[0001] 本
发明涉及一种新的黄瓜植物，该黄瓜植物产生具有更深绿
颜色的果实，这种更深绿颜色是延长的耐贮性的一部分。本发明还涉及表型和/或分子标记，以在植物早期阶段预测更深绿的颜色。
[0002] 增加黄瓜的耐贮性通常是黄瓜育种的主要目标之一。耐贮性，或贮存期限，由多个方面组成，最重要的一方面是果实颜色。果实颜色作为延长的耐贮性的一个方面，又可以再分为两个部分：初始果实颜色，以及在较长的时间内持绿的能
力。这两个部分都在很大程度上受到黄瓜植物的遗传背景的影响，但环境影响也具有一定作用。
[0003] 在育种过程中，只能在成株期，在果实
收获之后从表型上观察初始果实颜色。因此基于改良的初始果实颜色来培育具有提高的耐贮性的黄瓜是耗时的，因为育种周期长，并且需要许多代来确保该性状的传递。在培育具有较长贮存期限(即增加黄瓜果实贮存天数)同时保持其颜色适合于食用上的进展缓慢。
[0004] 从商业的
角度来说，黄瓜果实贮存期间果实颜色的改良是合乎需要的。在收获后采取各种措施以减少黄瓜果实的变质，例如收缩
包装或涂蜡。从环境意识的角度来说，收缩包装是不合乎需要的，因为它会导致额外的废料。收缩包装和涂蜡都还需要对果实进行额外的处理，这增加成本并可能导致表面损伤。这些措施所需要的额外的材料也增加了成本。
[0005] 在获得本发明的研究过程中，创造了一种新的黄瓜植物，该黄瓜植物的果实具有更深的初始果实颜色，这种更深的果实颜色可以在植物早期阶段通过分子标记从表型和/或遗传学上进行预测。更深的果实颜色可以作为延长的耐贮性的一部分。
[0006] 本发明的一个目的是提供黄瓜植物，所述黄瓜植物产生具有延长的耐贮性的果实。
[0007] 本发明的一个目的是提供黄瓜植物(黄瓜(Cucumis sativus)，所述黄瓜植物携带导致更深绿色果实的遗传决
定子(genetic determinant)。
[0008] 本发明的进一步的目的是提供表型标记，以在苗期
鉴别携带本发明遗传决定子的黄瓜植物。
[0009] 本发明的一个目的是提供分子标记以鉴别本发明的遗传决定子。
[0010] 因此，本发明提供黄瓜(Cucumis sativus)种的黄瓜植物，其携带遗传决定子，与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，所述遗传决定子导致在苗期有更深绿色的茎，这预示果实为更深的绿色，所述遗传决定子包含在黄瓜植物中，其代表性
种子保藏在NCIMB，保藏号为NCIMB 41859。
[0011] 在一个实施方案中，与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，导致在苗期有更深绿色茎的遗传决定子是从包含所述遗传决定子的黄瓜植物基因渗入的，其代表性种子保藏在NCIMB，保藏号为NCIMB 41859，其中在苗期有更深绿色茎预示果实为更深的绿色。
[0012] 在获得本发明的研究过程中，创造了一种新的黄瓜(Cucumis sativus)植物。新的黄瓜植物的苗茎富含叶绿素，其在萌芽后一周内已经可以观察到。可以进行目测观察，因为茎是非常深的绿色，或者可以测量茎中的叶绿素含量。在植物后期，叶茎和果实茎也表现出深绿色和/或叶绿素含量提高。在果实采收期，果实颜色是非常深的绿色。此外，在收获之后，果实具有提高的保存或耐贮存品质。与在相同条件下生长的同基因型黄瓜植物相比，本发明植物的所有上述提及的部分颜色更深和/或叶绿素含量更高，所述同基因型黄瓜植物在遗传上是相同的，但不携带本发明的遗传决定子。
[0013] 本发明的性状由单基因显性或者至少不完全显性遗传决定子决定。因此，遗传决定子可以以纯合或杂合状态存在，导致本发明的表型性状。携带本发明遗传决定子的果实与没有携带所述遗传决定子的同基因型植物的黄瓜果实相比，表现出更深的绿色。
[0014] 在一个实施方案中，所述遗传决定子与黄瓜植物中的多态性分子AFLP标记E13/M51-143.48和/或E13/M51-154.68和/或E16/M60-086.74的任一个连
锁，其代表性种子保藏在NCIMB，保藏号为NCIMB41859。
[0015] 本发明还涉及包含本发明的遗传决定子的黄瓜植物，其中所述遗传决定子与分子标记E13/M51-143.48和/或E13/M51-154.68和/或E16/M60-086.74的任一个连锁。
