttgttagaa catggagtta   11520

tgatatacaa ccattcctat gtcttcatct aatagctaaa gcttttggcg tagttggtta   11580

acatggtatt ggaatcttat tttaaaggtc catcttattc gcaagtacaa ggcaggtgga   11640

cctgcgcatt attcacgtgc caggctcaaa gggattttgt atgaggggga atttttggaa   11700

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tagttgtatt attgcagtgt ctaaactagg catgatcttc tgtggaagga aatttaacct   11820

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taggtaatat gtaaatttca ctatagattc ttactgagga tgatggtctt gacttcgaag   12960

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tagctcttga ctgagagata ctttgagtta aaaaaatgta tttataaact attgtctatt   13560

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tgtaagtgta tttttttttt ctttctcttc tttaatatta ctcaatatca gattgcacat   13800

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gctttgattt tgattgtacg ttttttgttt ttattgtaaa gtgtttattt tattaaaatt   14820

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attgctttta ttcaacgcaa attctagtag gattttcagc ccaaattaaa agaagtttta   15540

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cctctataaa tctattttaa aaaaaccccc aaatttaagg a                       15941

<210>32

<211>15172

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<213>大豆

<400>32

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ttaggaagtt tgacaacttt agacattaat aattgttttt ttttcatata tataattgac    3360

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tggctcatgt gggatattag tttttgtccc ttacctaaaa agagagaaag agaaaaataa   14640

caatttaaaa agagtaccac cgctaccacc tttttcgctt ttaaattttt gttctgtttt   14700

cactactctt tcatgcgttg tttgttggct tctgatagtg acgaatatga tataatgatt   14760

ttatgttggg aaaaaagtgc catgtaaatt ctagagattg aaattttagc atcaaattat   14820

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<210>33

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<212>DNA

<213>引物

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<212>DNA

<213>引物

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<222>(27)..(27)

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<400>34

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<212>DNA

<213>含双突变的大豆EPSPS

<400>35

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taaggtaaca caatttccac aattctagaa ataaggttgt tgtctttcga gacaaacgta     420

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gaccggtttc cttcggtttt cccgacgttt tccacaaata aacgttggtg gcgactccgc     540

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aatactccta aaaatcaagt gggagtagta tacatatcta cagcaaatgt attaggtgag    4920

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gatattccaa tacattcatg atgtgttatt tatatgtacc taatattgac tgttgttttt    5040

ctccgcaatg accaagatta tttattttat cctctaaagt gactaattga gttgcttact    5100

ttagagaagt tggacccatt aggtgagagc gtggggggaa ctaatcttga atatacaatc    5160

tgagtcttga ttatccaagt atggttgtat gaacaatgtt agctctagaa gataaaccct    5220

cccccaaaac acaaattaga atgacatttc aagttccatg tatgtcactt tcattctatt    5280

atttttacaa cttttagtta cttaacagat gtcttgttca gcataaatta taatttattc    5340

tgtttttttt tagggaacaa ctgttgtaga caacttgttg tatagtgagg atattcatta    5400

catgcttggt gcattaagga cccttggact gcgtgtggaa gatgacaaaa caaccaaaca    5460

agcaattgtt gaaggctgtg ggggattgtt tcccactagt aaggaatcta aagatgaaat    5520

caatttattc cttggaaatg ctggtactgc aatgcgtcct ttgacagcag ctgtggttgc    5580

tgcaggtgga aatgcaaggt ctgttttttt ttttttgttc agcataatct ttgaattgtt    5640

cctcgtataa ctaatcacaa cagagtacgt gttcttcttc ctgttataat ctaaaaatct    5700

catccagatt agtcatcctt tcttcttaaa aggaaccttt aattatcaat gtatttattt    5760

aatatttaaa ttagcttgtc aaagtctagc atatacatat tttgattata ttctgagaaa    5820

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atgattactg gtttgagtct ctaagtagac catcttgatg ttcaaaatat ttcagctacg    5940

tacttgatgg ggtgccccga atgagagaga ggccaattgg ggatttggtt gctggtctta    6000

agcaacttgg tgcagatgtt gattgctttc ttggcacaaa ctgtccacct gttcgtgtaa    6060

atgggaaggg aggacttcct ggcggaaagg tatggtttgg atttcattta gaataaggtg    6120

gagtaacttt cctggatcaa aattctaatt taagaagcct ccctgttttc ctctctttag    6180

aataagacta agggtaggtt taggagttgg gttttggaga gaaatggaag ggagagcaat    6240

ttttttcttc ttctaataaa tattctttaa tttgatacat tttttaagta aaagaatata    6300

aagatagatt agcataactt aatgttttaa tcttttattt atttttataa atattatata    6360

cctgtctatt taaaaatcaa atatttgtcc tccattccct ttcccttcaa aacctcagtt    6420

ccaaatatac cgtagttgaa ttatattttg gaaggcctat tggttggaga cttttccttt    6480

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ccaaagtaaa tattgtagca agtgttggtt gatccattgt gaatcttatt atcctattta    6660

acatgcaggt gaaactgtct ggatcagtta gcagtcaata cttgactgct ttgcttatgg    6720

cagctccttt agctcttggt gatgtggaaa ttgagattgt tgataaactg atttctgttc    6780

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agtgttacat cacttttagt atccaaaatg caatgaaatt aaaactcatg tttcctatta    6960

ggtctcctgg caatgctttt gttgaaggtg atgcttcaag tgccagttat ttactagctg    7020

gtgcagcaat tactggtggg actatcactg ttaatggctg tggcacaagc agtttacagg    7080

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cttaatagct cttttatgtg ctgtttcatc tcttgagcag attctacatg attatccttt    7260

