水稻水杨酸羟基化酶及其编码基因和应用
阅读：777发布：2020-05-08
专利汇可以提供水稻水杨酸羟基化酶及其编码基因和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 水 稻水杨酸羟基化酶及其编码基因和应用。本发明对四个水稻水杨酸羟基化酶及其编码基因的功能进行了研究，并构建了单敲、双敲、四基因敲除突变体。实验结果表明，水稻水杨酸羟基化酶敲除突变体中，参与 植物 抗病的樱花素含量有所增加，敲除转基因水稻提高了对多种病原菌的抗性。本发明对于明确SA在水稻免疫等方面的作用及其抗病性水稻的育种有重要意义。，下面是水稻水杨酸羟基化酶及其编码基因和应用专利的具体信息内容。
1.方法A或方法B；
方法A：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时降低目的植物中OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
(a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
(a2)樱花素含量高于所述目的植物；
方法B：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因、OsSAH2蛋白的编码基因、OsSAH3蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
(a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
(a2)樱花素含量高于所述目的植物；
所述OsSAH1蛋白为如下如下(A1)或(A2)或(A3)：
(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)来源于水稻且与(A1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(A3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述OsSAH2蛋白为如下如下(B1)或(B2)或(B3)：
(B1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(B2)来源于水稻且与(B1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(B3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述OsSAH3蛋白为如下如下(C1)或(C2)或(C3)：
(C1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(C2)来源于水稻且与(C1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(C3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
所述OsSAH4蛋白为如下如下(D1)或(D2)或(D3)：
(D1)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(D2)来源于水稻且与(D1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
(D3)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
2.方法C或方法D；
方法C：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时降低目的植物中OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白中任意三种或两种蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
(a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
(a2)樱花素含量高于所述目的植物；
方法D：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因、OsSAH2蛋白的编码基因、OsSAH3蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因中任意三种或两种编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
(a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
(a2)樱花素含量高于所述目的植物；
所述OsSAH1蛋白为权利要求1中所述的OsSAH1蛋白；
所述OsSAH2蛋白为权利要求1中所述的OsSAH2蛋白；
所述OsSAH3蛋白为权利要求1中所述的OsSAH3蛋白；
所述OsSAH4蛋白为权利要求1中所述的OsSAH4蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述方法C包括如下步骤：同时降低目的植物中OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白中任意两种蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；
所述方法D包括如下步骤：同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因、OsSAH2蛋白的编码基因、OsSAH3蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因中任意两种编码基因的表达，得到转基因植物。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述方法C包括如下步骤(a)或步骤(b)：
(a)同时降低目的植物中OsSAH1和OsSAH4蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；
(b)同时降低降低目的植物中OsSAH2蛋白和OsSAH3蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；
所述方法D包括如下步骤(c)或步骤(d)：
(c)同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因的表达，得到转基因植物；(d)同时沉默或抑制目的植物中OsSAH2蛋白的编码基因和OsSAH3蛋白的的编码基因的表达，得到转基因植物。
5.方法E或方法F；
方法E：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：降低目的植物中OsSAH1蛋白或OsSAH2蛋白或OsSAH3蛋白或OsSAH4蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
(a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
(a2)樱花素含量高于所述目的植物；
方法F：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因或OsSAH2蛋白的编码基因或OsSAH3蛋白的编码基因或OsSAH4蛋白的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
(a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
(a2)樱花素含量高于所述目的植物；
所述OsSAH1蛋白为权利要求1中所述的OsSAH1蛋白；
所述OsSAH2蛋白为权利要求1中所述的OsSAH2蛋白；
所述OsSAH3蛋白为权利要求1中所述的OsSAH3蛋白；
所述OsSAH4蛋白为权利要求1中所述的OsSAH4蛋白。
6.OsSAH1蛋白和/或OsSAH2蛋白和/或OsSAH3蛋白和/或OsSAH4蛋白的应用，为如下(b1)-(b5)中的至少一种：
(b1)调控植物对病原菌的抗性；
(b2)调控植物樱花素含量；
(b3)催化水杨酸生成2,3-DHBA和/或2,5-DHBA；
(b4)调控植物SA含量；
(b5)调控植物2,5-DHBA含量；
所述OsSAH1蛋白为权利要求1中所述的OsSAH1蛋白；
所述OsSAH2蛋白为权利要求1中所述的OsSAH2蛋白；
