一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法
阅读：752发布：2021-12-01
专利汇可以提供一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于基因负向调控增加 植物 根瘤数量的方法，首先提取植物组织中总RNA；通过反转录PCR合成PCR反应模板；构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。利用本发明构建的重组表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆根系的根瘤数目。，下面是一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法专利的具体信息内容。
1.一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：通过在植物中下调表达序列表中SEQ ID NO：1所示的基因片段或其同源基因，以增加受体植物根系的结瘤数目。
2.根据权利要求1所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：构建敲除载体并转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。
3.根据权利要求2所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：操作步骤包括：A、首先提取植物组织中总RNA；B、通过反转录PCR合成PCR反应模板；C、构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；D、通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。
4.根据权利要求3所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：步骤C中所述敲除载体的骨架载体为pB7GWIW2载体。
5.根据权利要求4所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：步骤C中所述敲除载体的构建步骤包括：C-1、构建含有目的基因序列的pDONR207载体质粒；C-2、通过LR反应构建目标敲除载体。
6.根据权利要求5所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：步骤C-1的操作过程为：利用步骤B中反转录得到的植物cDNA为模板进行PCR，扩增目的基因片段；其中，扩增所用的正向引物序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO：3所示；扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃
1.5 min，30个循环；72 ℃ 70 sec；PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500 bp附近的条带；回收的 DNA 片段与载体pDONR207连接，5 μl体系中加入pDONR207 vector 1 μl，回收片段3 μl，BP酶1 μl混匀混合液，25 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆并测序。
7.根据权利要求5所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：步骤C-2的操作过程为：提取步骤C-1中得到的含有正确测序的pDONR207载体质粒，然后通过LR反应连接到pB7GWIW2骨架载体，连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，得到目标重组表达载体。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法，其特征在于：所述受体植物为蝶形花科植物。
9.一种具有负向调控功能的重组表达载体，包含pB7GWIW2骨架载体和序列表中SEQ ID NO：1所示的基因片段。
10.包含权利要求9所述重组表达载体的转化体和植物受体。
一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法
技术领域
背景技术
[0002] 大豆是重要的粮油经济作物，其通过根瘤可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供了必需的氮素营养。由根瘤介导的共生固氮过程不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境化学污染。目前，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一，而在分子层面了解大豆的结瘤和根瘤发生发育的分子机制是更加合理利用大豆高结瘤固氮效率这一特点的重要基础。
[0003] 植物激素参与豆科根瘤的形成和发育过程，这其中细胞分裂素（Cytokinin）在调节根瘤发育中起关键作用（Ferguson and Mathesius，2014）。在豆科植物中，可以通过外源施用细胞分裂素诱导根瘤状的结构的发生（Mathesius et al., 2000; Heckmann et al., 2011）。在蒺藜苜蓿中过表达LOG基因（细胞分裂素核苷5'-单磷酸磷酸水解酶）使得根瘤的数目减少（Mortier et al., 2014），异戊烯基转移酶（IPTs）是细胞分裂素生物合成的关键组分，在百脉根中叶片中由根瘤菌侵染诱导的LjIPT3可以促进细胞分裂素的合成并向地下运输来实现对二次结瘤的抑制（Sasaki et al., 2014）；除此之外，由根瘤菌侵染诱导的细胞分裂素氧化酶/脱氢酶基因（CKX）在根瘤原基和发育的根瘤中表达，蒺藜苜蓿中的ckx3突变体中细胞分裂素含量显着增加并抑制根瘤的发生，表明适量的细胞分裂素对豆科植物的结瘤特别重要（Dugald et al., 2016）。
[0004] 百脉根细胞分裂素受体的功能获得型突变能够产生自发结瘤（Gonzalez-Rizzo et al., 2006），而苜蓿和百脉根中的细胞分裂素受体突变体cre1和lhk1丧失了形成根瘤原基的能力。响应调节因子（RR）是细胞分裂素信号传导的下游关键组分，这其中 A响应调节因子是细胞分裂素信号通路中的负调节因子，包括ARR3-ARR9和ARR15-ARR17，它们只有10个受体结构域和短C末端；而B型反应调节因子是细胞分裂素信号通路中的正调节因子，包括ARR1，ARR2，ARR10-ARR14，ARR18-ARR21，其具有11个信号接受结构域、C末端DNA结合结构域和转录激活结构域，它们可以直接调节下游靶基因并激活A型反应调节因子的表达（Jennifer et al., 2008）。
[0005] 而关于RR在调控大豆结瘤中的作用，目前尚未见到。有关B型的响应因子RR11在大豆根系结瘤和共生固氮中是否有调控作用还没有报道。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种基于基因负向调控增加植物根瘤数量的方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0009] 作为本发明的一种优选技术方案，构建敲除载体并转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。
[0010] 作为本发明的一种优选技术方案，操作步骤包括：A、首先提取植物组织中总RNA；B、通过反转录PCR合成PCR反应模板；C、构建用于敲除对应基因的重组表达载体作为敲除载体；D、通过农杆菌介导的毛状根转化法转化受体植物，以下调受体植物中对应基因的表达，增加受体植物根系的结瘤数目。
[0011] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中所述敲除载体的骨架载体为pB7GWIW2载体。
[0012] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C中所述敲除载体的构建步骤包括：C-1、构建含有目的基因序列的pDONR207载体质粒；C-2、通过LR反应构建目标敲除载体。
[0013] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C-1的操作过程为：利用步骤B中反转录得到的植物cDNA为模板进行PCR，扩增目的基因片段；其中，扩增所用的正向引物序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO：3所示；扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 70 sec；PCR扩增产物进行