ttagtgaact tttttgtctt ttaaataatt gatatcatca tttgaacttg cacatcatct    7320

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ccaaattagg gcttttgcct cctcaatagc cattggttca aaattgcttt caataaaatg    7740

attacagaat caaattctta agaaagacct tcaagaacaa catcaagatg tttcctgtgc    7800

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tgtgtgtgag attctggaaa tgagcatgaa gttttttgca aagctcataa aatgaatgca    7980

gccaagaatc ctagatagga ttgaatttga gagagaggct tgaagtcaag ataaccgcaa    8040

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tgtggtgaga atatgagtgg gaattgtcag gcaacaaaga aaatgaaggc tatgagcctt    8160

tgttaaggtg cagagagaaa acagaaaatg aagaacttgt gtattgaagg aattgaaaag    8220

ccaattacaa ttgtgttgca gagagatatt tatagttctg aagtgtataa ctaactaaac    8280

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cttgatgata ggcttgattt gctgccaccg aagaagaaca ttattgttgg agagtttttc    8400

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ttgcagtgga agcggatgcg gcagaagcca tgggttcaga tcagaactat gttctagata    8580

ccatattagg gttagctttc aagagaaaac ttatgaaact gaactgtaaa ctgttgtatt    8640

attgattagc tgatctagta gtgatggaag cttgcttgcg aagcttctat ggaggctgga    8700

tcattgagct tcaatgaggt ccttcaatgg tgatttttca ccatggagat gcagcggaag    8760

ataaatgaag aggtgagagg aggcgtcatc cactaggaaa taaactatgg aagaaggagc    8820

ttcaccacca agagagtgtc ttggataaga agcttagaga ggaagcttca atggaggaat    8880

agaaagagag agggggaaca aaaaattgaa ggaggaaaag agggagagaa gttgaacttt    8940

gaagtgtgtc tcacaagact cattcattaa agttacaaca agtgttacac atgcttctat    9000

ttatagtcta ggtaacttcc ttgagaagct agaacttaac tacacacacc tctctaataa    9060

ctaagataac ctccttgaga aatttccttg agaagcttcc ttaagaagat tcctagagaa    9120

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ctagagcctt agctacacac acccttataa tagctaaact cactctattc caaaatacat    9240

gaaaatacaa aaaagttcct actacaaaga ttactcaaaa tgtcctgaaa tacaagacta    9300

aaactctata ctactagaat ggtcaaaata caaggtccaa aagaaggaaa aacctattct    9360

aatatttaca aagagagtgg acccaacctt agtccatggg ctcagaaatc taccctgagg    9420

ttcatgggaa tcctagggtc ttctttagta gctctagtcc aattttcttg gagtcttcta    9480

tccaatatcc ttgggggtag gattgcatca tgtagtacaa gagaggggaa tatatataca    9540

gttgtaagtt gtaactacct aatcaaaccc aactgactca ccatacacag aaaaacaatg    9600

tacaaaggat aatagaaaaa ctgaaactga gatatactca ttacatagaa gaattacatg    9660

atgaatctga aaattttaat tgggaaactg aggacaataa caaggctttc agagttcatt    9720

ttgacaatag gtaaattatg gacttcaact tagacctcaa gggtatgctt gggagtgggg    9780

ttttagagga aaaggggaag gagggaaatt ttttaattct agtaaatatt ctctattttg    9840

attaattttt aaaataaaac aaataaactt atagattagc attcacttaa tgtcctgatc    9900

ttttatttgt ttcatgaagt tttttatagc ctttctgttt ctgttaaaag aaattggagg    9960

gtgttcataa tctatatgcc catatatatg tattgtcctg ttgtctgtgt ttctgttttc   10020

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ttcaaatatt ccccagaact gtttcagtga acaaagttca agccagaaaa aaagcaagca   10200

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tatcatttta caatagaaaa ttagaagtgg gttgattagt ttatacgaac aattatttaa   10320

atagggttga tggtgtggtt aattactgat catatgttaa gactatgagt cgatgaccag   10380

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atctatgtag tgtggggcat ctatgttgtt cctttaagct ttgtgtcata gttgtacaac   10920

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tatattatta tccaacgatc tgatctttgt acatgatgct ggacaatcat caaagctagt   11220

ttggttacat catataatac cttttttttc ataaattatt ttttcccata atatatttat   11280

atgtattttt ttaatacaat attctgggga aatttttttt ttctgttttc ttttttctgg   11340

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tataatatat agaatcattc atgtggttca cctatcatgt gtcaactcaa gtttttgtcc   11760

tagttgtatt attgcagtgt ctaaactagg catgatcttc tgtggaagga aatttaacct   11820

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cttgaaaggt tttagttgta tctataaagg gtgcagaatt agggggtcag cttttctgtt   11940

gtaagcgtga attaagtgca ttttatgttg ttccctattt tatacatttg aactatcaac   12000

catatcattt agcaaacttc tttgttgctc agattcccat ttattcttgt ttcctctatt   12060

ttttagtggc aagttggaga gttaaagaga ctgagaggat gatagcaatc tgcacagaac   12120

tcagaaaggt cttgctaatt cctttatggt ttctatatta ctggactttt tacatctcac   12180

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tgtgtgatta ctccacctga gaaattgaat gtcacagcta tagacacata tgatgaccac   12300