[0016] 本发明的黄瓜植物可以通过将第一种黄瓜植物和第二种黄瓜植物杂交获得，其中至少一种所述植物是由保藏在NCIMB且保藏号为NCIMB 41859的代表性样品的种子生长而成，或者是其后代植物，任选地将得到的F1自交，并选择具有一个或多个下述特征的植物：
[0017] a)与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物的苗茎相比，它们在苗期具有更深绿色的茎，所述更深绿色的茎预示与没有携带所述遗传决定子并处于相同条件下的同基因型黄瓜植物果实相比，在收获期会产生具有更深绿色的果实，和/或
[0018] b)与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物的苗茎中的叶绿素含量相比，它们在苗期茎中的叶绿素含量提高，其中叶绿素含量的提高预示与没有携带所述遗传决定子并处于相同条件下的同基因型黄瓜植物果实相比，在收获期会产生更深绿色的果实。
[0019] 因此，用于获得本发明的黄瓜植物的第一种和第二种黄瓜植物的任一个或二者携带有导致苗期更深绿色茎的遗传决定子，苗期更深绿色茎预示果实的更深绿色。
[0020] 在保藏的种子中，遗传决定子与分子标记E13/M51-143.48和/或E13/M51-154.68和/或E16/M60-086.74的任一个连锁。该标记还可以与包含在作为亲本进行杂交以将深色茎表型转移到其它植物的任一种或两种黄瓜植物中的遗传决定子连锁，但是只要存在能引起所述表型的遗传决定子，至少一个所提及的标记的存在不是必要的。而且，当其中存在决定所述表型的遗传决定子、但不再存在所述标记的时候，如本文所述的表现出深色茎表型的本发明的植物仍然是本发明的植物。
[0021] 显然提供导致本发明性状的遗传决定子的亲本无需是由保藏种子直接生长而成的植物。亲本还可以是来自保藏种子的后代植物，通过例如自交或杂交获得，或者来自被鉴别已通过其他方式获得了导致本发明性状的遗传决定子的种子的后代植物。
[0022] 根据进一步的方面，本发明提供如本文所定义的遗传决定子，所述遗传决定子选自包含下列各项的组：基因、等位基因、基因构建体、QTL、启动子、分离的基因、转基因、DNA序列。
[0023] 可以基于下述选择特征鉴别本发明的植物：
[0024] a)与在相同条件下生长和贮存的没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物的果实相比，它们产生在收获期和收获之后达14天，优选达17天、更优选达19天、最优选达21天的贮存期间具有更深绿颜色的果实，和/或
[0025] b)与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物的苗茎相比，它们在苗期具有更深绿色的茎，和/或
[0026] c)与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物的苗茎相比，它们在苗期茎中的叶绿素含量提高。
[0027] 在优选的实施方案中，所选择的植物中一个或多个特征的发生与分子标记E13/M51-143.48和/或E13/M51-154.68和/或E16/M60-086.74的任一个遗传连锁。
[0028] 在本发明的黄瓜植物中，与在相同条件下生长和贮存的没有携带所述遗传决定子的苗期同基因型黄瓜植物的茎中的叶绿素含量相比，苗期植物茎中的叶绿素含量至少高，按优先级增加的顺序，40μg/g、70μg/g、100μg/g、120μg/g、150μg/g、180μg/g、200μg/g。
[0029] 携带有本发明的遗传决定子的黄瓜苗的茎中的叶绿素含量优选高于140μg/g。苗茎中的叶绿素含量适宜地不高于1000μg/g。
[0030] 在本发明的黄瓜植物中，与在相同条件下生长和贮存的没有携带所述遗传决定子的苗期同基因型黄瓜植物的茎中的叶绿素含量相比，苗期植物茎中的叶绿素含量至少，按优先级增加的顺序，高30％、高60％、高90％、高120％、高150％、高180％、高200％、高230％、高270％、高300％。