所述OsSAH3蛋白为权利要求1中所述的OsSAH3蛋白；
所述OsSAH4蛋白为权利要求1中所述的OsSAH4蛋白。
7.OsSAH1蛋白的编码基因和/或OsSAH2蛋白的编码基因和/或OsSAH3蛋白的编码基因和/或OsSAH4蛋白的编码基因的应用，为如下(b1)-(b4)中的至少一种：
(b1)调控植物对病原菌的抗性；
(b2)调控植物樱花素含量；
(b3)调控植物SA含量；
(b4)调控植物2,5-DHBA含量；
所述OsSAH1蛋白为权利要求1中所述的OsSAH1蛋白；
所述OsSAH2蛋白为权利要求1中所述的OsSAH2蛋白；
所述OsSAH3蛋白为权利要求1中所述的OsSAH3蛋白；
所述OsSAH4蛋白为权利要求1中所述的OsSAH4蛋白。
8.如权利要求：1至7任一所述的方法或应用，其特征在于：所述病原菌为稻瘟菌和/或胡麻斑菌和/或白叶枯菌。
9.权利要求1至4任一所述的方法，或，权利要求8所述的方法在植物育种中的应用。
10.如权利要求1至9任一所述的方法或应用，其特征在于：
所述植物为(D1)或(D2)或(D3)：
(D1)双子叶植物或单子叶植物；
(D2)禾本科植物；
(D3)水稻。
水稻水杨酸羟基化酶及其编码基因和应用
技术领域
背景技术
[0002] 水杨酸(Salicylic acid,SA)是植物体中一种重要的植物激素，在植物防御外界病原菌入侵过程中起到关键的调节作用，是植物抗病过程中重要的信号分子。普遍认为在拟南芥等双子叶植物中，SA在抵抗活体营养型和半活体营养型病原菌中起正调控作用。早期有关SA的代谢研究主要集中在糖基化和酯化。近年来，Zhang等(2013，2017)报道了拟南芥水杨酸羟基化酶AtSA3H和AtSA5H，能分别催化SA生成2,3-二羟基苯甲酸(2,3-DHBA)和2,5-DHBA，协同维持SA的动态平衡，调控拟南芥叶片衰老和对病原细菌Pst DC3000的抗性。体内外的实验结果表明，拟南芥UDP-糖基转移酶(UGT76D1)能对二羟基苯甲酸进行葡萄糖或者木糖基化。超表达UGT76D1的转基因植株提高了SA积累和抗病相关基因的表达，增强了对病原菌的抗性(Huang et al.,2018)。通过对SA代谢基因的研究，对明确其在作物免疫等方面的作用非常有意义，并可通过基因编辑技术有效地利用这些基因于作物抗病育种。
[0003] 根据同源性分析推测水稻中存在4个编码SAHs的基因(暂命名为OsSAH1-4)，与拟南芥等双子叶植物相比，水稻中SA含量约高出两个数量级(Silverman et al.,1995；Yang et al.,2004)，暗示水稻中SA合成和代谢机制与拟南芥相比会有较大差异。然而有关水稻SA代谢的研究还非常有限。因此，加速水稻SA代谢相关基因的研究，有助于揭示其抗病的分子机制，进而为作物抗病性的遗传改良提供依据。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供水稻水杨酸羟基化酶及其编码基因和应用。
[0005] 第一方面，本发明保护方法A或方法B。
[0006] 方法A：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时降低目的植物中OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
[0007] (a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
[0008] (a2)樱花素含量高于所述目的植物。
[0009] 方法B：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因、OsSAH2蛋白的编码基因、OsSAH3蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
[0010] (a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
[0011] (a2)樱花素含量高于所述目的植物。
[0012] 所述转基因植物产量不低于所述目的植物。
[0013] 所述OsSAH1蛋白为如下如下(A1)或(A2)或(A3)：
[0015] (A2)来源于水稻且与(A1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0016] (A3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0017] 所述OsSAH2蛋白为如下如下(B1)或(B2)或(B3)：
[0018] (B1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0019] (B2)来源于水稻且与(B1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0020] (B3)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0021] 所述OsSAH3蛋白为如下如下(C1)或(C2)或(C3)：
[0022] (C1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0023] (C2)来源于水稻且与(C1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0024] (C3)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0025] 所述OsSAH4蛋白为如下如下(D1)或(D2)或(D3)：
[0026] (D1)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0027] (D2)来源于水稻且与(D1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
[0028] (D3)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
[0029] 所述OsSAH1蛋白的编码基因为如下任一所述的DNA分子：
[0030] (a1)序列表的序列2所示的DNA分子；
[0031] (a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码所述OsSAH1蛋白的DNA分子；
[0032] (a3)来源于水稻且与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有80％以上同源性/相似性且编码所述OsSAH1蛋白的DNA分子。
[0033] 所述OsSAH2蛋白的编码基因为如下任一所述的DNA分子：
[0034] (b1)序列表的序列4所示的DNA分子；
[0035] (b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且编码所述OsSAH2蛋白的DNA分子；
[0036] (b3)来源于水稻且与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有80％以上同源性/相似性且编码所述OsSAH2蛋白的DNA分子。
[0037] 所述OsSAH3蛋白的编码基因为如下任一所述的DNA分子：
[0038] (c1)序列表的序列6所示的DNA分子；
[0039] (c2)在严格条件下与(c1)限定的DNA分子杂交且编码所述OsSAH3蛋白的DNA分子；
[0040] (c3)来源于水稻且与(c1)或(c2)限定的DNA序列具有80％以上同源性/相似性且编码所述OsSAH3蛋白的DNA分子。
[0041] 所述OsSAH4蛋白的编码基因为如下任一所述的DNA分子：
[0042] (d1)序列表的序列8所示的DNA分子；
[0043] (d2)在严格条件下与(d1)限定的DNA分子杂交且编码所述OsSAH4蛋白的DNA分子；
[0044] (d3)来源于水稻且与(d1)或(d2)限定的DNA序列具有80％以上同源性/相似性且编码所述OsSAH4蛋白的DNA分子。
[0045] 以上任一所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，
0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0046] 第二方面，本发明保护方法C或方法D。