1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500 bp附近的条带；回收的 DNA 片段与载体pDONR207连接，5 μl体系中加入pDONR207 vector 1 μl，回收片段3 μl，BP酶1 μl混匀混合液，25 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆并测序。
1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500 bp附近的条带；回收的 DNA 片段与载体pDONR207连接，5 μl体系中加入pDONR207 vector 1 μl，回收片段3 μl，BP酶1 μl混匀混合液，25 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆并测序。
[0014] 作为本发明的一种优选技术方案，步骤C-2的操作过程为：提取步骤C-1中得到的含有正确测序的pDONR207载体质粒，然后通过LR反应连接到pB7GWIW2骨架载体，连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，得到目标重组表达载体。
[0015] 作为本发明的一种优选技术方案，所述受体植物为蝶形花科植物。
[0016] 本发明的技术创新还包含一种具有负向调控功能的重组表达载体，包含pB7GWIW2骨架载体和序列表中SEQ ID NO：1所示的基因片段。
[0017] 本发明的技术创新还包含具有上述重组表达载体的转化体和植物受体。
[0019] 图1为实施例中，目的基因在根、叶和瘤中的表达模式（图1 A）以及在响应长期根瘤菌侵染的表达模式分析（图1 B）。可见该基因主要在根瘤中表达，且在根瘤菌侵染后的大豆根中，目的基因的表达受到显著诱导，该结果说明目的基因参与了大豆根系结瘤固氮的过程。
[0020] 图2为实施例2-3中，过表达和敲除GmRR11L1后对大豆结瘤的表型分析，在完全相同的实验环境下，上调表达GmRR11L1的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著减少(图2A-2C)，图2A为对转基因根系中 GmRR11L1的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmRR11L1的表达是显著上调的；下调表达GmRR11L1的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著减少(图2D-2F)，图2D为对转基因根系中GmRR11L1的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmRR11L1的表达是显著下调的。
具体实施方式
[0021] 以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的百分比（%），如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，如无特别说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0022] 实施例 1、目的基因的组织表达模式以及其在响应根瘤菌处理的表达模式分析。
[0023] 1）材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（W82）；材料按照以下流程进行：大豆种子用70%的洒精灭菌30 sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16 h光/8 h 暗，光强7000 LUX，温度26 ℃，相对湿度为70%。播种后10天，用OD600=0.08的USDA110进行接菌处理，并在相应的时间点取样检测基因的表达，而针对在根、叶和瘤中表达模式，在接菌28DAI取样。
[0024] 2）mRNA的分离：采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2 g加入1 mL离心管中然后加入1 mL TRI pure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5 min；②加200 μL氯仿，振荡混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心15 min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；④弃上清，用75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干
10 min左右，加20 μl左右DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。
10 min左右，加20 μl左右DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。
[0025] 3）反转录为cDNA：将提取的mRNA用TaKaRa反转录试剂盒，反转录为cDNA。
[0026] 4）实时荧光定量PCR分析：采用TIANGEN公司的 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒，具体实验方法如下：在10 μl体系中加入上步所得cDNA模板0.2 μl、正反向引物各0.2 μl、2 x SuperReal PreMix Plus 5 μl、ddH2O 4.4 μl；扩增程序为：95 ℃，15 min；95 ℃，10 sec；60 ℃，34 sec，40 cycles；65 ℃，5 sec，95 ℃，5 sec；其中，正向引物为：CTTGCAGAAATACAGGCTTTAT（SEQ ID NO：4）；反向引物为：ATCATTTTGTTGCTTGATTACTG（SEQ ID NO：5）。
[0027] 5）结果：如图1所示，随着根瘤菌处理后的时间的增加，目的基因的表达先受到显著诱导，该结果说明目的基因是受根瘤菌诱导的。
[0028] 实施例2、利用过表达载体上调表达目的基因，改变结瘤的数目。
[0029] 1）Wilimas82大豆根组织中总RNA的提取研钵经 180 ℃高温处理8 h或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1 ‰ DEPC水处理过夜后121 ℃高温湿热灭菌30 min，枪头，离心管65 ℃烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA：
（1）取100 mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1 mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 mL 离心管，室温放置5 min；
（2）加入200 μl 氯仿，震荡混匀，静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）弃上清，用1 mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀；
2）反转录PCR
（1）在用DEPC 处理过的的200 μl PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo (dt)18；4 μL dNTPs，65 ℃温育5 min 后迅速置于冰上冷却；
（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；
（4）将上述反应液混匀，37 ℃反应30 min；
（5）反应结束后，70 ℃处理10 min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板。
（1）取100 mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1 mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 mL 离心管，室温放置5 min；
（2）加入200 μl 氯仿，震荡混匀，静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）弃上清，用1 mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀；
2）反转录PCR
（1）在用DEPC 处理过的的200 μl PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo (dt)18；4 μL dNTPs，65 ℃温育5 min 后迅速置于冰上冷却；
（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；
（4）将上述反应液混匀，37 ℃反应30 min；
（5）反应结束后，70 ℃处理10 min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板。