[0031] 本发明的黄瓜植物的苗的更深绿色茎还可以进行目测评分。在1-5的量度上，本发明的黄瓜植物的苗茎比没有携带本发明遗传决定子的苗期同基因型黄瓜植物的茎的颜色至少深1级，优选至少深2级。为了比较茎的颜色，或者比较叶绿素含量，使苗在相同的条件下生长是必要的。
[0032]
播种后21天对茎颜色的目测比较以图示的方式显示在图1中。根据英国皇家
园艺学会(Royal Horticultural Society)的比色卡确定图1中所示的苗茎的实际颜色是：正常茎为137B，深色茎为N137A。但是，本发明的植物无需精确地为颜色N137A。本发明植物的颜色与没有遗传决定子的同基因型植物的颜色的差别与137B和N137A之间的差别的程度必须是相同或相似的。两种颜色的RGB、CIELab和CIELCh值列在下述表1中。
[0033] 表1
[0034] 颜色值比较
[0035]
[0036] 本发明植物与没有遗传决定子的同基因型植物的苗的叶绿素含量的测量和比较可以在图2中找到。
[0037] 在一周龄的
幼苗中视情况已经可以观察到更深绿色的苗茎，其
中子叶下面的下胚轴表现出更深色的茎。优选在2-3周龄的幼苗中对茎颜色和叶绿素含量进行比较，其中子叶之上的茎也表现出更深的颜色和/或叶绿素含量的增加。
[0038] 在黄瓜植物的整个生长周期中，茎保持更深的颜色，而且目测
叶片的茎以及后来的果实上的茎也比没有本发明的遗传决定子的黄瓜植物颜色更深。
[0039] 在一个实施方案中，本发明涉及携带本发明的遗传决定子的黄瓜植物，所述遗传决定子导致在苗期具有更深绿色的茎和/或叶绿素含量提高，其中由所述植物产生的果实的绿色比在相同条件下生长并贮存的没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物的果实颜色深至少2级，优选至少3级，按照1-9的量度。在收获期测定果实的颜色。
[0040] 在优选的实施方案中，当与没有携带所述遗传决定子、并在相同条件下生长和贮存的同基因型黄瓜植物的果实相比较时，果实的颜色从收获期直至贮存至少14天，优选直至贮存至少17天，更优选贮存至少19天，最优选贮存至少21天，一直保持深至少2级，优选深至少3级，按照1-9的量度(表3，图3)。
[0041] 在通常的收获期收获黄瓜果实之后，优选将黄瓜贮存在
气候室中。可以使用1-9的颜色量度目测确定果实的颜色差异。如本文所使用的，得分为1是最深绿色的果实颜色，得分为9是非常浅的或者黄色的果实颜色。
[0042] 颜色类别逐渐改变并进行如下说明：1.极度深的绿；2.非常深的绿；3.深绿；4.绿；5.中等绿；6.浅绿；7.有黄化的最初征兆的浅绿；8.部分黄化；9.黄色。按照此量度，标准欧洲
温室黄瓜种类具有评分为大约4或5的颜色。其它黄瓜种类的初始颜色可能评分高一点(较浅)或低一点(较深)。本发明的黄瓜果实优选具有大约3的评分，更优选具有大约2的评分，最优选具有1和2之间的评分。
[0043] 任选地可以使用另一种量度，例如1-5的量度，其中颜色差别至少是1级，优选至少1.5级。得分1-5为上述1-9量度中的得分1、3、5、7和9。
[0044] 导致在苗期具有更深绿色茎和/或叶绿素含量提高的遗传决定子优选还导致果实外皮叶绿素含量的提高。更深绿色茎可以作为更深色果实性状的标志，并允许早期鉴别携带有导致这种更深绿色果实的遗传决定子的植物。
[0045] 在一个实施方案中，本发明的黄瓜植物具有更深绿色的果实，其与果实外皮中叶绿素含量的提高有关，所述叶绿素含量与没有携带所述遗传决定子并在相同条件下生长和任选地贮存的同基因型黄瓜植物的果实相比，提高至少，按优先级增加的顺序，100μg/g、130μg/g、160μg/g、200μg/g、240μg/g。果实外皮叶绿素含量适宜地在收获期进行比较。
[0046] 在一个实施方案中，本发明涉及携带本发明遗传决定子的黄瓜植物，其中本发明植物的果实的更深的绿色与果实外皮中叶绿素含量的提高有关，所述叶绿素含量与没有携带所述遗传决定子并在相同条件下生长和任选地贮存的同基因型黄瓜植物的果实相比，提高至少，按优先级增加的顺序，30％、40％、50％、60％、70％(表4，图4)。果实外皮叶绿素含量适宜地在收获期进行比较。本发明的黄瓜果实外皮的总叶绿素含量适宜地不高于1000μg/g。