[0047] 方法C：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时降低目的植物中OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白中任意三种或两种蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
[0048] (a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
[0049] (a2)樱花素含量高于所述目的植物。
[0050] 所述转基因植物产量不低于所述目的植物。
[0051] 方法D：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因、OsSAH2蛋白的编码基因、OsSAH3蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因中任意三种或两种编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
[0052] (a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
[0053] (a2)樱花素含量高于所述目的植物。
[0054] 所述转基因植物产量不低于所述目的植物。
[0055] 所述OsSAH1蛋白如前文所述。
[0056] 所述OsSAH2蛋白如前文所述。
[0057] 所述OsSAH3蛋白如前文所述。
[0058] 所述OsSAH4蛋白如前文所述。
[0059] 所述OsSAH1蛋白的编码基因如前文所述。
[0060] 所述OsSAH2蛋白的编码基因如前文所述。
[0061] 所述OsSAH3蛋白的编码基因如前文所述。
[0062] 所述OsSAH4蛋白的编码基因如前文所述。
[0063] 进一步地，所述方法C包括如下步骤：同时降低目的植物中OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白中任意两种蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物。所述方法D包括如下步骤：同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因、OsSAH2蛋白的编码基因、OsSAH3蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因中任意两种编码基因的表达，得到转基因植物。
[0064] 进一步地，所述方法C包括如下步骤(a)或步骤(b)：
[0065] (a)同时降低目的植物中OsSAH1和OsSAH4蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；(b)同时降低降低目的植物中OsSAH2蛋白和OsSAH3蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物。所述转基因植物产量不低于所述目的植物。
[0066] 所述方法D包括如下步骤(c)或步骤(d)：
[0067] (c)同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因的表达，得到转基因植物；(d)同时沉默或抑制目的植物中OsSAH2蛋白的编码基因和OsSAH3蛋白的的编码基因的表达，得到转基因植物。所述转基因植物产量不低于所述目的植物。
[0068] 所述方法中，所述“同时降低目的植物中OsSAH1和OsSAH4蛋白的表达量和/或活性”或“同时沉默或抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因和OsSAH4蛋白的的编码基因的表达”是通过将敲除载体1和2导入目的植物中实现的。所述敲除载体1具体可为将将序列表的序列2自5’端第463-482位所示的DNA分子插入pCS3载体的Bsa I识别位点得到的敲除载体。所述敲除载体2具体可为将序列8自5’端第508-526位所示的DNA分子插入pCS3载体的Bsa I识别位点得到的敲除载体。
[0069] 所述方法中，所述“同时降低降低目的植物中OsSAH2蛋白和OsSAH3蛋白的表达量和/或活性”或“同时沉默或抑制目的植物中OsSAH2蛋白的编码基因和OsSAH3蛋白的的编码基因的表达”是通过将敲除载体3和敲除载体4导入目的植物中实现的。所述敲除载体3具体可为将序列表的序列4自5’端第513-532位所示的DNA分子插入pCS3载体的Bsa I识别位点得到的敲除载体。所述敲除载体4具体可为将序列6自5’端第228-250位所示的DNA分子插入pCS3载体的Bsa I识别位点得到的敲除载体。
[0070] 将敲除载体导入所述目的植物，具体可为通过农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0071] 第三方面，本发明保护方法E或方法F。
[0072] 方法E：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：降低目的植物中OsSAH1蛋白或OsSAH2蛋白或OsSAH3蛋白或OsSAH4蛋白的表达量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
[0073] (a1)对病原菌的抗性高于所述目的植物；
[0074] (a2)樱花素含量高于所述目的植物。
[0075] 所述转基因植物产量不低于所述目的植物。
[0076] 方法F：培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因或OsSAH2蛋白的编码基因或OsSAH3蛋白的编码基因或OsSAH4蛋白的编码基因的表达，得到转基因植物；所述转基因植物具有如下(a1)和/或(a2)所述的性状：
[0077] (a1)抗病性高于所述目的植物；
[0078] (a2)樱花素含量高于所述目的植物。
[0079] 所述转基因植物产量不低于所述目的植物。
[0080] 所述OsSAH1蛋白如前文所述。
[0081] 所述OsSAH2蛋白如前文所述。
[0082] 所述OsSAH3蛋白如前文所述。
[0083] 所述OsSAH4蛋白如前文所述。
[0084] 所述OsSAH1蛋白的编码基因如前文所述。
[0085] 所述OsSAH2蛋白的编码基因如前文所述。
[0086] 所述OsSAH3蛋白的编码基因如前文所述。
[0087] 所述OsSAH4蛋白的编码基因如前文所述。
[0088] 所述方法中，所述“降低目的植物中OsSAH1蛋白的表达量和/或活性”或“抑制目的植物中OsSAH1蛋白的编码基因的表达”具体可通过将前文所述的敲除载体1导入目的植物中实现。
[0089] 所述方法中，所述“降低目的植物中OsSAH2蛋白的表达量和/或活性”或“抑制目的植物中OsSAH2蛋白的编码基因的表达”具体可通过将前文所述的敲除载体3导入目的植物中实现。
[0090] 所述方法中，所述“降低目的植物中OsSAH3蛋白的表达量和/或活性”或“抑制目的植物中OsSAH3蛋白的编码基因的表达”具体可通过将前文所述的敲除载体4导入目的植物中实现。
[0091] 所述方法中，所述“降低目的植物中OsSAH4蛋白的表达量和/或活性”或“抑制目的植物中OsSAH4蛋白的编码基因的表达”具体可通过将前文所述的敲除载体2导入目的植物中实现。
[0092] 将敲除载体导入所述目的植物，具体可为通过农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0093] 第四方面，本发明保护OsSAH1蛋白和/或OsSAH2蛋白和/或OsSAH3蛋白和/或OsSAH4蛋白的应用，为如下(b1)-(b5)中的至少一种：
[0094] (b1)调控植物对病原菌的抗性；
[0095] (b2)调控植物樱花素含量；
[0096] (b3)催化水杨酸生成2,3-DHBA和/或2,5-DHBA；
[0097] (b4)调控植物SA含量；
[0098] (b5)调控植物2,5-DHBA含量。
[0099] 所述OsSAH1蛋白如前文所述。
[0100] 所述OsSAH2蛋白如前文所述。
[0101] 所述OsSAH3蛋白如前文所述。
[0102] 所述OsSAH4蛋白如前文所述。
[0103] 所述(b1)中，所述调控为负调控，且该调控不影响产量。
[0104] 第五方面，本发明保护OsSAH1蛋白的编码基因和/或OsSAH2蛋白的编码基因和/或OsSAH3蛋白的编码基因和/或OsSAH4蛋白的编码基因的应用，为如下(b1)-(b4)中的至少一种：
[0105] (b1)调控植物对病原菌的抗性；
[0106] (b2)调控植物樱花素含量；
[0107] (b3)调控植物SA含量；
