技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域,涉及一种丹参潜在生长素受体SmTIR1基因及其克隆方法。
背景技术
[0002] 生长素一直是影响
植物生长发育的重要因素,对于生长素的研究从未停息,作为与生长素结合并介导下游反应的受体,也一直备受关注。TIR1受体首先发现于一种拟南芥突变体,从中分离得到TIR1的基因,并将其产物称作运输抑制响应蛋白1(Transport inhibitorprotein 1,TIR1)。TIR1是一个含有F-box的
蛋白质,已知F-box是一个蛋白质与另一个蛋白质结合的特征性结构域。在之后的研究中有学者发现TIR1可以直接与Aux/IAA蛋白相结合然后介导该蛋白的降解。(Aux/IAA蛋白是参与生长素诱导的生理反应中特异的蛋白组分)当TIR1与生长素结合并被活化后,与结合生长素响应因子(ARFs)的Aux/IAA蛋白结合,形成SCFTIR1-Aux/IAA
复合体,随后复合体上的Aux/IAA蛋白被泛素化,介导蛋白酶体降解。并同时激活ARFs使生长素诱导的基因表达,引起生长素反应。
[0003] 丹参中并未出现过与SmTIR1基因相关的研究,也未曾有关于丹参中该基因的报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于,提供一种丹参潜在生长素受体SmTIR1基因及其克隆方法。对基因结构、功能、产物进行预测与分析,而对于预测的结果缺少实验验证。预测为研究植物丹参的潜在生长素受体基因SmTIR1的功能与相应的
信号通路研究提供了方向与依据。
[0005] 其技术方案如下:
[0006] 一种丹参潜在生长素受体SmTIR1基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007] TTTGCACGCCTGCCGTTCGACGATTCTTGTTGAGGCCTAAATGAATCCATCCTCCGAAAGCGAAATGGATCCAGAGCCGA
[0008] AGAAAGCTGAGGATTTGCCATCAAACTCTGAAAATTCCCATGGGCCAGTTCACCCTCAATCACCATTCCCAGATGAAGTG
[0009] CTAGAGAAAGTCCTCTCATTCGTAGATTCACATAAAGACAGGAGCTCACTCTCCCTTGTGCGCAAAGATTGGTATAATGC
[0010] TGAGAGATGGACAAGATCAAAGCTTTTTATTGGAAACTGCTATGCAGTGTCACCAGAAATAGTGGCTAGAAGGTTCCGAA
[0011] GAATTAAGAGTGTTACACTTAAAGGGAAGCCAAGATTTTCGGATTTTAATATGTTGCCACTGGATTGGGGTGCTAATGTG
[0012] CATTCTTGGTTGGTTATGTTTGCCAAAGTTTACCCGTTCTTGGAGGAGCTGAGACTTAAGAGGATGACCATCACTGATGA
[0013] GGGTCTGGAGCTCTTGGCGAAGTCATTCCCTGGCTTCAAGGCTTTATCTTTGTCCAGTTGTGATGGATTCACTGAAAATG
[0014] GGCTCAAAGCAACTGCCAGTCATTGCAGGAACTTGACTGAGCTCAACATACAGGACAGTATAGCAGAGGAAGTTGGTGGA
[0015] GGTTGGTTGAGTTGCTTCCCGGAAAACTTTGCTTCACTGGAAATACTAAACTTTTCTAGTCTCAATGGTGATGTCAATTT
[0016] TGATGACTTGGAGAGACTTGTGAGTCGGTGCAAACTATTAAGAGTTCTGAAGGTCAATGAGAGTATTACCTTGGATCAAT
[0017] TGCAACGGCTGCTTGTGCACGCTCCTAGATTAACAGAGCTTGGCACCGGTTCCTTCCAGCAAGAACTCACGCCTCGCCAA
[0018] TATGAAGAGATTGAAACTGCATTTTGTAATTGTAGAAATCTCCAGGTTCTTTCAGGTTTGTGGGAAGCAACTTCCTTATA
[0019] TCTCCCTCTTCTTTATGGAGCTTGTGCCAGCCTGACTTTCTTGAACTTGAGCGATGCGCCCCTTCAAAGTGGTGAATTTG
[0020] CAAAGCTTCTTGCTTACTGCCCCAATTTACGATGCCTTTGGGTAATTGATACAGTAGAAGACAAGGGGCTCGAGGCTGTT
[0021] GGTTCGAGCTGTCCCTTGCTTGAAGAGCTACGAGTCTACCCTGCTGATCCATATGACCGGCATCATCGTGATGGGGTGAC
[0022] TGAATTAGGTTTCTTGGCAGTGTCTCGTGGATGCCCCAAACTCCACTATGTTCTCTACTTCTGCAGGAGGATGACTAATG
[0023] CTGCTGTCGTGACCATAGTGCAGAACTGCCCTGATTTTACCCACTTCCGTCTATGCATTATGACCCCAGGCCAACCAGAT
[0024] TACCTCACAAACGACCCCATGGATGAGGCCTTTGGCGCTGTTGTCAAAACCTGCATGAAAATTAAGAGGCTTTCAGTTTC
[0025] GGGCCTTCTAACTGATCGAACATTTGAGTATATTGGCAAGTATGCGAAAGATCTTGAGACACTGTCTGTGGCTTTTGCTG
