一种耐辐射野生型丛枝菌根真菌诱变筛选富集植物共生菌新
种质的方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及诱变筛选富集植物共生菌新种质的方法，属于
微生物选育技术领域。
背景技术
[0002] 菌根(mycorrhiza)是植物根系与
土壤中某些特定真菌形成的共生体，能形成菌根的特定真菌称为菌根真菌。菌根真菌能够与植物根系建立互惠共生体系，一方面从
宿主植物获取
碳水化合物，同时向植物提供土壤中的矿质营养，尤其是磷素。菌根按照在植物体内的着生部位和形态特征分为
内生菌根、外生菌根和内外生菌根。丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal,AM)是内生菌根中分布最广的类群，其胞内菌丝在根皮层细胞内及细胞间延伸形成丛枝状结构，可以和大多数植物共生，陆地
生态系统中80％～90％的植物根系能够与其建立互惠共生体。丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)分布广泛，高山地带、针叶林带、热带雨林、草原、农田都有分布，甚至在高度退化地区也有分布。近年来的研究表明，在重金属或其他的污染土壤中，AMF能协助宿主抵抗不良胁迫，促进植物的生长和对重金属的富集，AMF可以提高植物对重金属的转移能
力，使植物地上部的重金属浓度升高，有利于提高
植物修复的效率。AMF不能降解和破坏核素和重金属，但可通过改变它们的化学或物理特性而影响核素和金属在环境中的迁移与转化。科学家已发现对辐射有极度耐受能力的微生物(耐辐射奇球菌)及某些能高效积累
放射性核素和重金属的微生物，显示出
微生物处理放射性核素和重金属的良好应用前景。
[0003] 微生物在放射性核素的固定中有着诱人的应用前景，但微生物应用到放射性核素的处理中还面临许多问题，其中最受关注的是微生物对放射性核素的
吸附富集、
氧化还原等能力与耐辐射能力往往不能同时具备，严重限制了微生物在放射性核素污染治理中的应用。如要真正实现微生物在放射性核素废物的
生物修复方面的实际应用，还有许多理论和实际问题要解决。已经报道有很多野生型微生物天然或经基因工程改建后具备转化、氧化还原解毒或原位
固化多种核素和重金属功能。但这些微生物存在的一个明显
缺陷是对辐射敏感，只能在辐射水平较低的环境中发挥功能。
铀尾矿区污染土壤长时间受放射性污染，导致土壤微生种群逐渐适应了铀尾矿区污染环境，在已有的微生种群产生耐受性的
基础上，还与可能新产生的抗胁迫种群和耐辐射菌株。
[0004] 在铀尾矿高污染土壤中丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)适应强，生长pH、
温度范围广，能分解多种底物，产酶活性高，从菌剂
角度，丛枝菌根真菌有更宽广的应用前景。因此，本发明通过在自然条件比较严酷，辐射、重金属、贫瘠、缺水等影响较大的铀尾矿环境，特别是铀尾矿高污染区域野生型微生物种群因经历长期的自然选择，往往表现比人工选育的同属微生物种群具有更强的适应性，因此筛选铀尾矿高污染土壤中耐辐射野生优势丛枝菌根真菌菌株作为出发菌株，利用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对其进行随机化学诱变筛选，通过菌群菌株充分融合的多重有性重组，使耐辐射丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排，筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种耐辐射野生型丛枝菌根真菌诱变筛选U污染氧化还原原位固定新种质的方法，以筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0008] A、从铀尾矿高污染土壤中分离获得耐辐射野生型丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)菌株；
[0009] B、用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株进行随机化学诱变筛选；
[0010] C、通过菌群菌株充分融合的有性重组，使耐辐射丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排，筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。
[0011] 本发明所述的从铀尾矿高污染土壤中分离获得耐辐射野生型丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)菌株，是从铀含量80～180mg/kg(土)的铀尾矿高污染土壤中分离获得耐辐射野生型丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)菌株；在铀尾矿中选择U含量80～180mg/kg(土)的高污染土壤取样，按重量比土样：无菌水＝1:10制备土壤稀释液，静置澄清，取上层液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，筛选获得耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株；所述的用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株进行随机化学诱变筛选，是用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株进行随机化学诱变筛选；挑取固体培养基上的菌丝放入液体培养基中，加入体积浓度4％～6％的甲基磺酸乙酯和体积浓度0.1％～0.3％的叠氮化钠，36℃，140r/min，培养24h，得到耐辐射野生型丛枝菌根真菌化学诱变菌液所述的通过菌群菌株充分融合的有性重组，使耐辐射丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排，筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质，是通过菌群菌株充分融合的有性重组4次，使耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排：
[0012] ①取原始诱变耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，然后挑取菌丝加入液体培养基中，36℃，140r/min培养24h，此过程是使菌群菌株能够发生充分融合；挑取，并将其涂布在含有100mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上；于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第二轮重排的母本；
[0013] ②第二轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第三轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含250mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第三轮重排的母本；
[0014] ③第三轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含500mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第四轮重排的母本；
[0015] ④第四轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含1000mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上；于32℃下培养2d后，从该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群中筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。
[0016] 所述的固体培养基由蛋白胨5g，
酵母浸出粉2g，
葡萄糖20g，
磷酸氢二
钾1g，
硫酸镁0.5g，琼脂17g，水1000m1组成；所述液体培养基：由
牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖lOml，
氯化钠5g，水1000m1组成。
[0017] 铀尾矿高污染土壤长时间受放射性污染，导致土壤微生种群逐渐适应了铀尾矿区污染环境，在已有的微生种群产生耐受性的基础上，还与可能新产生的抗胁迫种群和耐辐射菌株。本发明通过在自然条件比较严酷，辐射、重金属、贫瘠、缺水等影响较大的铀尾矿高污染环境中筛选耐辐射野生优势丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)菌株作为出发菌株，利用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对其进行随机化学诱变筛选，通过菌群菌株充分融合的多重有性重组，使耐辐射丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排，筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。本发明所筛选的丛枝菌根真菌新种质菌株修复效率比对照菌株提高了90％以上。