[0047] 在黄瓜果实的贮存过程中，果实外皮中的叶绿素含量随时间而降低。在至少14天的贮存过程中，优选直至至少21天的贮存过程中，与没有携带本发明遗传决定子的同基因型黄瓜果实相比，本发明果实外皮中的叶绿素含量显著保持更高。本文所提及的贮存适宜地是在17℃进行。
[0048] 本发明进一步涉及所
请求保护的黄瓜植物的细胞。这种细胞可以是分离的形式，或者可以是完整黄瓜植物的一部分或其多个部分，并且随后仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞在其基因组成中包含遗传信息，所述遗传信息导致定义了本发明黄瓜植物的特征。本发明的黄瓜植物的每一个细胞都携带所述遗传信息，即遗传决定子，其导致所述性状的表型表现。本发明的这种细胞还可以是可再生细胞，其可用于再生本发明的新的黄瓜植物。在本
申请的上下文中，“本发明”是指携带遗传决定子，所述遗传决定子导致苗期更深绿色茎和更深绿色的果实的表达。更深的绿色有助于更好的耐贮性。
[0049] 本发明还涉及请求保护的植物的组织。所述组织可以是未分化的组织或者已经分化的组织。未分化的组织是例如茎尖、花药、花瓣、花粉，并可用于微繁殖，以获得新的小植株，生长成为本发明的新的植物。所述组织也可以由本发明的细胞生长而来。
[0050] 根据进一步的方面，本发明涉及所请求保护的植物的种子。虽然种子不表现出本发明的黄瓜植物的遗传性状，但它们具有所述遗传信息，即遗传决定子，当植物是由这些种子生长而来的时候，所述遗传信息使得该植物是本发明的植物。
[0051] 本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织和种子的后代。这种后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。
[0052] 本文所使用的词语“后代”是指与包含遗传决定子的本发明的植物杂交得到的第一代和所有更远的后代，所述遗传决定子导致与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期有更深绿色的茎，其预示果实为更深的绿色。本发明的后代是与携带遗传决定子的本发明的植物的任何杂交的后代，所述遗传决定子导致在苗期有更深绿色的茎，其预示果实为更深的绿色。
[0053] “后代”还包括携带遗传决定子的植物，所述遗传决定子导致与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期有更深绿色的茎，其预示果实为更深的绿色，并且“后代”是从其它植物或本发明的植物后代通过
营养繁殖或增殖获得。
[0054] 因此，本发明进一步涉及所请求保护的植物的种子以及适合于有性繁殖的植物部分。这种部分例如选自由小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞组成的组。此外，本发明涉及适合于营养繁殖的植物部分，具体为扦插条、根、茎、细胞、和原生质体。上述提及的植物部分被视为是繁殖材料。
[0055] 根据进一步的方面，本发明涉及所请求保护植物的组织培养物，其也是繁殖材料。组织培养物包含可再生细胞。这种组织培养物可以是选自或来源于植物的任何部分，具体来自叶片、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎。组织培养物可以再生为携带本发明遗传决定子的植株。适宜地，再生植株与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，表达在苗期为更深绿色茎的表型，该表型预示果实为更深的绿色。
[0056] 本发明黄瓜植物的同基因型黄瓜植物可以通过与已接受了本发明遗传决定子的亲本进行一次或多次回交获得。在多次回交之后，得到的植物的基因组成与起始植物的基因组成基本相同，除了基因渗入的本发明的性状之外。那么，本发明的植物和起始植物是同基因型的。在同基因型植物之间进行颜色比较，以避免其它基因对颜色的任何潜在影响。
[0057] 本发明特别可用于所谓的长黄瓜(long cucumber)种类和欧洲温室黄瓜(European greenhouse cucumber)种类。