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cactaagcat tttgtacatt gagtagggaa gagagagaga tatatataaa tactcacaaa   12480

gcagtgagta tatggcttgc ttttgtttct aaacattcct ttataaggac ttgagataat   12540

ttgtattgtt taaaagagcc attggttctg ttgtatcaaa gtaatttaat tttcagtacc   12600

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attgggatgg gaccatacat tttttgttta ttatttaagt caaacatatc agataatatg   12720

tggtgaccag aaaagtgtct agcaatcaaa tgggtctgtg attgcatgtt tgagttcagg   12780

acatttatta atgagtgaca gaattttaaa aagctcgcca ataggagttg ccacatctga   12840

tcgagtcttc tgtaaacact aactgtaact tgagtttgat aatcagattc cccccgttgg   12900

taggtaatat gtaaatttca ctatagattc ttactgagga tgatggtctt gacttcgaag   12960

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ttgagtgaca tacagcaaat agcaatgaaa gcatgaccat ggccttgggg ggccaaatgg   13080

ccatgtacca cttttccacc tacttgagag ccatggtcct gaatgaggtc cttttgtttc   13140

atttttttta caataaagaa agttcatatt cttggcaata gcaaggcaaa tcatttgtgg   13200

aagtcacatg aaattcacca taggcttcat tgttcaaatc ctttagtcac taaggcaggg   13260

cctatgtaag aattttgact actcttgtaa atgctgtgcg gtaaagacta cgggaaaata   13320

taaattattg catatctaga ggtgaggttc atttctccga tccatttctc caagtaataa   13380

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ataggttcaa tctttggtta atctatcaaa tgcatctcaa tattttgaga gaatagtttt   13500

tagctcttga ctgagagata ctttgagtta aaaaaatgta tttataaact attgtctatt   13560

gaatttttat tttttttgta acaccacatg tgagtatttt actaaatcca tgttacaatg   13620

tactgaatgt tttacaatac agtctggttt gataataaaa tatgcacaaa gtccagctta   13680

tgtaactctt tcaattcatg gaaaatgatg atatgcgaat tgaaagaaag aaaaccataa   13740

tgtaagtgta tttttttttt ctttctcttc tttaatatta ctcaatatca gattgcacat   13800

gggaagggta ctggctcatg tgggatatta atttttatcc cttacctaaa aagagagaaa   13860

gagaaaataa ctatttaaaa agagtaccac caccaccttt ttcgctttta agttttgttc   13920

tgttttcact actctttcat gcgttgtttg ttggcttccg atagtgacga atatgataat   13980

gattttacgt tgagaaaaaa aatgtgccat gtaaattcca gagattgaaa ttttagcttc   14040

aaattaatat ttattttatt atcttttcaa attggttgca tgtgaaagaa tttgaagttc   14100

ttcaacaagg aaataaacac ttcaatgctc aatccttaga gtcagtcact agatcccaaa   14160

agaatgtgat gtttacacac attagtatat atatatatat aaacacagct tatattatat   14220

taatgagtga tgcgcgagga cggtggtgac actacatggc caaaacaaga aatgtaattt   14280

aatttttttt tctttaagta ttactctatc cttgaatatt agtcttaaat cttcaaagac   14340

cttgcgaagg aagcaatctt gtcctgatcc tgtgattgtt ctacactagt ccttacgtgt   14400

acctaagcac atgatacttt gctgccctaa cataaattgt accataagga ttcttgggga   14460

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ttggatcaac tgcatataca tatgttttat gagtttcatt gaatttatat ttacacaaac   14700

agttattaaa acataatgta gagccttgtc attaacctga tgttagatt ataatttcat    14760

gctttgattt tgattgtacg ttttttgttt ttattgtaaa gtgtttattt tattaaaatt   14820

tgtcttggag tgctgtgatc tttagggtgc accgttcaaa agagagacga caaggataat   14880

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gaaagttata tcaaagtatc atatactaga cttcatggct agcttttact ttgattataa   15240

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attcaacaaa ccacccatta ttatgttccc ttaataaatc tcacacttaa aaaccctcct   15840

cacccataat taacccaaaa ggaagtttcc tccacacaaa aaatatcctt aaacaaagag   15900

cctctataaa tctattttaa aaaaaccccc aaatttaagg a                       15941

<210>36

<211>15172

<212>DNA

<213>含双突变的大豆EPSPS

<400>36

aaaagtctga atgaagtgaa gttgttgtgt tagggggatg ctgaatttga ttttaattta      60

atttaaataa attacctgtg taaaggattt ttgtaccgcc ttttaatcac aaattgtcgt     120

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ctgattagtt aaccatgtaa atttttttaa tgggtttgtg tttgttttaa ctgatgttgt     240

ttttgatatg tacgtggtaa gtgtgatgag tttgtgcata tcttgatcaa agactgaagt     300

gaagttgttg tgtttggggg gttgactctt ttaggaagag gatttgaggg aatttcgcca     360

atgggggagc agaactccgg gacaccctga gaattttgag actccgggaa ttgaagttac     420

aacaggtttg atatgagtta gagtttgtat aatagaatag taattctttt tattttttat     480

ttttattgtt tatttatcca ttattgctat ttttgtaggt cctcttggtc aggggattgc     540

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caatgagatt gttgaccatt acacgtaaaa ataactaaat catacacaac ttgcaagact     660

ttagttgttg gtgttttgct aatggcgttt gttttatgca ggtatgctat tctgggtgat     720

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gggaagctga tagcatttta tgatgacaat catatttcta ttgatggtaa cacagagatt     840

gcgttcaccg agagtgttga tagtcgtttt gagggacttg ggtggcatgt tatttgggta     900

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aaagacaaac ccacattaat caaggttagt ttactaattg tggcaatgat atgcatagat    1020

