一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法专利检索-园艺作物农作物作物管理专利检索查询-专利查询网

一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法

阅读：827发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于植物基因工程领域，具体公开一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法。包括以下步骤：（1）对控制番茄固形物的基因INVINH1进行序列分析，确定特异的sgRNA序列；（2）构建含有sgRNA和Cas9蛋白的表达载体；（3）利用农杆菌侵染法将重组载体转化到果实低固形物含量的番茄中，获得T0代转基因植株；（4）将INVINH1基因序列发生纯合突变的T0代植株种植于温室，自交获得T1代植株，从T1代中筛选不含有外源转基因成份但是INVINH1基因发生纯合突变且果实固形物含量高的植株，即为高固形物番茄材料。本方法成本低，缩短制备周期，一年之内即可获得高固形物番茄材料，且该高固形物番茄不含有外源基因，安全无风险。，下面是一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法，其中INVINH1基因第1外显子的核苷酸如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的INVINH1基因第1外显子，其特异性靶向sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求2所述sgRNA序列的CRISPR/Cas9载体。
4.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体在制备果实高固形物含量番茄材料中的应用。
5.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体在番茄改良育种中的应用。
6.一种果实高固形物含量番茄材料的制备方法，包括以下步骤：
（1）利用农杆菌侵染法将权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体转化到低固形物番茄中，获得T0代转基因植株；
（2）将T0代植株自交获得T1代植株；
（3）从T1代中筛选不含有外源转基因成份，但INVINH1基因发生纯合突变且果实固形物含量显著提高的植株，即高固形物番茄材料。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的低固形物番茄为果实固形物含量低的纯合自交系材料，市售可得。
8.一种检测权利要求6所述的制备方法获得的高固形物番茄生物材料中INVINH1是否成功进行了基因编辑的检测方法，其特征在于：
首先，设计特异性引物对，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
然后，利用PCR扩增INVINH1基因的特异片段如SEQ ID NO.5所示，对PCR产物进行测序；
最后，将测序结果与野生型INVINH1基因进行序列比对，检测在sgRNA的位置是否有碱基突变，如果有碱基突变，意味着成功对INVINH1进行了编辑。

说明书全文

一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程和基因遗传修饰领域，具体涉及一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法。

背景技术

[0002] 番茄(Solanum lycopersicum)是重要的蔬菜和经济作物，在世界范围内广受欢迎。我国是鲜食番茄第一大生产国，也是加工番茄的第三大生产国，在世界番茄市场中具有举足轻重的地位。近年来，由于经济原因及品质问题，我国番茄酱的出口量大幅减少，加工番茄栽培面积也萎缩严重。可溶性固形物(TSS,Total Soluble Solids)含量是衡量番茄果实品质的重要指标，其主要成分为可溶性糖，还有少量有机酸和氨基酸等。由于甜度是果实重要的风味特性，而甜味主要是由含糖量决定，因此，TSS也成为决定鲜食番茄风味品质的重要指标。除影响风味外，TSS含量也是影响加工番茄番茄酱的生产成本。研究表明，生产浓度为28％的番茄酱，如果加工番茄的TSS含量从4％提高到5％，将减少原料消耗约25％。我国加工番茄现有品种的TSS含量大部分在4.0-5.0％，多数地区还使用老品种，而美国等发达国家早已使用新品种，平均TSS含量可达到5.5％。因此，提高番茄TSS含量，不仅可以改善鲜食番茄的风味品质，还可提高加工番茄的生产效率，增强我国番茄加工产品在国际市场上的竞争力。

[0003] 目前，通过传统回交的方法将一个低固形物含量的自交系改良成高固形物含量的自交系，一般需要至少7代才能转育成功，包括1代杂交，至少5代的回交和1次自交，按一年种植2代计算，至少需要3年半的时间才能完成。基因靶向编辑技术(gene targeted editing)是一种可以在全基因组水平对DNA序列进行改造编辑的遗传操作技术。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继TALEN基因编辑技术之后又一重大突破。该技术通过RNA指导Cas9核酸酶对靶向基因进行特定DNA编辑。CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率更高，Cas9系统的载体构建与使用也更加便捷，并已应用在各物种中，是目前使用广泛的基因编辑技术。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法，以克服现有技术制备高固形物番茄耗时耗力的不足。

[0005] 本发明的技术方案：一、一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法，其中INVINH1基因第1外显子的核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 二、如所述的INVINH1基因第1外显子，其特异性靶向sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0007] 三、含有上述sgRNA序列的CRISPR/Cas9载体。

[0008] 四、上述CRISPR/Cas9载体在制备果实高固形物含量番茄材料中的应用。

[0009] 五、上述CRISPR/Cas9载体在番茄改良育种中的应用。

[0010] 六、一种果实高固形物含量番茄材料的制备方法，包括以下步骤：(1)利用农杆菌侵染法将权利要求3所述的CRISPR/Cas9载体转化到低固形物番茄中，获得T0代转基因植株；(2)将T0代植株自交获得T1代植株；(3)从T1代中筛选不含有外源转基因成份，但INVINH1基因发生纯合突变且果实固形物含量显著提高的植株，即高固形物番茄材料。其中，步骤(1)中所述的低固形物番茄为果实固形物含量低的纯合自交系材料，市售可得。