[0058] 本发明进一步涉及杂交种子和产生杂交种子的方法，包括使第一种亲本植物与第二种亲本植物杂交并收获得到的杂交种子，其中所述第一种亲本植物和/或第二种亲本植物具有本发明的遗传决定子。当亲本以纯合形式具有本发明的遗传决定子时，得到的杂交植物也是所请求保护的植物。
[0059] 在一个实施方案中，本发明涉及携带本发明遗传决定子的本发明的黄瓜植物，所述遗传决定子导致与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期有更深绿色的茎，其预示果实为更深的绿色，并且所述黄瓜植物通过传统育种，或基因修饰，特别是通过同源转基因或转基因的方式，从合适的来源引入负责该性状的遗传信息来获得所述决定子。同源转基因(cisgenesis)是使用来自于作物植物本身或来自于性相容的供体植物的编码(农业)性状的天然基因对植物进行基因修饰。转基因是用来自于非可交配物种的基因或合成基因对植物进行基因修饰。
[0060] 在一个实施方案中，用于获得本发明的遗传决定子的来源由植物生成，所述植物是保藏号为NCIMB 41859的代表性样品的种子生长而成的，或者是由保藏的种子NCIMB 41859生长而成的，或者来自于其营养繁殖或有性繁殖后代，或者来自于包含导致本发明性状的遗传决定子的另一个来源，或者来自这些来源的组合。
[0061] 在优选的实施方案中，本发明涉及非转基因黄瓜(Cucumis sativus)植物。用于获得本发明的遗传决定子的来源，其目的是获得具有预示着果实为更深绿色的更深绿色茎的本发明的植物，适宜地是携带有NCIMB 41859中包含的遗传决定子的黄瓜(Cucumis sativus)植物，或者是携带有所述基因并能够与黄瓜(Cucumis sativus)杂交的黄瓜属(Cucumis species)的植物。任选地，与近缘物种杂交后，可以进行例如胚胎拯救、回交的技术，或者技术人员已知的其他技术以获得种间杂交的种子，所述种子可以作为源以进一步培育非转基因黄瓜(Cucumis sativus)植物，所述非转基因黄瓜(Cucumis sativus)植物与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期表现出更深绿色茎，所述更深绿色茎预示果实为更深的绿色。
[0062] 本发明还涉及本发明植物的种质。种质由
生物体的所有遗传特征组成，根据本发明，种质包括至少本发明的性状。可以在育种程序中使用种质，以培育与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，具有更深绿色茎的黄瓜植物，所述更深绿色茎预示果实为更深的绿色。在育种中使用导致更深绿色茎和更深绿色果实的遗传决定子的种质也是本发明的一部分。
[0063] 本发明还涉及导致本发明性状的遗传决定子的应用，其中遗传决定子与分子标记E13/M51-143.48和/或E13/M51-154.68和/或E16/M60-086.74的任一个遗传连锁，以培育与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期表现出更深绿色茎的黄瓜植物，所述更深绿色茎预示果实为更深的绿色。
[0064] 本发明还涉及由本发明植物产生的黄瓜果实。本发明进一步涉及食品，包含所请求保护的黄瓜植物的果实，或其部分。本发明还涉及加工形式的食品。
[0065] 在一个方面，本发明涉及产生黄瓜植物的方法，所述黄瓜植物包含遗传决定子，所述遗传决定子导致与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期表现出更深绿色茎，所述更深绿色茎预示果实为更深的绿色，所述方法包括：
[0066] a)使包含本发明遗传决定子的植物，该植物的代表性种子保藏号为NCIMB 41859，与不包含所述遗传决定子的植物杂交，获得F1群体；
[0067] b)任选地将来自F1的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交；