[0026] GCAGCAGCGATTGGGGAATGCAGTGTATCATGGAAGGCTGTCCTAAGCTGAGGAAGCTCGAGATTAGAGATTGCCCCTTT
[0027] GGAGATGCTGCTCTGCTGTCTGGACGAGTGAAATATGAGATGATGCGATCATTATGGATGTCCACGTGCAGTGTGACCAT
[0028] GAAAGGCTGCAGACTACTCGCAAGGGAGTTTCCAAGACTCAATGTAGAAGTGATTAGAGAGGAGGGAGGTGATGAAGATC
[0029] AAGCTCACAAAGTGTACGTCTATCGTTCTGTAGCAGGGCCAAGACGGGATGCCCCGCCATTTGTTCTCACAGTTTGACAG
[0030] TGAAGGGAAAACCAATCTCTGGAAGATCCGCGCGTACCGAGCTACTG。
[0031] 一种丹参潜在生长素受体SmTIR1基因的克隆方法,包括以下步骤:
[0032] 步骤1、RNA的提取与第一链cDNA合成
[0033] 取100g丹参
叶片放于研钵,倒入液氮
研磨,然后利用天根多糖多酚植物RNA提取
试剂盒(天根,cat.DP441,北京,中国)提取丹参总RNA。利用NanoDrop③测定RNA浓度,RNA储藏与-80℃
冰箱保存,用于下游cDNA合成。
[0034] 步骤2、cDNA的合成(反转录)
[0035] 将测的浓度后的丹参总RNA利用Takara反转录试剂盒(TaKaRa,Code No.RR047A,北京,中国)进行反转录,得到丹参的cDNA。
[0036] 步骤3、引物的设计与基因的克隆、扩增
[0037] 用primer6.0设计扩增引物,对SmTIR1基因进行克隆与扩增。
[0038] 对SmTIR1基因进行克隆、扩增
[0039] 引物的序列如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3所示:
[0040] tir1-F:CTTGTTGAGGCCTAAATGAATCCATCC
[0041] tir1-R:GGTTTTCCCTTCACTGTCAAACTG
[0042] 扩增条件:
[0043] 95℃5min,(95℃45s,58℃45s,72℃2min)35个循环,72℃10min,4℃[0044] 与
现有技术相比,本发明的有益效果:
[0045] 本发明在丹参中发现潜在生长素受体SmTIR1,并首次通过克隆获得SmTIR1基因,得到ORF区,随后对其基因结构、基因的上有启动子调控区进行预测,对整个基因的潜在结构与功能有了更为深刻的认识。研究植物生长发育的关键基因。
附图说明
[0046] 图1是:对SmTIR1基因克隆扩增后的凝胶
电泳图;
[0047] 图2是:基因结构预测(CDS区的预测);
[0048] 图3是:SmTIR1基因编码蛋白的蛋白二级结构预测;
[0049] 图4是:SmTIR1基因编码蛋白的蛋白三级结构预测;
[0051] 图6是:进化关系预测(进化树);
[0052] 图7是:潜在生长素受体基因SmTIR1上游启动子调控区预测结果。
具体实施方式
[0053] 下面结合附图和
实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0054] 对SmTIR1基因进行克隆、扩增
[0055] 引物
[0056] tir1-F:CTTGTTGAGGCCTAAATGAATCCATCC
[0057] tir1-R:GGTTTTCCCTTCACTGTCAAACTG
[0058] 扩增条件
[0059] 95℃5min,(95℃45s,58℃45s,72℃2min)35个循环,72℃10min,4℃。对SmTIR1基因克隆扩增后的凝胶电泳图如图1所示。
[0060] (所用DNAMaker TIANGEN 500bp DNAladder)
[0061] 对所获得的克隆序列进行生物信息学预测及分析
[0062] 1.SmTIR1潜在受体基因结构
预测分析(CDS区预测结果)如图2所示。
[0063] 2.SmTIR1受体基因所编码蛋白结构与性质分析(包括蛋白二级结构、三级结构预测及分析,蛋白质性质与
磷酸化位点预测分析)如图3所示。
[0064] 蛋白质二级结构预测(SmTIR1编码蛋白包含47.97%α螺旋,35.76%无规卷曲,延伸链12.37%,β转
角3.90%)如图4所示。
[0065] 分析磷酸化位点,共发现丝
氨酸位点35个,苏氨酸位点14个,酪氨酸位点4个,如图5所示。
[0066] 3.对潜在生长素受体SmTIR1基因进化关系预测结果如图6所示。
[0067] Salvia splendens(SsTIR1,TEY30884.1);Sesamum indicum(SiTIR1,XP011096196.1);Erythranthe guttata(EgTIR1,XP 012849055.1);Nicotiana tomentosiformis(NtTIR1,XP 009603009.1);Nicotiana sylvestris(NSTIR1,XP009763253.1)Daucus carota subsp.Sativus(Dcs.sativus TIR1,XP 017229520.1);Camellia sinensis(CsTIR1,XP 028113968.1)。
[0068] 4.对潜在生长素受体基因SmTIR1上游2000bp进行预测(结果见图7)。
[0069] 表1丹参TIR1启动子顺式作用元件预测分析
[0070]
[0071]
[0072]
[0073]
[0074] 以上所述,仅为本发明最佳实施方式,任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。