[0108] (b4)调控植物2,5-DHBA含量；
[0109] 所述OsSAH1蛋白如前文所述。
[0110] 所述OsSAH2蛋白如前文所述。
[0111] 所述OsSAH3蛋白如前文所述。
[0112] 所述OsSAH4蛋白如前文所述。
[0113] 所述(b1)中，所述调控为负调控，且该调控不影响产量。
[0114] 第六方面，本发明保护以上任一所述的方法在植物育种中的应用。
[0115] 所述育种的目的具体可为培育对病原菌的抗性高的植物。
[0116] 以上各方面中，所述病原菌为稻瘟菌和/或胡麻斑菌和/或白叶枯菌。
[0117] 所述稻瘟菌具体可为稻瘟菌小种Magnaporthe oryzae SZ(M.oryzae SZ)。
[0118] 所述胡麻斑菌具体可为胡麻斑菌Bipolaris oryzae(B.oryzae)。
[0119] 所述白叶枯菌具体可为白叶枯菌Xoo J18。
[0120] 以上任一所述植物为(D1)或(D2)或(D3)：
[0121] (D1)双子叶植物或单子叶植物；
[0122] (D2)禾本科植物；
[0123] (D3)水稻。
[0124] 所述水稻具体可为水稻中花17。
[0125] 本发明对四个水稻水杨酸羟基化酶及其编码基因的功能进行了研究，并构建了单敲、双敲、四基因敲除突变体。实验结果表明，水稻水杨酸羟基化酶敲除突变体中，参与植物抗病的樱花素含量有所增加，敲除转基因水稻提高了对多种病原菌的抗性。本发明对于明确SA在水稻免疫等方面的作用及其抗病性水稻的育种有重要意义。附图说明
[0126] 图1为四个水杨酸羟基化酶与水杨酸反应的酶反应动力学曲线。
[0127] 图2为四个水稻水杨酸羟基化酶基因表达模式分析。
[0128] 图3为四个水杨酸羟基化酶基因在水稻组织中的特异性表达分析。
[0129] 图4为四个水稻水杨酸羟基化酶基因超表达转基因水稻株系PCR鉴定结果。
[0130] 图5为水稻水杨酸羟基化酶单基因敲除株系鉴定结果。
[0131] 图6为水稻水杨酸羟基化酶双基因敲除株系鉴定结果。
[0132] 图7为转基因水稻水杨酸羟基化酶基因转录水平分析。
[0133] 图8为转基因水稻水杨酸相关化合物代谢水平。
[0134] 图9为转基因水稻农艺性状统计。
[0135] 图10为转基因水稻对稻瘟病菌的抗性分析。
[0136] 图11为稻瘟菌接种24h后转基因水稻化合物含量分析。
[0137] 图12为转基因水稻对胡麻斑病菌的抗性分析。
[0138] 图13为转基因水稻对白叶枯菌的抗性分析。
具体实施方式
[0139] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0140] 野生型水稻中花17(Oryza sativa L.Japonica var.Zhonghua 17)记载于文献：Wang HH,Hao JJ,Chen XJ,Hao ZN,Wang X,Lou YG,Peng YL and Guo ZJ，Overexpression of rice WRKY89enhances ultraviolet B tolerance and disease resistance in rice plants.Plant Mol Biol,65:799-815,2007；公众可从中国农业大学获得。
[0141] pGEX-4T-3载体记载于文献：Liu JQ,Chen XJ,Liang XX,Zhou XG,Yang F,Liu Jia,He SY and Guo ZJ.Alternative splicing of rice WRKY62 and WRKY76 transcription factor genes in pathogen defense.Plant Physiol,2016,171:1427-1442；公众可从中国农业大学获得。
[0142] pCS3载体：参考文献：Miao J,Guo DS,Zhang JZ,Huang QP,Qin GJ,Zhang X,Wan JM,Gu HY and Qu LJ.Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system.Cell Research,23:1233-1236,2013.；公众可以从中国农业大学获得。
[0143] pCDU-OW62.1载体：参考文献：Liu JQ,Chen XJ,Liang XX,Zhou XG,Yang F,Liu Jia,HeSY and Guo ZJ.Alternative splicing of rice WRKY62 and WRKY76 transcription factor genes in pathogen defense.Plant Physiol,2016,171:1427-1442.；公众可以从中国农业大学获得。
[0144] pMD-18T载体：宝日医生物技术(北京)有限公司。
[0145] 大肠杆菌BL21(DE3)：北京全式金生物技术有限公司。
[0147] N6基本培养基：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：C1416。
[0148] 谷氨酰胺：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：货号A600224。
[0149] L-脯氨酸：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600923。
[0151] 肌醇：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600536。
[0152] 蔗糖：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A502792。
[0153] 2,4-D：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600722。
[0154] 乙酰丁香酮：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：D134406。
[0155] 特美汀：上海翊圣生物科技有限公司，货号：60230ES07。
[0156] 潮霉素B：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：V900372。
[0157] 6-BAP(6-苄氨基嘌呤)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：B3408。
[0158] NAA(萘乙酸)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：N0640。
[0159] MS基本培养基：北京兰博利德商贸有限公司，货号：MSP23。
[0160] 本发明中的四种水稻水杨酸羟基化酶包括OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白。所述OsSAH1蛋白如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。所述OsSAH2蛋白如序列表的序列3所示，其编码基因如序列表的序列4所示。所述OsSAH3蛋白如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列6所示。所述OsSAH4蛋白如序列表的序列7所示，其编码基因如序列表的序列8所示。
[0161] 实施例1、酶学特性研究
[0162] 一、表达载体的构建
[0163] 1、以野生型水稻中花17的基因组DNA为模板，采用上游引物OsSAH1B1F：5'-TGGATCCGGCATGGCGGACCAGCTCATC-3'及下游引物OsSAH1PmR：5'-TCACGTGAGATGTGTCTGTAGGTGTTGTTCT-3'组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物连接pMD-
18T载体上并测序验证无误后得到质粒pMD-18-OsSAH1，采用BamHⅠ和PmaCⅠ对质粒pMD-18-OsSAH1进行双酶切并回收约1043bp的片段，采用回收的片段代替pGEX-4T-3载体BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体pGEX-OsSAH1(已经测序验证)。
18T载体上并测序验证无误后得到质粒pMD-18-OsSAH1，采用BamHⅠ和PmaCⅠ对质粒pMD-18-OsSAH1进行双酶切并回收约1043bp的片段，采用回收的片段代替pGEX-4T-3载体BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体pGEX-OsSAH1(已经测序验证)。