[0030] 3）构建重组表达载体（1）目的基因片段的克隆
根据目的的编码序列（SEQ ID NO：1）设计引物对用于过表达载体构建，引物末端分别引入gateway接头；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增基因片段；引物序列为：
正向引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGATAATGGTTGTTTCTCTT（SEQ ID NO: 2）；
反向引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CAGAACTGGCATAATCATTG（SEQ ID NO:
3）；
扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 1.5 min，30个循环；
72 ℃ 70 sec；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500 bp左右的条带；
回收的 DNA 片段与载体pDONR207 (Invitrogen 公司) 连接，5 μl体系中加入pDONR207 vector 1 μl，回收片段3 μl，BP酶1 μl混匀混合液，25 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。
根据目的的编码序列（SEQ ID NO：1）设计引物对用于过表达载体构建，引物末端分别引入gateway接头；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增基因片段；引物序列为：
正向引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGATAATGGTTGTTTCTCTT（SEQ ID NO: 2）；
反向引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CAGAACTGGCATAATCATTG（SEQ ID NO:
3）；
扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 1.5 min，30个循环；
72 ℃ 70 sec；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500 bp左右的条带；
回收的 DNA 片段与载体pDONR207 (Invitrogen 公司) 连接，5 μl体系中加入pDONR207 vector 1 μl，回收片段3 μl，BP酶1 μl混匀混合液，25 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。
[0031] (2) 重组表达载体的构建a. 提取含有正确测序的基因序列的pDONR207载体质粒；
b. 通过LR反应连接到C3F；
c. 将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmRR11L1- C3F。
b. 通过LR反应连接到C3F；
c. 将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmRR11L1- C3F。
[0032] 4）农杆菌K599介导的毛状根转化：（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：
a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒质粒GmRR11L1- C3F，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；
b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μl LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 (150 r/min) 4-5 h；
c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板含50 mg/ml 卡那霉素）；
d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
（2）农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10 h后，在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD600=0.6）后，将外植体转至1/2 MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8 cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110（OD600=0.08）30 mL/株，培养28天后统计根瘤数量。
a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒质粒GmRR11L1- C3F，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；
b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μl LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 (150 r/min) 4-5 h；
c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板含50 mg/ml 卡那霉素）；
d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
（2）农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10 h后，在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD600=0.6）后，将外植体转至1/2 MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8 cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110（OD600=0.08）30 mL/株，培养28天后统计根瘤数量。
[0033] 5. 结果观察结果如图2所示，表明在完全相同的实验环境下，上调表达质粒GmRR11L1- C3F的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著减少（图2 A-2 C），图2 A为对转基因根系中目的基因的表达水平分析，结果显示在转基因根系中目的基因的表达是显著上调的。
[0034] 实施例3、利用敲除载体下调表达目的基因，改变结瘤的数目。
[0035] 1）Wilimas82大豆根组织中总RNA的提取研钵经 180 ℃高温处理8 h或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1 ‰ DEPC水处理过夜后121 ℃高温湿热灭菌30 min，枪头，离心管65 ℃烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA：
（1）取100 mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1 mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 mL 离心管，室温放置5 min；
（2）加入200 μl 氯仿，震荡混匀，静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）弃上清，用1 mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀；
2）反转录PCR
（1）在用DEPC 处理过的的200 μl PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo (dt)18；4 μL dNTPs，65 ℃温育5 min 后迅速置于冰上冷却；
（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；
（4）将上述反应液混匀，37 ℃反应30 min；
（5）反应结束后，70 ℃处理10 min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板。
（1）取100 mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1 mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5 mL 离心管，室温放置5 min；