ttctggcttg tagttaccat aacaatcata atctgtcatg atttataggg attcttttaa    1080

actaaggtta taaacatgat atgttactaa agactgcatt gcattgtagt acctcatttg    1140

agaaactgga agttataggt gggaaatcaa aatagtaaat tatgggtcag tttattaagt    1200

gtagctggtt tgtcttttgc taactctatc atttcacagg tcacaacaac cattggttat    1260

ggttctccta acaaggctaa ctcctacagt gtgcatggaa gtgcactggg tgccaaagaa    1320

gttgatgcca ccaggcagaa ccttggatgg tcacatgagc cattccacgt gcctgaggat    1380

gtcaaaaagt atggatgatg ggtttagaga tttctttttt cctgtgacac tgctgatgtt    1440

tataatgata ctgaataaga attgcttgtc tgtccccagg cattggagtc gccacacccc    1500

tgagggtgct gcacttgaag ctgagtggaa tgctaagttt gctgagtatg aaaagaaata    1560

caaggaggaa gctgcagaat tgaaatctat tatcaatggt gaattccctg ctggttggga    1620

gaaagcactt ccggtgagta aattctaaac tcagaggttt ttcttacatg tttgtaactt    1680

ttcaaggttt ggattacata ctatccaaag ttgatcatga tttcagtttg atttggtagt    1740

atggggcttc aaaaagttat tccaaatatt aaaacctggc ttccaatttg atttcagaca    1800

tacactccag agagcccagc ggatgccacc agaaacctgt ctcaaacaaa ccttaatgcc    1860

cttgcaaagg ttcttcccgg tctgcttggt ggcagtgcag atcttgcttc ttccaacatg    1920

accttgctca aaatgttcgg ggacttccaa aaggatactc cagcagagcg taatgttaga    1980

ttcggtgtta gagaacacgg aatgggagct atctgcaacg gcattgctct tcacagccct    2040

ggactgattc catattgtgc aaccttcttt gtattcactg actacatgag aggtgccata    2100

aggctttctg cgctgtctga ggctggggtt atttatgtca tgacccatga ttcaatagga    2160

cttggagaag atgggccaac ccaccagcct attgagcacc tagcaagctt ccgggcaatg    2220

ccaaacattt tgatgcttcg tcctgccgac ggtaacsgaa acagccsgag catacaaagt    2280

ggccgtgctc aacaggaaag agaccctcca ttcttgccct atccaggcaa aaactgcccc    2340

agcttcccgg aactthcatt gaaggagttg aaaagggtgg ttacaccatt tcgggacaac    2400

tccactggca acaagcctga tgtcattttg atcggaactg gttcggaatt ggaaatcgct    2460

gccaaagctg ctgatgacct aaggaaggaa gggaaggctg ttagagttgt ttcccttgtt    2520

tcttggggaa ctttttgatg agcaatcaga agcstacaag gagagtgttt tccctgctgc    2580

tgtttcagcc agagttagca ttgaggcagg atcaacattt gggtgggaga aaattgttgg    2640

agcaaaggga aaagcaatag gcattgatcg ttttggagct agtgctccag ctggaagaat    2700

atacaaagaa tttggtatca ctaaggaagc tgttgttgct gcagctaaag agcttatcta    2760

gaacttttga tttttttttg ccttctggtt ttggttgaga gcattccatg tcatgaataa    2820

gaaaaaggtt aaatatcctt cgattgggaa tttgggattc taagtgaaga agcaacatag    2880

atcaaagaat tttgtgaact tgtaataact atttgacaat ttagttttgc actgccacat    2940

ggttaaattc aatgtttgat catatcaacc atagatgcta gtttatacta cttgtataat    3000

ttgtttcact tgcagattca ctcttagcat ttgagtgttt ggatggccgt gttttgttca    3060

ttaagaaatg ttgacatgga tagtttgttg catggtaaat tggtgattaa taccttttta    3120

agcttctttt ggcaagttgt taaaaagtgt tttgttttaa tctctagtta atctaaaaat    3180

gcctacttat tttattttga ctttcaaaac ttgtctatat gccgagtata aaaaaaactt    3240

gtctatataa gttccttatg gaaaaaggac ctacaaaata atttaaaaat gctgaatttg    3300

ttaggaagtt tgacaacttt agacattaat aattgttttt ttttcatata tataattgac    3360

tttcaaaact tgtctatata ttataaattc gttatggaaa gggcgaccac acgtaaaacg    3420

taacatgcca atctctccct agtgaactgt tattctcatt cagtttttgt aagttcacct    3480

tcaaattttc aatttttttt ttgacaaaaa tatctttgat ggaacacgtt aggggtgtaa    3540

attcaccatt catcatttca ttcattatac acaatagtct ttcataatcc aatgaaaact    3600

tgtttttgtt gttatttttt tctgaaaaat ctttataaaa taaataaaaa catttttttg    3660

ttataaattt cagttgaaat acataaccat taattctaca gagtgttaat gttgatgtaa    3720

aataaaaaaa tattggatat caaacttaat gaacagaaca aaaattacaa aattgtacaa    3780

tttaaatgat aaaaaaccaa attcacaaaa ataaaaatta aggacgaaat ttgagaaatg    3840

ataattaaaa acgattaaaa atataattaa actaaaattt attatgtaat tctttaatat    3900

atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat ataataaaag ttttacatta    3960