[0164] 2、以野生型水稻中花17的基因组DNA为模板，采用上游引物OsSAH2B1F：5'-AGGATCCTCTCCCATGGCAACGACGCAGTTG-3'及下游引物OsSAH2PmR：5'-ACACGTGGCCTTTGAAGAGCTCTAGGCAG-3'组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物连接pMD-18T载体上并测序验证无误后得到质粒pMD-18-OsSAH2，采用BamHⅠ和PmaCⅠ对质粒pMD-18-OsSAH2进行双酶切并回收约1037bp的片段，采用回收的片段代替pGEX-4T-3载体BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体pGEX-OsSAH2(已经测序验证)。
[0165] 3、以野生型水稻中花17的基因组DNA为模板，采用上游引物OsSAH3B2F：5'-AAGATCTAACATGGCTCCAGCCATTGCCAAG-3'及下游引物OsSAH3PmR：5'-ACACGTGGACGGCCTGATCGTTAGGCCGGAAC-3'组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物连接pMD-18T载体上并测序验证无误后得到质粒pMD-18-OsSAH3，采用BglⅡ和PmaCⅠ对质粒pMD-18-OsSAH3进行双酶切并回收约1072bp的片段，采用回收的片段代替pGEX-4T-3载体BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体pGEX-OsSAH3(已经测序验证)。
[0166] 4、以野生型水稻中花17的基因组DNA为模板，以上游引物OsSAH4B1F：5'-AGGATCCGTGAACATGGCGGCGGAGG-3 '及下游引物OsSAH4PmR：5 '-TCACGTGAGTCCTGAACAGCTCGAGGCAGT-3'组成的引物对进行PCR扩增，将扩增产物连接pMD-
18T载体上并测序验证无误后得到质粒pMD-18-OsSAH4，采用BamHⅠ和PmaCⅠ对质粒pMD-18-OsSAH4进行双酶切并回收约1049bp的片段，采用回收的片段代替pGEX-4T-3载体BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体pGEX-OsSAH4(已经测序验证)。
18T载体上并测序验证无误后得到质粒pMD-18-OsSAH4，采用BamHⅠ和PmaCⅠ对质粒pMD-18-OsSAH4进行双酶切并回收约1049bp的片段，采用回收的片段代替pGEX-4T-3载体BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点间的片段，得到重组表达载体pGEX-OsSAH4(已经测序验证)。
[0167] 二、重组蛋白的诱导表达及纯化
[0168] 1、将步骤一得到的表达载体分别导入大肠杆菌BL21(DE3)(北京全式金生物技术有限公司)，得到重组菌。
[0169] 2、取步骤1得到的重组菌，接种于含有氨苄抗性的LB液体培养基中，28℃、120rpm培养至菌液OD＝0.5-0.6，加入IPTG至终浓度为0.2mM，继续18℃、120rpm培养14-19h。
[0170] 3、完成步骤2后，取培养体系离心收集菌体，采用预冷的PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3)洗涤菌体，然后采用预冷的PDT溶液(20ml PBS中加入20μL 1M DTT和200μl 10％Triton X-100)悬浮菌体。
[0171] 4、完成步骤3后，用超声波破碎仪(宁波新芝科技有限公司)破碎菌体(功率为30Hz，工作模式为超声波工作3s后暂停3s)，直至菌液澄清透亮，4℃、12000rpm离心10min，取上清，用谷胱甘肽琼脂糖凝胶Sepharose 4B-GST柱(GE healthcare)对蛋白进行纯化，具体方法按供应商说明书。
[0172] 按照步骤1-4进行操作，得到纯化的OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白。
[0173] 三、酶动力学检测
[0174] 待测蛋白：步骤二纯化的OsSAH1蛋白、OsSAH2蛋白、OsSAH3蛋白和OsSAH4蛋白。
[0175] 1、以水杨酸为底物进行酶活反应，100μL反应体系如下：
[0176] 5mM DTT(100mM的母液，每反应加5μL)、50mM Tris·HCl(pH7.5，1M的母液，每反应加5μL)、1mM氧代戊二酸(50mM母液，每反应加2μL)、1mM抗坏血酸钠(50mM母液，每反应加2μL)、0.4mM FeSO4(10mM母液，每反应加4μL)、0.1mg/mL过氧化氢酶(母液含30％甘油，浓度为40mg/mL，每反应加0.25μL)，水杨酸浓度在1-500μM，5μg待测蛋白，ddH2O补足体积至100μL。
[0177] 将反应体系30℃反应15min后，加入等体积的50％乙腈，煮沸1min结束。
[0178] 2、完成步骤1后，向反应体系中加入等体积乙酸乙酯萃取2次，仅第一次含10ng D5-BA，每次萃取经漩涡混合1min以上，萃取后在4℃、12000rpm离心20min，吸取上清转移入新的离心管，合并2次上清，经氮气吹干后用50μL 90％甲醇充分溶解，4℃12000rpm离心20min后取10μL于进样瓶中。通过液相色谱-质谱联用仪(Agilent 1260/6520)的进行检测，化合物采用C18色谱柱(Phenomenex Luna 3u C18 100A，2.0×150mM，3μm；广州菲罗门公司)进行分离，进样体积为5μL，流动相为水(A，含0.05％乙酸)及乙腈(B，含0.05％乙酸)，初始流动相比例为5％B，流动相梯度洗脱程序：0-2min，5％B；2-10min，5-25％B；10-40min，
25-70％B；40-43min，70-95％B。质谱参数：干燥气体N2，流速11L/min，温度340℃；
Nebulizer40psi；毛细管入口电压和出口电压在负模式中分别为3200V，140V；质量采集范围为M/Z50-1000。
25-70％B；40-43min，70-95％B。质谱参数：干燥气体N2，流速11L/min，温度340℃；
Nebulizer40psi；毛细管入口电压和出口电压在负模式中分别为3200V，140V；质量采集范围为M/Z50-1000。
[0179] 2,3-DHBA标准品购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：126209。
[0180] 2,5-DHBA标准品购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，货号：149357。
[0182] 图1A为产物为2,3-DHBA时的酶反应动力学曲线；图1B为产物为2,5-DHBA时的酶反应动力学曲线。图1结果显示，OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3、OsSAH4能特异性的与水杨酸进行反应，催化水杨酸生成2,3-DHBA和2,5-DHBA，且反应速率随着水杨酸浓度的增加呈现先加快后减慢的过程，由此曲线获得的动力学反应参数见表1。
[0183] 表1酶反应动力学参数
[0184]
[0185] 实施例2、基因表达模式分析
[0186] 1、将水稻中花17种子在37℃下浸泡1-2天，露白后催芽1天，然后播种在营养土中，在温室中培养，28℃(14h光照)/22℃(10h黑暗)。21天苗分别用紫外及病原菌处理，于处理后24h取样，提取叶片总RNA。
[0187] 紫外处理：在UV-B紫外灯(20w/m2)下照射15分钟。
[0188] 病原菌处理：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae SZ)经西红柿燕麦培养基培养后进行产孢，用含0.05％的Silwet L-77洗下孢子，调节孢子悬浮液浓度为5×105个/mL。将孢子悬浮液均匀喷洒在水稻叶片上，保持湿度90％、温度26℃。