具体实施方式
[0018] 下面结合具体
实施例对本发明做进一步详细说明。
[0019] 实施例1：(1)从铀尾矿中选择U含量80mg/kg(土)的高污染土壤取样，按重量比土样：无菌水＝1:10制备土壤稀释液，静置澄清，取上层液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，筛选获得耐辐射野生型丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)菌株；(2)用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株进行随机化学诱变筛选；挑取固体培养基上的菌丝放入液体培养基中，加入体积浓度4％的甲基磺酸乙酯和体积浓度0.3％的叠氮化钠，36℃，140r/min，培养24h，得到耐辐射野生型丛枝菌根真菌化学诱变菌液；(3)通过菌群菌株充分融合的有性重组4次，使耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排：
[0020] ①取原始诱变耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，然后挑取菌丝加入液体培养基中，36℃，140r/min培养24h，此过程是使菌群菌株能够发生充分融合；挑取，并将其涂布在含有100mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上；于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第二轮重排的母本；
[0021] ②第二轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第三轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含250mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第三轮重排的母本；
[0022] ③第三轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含500mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第四轮重排的母本；
[0023] ④第四轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含1000mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，从该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群中筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。
[0024] 实施例2：(1)从铀尾矿中选择U含量180mg/kg(土)的高污染土壤取样，按重量比土样：无菌水＝1:10制备土壤稀释液，静置澄清，取上层液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，筛选获得耐辐射野生型丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)菌株；(2)用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株进行随机化学诱变筛选；挑取固体培养基上的菌丝放入液体培养基中，加入体积浓度6％的甲基磺酸乙酯和体积浓度0.1％的叠氮化钠，36℃，140r/min，培养24h，得到耐辐射野生型丛枝菌根真菌化学诱变菌液；(3)通过菌群菌株充分融合的有性重组4次，使耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排：
[0025] ①取原始诱变耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，然后挑取菌丝加入液体培养基中，36℃，140r/min培养24h，此过程是使菌群菌株能够发生充分融合；挑取，并将其涂布在含有100mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上；于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第二轮重排的母本；
[0026] ②第二轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第三轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含250mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第三轮重排的母本；
[0027] ③第三轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含500mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第四轮重排的母本；
[0028] ④第四轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含1000mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，从该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群中筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。
[0029] 实施例3：(1)从铀尾矿中选择U含量140mg/kg(土)的高污染土壤取样，按重量比土样：无菌水＝1:10制备土壤稀释液，静置澄清，取上层液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，筛选获得耐辐射野生型丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)菌株。(2)用甲基磺酸乙酯(EMS)+叠氮化钠(NaN3)对耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株进行随机化学诱变筛选；挑取固体培养基上的菌丝放入液体培养基中，加入体积浓度5％的甲基磺酸乙酯和体积浓度0.2％的叠氮化钠，36℃，140r/min，培养24h，得到耐辐射野生型丛枝菌根真菌化学诱变菌液。(3)通过菌群菌株充分融合的有性重组4次，使耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌株间发生基因组重排：
[0030] ①取原始诱变耐辐射野生型丛枝菌根真菌菌液在固体培养基上通过划线培养分离，37℃，培育5天，然后挑取菌丝加入液体培养基中，36℃，140r/min培养24h，此过程是使菌群菌株能够发生充分融合；挑取，并将其涂布在含有100mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上；于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第二轮重排的母本；
[0031] ②第二轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第三轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含250mg/l铀酰离子(UO2)2+的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第三轮重排的母本；
[0032] ③第三轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含500mg/l铀酰离子+(UO2)2的选择平板上。于32℃下培养2d后，将该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群作为第四轮重排的母本；
[0033] ④第四轮基因组重排，将选择平板上筛选得到的优良性状的重组菌株作为第四轮重排的母本，方法同第一轮重排，将重排后的丛枝菌根真菌菌丝涂布在含1000mg/l铀酰离+子(UO2)2的选择平板上。于32℃下培养2d后，从该平板上形成的丛枝菌根真菌菌群中筛选获得U污染生物修复富集植物-微生物共生组合丛枝菌根真菌的新种质。
[0034] 所述的固体培养基由蛋白胨5g，酵母浸出粉2g，葡萄糖20g，
磷酸氢二钾1g，
硫酸镁0.5g，琼脂17g，水1000m1组成；所述液体培养基：由牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖lOml，氯化钠5g，水1000m1组成。
[0035] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