（2）加入200 μl 氯仿，震荡混匀，静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；
（4）弃上清，用1 mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀；
2）反转录PCR
（1）在用DEPC 处理过的的200 μl PCR管中顺序加入5μL RNA 和3μL oligo (dt)18；4 μL dNTPs，65 ℃温育5 min 后迅速置于冰上冷却；
（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；
（4）将上述反应液混匀，37 ℃反应30 min；
（5）反应结束后，70 ℃处理10 min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA 第一条链可用作PCR反应模板。
[0036] 3）构建重组表达载体（1）目的基因片段的克隆
根据目的基因的编码序列（SEQ ID NO：1）设计引物对用于过表达载体构建，引物末端分别引入gateway接头；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增目的基因的基因片段；引物序列为：
正向引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGATAATGGTTGTTTCTCTT（SEQ ID NO: 2）；
反向引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CAGAACTGGCATAATCATTG（SEQ ID NO:
3）；
扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 1.5 min，30个循环；
72 ℃ 70 sec；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500 bp左右的条带；
回收的 DNA 片段与载体pDONR207 (Invitrogen 公司) 连接，5 μl体系中加入pDONR207 vector 1 μl，回收片段3 μl，BP酶1 μl混匀混合液，25 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。
根据目的基因的编码序列（SEQ ID NO：1）设计引物对用于过表达载体构建，引物末端分别引入gateway接头；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增目的基因的基因片段；引物序列为：
正向引物：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGGATAATGGTTGTTTCTCTT（SEQ ID NO: 2）；
反向引物：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CAGAACTGGCATAATCATTG（SEQ ID NO:
3）；
扩增程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，68 ℃ 1.5 min，30个循环；
72 ℃ 70 sec；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1500 bp左右的条带；
回收的 DNA 片段与载体pDONR207 (Invitrogen 公司) 连接，5 μl体系中加入pDONR207 vector 1 μl，回收片段3 μl，BP酶1 μl混匀混合液，25 ℃连接过夜，热击法转入E.coli 大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。
[0037] (2) 重组表达载体的构建a. 提取含有正确测序的基因序列的pDONR207载体质粒；
b. 通过LR反应将GmRR11L1连接到pB7GWIW2；
c. 将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmRR11L1- pB7GWIW2。
b. 通过LR反应将GmRR11L1连接到pB7GWIW2；
c. 将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37 ℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmRR11L1- pB7GWIW2。
[0038] 4）农杆菌K599介导的毛状根转化：（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作为：
a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒质粒GmRR11L1- pB7GWIW2，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；
b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μl LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 (150 r/min) 4-5 h；
c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板含50 mg/ml 卡那霉素）；
d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
（2）农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10 h后，在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD600=0.6）后，将外植体转至1/2 MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8 cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110（OD600=0.08）30 mL/株，培养28天后统计根瘤数量。
a. 取出冻存的200 μl感受态细胞，融化后加入5-10 μl质粒质粒GmRR11L1- pB7GWIW2，轻弹管壁混匀，冰上放20-30 min；
b. 放入液氮中5 min后取出，将管转入37 ℃（5 min）融化后，加入800 μl LB（无抗性）液体培养基，28 ℃低速振荡 (150 r/min) 4-5 h；
c. 4000 r/min，30 sec, 去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板含50 mg/ml 卡那霉素）；
d. 置28 ℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
（2）农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10 h后，在B5培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD600=0.6）后，将外植体转至1/2 MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8 cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110（OD600=0.08）30 mL/株，培养28天后统计根瘤数量。
[0039] 5. 结果观察结果如图2所示，表明在完全相同的实验环境下，下调表达质粒GmRR11L1- pB7GWIW2的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV2）相比，根瘤数量显著增多（图2 D-2 F），图2D为对转基因根系中目的基因的表达水平分析，结果显示在转基因根系中目的基因的表达是显著下调的。
[0040] 综上实施例可见，本发明构建的过表达载体能够特异的过表达大豆中的GmRR11L1基因。此基因定位在大豆18号染色体上，实时荧光定量PCR检测结果表明， GmRR11L1基因在大豆根中的表达受到根瘤菌侵染的诱导；通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析显示，上调表达GmRR11L1可以显著抑制大豆结瘤数目，敲除GmRR11L1可以显著增加大豆结瘤数目，表明GmRR11L1在大豆根瘤发育中具有重要的作用，并培育形成了根瘤数目增多的转基因大豆。
[0041] 上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
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