[0189] 稻瘟菌(M.oryzae SZ)及处理方法见参考文献：Liu JQ,Chen XJ,Liang XX,Zhou XG,Yang F,Liu Jia,He SY and Guo ZJ.Alternative splicing of rice WRKY62 and WRKY76 transcription factor genes in pathogen defense.Plant Physiol,2016,171:1427-1442”.；公众可以从中国农业大学获得稻瘟菌(Magnaporthe oryzae SZ)。
[0190] 2、将水稻中花17种子在37℃下浸泡1-2天，露白后催芽1天，然后在温室中营养液培养。28℃(14h光照)/22℃(10h黑暗)。12天苗用0.5mM水杨酸(含0.01％Silwet L-77)或200ng/mL几丁质(含0.01％Silwet L-77)喷施叶片，分别于12h、24h取样，提取叶片总RNA。
[0191] 3、提取水稻中花17孕穗期时的剑叶、茎和小穗组织以及幼苗期(21天)的根、叶的总RNA。
[0192] 4、将步骤1、2和3中的总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR(ABI StepOne)检测基因表达。检测时以水稻OsUBQ基因为内参基因，检测引物如表2所示。
[0193] 表2荧光定量PCR引物
[0194]检测基因 正向引物(5’-3’) 反向引物(5’-3’)
OsSAH1 TTCTCAAGGAAGGCAGGTGGATCG TTCCGTTGCTTAGCGCCTGTAG
OsSAH2 GCATGTCGGTGGCATCTTTCAT CGTAGGTGAAGCTCCGGTA
OsSAH3 AAGTGCTATTCCGACGACC ATGCAAGCGCAGGAAGTCGC
OsSAH4 GGCGGTGAACTACTACCCAC TGGTCGTCCATGAGGAGGAT
OsUBQ GTGGTGGCCAGTAAGTCCTC GGACACAATGATTAGGGATCA
OsSAH1 TTCTCAAGGAAGGCAGGTGGATCG TTCCGTTGCTTAGCGCCTGTAG
OsSAH2 GCATGTCGGTGGCATCTTTCAT CGTAGGTGAAGCTCCGGTA
OsSAH3 AAGTGCTATTCCGACGACC ATGCAAGCGCAGGAAGTCGC
OsSAH4 GGCGGTGAACTACTACCCAC TGGTCGTCCATGAGGAGGAT
OsUBQ GTGGTGGCCAGTAAGTCCTC GGACACAATGATTAGGGATCA
[0195] 图2结果显示，经稻瘟菌处理24h后，OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3的表达显著上调，OsSAH4的表达下调，OsSAH2、OsSAH3的表达均上调10倍以上；OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3、OsSAH4均能被UV诱导，其中OsSAH2最为明显，可被诱导18倍以上；几丁质处理后24h，OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3、OsSAH4均被诱导上调；经0.5mM水杨酸处理12h后，OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3、OsSAH4均显著被诱导，其中OsSAH3被诱导近千倍。
[0196] 图3结果显示，OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3、OsSAH4的转录水平在水稻的不同组织具有差异，OsSAH1在穗中及幼根中有较高表达，在幼叶、剑叶、及孕穗期的茎中表达相对较低，OsSAH2的表达则集中在剑叶中，OsSAH3在穗中有较高的表达，在其余组织表达相对较低，OsSAH4在穗中和剑叶中表达量同样较高，在其它组织中相对较低。
[0197] 实施例3、转基因植株的获得
[0198] 一、重组表达载体的构建
[0199] 1、超表达载体的构建
[0200] (1)将实施例1中获得的载体pMD-18-OsSAH1和pCDU-OW62.1载体分别用BamHⅠ和PmaCⅠ酶切，连接获得超表达载体pCDU-OsSAH1(已经测序验证)。
[0201] (2)将实施例1中获得的载体pMD-18-OsSAH2和pCDU-OW62.1载体分别用BamHⅠ和PmaCⅠ酶切，连接获得超表达载体pCDU-OsSAH2(已经测序验证)。
[0202] (3)将实施例1中获得的载体pMD-18-OsSAH3和pCDU-OW62.1载体分别用BamHⅠ和PmaCⅠ酶切，连接获得超表达载体pCDU-OsSAH3(已经测序验证)。
[0203] (4)将实施例1中获得的载体pMD-18-OsSAH4和pCDU-OW62.1载体分别用BamHⅠ和PmaCⅠ酶切，连接获得超表达载体pCDU-OsSAH4(已经测序验证)。
[0204] 2、敲除载体的构建
[0205] (1)将序列表的序列2自5’端第463-482位所示的DNA分子设计为靶序列，插入pCS3载体的Bsa I识别位点，得到敲除载体pCS3-OsSAH1(已经测序验证)。
[0206] (2)将序列表的序列4自5’端第513-532位所示的DNA分子设计为靶序列，插入pCS3载体的Bsa I识别位点，得到敲除载体pCS3-OsSAH2(已经测序验证)。
[0207] (3)将序列6自5’端第228-250位所示的DNA分子设计为靶序列，插入pCS3载体的BsaI识别位点，得到敲除载体pCS3-OsSAH3(已经测序验证)。
[0208] (4)将序列8自5’端第508-526位所示的DNA分子设计为靶序列，插入pCS3载体的BsaI识别位点，得到敲除载体pCS3-OsSAH4(已经测序验证)。
[0209] 二、转基因植株的获得
[0210] 1、将上述步骤一和步骤二得到的载体分别导入根癌农杆菌EHA105(购于Clontech公司)中获得重组菌EHA105/pCDU-OsSAH1、EHA105/pCDU-OsSAH2、EHA105/pCDU-OsSAH3、EHA105/pCDU-OsSAH4、EHA105/pCS3-OsSAH1、EHA105/pCS3-OsSAH2、EHA105/pCS3-OsSAH3和EHA105/pCS3-OsSAH4。
[0211] 2、将步骤1得到的如下重组菌分别转化水稻中花17；
[0212] (1)重组菌EHA105/pCDU-OsSAH1；(2)EHA105/pCDU-OsSAH2；(3)EHA105/pCDU-OsSAH3；(4)EHA105/pCDU-OsSAH4；(5)EHA105/pCS3-OsSAH1；(6)EHA105/pCS3-OsSAH2；(7)EHA105/pCS3-OsSAH3；(8)EHA105/pCS3-OsSAH4；(9)EHA105/pCS3-OsSAH1+EHA105/pCS3-OsSAH4；(10)EHA105/pCS3-OsSAH2+EHA105/pCS3-OsSAH3；
[0213] 具体方法如下：
[0214] 将成熟水稻中花17种子剥去颖壳、70％乙醇表面消毒1分钟后，用50％(v/v)的次氯酸钠消毒20分钟，无菌水冲洗3次后，将种子于灭菌滤纸上吹干后，均匀摆放在NBi诱导培养基(N6基本培养基添加0.3g/L CEH(酶水解酪素)，0.5g/L谷氨酰胺，0.5g/L L-脯氨酸，2.0mg/L 2,4-D，30g/L蔗糖；pH5.8)上28℃培养，2周左右长出愈伤，将愈伤组织剥下来放到新的NBi培养基上培养，4天后可用于侵染；
[0215] 将待转重组农杆菌的菌液分别涂布在固体YEP平板上，28℃培养2-3天，用无菌水冲洗得到菌液，将冲洗得到的菌液加入到含100μM乙酰丁香酮的共培养液(N6基本培养基添加0.3g/L CEH，2g/L肌醇，30g/L蔗糖；pH5.3)中，调整待转农杆菌悬浮液浓度至OD600＝0.5，如需两种农杆菌共侵染时，将两种菌等体积混合；
[0216] 将愈伤放入到农杆菌悬浮液中浸没15-20分钟，期间不时轻轻摇动。倒掉农杆菌悬浮液，将愈伤放到灭菌滤纸上吸干表面菌液，随后移到含100μM乙酰丁香酮的NBco共培养培养基上(N6基本培养基添加0.3g/L CEH，0.5g/L谷氨酰胺，0.5g/L脯氨酸，2.0mg/L 2,4-D，30g/L蔗糖；pH5.3)；
[0217] 将培养2天的愈伤用无菌水洗3次，再用含有400mg/L特美汀的无菌水浸泡15分钟，倒掉水后，将愈伤放到灭菌滤纸上吸干，然后转移到含400mg/L特美汀的预筛选培养基NBps(N6基本培养基添加0.3g/L CEH，0.5g/L谷氨酰胺，0.5g/L脯氨酸，2.0mg/L 2,4-D，30g/L蔗糖；pH5.8)上，28℃培养，1周后将愈伤转移到含400mg/L特美汀、40mg/L潮霉素B的筛选培养基NBs(N6基本培养基添加0.3g/L CEH，0.5g/L谷氨酰胺，0.5g/L脯氨酸，2.0mg/L2,4-D，30g/L蔗糖；pH5.8)上，28℃培养4周左右；