[0068] c)选择包含所述遗传决定子的植物，所述遗传决定子导致与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期表现出预示着果实为更深绿色的更深绿色茎，适宜地通过使用与所述遗传决定子连锁的分子标记进行选择。还可以通过目测检查幼苗茎比不包含本发明遗传决定子的亲本植物具有更深的绿色来选择植物。
[0069] 本发明另外提供将另一种所需的性状引入包含本发明性状的黄瓜植物的方法，包括：
[0070] a)使包含遗传决定子的黄瓜植物与包含另一种所需性状的第二种黄瓜植物杂交，所述遗传决定子导致与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期具有更深绿色茎，所述更深绿色茎预示果实为更深的绿色，其代表性种子保藏在NCIMB，保藏号为NCIMB41859；
[0071] b)选择包含本发明性状的遗传决定子和所需性状的遗传决定子的F1后代；
[0072] c)使所选择的F1后代与任一亲本杂交，产生回交后代；
[0073] d)选择包含所需性状的遗传决定子和本发明性状的遗传决定子的回交后代；以及[0074] e)任选地重复步骤c)和d)一次或多次，之后产生所选择的包含所需性状和本发明性状的第四代或第五代回交后代。本发明包括由这种方法生产的黄瓜植物以及由此获得的黄瓜果实。
[0075] 任选地，在任何一次杂交或回交步骤之后进行自交步骤。或者可以在本发明的任何一次杂交或自交步骤之后选择包含本发明遗传决定子和所需性状的植物。
[0076] 在一个实施方案中，纯合或杂合地包含所述遗传决定子的本发明的植物是自交系、杂交、双单倍体、或分离群体植物。
[0077] 本发明进一步提供产生包含如本发明所定义的更深绿色茎的黄瓜植物的方法，所述方法通过使用双单倍体产生技术以产生纯合地包含导致更深绿色茎的遗传决定子的双单倍体系，所述双单倍体系可以与缺乏所述遗传决定子的系杂交以产生杂合地包含所述遗传决定子的本发明的植物。
[0078] 本发明还涉及产生包含导致本发明的更深绿色茎的遗传决定子的黄瓜植物的方法，所述方法通过使用在其基因组中包含导致本发明的更深绿色茎的遗传决定子的种子，以培养所述黄瓜植物。所述种子适宜地是保藏在NCIMB的保藏号为NCIMB 41859的代表性样品的种子。
[0079] 本发明还涉及产生种子的方法，包括培养包含本发明的遗传决定子的黄瓜植物，所述遗传决定子导致本发明的表型性状，使植物产生种子，并收获那些种子。种子的产生适宜地通过杂交或自交进行。
[0080] 在一个实施方案中，本发明涉及通过使用组织培养物产生黄瓜植物的方法，所述黄瓜植物包含更深绿色茎，所述更深绿色茎预示更深绿的果实颜色。本发明进一步涉及通过营养繁殖产生包含本发明的深绿色茎的黄瓜植物的方法。
[0081] 在一个实施方案中，本发明涉及产生包含深绿色茎的黄瓜植物的方法，所述方法通过使用基因修饰的方法将本发明的遗传决定子引入黄瓜植物，所述遗传决定子导致与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期有更深绿色茎，所述更深绿色茎预示果实为更深的绿色。
[0082] 本发明优选提供黄瓜植物，所述黄瓜植物与没有携带所述遗传决定子的同基因型黄瓜植物相比，在苗期显示出更深绿色茎，所述更深绿色茎预示果实为更深的绿色。
[0083] 本发明还涉及产生黄瓜果实的方法，包括培养如本文所述的具有更深绿色茎的黄瓜植物，并使它们产生黄瓜果实，并任选地收获所述果实。
[0084] 本文中使用的术语“遗传决定子(genetic determinant)”和“遗传决定子(genetic determinants)”包含一个或多个QTLs、基因、或等位基因。这些术语可以互换使用。
[0085] 可以通过使用分子标记来鉴别遗传决定子。可以通过在基因图谱上进行
定位，或者通过指出其在连锁群或
染色体上的
位置来鉴别遗传决定子。当遗传决定子不再与特定的分子标记连锁时，它在染色体上的位置，如基因图谱上所定义的，并不改变，该遗传决定子与它和分子标记连锁时仍然是相同的。因此，它所导致的遗传性状也仍然是相同的。
[0086] “遗传性状”是由遗传决定子赋予的性状或特征。遗传性状可以通过表型来鉴别，例如进行生物测定。但是，无法进行表型测定的植物阶段也会携带导致遗传性状的遗传信息。可以使用“性状”或“表型性状”而不是“遗传性状”。
