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一种藤苦参组织培养方法

阅读:648发布:2020-05-08

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1.一种藤苦参组织培养方法,其特征在于,包括下述步骤:
1)外植体灭菌:将藤苦参果荚进行预处理,取出果荚中的种子,消毒,备用;
2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有0.8-2.0mg/L6-BA、0.2-
0.5mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,20-25d后,得到藤苦参幼芽;
3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种于添加有3.0-4.0mg/L6-BA和0.2-
0.5mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,35-45d后得到藤苦参分化芽;
4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3-4cm幼苗时,将其转接到添加有
0.8-1.21.0mg/LNAA和0.8-1.2g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,45-55d后,得到生根幼苗;
5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗
3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
2.根据权利要求1所述的一种藤苦参组织培养方法,其特征在于,步骤1)中,对藤苦参果荚进行预处理并对种子进行消毒的过程包括:
11)以无菌对藤苦参果荚进冲洗3次,每次1-2分钟;
12)取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子20-30s,然后以无菌水对种子冲洗
3次,每次1-2分钟;
13)用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子10-15min,然后用无菌水冲洗4~5次,每次1分钟,备用。
3.根据权利要求1所述的一种藤苦参组织培养方法,其特征在于,步骤2)-4)中,培养室温度为23-27℃、光照强度为1000-1200lx,光照时间12-14h/天。
4.根据权利要求1所述的一种藤苦参组织培养方法,其特征在于,步骤2)-4)中,MS培养基的pH值控制为6.2-6.7。

说明书全文

一种藤苦参组织培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及组织培养与繁殖技术领域,更具体地说是涉及一种藤苦参的组织培养方法。

背景技术

[0002] 藤苦参系萝藦科莲鞍属植物马莲鞍的干燥根,又名古羊藤、南苦参,为傣药解药精方雅叫哈顿散中的主治药之一,在南、广西等地被广泛用于治疗痢疾、湿热腹泻、心胃气痛、感冒发热、慢性胃炎、跌打损伤等症。
[0003] 现有技术中,藤苦参的繁殖方法通常采用种子繁殖,压条繁殖,组织培养等;藤苦参种子繁殖费时费工,而且经30~40天方可出苗,2~3年后才可移栽,长成药材的时间则更长。而藤苦参压条繁殖的成活率较低,不利于规范化种植。藤苦参组织培养(快速繁殖)效率较高,且简便易行,收效快,效果好,故生产上多推荐采用组织培养法。藤苦参组织培养苗一旦成活,根深扎后耐旱能较强,具有较强的环境生存能力。
[0004] 因此,如何提供一种可以显著提高藤苦参组培苗质量的组织培养方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