[0218] 挑选抗性愈伤、转入到含30mg/L潮霉素B、3.0mg/L 6-BAP(6-苄氨基嘌呤)和0.5mg/L NAA(萘乙酸)的再生培养基NBr(N6基本培养基添加0.3g/L CEH，0.5g/L谷氨酰胺，
0.5g/L脯氨酸，30g/L蔗糖；pH5.8)上，28℃光照培养，直到组织出绿、分化出芽；
0.5g/L脯氨酸，30g/L蔗糖；pH5.8)上，28℃光照培养，直到组织出绿、分化出芽；
[0219] 待长出的小苗到2-3厘米时，将其移到含有40mg/L潮霉素B的生根培养基(1/2MS基本培养基添加3g/L蔗糖和7g/L葡萄糖)中；2-3周左右、待小苗长出粗壮的根系后，移到温室培养，直到收种，获得T0代转基因水稻。T0代转基因植株自交所得的种子和由该种子长成的植株为T1代。T1代转基因植株自交所得的种子和由该种子长成的植株为T2代。
[0220] 经含有超表达载体pCDU-OsSAH1或pCDU-OsSAH2或pCDU-OsSAH3或pCDU-OsSAH4的重组菌液侵染得到超表达株系，经含有敲除载体pCS3-OsSAH1或pCS3-OsSAH2或pCS3-OsSAH3或pCS3-OsSAH4的重组菌液侵染得到单基因敲除株系，经同时含有敲除载体pCS3-OsSAH1+pCS3-OsSAH4或pCS3-OsSAH2+pCS3-OsSAH3的重组菌液侵染得到双基因敲除株系。
[0221] 3、超表达水稻的PCR鉴定方法如下：
[0222] (1)转OsSAH1基因阳性株系鉴定：提取转基因植株的基因组DNA，采用Ubi1870:5'-GG AT GA TG GC AT AT GC AG CA GC T- 3 '和引 物O sS AH 1P mc R ：5 '-TCACGTGAGATGTGTCTGTAGGTGTTGTTCT-3'组成的引物对进行PCR扩增，如果以待检测的株系基因组DNA为模板可以扩增出大小为1149bp的条带，则该植株为转基因阳性植株。如图4A所示，将2个转入OsSAH1基因的水稻株系阳性株系分别记作T0代转基因株系OE-SAH1-8、OE-SAH1-25。
[0223] (2)转OsSAH2基因阳性株系鉴定：提取转基因植株的基因组DNA，采用Ubi1870:5'-GGATGATGGCATATGCAGCAGCT-3'和引物OsSAH2PmcR：5'-ACACGTGGCCTTTGAAGAGCTCTAGGCAG-3'组成的引物对进行PCR扩增，如果以待检测的株系基因组DNA为模板可以扩增出大小为
1133bp的条带，则该植株为转基因阳性植株。如图4B所示，将2个转入OsSAH2基因的水稻株系分别记作T0代转基因株系OE-SAH2-53、OE-SAH2-60。
1133bp的条带，则该植株为转基因阳性植株。如图4B所示，将2个转入OsSAH2基因的水稻株系分别记作T0代转基因株系OE-SAH2-53、OE-SAH2-60。
[0224] (3)转OsSAH3基因阳性株系鉴定：提取转基因植株的基因组DNA，采用Ubi1870:5'-GGATGATGGCATATGCAGCAGCT-3'和引物OsSAH3PmcR：5'-ACACGTGGACGGCCTGATCGTTAGGCCGGAAC-3'组成的引物对进行PCR扩增，如果以待检测的株系基因组DNA为模板可以扩增出大小为1179bp的条带，则该植株为转基因阳性植株。如图4C所示，将2个转入OsSAH3基因的水稻株系分别记作T0代转基因株系OE-SAH3-3、OE-SAH3-11。
[0225] (4)转OsSAH4基因阳性株系鉴定：提取转基因植株的基因组DNA，采用Ubi1870:5'-GGATGATGGCATATGCAGCAGCT-3'和引物OsSAH4PmcR：5'-TCACGTGAGTCCTGAACAGCTCGAGGCAGT-3'组成的引物对进行PCR扩增，如果以待检测的株系基因组DNA为模板可以扩增出大小为
1148bp的条带，则该植株为转基因阳性植株。如图4D所示，将3个转入OsSAH4基因的水稻株系分别记作T0代转基因株系OE-SAH4-13、OE-SAH4-14和OE-SAH4-15。
1148bp的条带，则该植株为转基因阳性植株。如图4D所示，将3个转入OsSAH4基因的水稻株系分别记作T0代转基因株系OE-SAH4-13、OE-SAH4-14和OE-SAH4-15。
[0226] 4、敲除植株的鉴定方法
[0227] (1)敲除OsSAH1基因的转基因水稻的鉴定：分别提取T0、T1、T2代转敲除OsSAH1基因的转基因水稻的基因组DNA，利用引物jd-SAH1F：5'-ATTGGAGCTCGTTGGTGTGATG-3'和jd-SAH1R：5'-TCACCTGTAGCTGATCACCAAT-3'组成的引物对扩增含有敲除靶序列基因片段，PCR产物纯化后，连接到pMD-18T载体上，测序。获得稳定遗传的纯合突变体KO-SAH1-1，突变类型为i1T(插入一个碱基T，导致氨基酸移码、蛋白翻译提前终止)，如图5A所示。
[0228] (2)敲除OsSAH2的转基因水稻的鉴定：分别提取T0、T1、T2代转敲除OsSAH2的转基因水稻的基因组DNA，利用引物jd-SAH2F：5'-ATTGGAGCTCGTTGGTGTGATG-3'和jd-SAH1R：5'-TCACCTGTAGCTGATCACCAAT-3'组成的引物对扩增含有靶序列的基因片段，PCR产物纯化后，连接到pMD-18T载体上，测序。获得bi-allele突变SAH2-KO-7，突变类型为i1C/d1C(插入一个碱基C或缺失一个碱基C，导致氨基酸移码、蛋白翻译提前终止)，如图5B所示。
[0229] (3)敲除OsSAH3的转基因水稻的鉴定：分别提取T0、T1、T2代转敲除OsSAH3的转基因水稻的基因组DNA，利用引物jd-SAH3F：5'-AAGCCTCTCCTGAGCGATCTGG-3'和jd-SAH3R：5'-GTCCAGGGCTGACCTGAAGGAG-3'组成的引物对扩增含有敲除靶序列基因片段，PCR产物纯化后，连接到pMD-18T载体上，测序。获得稳定遗传的纯合突变体SAH3-KO-1，突变类型为i1T(插入一个碱基T，导致氨基酸移码、蛋白翻译提前终止)，如图5C所示。
[0230] (4)敲除OsSAH4的转基因水稻的鉴定：分别提取0、T1、T2代转敲除OsSAH4的转基因水稻的基因组DNA，利用引物jd-SAH4F：5'-TCAGTGATGACAGGTGCTGTTC-3'和jd-SAH4R：5'-GATGATCTGAGAGGAATGGTCA-3'组成的引物对扩增含有靶序列的基因片段，PCR产物纯化后，连接到pMD-18T载体上，测序。获得稳定遗传的纯合突变体SAH4-KO-1，突变类型为i1C(插入一个碱基C，导致氨基酸移码、蛋白翻译提前终止)，如图5D所示。
[0231] (5)OsSAH1和OsSAH4基因双敲除水稻的鉴定：分别提取T0、T1、T2代OsSAH1和OsSAH4基因双敲除水稻的基因组DNA，分别利用(1)及(4)所述的引物对扩增含有OsSAH1和OsSAH4靶序列的基因片段，PCR产物纯化后，连接到pMD-18T载体上，进行测序，筛选得到OsSAH1和OsSAH4基因双敲除株系，命名为SAH1/SAH4-KO-2，如图6A所示。
[0232] (6)OsSAH2和OsSAH3基因双敲除水稻的鉴定：提取T0、T1、T2代OsSAH2和OsSAH3基因双敲除水稻的基因组DNA，分别利用(2)及(3)所述的引物对扩增含有OsSAH2和OsSAH3靶序列的基因片段，PCR产物纯化后，连接到pMD-18T载体上，进行测序，筛选得到OsSAH1和OsSAH4基因双敲除株系，命名为SAH2/SAH3-KO-2，如图6B所示。
[0233] 实施例4、转基因植株转录水平分析
[0234] 待测植株：野生型水稻中花17、超表达株系OE-SAH1-8、OE-SAH1-25、OE-SAH2-53、OE-SAH2-60、OE-SAH3-3、OE-SAH3-11、OE-SAH4-13、OE-SAH4-14、单基因敲除株系SAH1-KO-1、SAH2-KO-7、SAH3-KO-1、SAH4-KO-1、双基因敲除株系SAH2/SAH3-KO-2、SAH1/SAH4-KO-2。
[0235] 提取21天苗龄待测植株总RNA，并反转录为cDNA，以所述cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR检测OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3和OsSAH4表达情况，以水稻OsUBQ基因为内参，引物见表2。实验进行三次重复，数据处理采用comparative Ct方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(待测基因)-Ct(OsUBQ)，以2-ΔCt值衡量基因转录水平，对转基因及野生型水稻中的转化基因进行比较分析。