taattttgaa atgaagtatt tgataaacga acaacccacc cttggggttg gtgagagtga    4020

aacggagaac agtgtctccc tcacttggtc ttctgagtcg agtcctattc atcaccaacc    4080

cactcgtcaa aattgttgta tgctatgtaa ccattttgtt ttttaataaa taaaagtgtt    4140

ttgttctgct atgcactccc catcaaatac catttacttt ttttttgtct tctatcaatt    4200

tctatttagt tcctagttgc tacaacttcc agctggtgaa aaatagtcaa cagagactac    4260

aatattctaa taaaatagaa taacaaaatc aaatatattc atttaatatg attttatttt    4320

tatttaattt aaaacatgaa ttatttgttt cttatttaat taccgtttcg ttcacttctc    4380

aattaataaa ataaaaaatt tctacaatta tagaaaaagt ttagttttgt agattgttaa    4440

cataaagatt tttcctatta actaattaat taaaagtcat cttatatata agttttaaag    4500

taattatctt atatatgtac ccaaaagttt taaagcaatt attataaaaa agtaaaattt    4560

tatcatatac aataatctat aattacatga aagtataatt tttaaattat taatacgtta    4620

aaattatttt tttaaaattt gaatgatcat atagtaattt tattttatac caagtcccaa    4680

catttcctat tttattccac ttttaccaat aaatttcctc ataaacactt ataagaaaaa    4740

aagtaagtaa agaataaaat aagcttttct ataaactata aacaaatttg tataaacttt    4800

cttatattag tttttctgaa aactaatttt aaattataca taaattgaat ttactgataa    4860

ttttttattt tctttttgta taagtgtttt ttaagaaatt tgttcaaaca tatttttatg    4920

acatgtcaat gcttgagaga tataaggtga gttaaatcat aaatgattaa agaaaaataa    4980

aagaagaaaa agataattaa tttaattttt tattaacatt ctaacaaatt aacattatat    5040

aaataaaaat aatatttcaa taattggatc aataatacta ttgttcttaa acaccaaacc    5100

aaccttccta aagtcctaat ctaatccaaa agccatcatt cattttcctt ggtaggtaaa    5160

gttccaaaac ctttaccaac cttttcactc aattattttg gtgtaagcaa ttcgacatgt    5220

gttagtgtta gttggcaacc aaaaacccct ttatgtgact cactcaatcc aacaacctct    5280

cacaccacca acccccccat aactcataag gccaaaacca tttctcacaa aacccttcat    5340

tacacacatt attatcatta tcacacacac aaaaaacctc tcatttcaaa gagagagaga    5400

gatttcacag accaaattgc agaggacgac aaagttcaca acttcaagga aaatcgaaat    5460

ggcccaagtg agcagagtgc acaatcttgc tcaaagcact caaattttyg gycattcttc    5520

caayyccaac aaacycaaat cggygaattc ggtttcattg aggccacgcc tttggggksc    5580

ctcaaaatct cgcatcyygr tgmayaaaam tggaagcytt atgggaaatt ttaatgyggg    5640

gaagggaaat tccggcrtgt ttaaggtttc tgcatcsgtc gccgccgccg cagagaagcc    5700

gtcaacgtcg ccggagatcg tgttggaacc catcaaagac ttctcgggta ccatcacatt    5760

gccagggtcy aagtctctgt ccaatcgaat tttgcttctt gctgctctct ctgaggtaaa    5820

gtttatttat ttatttattt ctgtatccaa aaatgtaaat tgttagtttg ttaatttttg    5880

ttagcagtga gagtcgaact acttggcttc tttcttagtc atccaaccaa ccttatatct    5940

ccaaaattta tttattggtt ttttttgggg ttatgtggtt aggaatagga gtttgatgcg    6000

tggagtggat tttgaatatt tgattttttt tttttttgta ttattcagtg aaaatgaagc    6060

atcttgtccc atgaaagaaa tggacacgaa attaagtggc gtatgattta gaatgatgat    6120

agaaatgtgt ataggtggtt ttaatgtgta gcaataagca tattcaatat ctggattgat    6180

ttggacgttt ctgtataaag gagtatgcta gcaatgtgtt aataatgtct tgttaaaagt    6240

atggatggct aaaataatca taaaaatcga gtgggagtag tatacatatc tacaggaaat    6300

gtattaggtg aggcatttgg cttctctatt gcgagtaagg aacaagtaat ctcagttaat    6360

gtgaaaatca atggttgata ttccaataca ttcatgatgt gttatttacg ggaacgcaat    6420

attgactgtt gattttatct gcagctgaga ttatatacta tatccttcca aagaaatctt    6480

tgactcttga ttatccaagt atggttgtat taccaatttt agctctagaa gataatccct    6540

cccccaaaac acaaattaga atggtgctgc aagttccgtg ttactttcat tctattattt    6600

ttataacttt taattattta atagatgtct tgtttggcat aaactataat ttattctgtt    6660

tttttttatt cttatttagg gaacaactgt tgtagacaac ttgytgtaya gygaggatat    6720

tcattacatg cttggtgcat taaggaccct tggactgcgt gtggaagayg acmaaacaac    6780

caaacaagca attgtkgaag gctgtggggg attgtttccc actaktaarg aatctaaaga    6840

tgaaatcaat ttattccttg gaaatgctgg tactgcratg cgtcctttga cagcagctgt    6900

rgttgctgca ggtggaaatg caaggtctgt tttttgtttt gtttgttcat catgatctct    6960

gaattgttcc tcgtataact aatcacatca gactatgtgt tcttcctcca tcctgttata    7020

atctaaaaat ctcatccaga ttagtcatcc ttctttaaat gaacctttaa ttatatctat    7080

gtatttattt aacatgtaaa ttagcttgtc aagtcaaagt ctagcatata gatatactga    7140

ttacactctg aggaatgcac ctgagggtct taatcatgat ctatttcaac cttgccactt    7200

tcttctttta ttattagatc acctatcatg attactggtt tgagtctcta aatagaccat    7260

cttgatgttc aaaatatttc agctacgtac ttgatggrgt gccccgaatg agagagaggc    7320