[0005] 有鉴于此,本发明提供了一种藤苦参组织培养方法,在藤苦参不同发育阶段使用不同浓度的植物生长调节剂,显著提高了藤苦参幼芽、分化芽及幼苗的数量和质量,提高了组织培养的成活率。
[0006] 为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
[0007] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0008] 1)外植体灭菌:将藤苦参果荚进行预处理,取出果荚中的种子,消毒,备用;
[0009] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有0.8-2.0mg/L6-BA、0.2-0.5mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,20-25d后,得到藤苦参幼芽;
[0010] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.0-4.0mg/L6-BA和0.2-0.5mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,35-45d后得到藤苦参分化芽;
[0011] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3-4cm幼苗时,将其转接到添加有0.8-1.2mg/LNAA和0.8-1.2g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,45-55d后,得到生根幼苗;
[0012] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0013] 以上技术方案达到的技术效果是:在组织培养中,激素和生长素的合理配合是达到最佳培养效果的关键,本发明在种子萌发、丛生芽分化及生根壮苗阶段,向MS固体培养基中加入不同浓度的植物生长调节剂,进而使得特定浓度的6-BA和NAA之间具备协同增效作用,显著提升了萌发率和丛生芽分化量,提高了幼苗的质量;
[0014] 在植物生根培养过程中,适当的增加光照时间有利于小苗生根,但强光直接照射根部会抑制根的生长,所以在生根壮苗培养基中添加活性炭可提供生根的暗环境,防止褐变;活性炭还可以吸附植物生长过程中释放的一些有害物质,利于幼苗的生长。
[0015] 活性炭可以吸附植物生长过程中释放的一些有害物质,因此,本实验中在生根壮苗培养阶段添加活性炭,小苗生长较壮。
[0016] 作为本发明优选的技术方案,步骤1)中,对藤苦参果荚进行预处理并对种子进行消毒的过程包括:
[0017] 11)以无菌对藤苦参果荚进冲洗3次,每次1-2分钟;
[0018] 12)取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子20-30s,然后以无菌水对种子冲洗3次,每次1-2分钟;
[0019] 13)用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子10-15min,然后用无菌水冲洗4~5次,每次1分钟,备用。
[0020] 作为本发明优选的技术方案,步骤2)-4)中,培养室温度为23-27℃、光照强度为1000-1200lx,每天光照12-14h。
[0021] 以上技术方案达到的技术效果是:适宜的温度、光照强度及时间,促进植物的生根长苗,反之,若温度过高或过低,强光照射均抑制培养组织的生产。
[0022] 作为本发明优选的技术方案,步骤2)-4)中,MS培养基的pH值控制为6.2-6.7(精密PH试纸测量)。
[0023] 经由上述的技术方案可知,与现有技术相比,本发明公开提供了一种藤苦参组织培养方法,该方法显著提高了藤苦参种子的萌发率,幼芽生长量、丛生芽分化量、幼苗数量与质量;
[0024] 而且,同科其他植物的组织培养外植体选用的是茎尖、子叶、叶片等,藤苦参茎及叶均具有乳汁,且密被绒毛,在选择外植体的时候考虑到外植体取茎尖不易灭菌,且其本身受伤会释放乳汁影响到外植体接种到培养基后的存活率等,所以,本实验选取种子作为外植体,可提高灭菌率,同时提高了幼苗的存活率。附图说明
[0025] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0026] 图1附图为实施例12步骤2)中藤苦参幼芽的生长示意图;
[0027] 图2附图为实施例12步骤3)中藤苦参分化芽的生长示意图;
[0028] 图3附图为实施例12步骤4)中藤苦参幼苗的生长示意图。