[0087] 在不存在分子标记时，或者在遗传决定子和所述标记发生重组，使得所述标记不再具有预测性的情况下，可以通过等位性测试来确定遗传决定子的等同性。为了进行等位性测试，将对于已知的本发明的决定子为纯合的测试植物与对于其遗传决定子也是纯合的待测材料进行杂交，当在杂交的F2中不存在所要观察的性状的分离时，证明遗传决定子是等同或是相同的。
[0088] 当多于一种基因负责某一性状时，进行等位性测试来确定等同性，进行测试的技术人员必须确保所有的相关基因都是以纯合方式存在的，以使得测试正确地起作用。
[0089] 保藏
[0090] 包含本发明的遗传决定子和表型性状的黄瓜(Cucumis sativus)EX5004的种子于2011年8月31日保藏在NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,UK，保藏号为NCIMB 41859。
[0091] 保藏的种子不符合获得植物新品种保护所要求的DUS标准，因此，不能被视为是植物新品种。
[0092] 本发明在下述的
实施例中进行进一步说明。
[0093] 标记信息
[0094] 用于AFLP标记的引物是标准化的，其结合的序列可以在例如下述
网站找到：ttp://wheat.pw.usda.gov/ggpages/keygeneAFLPs.html。
[0096] 图1：黄瓜深色茎和正常茎的比较照片。植物11AF.873具有正常茎；植物11AF.874具有深色茎，以及植物11AF.875是杂交的F1(深色茎x正常茎)。
[0097] 图2：黄瓜苗茎中的叶绿素测定
[0098] 图3：收获时和贮存后的平均黄瓜果实颜色
[0099] 图4：收获时和贮存后外皮中的叶绿素含量实施例
[0100] 实施例1
[0101] 本发明的表型特征
[0102] 为了获得具有提高的耐贮性的黄瓜果实，一个方面是改良果实的颜色，其中更深绿色的果实颜色是有利的。然而，这是育种中要达到的一个复杂目标。
[0103] 在黄瓜育种程序的种质中，培育出了一种植物，在发芽后已经过了几天之后还表现出不寻常的深色苗茎。在随后对植物的培育过程中监测该表型性状。随后的植物茎，包括主茎，和叶的茎、或叶柄以及后来果实的茎，看来都显示出不寻常的深色。
[0104] 决定研究深绿色茎是否存在与果实颜色相关潜在的益处，预期其与叶绿素含量的提高有关联。令人惊讶地，发现表现出更深绿色的茎颜色的植物也会具有更深绿色的果实颜色。之前从未发现在黄瓜的果实和茎的颜色之间有关联。
[0105] 将包含更深绿色茎颜色的植物与具有正常茎颜色的植物进行杂交，以观察遗传。清楚的是，F1也表现出更深的茎颜色，其证明了该性状的表型的显性遗传(图1)。还比较了所述植物的果实，更深绿色的果实颜色的遗传也证明是显性的。
[0106] 在F1植物自交之后，来自F2和后代的隔离数据与该性状存在单性决定子相符。
[0107] 实施例2
[0108] 本发明的生物化学特征
[0109] 分析实施例1中培育的幼苗茎的叶绿素含量。为了得到可靠的比较，对纯合地包含所述性状的不同植物进行测量，对遗传上相同但缺乏本发明的遗传决定子的同基因型系进行比较。
[0110] 分析证明更深绿色的苗茎是叶绿素含量提高的结果。存在的两种叶绿素组分，叶绿素a和叶绿素b，均提高，导致总叶绿素含量的显著提高(图2)。
[0111] 还测量了F1苗茎的叶绿素含量。这表明在苗茎中，该生物化学特征也作为完全显性的性状遗传。与正常茎颜色相比叶绿素含量的提高是明显存在的，并且甚至略高于其中遗传决定子以纯合方式存在的亲本的含量。
[0112] 而且，还对茎中叶绿素含量提高的植物的果实进行了观察。对这些植物的更深绿色果实的测量证明其更深的颜色也是果实外皮中叶绿素含量提高的结果，并且该特征是显性遗传的。因此在本发明的植物的果实和茎的叶绿素含量的提高之间具有明显的关联。
[0113] 实施例3
[0114] 本发明的分子表征
[0115] 从深色茎和正常茎的F1培育90DH植物群体。最终使用48DH个体通过群组隔离分析(Bulk Segregant Analysis,BSA)法来鉴别与该性状连锁的AFLP标记。一半的个体具有深绿色茎的表型，另一半是正常的绿色。群体的两个亲本都包括在分析中。