[0236] 结果见图7，结果显示水稻OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3和OsSAH4基因的超表达株系中，转化基因分别有不同程度的上调表达。
[0237] 实施例5、转基因植株代谢水平分析
[0238] 待测植株：野生型水稻中花17、超表达株系OE-SAH1-8、OE-SAH1-25、OE-SAH2-53、OE-SAH2-60、OE-SAH3-3、OE-SAH3-11、OE-SAH4-13、OE-SAH4-14、敲除株系SAH1-KO-1、SAH2/SAH3-KO-2、SAH3-KO-1、SAH4-KO-1、SAH1/SAH4-KO-2。
[0239] 检测21天苗龄待测植株SA、2,5-DHBA和樱花素含量，具体方法参见文献“Liang XX,Chen XJ,Li C,Fan J and Guo ZJ.Metabolic and transcriptional alternations for defense by interfering OsWRKY62 and OsWRKY76 transcriptions in rice.Scientific reports,2017,7:2474|DOI:10.1038/s41598-017-02643-x”。
[0240] 结果见图8。结果显示，超表达转基因株系中SA含量与野生型中花17相比显著下降，2,5-DHBA含量与野生型相比显著升高。敲除株系SAH2/SAH3-KO-2、SAH3-KO-1中2,5-DHBA含量显著降低，所有敲除株系中樱花素含量均大幅度升高。
[0241] 实施例6、转基因植株表型分析
[0242] 待测植株：野生型水稻中花17、超表达株系OE-SAH1-8、OE-SAH1-25、OE-SAH2-53、OE-SAH2-60、OE-SAH3-3、OE-SAH3-11、OE-SAH4-13、OE-SAH4-14、单基因敲除株系SAH1-KO-1、SAH2-KO-7、SAH3-KO-1、SAH4-KO-1、双基因敲除株系SAH1/SAH4-KO-2、SAH2/SAH3-KO-2。
[0243] 在待测水稻的成熟期对水稻的株高进行统计。株高统计时，将最高的稻穗拉直，稻穗尖部朝上与地面成90°夹角，统计的最小样本数量在10株以上，测量地面与穗尖的距离即为株高。待水稻种子收回后，37℃烘干种子、脱粒后，对种子的千粒重进行统计，统计时随机选取100粒种子进行称重，每个株系3个重复试验，用Excel 2010及Spss 18.0对以上数据进行分析。
[0244] 结果见图9，结果显示OsSAH1、OsSAH2、OsSAH3、OsSAH4超表达株系的株高均显著低于野生型中花17。敲除株系的千粒重与野生型并无明显差异。总体上，敲除株系并未降低作物产量。
[0245] 实施例7、转基因植株抗性性分析
[0246] 一、对稻瘟菌的抗性分析
[0247] 待测植株：野生型水稻中花17、超表达株系OE-SAH1-8、OE-SAH1-25、OE-SAH2-53、OE-SAH2-60、OE-SAH3-3、OE-SAH3-11、OE-SAH4-13、OE-SAH4-14、单基因敲除株系SAH1-KO-1、SAH2-KO-7、SAH3-KO-1、SAH4-KO-1、双基因敲除株系SAH2/SAH3-KO-2、SAH1/SAH4-KO-2。
[0248] 利用稻瘟菌小种Magnaporthe oryzae SZ(M.oryzae SZ)分别对21天苗龄的待测水稻叶片进行喷雾接种、对80天苗龄的待测水稻进行注射接种(菌株及注射方法见参考文献“Liu JQ,Chen XJ,Liang XX,Zhou XG,Yang F,Liu Jia,He SY and Guo ZJ.Alternative splicing of rice WRKY62 and WRKY76 transcription factor genes in pathogen defense.Plant Physiol,2016,171:1427-1442”.；公众可以从中国农业大学获得该菌株)，并于喷雾接菌24h后取样，进行化合物检测(具体方法同实施例5)，接菌后的第6天统计病斑面积并拍照。
[0249] 转基因水稻对稻瘟病菌抗性分析结果见图10。图10中，A为21天苗龄的待测水稻叶片喷雾接种病斑面积统计；B为喷雾接种发病叶片照片；C为80天苗龄的待测水稻注射接种病斑长度统计；D为注射接种发病叶片照片。结果显示敲除株系对稻瘟菌抗性增强，表明四个羟基化酶基因负调控水稻对稻瘟病菌的抗性。
[0250] 化合物变化如图11所示。结果显示，各超表达株系中SA均显著低于野生型水平，而敲除株系中水杨酸含量略有升高。各超表达株系中2,5-DHBA含量均高于野生型。稻瘟菌接种能诱导野生型水稻中花17中樱花素的升高，而敲除株系中的樱花素含量始终高于野生型和超表达植株。
[0251] 二、对胡麻斑菌的抗性分析
[0252] 待测植株：野生型水稻中花17、超表达株系OE-SAH1-8、OE-SAH1-25、OE-SAH2-53、OE-SAH2-60、OE-SAH3-3、OE-SAH3-11、OE-SAH4-13、OE-SAH4-14、单基因敲除株系SAH1-KO-1、SAH2-KO-7、SAH3-KO-1、SAH4-KO-1、双基因敲除株系SAH2/SAH3-KO-2、SAH1/SAH4-KO-2。
[0253] 用0.01％的Silwet L-77水溶液配制胡麻斑菌Bipolaris oryzae(B.oryzae)(菌株见参考文献“Jia J,Xing JH,Dong JG,Han JM and Liu JS.Functional analysis of MYB73 of Arabidopsis thaliana against Bipolaris oryzae.Agr Sci China,2011,10:721-727”；公众可以从中国农业大学获得该菌株)的孢子悬浮液，调整孢子浓度为5×105个/mL，对21天苗龄的待测水稻叶片进行喷雾接种。统计时利用Image J软件对10cm的水稻叶片上直径超过0.2cm的菌斑进行计数。结果见图12，结果显示各超表达株系叶片上的病斑数量明显多于野生型水稻中花17，而敲除株系叶片上的病斑个数均显著减少。由此表明，四个水杨酸羟基化酶基因亦能负调控水稻对胡麻斑病菌的抗性。
[0254] 三、对白叶枯菌的抗性分析
[0255] 待测植株：野生型水稻中花17、超表达株系OE-SAH1-8、OE-SAH1-25、OE-SAH2-53、OE-SAH2-60、OE-SAH3-3、OE-SAH3-11、OE-SAH4-13、OE-SAH4-14、单基因敲除株系SAH1-KO-1、SAH2-KO-7、SAH3-KO-1、SAH4-KO-1、双基因敲除株系SAH2/SAH3-KO-2、SAH1/SAH4-KO-2。
[0256] 将白叶枯菌Xoo J18于NA培养基中28℃培养3-4d，用10mM MgCl2悬浮至OD600约为0.8。参照文献：Liu JQ,Chen XJ,Liang XX,Zhou XG,Yang F,Liu Jia,He SY and Guo ZJ.Alternative splicing of rice WRKY62 and WRKY76 transcription factor genes in pathogen defense.Plant Physiol,2016,171:1427-1442”中所述的剪叶接种法，选取完全展开的上部叶片，用小剪刀蘸取菌液后，剪去叶片顶端2-3cm，即完成接菌过程，接种约
10片叶。接种14-18天统计病斑长度。白叶枯菌Xoo J18也记载于上述文献中，公众可以从中国农业大学获得。
10片叶。接种14-18天统计病斑长度。白叶枯菌Xoo J18也记载于上述文献中，公众可以从中国农业大学获得。
[0257] 结果见图13。结果显示，与野生型相比，接种白叶枯接菌后，各超表达株系病斑长度明显增加、病菌扩展速度更快；相反敲除株系的病斑长度显著减少，病斑扩展速度慢，敲除株系的平均病斑长度在4至6.5cm之间显著短于野生型的8.7cm。由此说明，水杨酸羟基化酶基因也能负调控水稻对白叶枯菌的抗性。
[0258] 综上结果表明，四个水稻水杨酸羟基化酶负调控水稻对病原真菌和病原细菌的抗病性，且不影响水稻生长及产量。
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