具体实施方式

[0029] 下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
[0030] 实施例1
[0031] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0032] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子20s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子10min,然后用无菌水冲洗4次,备用;
[0033] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有0.8mg/L6-BA、0.5mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.2,培养室温度为23℃、光照强度为1000lx,每天光照12h,25d后,得到藤苦参幼芽;
[0034] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.0mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.2,培养室温度为23℃、光照强度为1000lx,每天光照12h,45d后得到藤苦参分化芽;
[0035] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.2,培养室温度为23℃、光照强度为1000lx,每天光照12h,55d后,得到生根幼苗;
[0036] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0037] 实施例2
[0038] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0039] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子30s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子15min,然后用无菌水冲洗5次,备用;
[0040] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有2.0mg/L6-BA、0.5mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.7,培养室温度为27℃、光照强度为1200lx,每天光照14h,22d后,得到藤苦参幼芽;
[0041] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.5mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.7,培养室温度为27℃、光照强度为1200lx,每天光照14h,40d后得到藤苦参分化芽;
[0042] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.7,培养室温度为27℃、光照强度为1200lx,每天光照14h,50d后,得到生根幼苗;
[0043] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0044] 实施例3
[0045] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0046] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子21s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子11min,然后用无菌水冲洗5次,备用;
[0047] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有0.8mg/L6-BA、0.2mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.3,培养室温度为24℃、光照强度为1050lx,每天光照13h,23d后,得到藤苦参幼芽;
[0048] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有4.0mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.3,培养室温度为24℃、光照强度为1050lx,每天光照13h,42d后得到藤苦参分化芽;
[0049] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.3,培养室温度为24℃、光照强度为1050lx,每天光照13h,51d后,得到生根幼苗;
[0050] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0051] 实施例4
[0052] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0053] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子22s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子12min,然后用无菌水冲洗4次,备用;
[0054] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有1.0mg/L6-BA、0.2mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.4,培养室温度为26℃、光照强度为1100lx,每天光照14h,23d后,得到藤苦参幼芽;
[0055] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.0mg/L6-BA和0.3mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.4,培养室温度为26℃、光照强度为1100lx,每天光照12h,38d后得到藤苦参分化芽;
[0056] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.6,培养室温度为25℃、光照强度为1150lx,每天光照13h,53d后,得到生根幼苗;
[0057] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0058] 实施例5
[0059] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0060] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子23s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子13min,然后用无菌水冲洗5次,备用;
[0061] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有1.5mg/L6-BA、0.2mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为25℃、光照强度为1200lx,每天光照12h,23d后,得到藤苦参幼芽;
[0062] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.5mg/L6-BA和0.3mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.2,培养室温度为23℃、光照强度为1160lx,每天光照13h,42d后得到藤苦参分化芽;
[0063] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.2,培养室温度为23℃、光照强度为1160lx,每天光照13h,52d后,得到生根幼苗;
[0064] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0065] 实施例6
[0066] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0067] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子24s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子14min,然后用无菌水冲洗4次,备用;
[0068] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有2.0mg/L6-BA、0.2mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为24℃、光照强度为1090lx,每天光照12h,22d后,得到藤苦参幼芽;
[0069] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有4.0mg/L6-BA和0.3mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为24℃、光照强度为1090lx,每天光照12h,39d后得到藤苦参分化芽;
[0070] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为24℃、光照强度为1090lx,每天光照12h,48d后,得到生根幼苗;
[0071] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0072] 实施例7
[0073] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0074] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子25s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子15min,然后用无菌水冲洗5次,备用;
[0075] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有0.8mg/L6-BA、0.3mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.7,培养室温度为24℃、光照强度为1170lx,每天光照13h,21d后,得到藤苦参幼芽;
[0076] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.7,培养室温度为24℃、光照强度为1170lx,每天光照13h,40d后得到藤苦参分化芽;
[0077] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3-4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.7,培养室温度为24℃、光照强度为1170lx,每天光照13h,50d后,得到生根幼苗;
[0078] 5)将步骤4)得到的生根幼苗移栽至土壤中,进行定植。
[0079] 实施例8
[0080] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0081] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子26s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子13min,然后用无菌水冲洗4次,备用;
[0082] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.3,培养室温度为25℃、光照强度为1160lx,每天光照12h,24d后,得到藤苦参幼芽;
[0083] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.3,培养室温度为25℃、光照强度为1160lx,每天光照12h,37d后得到藤苦参分化芽;
[0084] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3-4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.3,培养室温度为25℃、光照强度为1160lx,每天光照12h,45-55d后,得到生根幼苗;
[0085] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0086] 实施例9