caattgggga tttggttgct ggtcttaagc arctyggtgc agatgttgat tgctttcttg    7380

gcacaaactg tccacctgtt cgtgtaaatg ggaagggagg acttcctggc ggaaaggtat    7440

ggtttggatt tccattagaa taaggtggac taactttcct ggagcaaaat tctaatttat    7500

accctgtttc cccctcttta gaataagaca ctaagggtat gtttaggagt tgggttttgg    7560

cgagaaaggg aagggagggc aatttttttt ctaataaata ttctttaatt tgataaattt    7620

tttaaacgaa ggaatatgaa gatagattag cataacttaa tgttttaatc ttttatttat    7680

ttttataaat attatatacc tctatttaaa aacaagatat ttttcctcca ttccctttcc    7740

ctttaaaacc tcagttccaa atataccgta cttgaattat attttggaag gtgtattggt    7800

tggagacctt tccttttcag aggttatccc tcacctttat tatagccttt ctactctctt    7860

aatgagttca ttgtgcattg agtcattgaa cttcctgtga aaagaaattg tttacttttc    7920

tttatttgtt acctacatcc ttattcctgt tttaaaaaat actaagtttt cttttagtta    7980

tgccttcccc tccttattct ctccaaagaa aatataatag cgaatgttgg tttatccatt    8040

gtgaatctta ttatcctatt tcacatgcag gtgaaactgt ctggatcagt tagcagtcaa    8100

tacytractg ctttgcttat ggcagctcct ttagctcttg gygatgtgga aattgagatt    8160

gttgataaac tgatttctgt tccatatgtt gaaatgactc tgaagttgat ggagcgtttt    8220

ggagtttctg tggaacacag tggtaattgg gatargttct tggtccatgg aggtcaaaag    8280

tacaagtagg tttctatgtt ttagcattac atcacttttt agtatccaaa atgcaatgaa    8340

atcaaaactc atgttttcta tcaggtctcc tggcaatgct tttgttgaag gtgatgcttc    8400

aagtgccagt tayttmctag ctggtgcagc arttactggt gggactatca ctgttaatgg    8460

ctgtggcaca agcagtttac aggtattcat gcttgacact attttctatt atcttttatt    8520

ttatggtcta tactgtatca ttcctaattc aacccccttc ttttctcttt cccctcactt    8580

ccaaaaaaat agagcttatc attgtattct taatagctct tgtatgtcct ttttcgtctc    8640

ttgagcagat tctaccgtga ttatcctttt tagtaaactt tttttttgtg tgtcttttaa    8700

ataattgata tcatcatatg aattcacaca tcatctctat cccttcctca ttttattata    8760

tttcattaac agtgataaag ataaaaataa attgtcaagt aaagcaagtt agcatgtcag    8820

ataatgatgc ttcaattgca aaattggtga aagcttgcac agtacattag ctttggtgac    8880

aattgtgatg tagatagcca taacctccca tgcaacttat tatgttgttt gcttaaactt    8940

cttttgcact taaacacgga ttagagagag tgaggatgaa caataataac agacacaaag    9000

cttagtttta taccacccgg cacccagtgg tgaagaccaa gcagtatgag tgagatcaat    9060

ggcagcatct gattgaagct tcttgtggta tttttggaga tgaaatccga ggcgaattag    9120

ggcatctggc tcaacaatag ccattggttc aaacttgctt ttaataaaat tgattacaga    9180

atcaaattct tgaggaagcc ttcaagaact acatcatgat gttccctgtg caaaacaggt    9240

tcaccgacaa aagagaacat ctacaagttc ctttacacat gccaaaaatt cctcaactga    9300

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atgattctgg aaatgagcat gaagtttttt cctaagctca taaaagtgaa tgcagccaag    9420

aaccctagat aggattgaat cggagagagg cttgaagcca agataacagc aactgatctt    9480

gctgttccca tgctgcgtag gactcattga ttctaccaag atcacaatct tctgtggtga    9540

gaaaatgagg gtgaattgtc aaccaataaa gaaaatggtg aaggctgagt cttgatgata    9600

ggcttgattt gcttgcgctg aagaagaacg ttattgttgt agagtttctc agtgattgta    9660

tgagagtaag ttacaggtgc gattggaggat gaggacttg tggtgggagg agggtaagtg    9720

ttaagtggtg gaatgcgtat cagaggtggt tgcccagcca aagaagctgg ttgcggtgga    9780

ggaggtggtg gtgcagtgga agccatgggt tttgatgctt ttgagagaaa acatacgaaa    9840

ctgaactgta aacttttgta ttattgatta gctgatttgg tagtacaaga gaggaatata    9900

tatacagttt taatgtaact acctaaccaa acatgaggaa ctctccatac acagaaagac    9960

gtatacaaag gataacagac aaacagaaac ttagatatac tcatacagag aagaattaca   10020

ggatgaatct gagaatttta attgggaaac tgaggaaaat agcaagggtt tcagaattca   10080

ttttgacgat aggcaaatca tggacttaac ttagacctca agggtacgct tgggagtggg   10140

ggtttttaga gggaaaaggg aaggagggca aacttttaat tcctaataaa tattctcttt   10200

tttgattttt ttttaaataa aacaaataaa cttatagatt agcatacact taatgtccta   10260

atcttttatt tatttgcatg agtttttttc ttttatattc tttctgtttc tgttttcttt   10320

cttcagtgtc tcttgtcttt ccttaattcc ttatcaatac cttgtttatt tttgaaaact   10380

taattttcct cattttttta acttataggc tatactatag tatgtataac tattcaaata   10440

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tcattttaga atacaaaatt agaagtggtt tgattagttt atacgaacga ttatttaaat   10620

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tgaaaacttc ttttgtggac aatttttctt ttatctatgg attgtggggc atctatgttg   11160