[0116] 最初用192个引物组合(PC’s)使用两群10个个体进行筛选。由该筛选，发现6个PC’s在48个DH个体上得以验证，获得了7个共显性评分的AFLP标记。进一步分析产生的AFLP标记与本发明性状的连锁关系。最终，确定有3个AFLP标记与该群体中的深色茎性状完全相关，这些标记是E13/M51-143.48、E13/M51-154.68、和E16/M60-086.74
[0117] 可以使用鉴别的分子标记来鉴别由保藏号为NCIMB 41859的种子生长而成的植物中本发明遗传决定子的存在。包含与本发明相同的遗传决定子的其它植物也可以与所述标记连锁，但也可以任选地与在特定群体中为多态性的任何其它分子标记连锁。
[0118] 进一步分析本发明的黄瓜植物中已知的保存期QTLs，如WO2007/042070中所定义的。通过确定在本发明的黄瓜植物，例如保藏物中是否存在SEQ ID No.9(如WO2007/042070中所示为QTL1)，来测定所述申请中的QTL1的存在。此外，通过确定WO2007/042070中所定义的标记的存在来测定QTL2的存在，所述标记是大约137个
碱基对的标记，从5’到3’由具有SEQ ID No:5的第一引物、黄瓜基因
片段、和具有SEQ ID No:6的第二引物组成。对于能够鉴别出所述QTL2的第二标记来说，在非常大集合的黄瓜植物中没有发现多态性。
[0119] 由于WO2007/042070并未提供保藏物以供参考，通过在KeyGene(Wageningen,Netherlands)进行标记分析，来鉴别包含所述申请的SEQ ID No.9以及QTL2的
现有技术的黄瓜品种。将该特定植物的茎与本发明的黄瓜植物相比较，特别是与保藏物相比较，结果显示在表2中。
[0120] 表2
[0121]
[0122] A表示该标记或序列以纯合形式存在
[0123] H表示该标记或序列以杂合形式存在
[0124] B表示不存在该标记或序列
[0125] 实施例4
[0126] 贮存过程中的果实颜色和叶绿素
[0127] 在贮存过程中观察本发明植物的果实的表现。将这些果实与遗传上相同但不包含本发明遗传决定子的同基因型植物的果实相比较。
[0128] 对两种类型的果实的初始果实颜色进行评分，使用1-9的得分，其中得分为1是观察到最深的绿色，以及9是黄化的黄瓜果实。然后将果实在17℃贮存10到19天，并在结束时再次分级。本发明的果实在收获期颜色深至少3级，平均深甚至3.6级，并且在贮存后仍然深至少2.5级，平均深甚至3.5级(表3)。
[0129] 表3
[0130] 贮存期间的果实颜色
[0131] 平均
[0132] 1＝最深的绿色
[0133] 9＝最浅/黄色
[0134] 从这些数据可以看出，本发明的黄瓜果实在贮存结束时仍然比刚收获的不包含本发明遗传决定子的黄瓜果实具有更深的颜色，这被认为是更好的。因此，本发明植物的更深绿色的茎是令人惊讶的，但明显与黄瓜果实的初始果实颜色、以及贮存期间果实颜色的改善相关。
[0135] 此外，在收获后、7天后、14天后、和21天后测量果实外皮中的叶绿素含量。这种测量明确证实与缺少本发明的遗传决定子的同基因系相比，本发明的深绿色果实的叶绿素含量从一开始就显著更高，并且在贮存达21天的过程中保持显著地更高(表4，图4)。
[0136] 表4
[0137] 果实外皮中的叶绿素含量
[0138]
[0139] 果实外皮的叶绿素测量证实了一方面深绿色茎和/或茎的叶绿素含量较高，与另一方面收获时或在贮存直至21天的过程中的深绿色果实颜色和/或果实外皮叶绿素含量较高之间的关联。
[0140] 实施例5
[0141] 本发明的性状的传递
[0142] 在例如实施例1中培育的F2群体中，可以通过表型选择包含更深绿色茎的植物，但是为了立即获得纯合地含有所述性状的植物，使用实施例3中所述的标记。本发明的性状显示易于传递到其它背景中，其也可以从图2中看出。证明遗传决定子的存在导致与杂交中所使用的未含有本发明遗传决定子的亲本相比，具有更深绿色的苗茎和更深绿色的果实。
[0143] 因此，本发明的遗传决定子和表型性状可用于不同的背景中，以改善黄瓜的初始果实颜色，并且同时提高黄瓜果实在至少10天至至少21天的贮存期中的品质。