[0087] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0088] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子27s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子13min,然后用无菌水冲洗4次,备用;
[0089] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有1.5mg/L6-BA、0.3mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为25℃、光照强度为1050lx,每天光照13h,22d后,得到藤苦参幼芽;
[0090] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有4.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为25℃、光照强度为1050lx,每天光照13h,37d后得到藤苦参分化芽;
[0091] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3-4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为25℃、光照强度为1050lx,每天光照13h,48d后,得到生根幼苗;
[0092] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0093] 实施例10
[0094] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0095] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子28s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子15min,然后用无菌水冲洗5次,备用;
[0096] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有2.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.4,培养室温度为26℃、光照强度为1200lx,每天光照14h,21d后,得到藤苦参幼芽;
[0097] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有4.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.4,培养室温度为26℃、光照强度为1200lx,每天光照14h,39d后得到藤苦参分化芽;
[0098] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.4,培养室温度为26℃、光照强度为1200lx,每天光照14h,49d后,得到生根幼苗;
[0099] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0100] 实施例11
[0101] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0102] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子28s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子13min,然后用无菌水冲洗5次,备用;
[0103] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有1.0mg/L6-BA、0.5mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.6,培养室温度为26℃、光照强度为1000lx,每天光照14h,24d后,得到藤苦参幼芽;
[0104] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.0mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.6,培养室温度为26℃、光照强度为1000lx,每天光照14h,42d后得到藤苦参分化芽;
[0105] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3-4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.6,培养室温度为26℃、光照强度为1000lx,每天光照14h,49d后,得到生根幼苗;
[0106] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0107] 实施例12
[0108] 一种藤苦参组织培养方法,包括下述步骤:
[0109] 1)外植体灭菌:以无菌水对藤苦参果荚进行冲洗;取出藤苦参果荚中的种子,以75%酒精浸泡种子29s,然后以无菌水对种子冲洗1次;然后用0.1%升汞浸泡经步骤2)处理后的种子11min,然后用无菌水冲洗4次,备用;
[0110] 2)种子萌发培养:将步骤1)中消毒后的种子接种于添加有1.5mg/L6-BA、0.5mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行萌发培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为25℃、光照强度为1100lx,每天光照12h,20d后,得到藤苦参幼芽,见图1;
[0111] 3)丛生芽分化培养:将步骤2)所得藤苦参幼芽接种至添加有3.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS培养基中进行分化培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为25℃、光照强度为1100lx,每天光照14h,35d后得到藤苦参分化芽,如图2;
[0112] 4)生根壮苗培养:待步骤3)中的藤苦参分化芽长成3-4cm幼苗时,将其转接到添加有1.0mg/LNAA和1g/L活性炭的MS培养基中进行生根壮苗培养,MS培养基pH值控制为6.5,培养室温度为25℃、光照强度为1100lx,每天光照12h,45d后,得到生根幼苗;如图3;
[0113] 5)炼苗及定植:将步骤4)得到的生根幼苗置于自然光下培养3天,打开试管苗瓶盖炼苗3天,然后用镊子轻轻夹出试管苗,洗去基部的琼脂,移栽到添加了1/2MS营养液的砂土中,4周后移栽至土壤中,进行定植。
[0114] 按照实施例1-12中的方法进行试验,实验地点:广西中医药研究院组培实验室。种子数量:30粒。统计步骤2)萌发率、步骤3)分化的芽数、步骤4)中生根苗的状况、及成活率进行统计,如表1所示;
[0115] 表1
[0116]
[0117] 由表1可知,种子萌发培养中,当6-BA浓度为1.0mg/L和1.5mg/L,NAA浓度为0.5mg/L时,种子萌发率为100%,芽生长均较壮,因此,在实际生产过程中,考虑到成本的因素,采用1.0mg/L浓度的6-BA更为合适。
[0118] 实施例13
[0119] 以实施例12中的方式对100粒藤苦参果荚进行试验,记为对照组1;
[0120] 实施例12中步骤2)不添加6-BA和NAA,记为对照组2;
[0121] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为0.2mg/L,NAA为0mg/L,记为试验组1;
[0122] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为0.5mg/L,NAA为0.2mg/L,记为试验组2;
[0123] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为0.5mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组3;
[0124] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为0.8mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组4;
[0125] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为1.0mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组5;
[0126] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为1.5mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组6;
[0127] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为2.0mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组7;
[0128] 统计本实施例各组中的萌发率和生长情况,见表2;
[0129] 表2
[0130]
[0131] 实施例14
[0132] 选取120个幼芽进行接种,分为12组,每组10个,进行试验:
[0133] 以实施例12中的步骤3)的方式进行试验,记为对照组1;
[0134] 实施例12中步骤3)不添加6-BA和NAA,记为对照组2;
[0135] 实施例12中步骤3)6-BA的浓度为0.5mg/L,NAA为0.2mg/L,记为试验组1;
[0136] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为1.0mg/L,NAA为0.2mg/L,记为试验组2;
[0137] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为2.0mg/L,NAA为0.2mg/L,记为试验组3;
[0138] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为5.0mg/L,NAA为0.5mg/L,记为试验组4;
[0139] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为0.5mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组5;
[0140] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为1.0mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组6;
[0141] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为2.0mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组7;
[0142] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为3.0mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组8;
[0143] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为4.0mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组9;
[0144] 实施例12中步骤2)6-BA的浓度为5.0mg/L,NAA为1.0mg/L,记为试验组10;
[0145] 统计本实施例中各组的分化的芽数和生长势,如表3所示;
[0146] 表3
[0147]
[0148] 实施例15
[0149] 以实施例12的方法进行试验,记为对照组;
[0150] 在实施例12生根壮苗培养时,不添加活性炭,记为试验组;
[0151] 统计小苗生长情况,见表4;
[0152] 表4
[0153]  对照组 试验组
小苗生长情况 茎粗、根粗 茎稍细,根长
[0154] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述,每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处,各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言,由于其与实施例公开的方法相对应,所以描述的比较简单,相关之处参见方法部分说明即可。
[0155] 对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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