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tggttacatc atataatacc ttttttttca tatattattt ttcccatagt atatttttgt   11520

gttttttttt catacaatat tattctgaaa aaaacttgtt tcgttttttt cctggcttga   11580

atgctatttc aatgactggg ccttattatt ttctggttta ggttatacaa ctgtcctcca   11640

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ttgaatatgt tagaacatgg aaggcttaaa tatcttttta gtctttgcaa tttaacgttt   11760

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tttgtttttg agggcgagcc ctggtgcagc ggtaaagttg tgccttggtg acttgttggt   11880

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gaaattatgg tataaaacca ttcatatgtc ttcatctaat agcttaagct tttgggatag   12240

ttggttaaca atatggtatt agagtcttat gatttttagg tggtctttga gttcaatcct   12300

tgctgctccc agttctagtt aatttctttt tggtccactt caaataaaaa gttgaattta   12360

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gggggcatgt ttggaatata atatagaatc attcatgtgg tttcacctat caaggacaac   12480

tctagttttt gtcatacttg tattattaca gtgtctaaac tagacatgat ctttttccgg   12540

aaggaaattt aacttaaaag gaacttagat gcttcttgtt ctgtgatctt tatttgttta   12600

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tggactatct accatatcat ttagcaaact tgtttgctgc tcagattctc ctttggacta   12720

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gtcctgatta ctgtgtgatt actccacctg agaaattgaa tgtcacagct atagacacat   13020

atgatgacca cagaatggcc atggcattct ctcttgctgc ttgtggggat gttccagtaa   13080

ccatcaagga tcctggttgc accaggaaga catttccyga ctactttgaa gtccttgaga   13140

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cacaaaacag tgagtatatg catggcttgc ttttgtttct taacattccc ttgtaagaac   13260

ttgagataat ttgtattgtt ggaaagagct attgattctg ttgtatcaaa gtaatttaat   13320

ttccagtaca gacttggctc tattcctcat atgtggtggt gtacattgca tctttgcatt   13380

tgatcccatt tctattggga taggaccata cctttttttg tttattattc aagtcaaact   13440

tagcagataa tatgtggtga ccagaaaata gtctagctag caaatagacc tgtgattgca   13500

tgtttgaatt caggacttca ggacatttaa ttaatgagtg acaatgttaa aaagctcgcc   13560

aacaggagtt gacacatctg attgagtctt ctattaacac taactgtaac ttgagtttga   13620

ttatcagatt cctcctgttg gtaggtaata tgtaaatttc actatatatt taccgaggtt   13680

ggtggtctta cttgactttg aagaggtgag tgtaatttaa acttttatat caaaaaaaga   13740

ttgctaaaag cttgagtggc atgcaacaaa tagcaatgaa agaatgacta tggccttggg   13800

aaccaaatgg ccacgtacca cttttccacc aacttgagag ccctggtcct ggatgatgcc   13860

cctttttttt tttcatttct ttgacaataa agaaagttct tattcttggc aattgcaagt   13920

cgtttgtgga agtcacatga aattcaccat aggcttcatt gttcaaatcc tttagtcact   13980

aactaaaggc tggacctatg caagaatttt ggctactctt ataaatgctg tgcggcaaag   14040

actacggaaa aatataaatt attgcatatc tagaggtgag gttcattgct cccatccatt   14100

tttccaagaa ctaaaatata tataaattat taatatgata ttacattgaa aaataatatt   14160

tttcttttaa atatgtgatc ataagtttaa ttttaagtct attcatacga aaaaaatatt   14220

tattagaaaa gattaattta ttaaatggat ctcaatattt taagaaatta acttttagct   14280

ctcaaccaac agatgatttg agttaaaaaa atgtatatat aaactattgc atatctgctg   14340

atttttgttt gtaacaccaa taagtgggca ttttactaaa tccatgtgac aatgtactga   14400

atgttttaga atacagtctg gtttgataat aaaacgtgca taaagtccag cttatgttaa   14460

ctcttaattc atggaaaatg atgatatgcg aattgaaaga aagaaaacca taatgtaagt   14520

gcagttttct ctctcttttt taatattatt caatatcaga ttgcacatgg gaaggggtat   14580

tggctcatgt gggatattag tttttgtccc ttacctaaaa agagagaaag agaaaaataa   14640

caatttaaaa agagtaccac cgctaccacc tttttcgctt ttaaattttt gttctgtttt   14700

cactactctt tcatgcgttg tttgttggct tctgatagtg acgaatatga tataatgatt   14760

ttatgttggg aaaaaagtgc catgtaaatt ctagagattg aaattttagc atcaaattat   14820

ttattttatc accttttaaa atttgttgca tgtgaaagaa tttgaagctc tccaacaagg   14880

aaataacact tcaatcctta gagtcatcct ctagatccca aaagaatgtg atgtttatac   14940

acattagtat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat   15000

atatatatat agggtttata ttatattaat gagtgatgta cgaggacggt ggtgacacta   15060

tatggccaaa acaagtgtaa tataattatt tttttttctc aagtattact ctatccttga   15120

atattattag tcttaaatct tcaagcacct tgtgaacgaa gcaatcttgt cc           15172

<210>37

<211>522

<212>DNA

<213>增强子

<400>37

aagcttcccg ggccggccgc agctggcttg tggggaccag acaaaaaagg aatggtgcag      60

aattgttagg cgcacctacc aaaagcatct ttgcctttat tgcaaagata aagcagattc     120

ctctagtaca agtggggaac aaaataacgt ggaaaagagc tgtcctgaca gcccactcac     180

taatgcgtat gacgaacgca gtgacgacca caaaactcga gacttttcaa caaagggtaa     240

tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag     300

tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg     360

aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg     420

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg     480

acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcttaatt aa                        522