[0011] 七、一种检测上述制备方法获得的高固形物番茄生物材料中INVINH1是否成功进行了基因编辑的检测方法，首先，设计特异性引物对，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；然后，利用PCR扩增INVINH1基因的特异片段如SEQ ID NO.5所示，对PCR产物进行测序；最后，将测序结果与野生型INVINH1基因进行序列比对，检测在sgRNA的位置是否有碱基突变，如果有碱基突变，意味着成功对INVINH1进行了编辑。

[0012] 本发明有益效果：利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对控制果实固形物的基因INVINH1进行了编辑，造成了该基因发生了删除突变，果实的固形物含量有明显的提高。本发明提供的特异度高的sgRNA靶向性强，可用于制备果实高固形物含量的番茄，应用于番茄改良育种。本发明制备高固形物番茄材料的方法简单易行，一年之内即可获得目的基因发生改变的植株。虽然创制新材料的过程中应用到了转基因，但是终产品并不含外源转基因成份，使制得的高固形物番茄材料安全无风险。附图说明

[0013] 图1是T0代转基因植株的基因型，与野生型相比，单株5含有一个突变型，在sgRNA的位置发生突变，且为纯合突变；(注：“-”表示发生了删除突变的序列，“-”后边的数字表示删除的核苷酸的数量，带下划线的核苷酸为靶点的序列。)

具体实施方式

[0014] 实施例1、含特异sgRNA的CRISPR/Cas9载体的构建首先将控制番茄果实固形物含量的基因INVINH1(invertase inhibitor 1，转化酶抑制子1)进行序列分析，查找含PAM序列，即5’-NGG-3’的序列(N代表A、T、C、G任一种核苷酸)，将NGG之前20bp的序列定义为sgRNA。以sgRNA作为查询序列，在番茄参考基因组中(通过登录公开的GeneBank数据库获得的)进行BLAST，获得一个特异匹配的sgRNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示，位于该基因的第一个外显子(如SEQ ID NO.1所示)上。体外合成sgRNA序列，通过酶切-连接的方式连接到CRISPR/Cas9载体上，构建重组载体，并将重组载体转化到农杆菌GV3101菌株中。

[0015] 实施例2、高固形物番茄材料的制备与鉴定利用农杆菌侵染法将实施例1制得的载体转化到低固形物番茄M82(市售可得)的下胚轴组织中，通过再生获得T0代转基因植株；对T0代植株进行检测，分析再生植株中INVINH1基因序列，获得1株INVINH1基因发生突变的转基因植株，命名为单株5，单株5为等位基因的纯合突变(图1)；将该单株种植于温室，果实成熟时检测果实固形物含量，单株5果实固形物的含量均高于野生型M82果实固形物的含量(表1)；然后，将T0代植株进行自交，获得了T1代的种子，为了在T1代中获得不含外源转基因片段的个体，通过PCR方法扩增T1代植株中的CRISPR/Cas9载体序列，其中，正向引物：cttcatcaagagacagctggtg；反向引物：
cttagggtcccagtccttcttt)。其中，反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环；72℃延伸5分钟。结果发现，本实施例单株5的T1代植株中1/4的植株(21/82)不含外源转基因Cas9片段。

[0016] 表1单株5与野生型M82间果实固形物含量比较然后，检测INVINH1的突变是否稳定遗传到不含外源转基因成份的T1植株中。采用PCR扩增INVINH1基因片段，正向引物(SEQ ID NO.3所示)：GACTATCTCCAGGTCCAAACA；反向引物(SEQ ID NO.4所示)：TTCACTAAGCAACCAGTAAGA，扩增片段大小为723bp(SEQ ID NO.5所示)。
然后对PCR产物进行测序，将测序结果与野生型INVINH1基因进行序列比对，检测在sgRNA靶区位置存在的碱基突变(见图1)，说明CRISPR/Cas9产生的突变可以从T0代稳定地遗传到T1代。不含外源转基因成份且INVINH1发生纯合突变的T1代植株即为新的高固形物番茄材料。

[0017] 本方法中，从构建CRISPR/Cas9载体，将其转化到低固形物番茄M82的下胚轴中，再生获得T0代转基因植株这段过程需要6个月，T0代植株进行自交，获得了T1代的种子所需时间为4个月，对T1代进行筛选需时为1个月，完成整个过程需11个月，即1年以内完成了高固形物番茄新材料的创制，大大缩短了改良过程。

[0018] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法	2020-05-08	827
一种十字花科种间杂交结籽率的方法	2020-05-15	70
水性悬浮农药组合物	2020-05-08	67
包含二酰基或二芳基脲以及至少一种植物生长调节剂的协同农业制剂	2020-05-11	589
一种果实高固形物含量的番茄材料的创制方法	2020-05-08	407
一种含有间二酰胺类化合物的药物组合物及其应用	2020-05-11	822
一种为家庭园艺专门设计的立体栽培系统	2020-05-11	489
转动式阳台多功能种植装置	2020-05-15	425
用于农学领域的简易经济作物果实采摘装置	2020-05-08	334
一种含有间二酰胺类化合物的药物组合物及其应用	2020-05-12	893

一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法

一种果实高固形物含量的番茄材料的制备方法

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：