<210>38

<211>552

<212>DNA

<213>增强子

<400>38

aagcttcccg ggccggccgc agctggcttg tggggaccag acaaaaaagg aatggtgcag      60

aattgttagg cgcacctacc aaaagcatct ttgcctttat tgcaaagata aagcagattc     120

ctctagtaca agtggggaac aaaataacgt ggaaaagagc tgtcctgaca gcccactcac     180

taatgcgtat gacgaacgca gtgacgacca caaaactcga gaacatggtg gagcacgaca     240

cacttgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccagagg gctattgaga     300

cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc     360

acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag atggcttcta caaatgccat cattgcgata     420

aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctcta ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac     480

ccacgaggaa catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt     540

gatgttaatt aa                                                         552

<210>39

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>39

ctgcagggat cctggttgca ccaggaag                                         28

<210>40

<211>29

<212>DNA

<213>引物

<400>40

gaattcccgg gtatggtgaa tttcatgtg                                        29

<210>41

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>41

gacttctcgg gtaccatcac attgc                                            25

<210>42

<211>55

<212>DNA

<213>引物

<400>42

cacctgcagc aaccacagct gctgtcaaag aacgcattgc aataccagca tttcc           55

<210>43

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>43

aatttaatta attcataaat atgttac                                          27

<210>44

<211>73

<212>DNA

<213>引物

<400>44

ggtcttctcc ttcttagttc tcaactactt gttcttctgc tgccagattt caattttcct      60

taaagttgtg aac                                                         73

<210>45

<211>72

<212>DNA

<213>引物

<400>45

atctggcagc agaagaacaa gtagttgaga actaagaagg agaagaccat ggcccaagtg      60

agcagagtgc ac                                                          72

<210>46

<211>24

<212>DNA

<213>引物

<400>46

ggcaatgtga tggatcccga gaag                                             24

<210>47

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>47

gcgccatggc ggcatcggtt tccaggg                                          27

<210>48

<211>33

<212>DNA

<213>引物

<400>48

gcgggtacct cagacaagca cctgagctgc agc                                   33

<210>49

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>49

gcggcatgcc caacaatggc tcgtc                                            25

<210>50

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>50

gcggatcctt atttcttcag ttcagcca                                         28

<210>51

<211>9

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X为不是S或T的任意氨基酸

<400>51

Ala Leu Leu Met Xaa Ala Pro Leu Ala

1               5

<210>52

<211>8

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X为不是V的任意氨基酸

<400>52

Glu Ile Glu Ile Xaa Asp Lys Leu

1               5

<210>53

<211>7

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X为V或I

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X为K或S

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X为不是V的任意氨基酸

<400>53

Phe Gly Xaa Xaa Xaa Glu His

1               5

<210>54

<211>7

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X为K或R

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X为不是R的任意氨基酸

<400>54

Ala Leu Xaa Xaa Leu Gly Leu

1               5

<210>55

<211>15

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X为任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>X为任意氨基酸，但不是T(和/或位置9上的氨基酸不为E)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X为任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X为不是E的任意氨基酸(和/或位置6上的氨基酸为不是T的

     任意氨基酸)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(10)..(12)

<223>X为任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(14)..(14)

<223>X为I或V

<400>55

Gly Leu Xaa Val Glu Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Val

1               5                   10                  15

<210>56

<211>9

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(5)..(5)

<223>X为不是K的任意氨基酸(和/或位置9上的氨基酸为不是T的任意氨基酸)

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X为L或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X为K或N

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(9)

<223>X为不是T的任意氨基酸(和/或位置5上的氨基酸为不是K的任意氨基酸)

<400>56

Ile Thr Pro Pro Xaa Lys Xaa Xaa Xaa

1               5

<210>57

<211>8

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(3)

<223>X为不是N或L的任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X为D或N

<400>57

Thr Ile Xaa Xaa Pro Gly Cys Thr

1               5

<210>58

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为D或N

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(4)..(4)

<223>X为任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(7)..(7)

<223>X为任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X为不是R的任意氨基 酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(9)..(10)

<223>X为任意氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为K或R

<400>58

Xaa Tyr Phe Xaa Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His

1               5                   10

<210>59

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为I或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X为I或L或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为V或A或T

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X为S或G

<400>59

Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Xaa

1               5                   10

<210>60

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为I或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X为I或L或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为V或A或T

<400>60

Xaa Val Val Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Glu

1               5                   10

<210>61

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为I或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X为I或L或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为V或A或T

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X为S或G

<400>61

Xaa Val Val Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Xaa

1               5                   10

<210>62

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为I或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为V或A或T

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X为S或G

<400>62

Xaa Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Xaa Xaa

1               5                   10

<210>63

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为I或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为V或A或T

<400>63

Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Xaa Glu

1               5                   10

<210>64

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为I或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(8)

<223>X为I或L或Q

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为V或A或T

<400>64

Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Xaa Phe Pro Xaa Glu

1               5                   10

<210>65

<211>12

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(1)

<223>X为I或V

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(11)

<223>X为V或A或T

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(12)..(12)

<223>X为S或G

<400>65

Xaa Val Glu Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro Xaa Xaa

1               5                   10

<210>66

<211>10

<212>PRT

<213>基元

<400>66

Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu

1               5                   10

<210>67

<211>10

<212>PRT

<213>基元

<400>67

Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu

1               5                   10

<210>68

<211>18

<212>PRT

<213>基元

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>X为A或V

<400>68

Lys Xaa Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys Gly Gly Lys Phe Pro

1               5                   10                  15

Val Glu

<210>69

<211>14

<212>PRT

<213>基元

<400>69

Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val

1               5                   10

<210>70

<211>14

<212>PRT

<213>基元

<400>70

Gly Asn Ala Gly Ile Ala Met Arg Ser Leu Thr Ala Ala Val

1               5                   10