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酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法

阅读：405发布：2020-05-08

专利汇可以提供酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了豆科植物研究领域的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，所述的研究方法包括以下步骤：1)挑选蒺藜苜蓿种子，并进行表面灭菌、催芽和萌发；2)不同磷浓度条件下，对蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌和蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌分别进行盆栽试验；3)检测MtPAP2在苜蓿根瘤中的组织特异性表达和MtPAP2在苜蓿菌根中的组织特异性表达以及磷对MtPAP2基因表达的影响、磷对苜蓿根瘤的影响、磷对苜蓿菌根的影响；4)利用时空表达、启动子组织定位、超表达、沉默方法研究苜蓿与根瘤菌、菌根真菌共生过程中的作用。通过获得了直接实验证据，为植物响应低磷胁迫和协调机体自身磷稳态的分子机制提供新见解。，下面是酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述的研究方法包括以下步骤：
1)挑选蒺藜苜蓿种子，并进行表面灭菌、催芽和萌发；
2)不同磷浓度条件下，对蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌和蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌分别进行盆栽试验；
3)检测MtPAP2在苜蓿根瘤中的组织特异性表达和MtPAP2在苜蓿菌根中的组织特异性表达以及磷对MtPAP2基因表达的影响、磷对苜蓿根瘤的影响、磷对苜蓿菌根的影响；
4)利用时空表达、启动子组织定位、超表达、沉默方法研究苜蓿与根瘤菌、菌根真菌共生过程中的作用。
2.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述步骤1)的具体步骤为：
(1)挑选大小均一的蒺藜苜蓿A17种子；
(2)用手术刀片或注射器针头在种子表面轻划一下，肉眼能看到轻微的划痕即可；
(3)将划好的种子倒置100mL无菌的三角瓶中，按照2％(V/V)比例加次氯酸钠至三角瓶中，轻微晃动3-5min，直至种皮表面出现褐色划痕；
(4)弃废液，无菌水冲洗7-10次，至三角瓶中液体由淡黄色变为无色，最后加入少量无菌水淹没种子，常温放置3h，至种子吸水至饱满状；
(5)弃废液，用无菌水冲洗5遍，然后将种子铺至水琼脂上，最后放置4℃黑暗处理48h；
(6)将含有种子的水琼脂平板倒置放置28℃恒温培养箱，黑暗处理10-12h，直至种子萌发出1cm长的胚根，可用于植物盆栽及苜蓿毛根转化。
3.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述步骤2)中，不同磷浓度条件下，蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌盆栽试验具体步骤如下：
(1)取适量的河砂，用自来水冲洗干净，装入罐头瓶中，一半数量的瓶中倒入适量的无氮营养液(NFS)，另外一半的瓶中倒入适量的低磷(5μmol/LKH2PO4)无氮营养液(LP-NFS)，牛皮纸封口包紧，121℃灭菌1h；
(2)把健壮、长势一致的苜蓿幼苗移栽到罐头瓶中，每瓶种植4颗幼苗，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；
(3)待幼苗第一片真叶长出后(约6-7天)，每颗幼苗接种1mLOD600＝0.5-1.0的Sinorhizobiummeliloti1021菌液；
(4)每隔3天分别更换瓶内的无氮营养液和低磷无氮营养液；
(5)在接种Sinorhizobiummeliloti102121天后，收取根样和根瘤样品，做好标记，放置-80℃保存，待用于基因表达分析。
4.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述步骤2)中，不同磷浓度条件下，蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌盆栽试验具体步骤如下：
(1)取适量的河砂清洗干净，装入布袋，放入烘箱烘干；同时将试验田采集的土壤锤碎，过筛，与河砂按照1:3(V/V)的比例混匀组成砂土混合物基质，装入布袋，121℃灭菌1h，间歇灭菌3次；直径10cm的盆钵用自来水冲洗干净，同样121℃灭菌1h，间歇灭菌3次；
(2)把健壮、长势一致的苜蓿幼苗移栽到盛有无菌砂的盆钵中，同时浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland营养液，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；
(3)待幼苗第一片真叶长出后，按照10％(V/V)的接种量称取适量AM真菌
Rhizophagusirregularis接种剂与相应比例沙土混合物基质混合均匀；作为对照，另外一组不接种AM真菌接种剂；将两组基质分别装入等数量的盆钵中，将幼苗移至其中，每盆种植
5颗，同时浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland营养液，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；
4)前两周浇灌含有20μmol/LKH2PO4的1/2Hoagland低磷营养液，从第三周开始，植物盆栽等分三组，一组浇灌含有20μmol/LKH2PO4的1/2Hoagland低磷营养液，第二组浇灌含有
0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland中磷营养液，第三组浇灌含有1mmol/LKH2PO4的1/
2Hoagland高磷营养液，其余时间浇灌无菌去离子水，保证植株正常生长所需水分；
5)在不同磷浓度处理两周后，收取根样，做好标记，放置-80℃保存，待用于基因表达分析。
5.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述磷对MtPAP2基因表达的影响研究方法包括以下步骤：收取经Hoagland(1mmol/LPi)和LP-Hoagland(5μmol/LPi)营养液处理21天的植物根样，抽取RNA，进行转录水平分析，以低磷胁迫根中诱导表达的磷转运基因MtPT1作为对照；磷对苜蓿根瘤的影响研究方法包括以下步骤：收取NFS(含1mmol/LPi)和LP-NFS(含5μmol/LPi)处理21天后的根和根瘤，抽取RNA，反转录为cDNA进行转录水平分析；磷对苜蓿菌根的影响研究方法包括以下步骤：接种AM真菌后，先用1/2LP(20μmol/LPi)Hoagland营养液浇灌植物2周，再分别用1/2HP(1mmol/LPi)，1/2MP(0.2mmol/LPi)和1/2LP(20μmol/LPi)Hoagland营养液浇灌2周，最后将收集的根样均分两份，一份根样用于TB染色，另一份根样抽取RNA，反转录为cDNA进行转录水平分析。
6.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述的时空表达包括MtPAP2在苜蓿根瘤中的时空表达、MtPAP2在苜蓿菌根中的时空表达和MtPAP2在菌根共生中的时空表达，
所述MtPAP2在苜蓿根瘤中的时空表达的具体实现步骤为：收取不接种和接种苜蓿中华根瘤S.meliloti1021后第9天、15天、21天和28天的植株材料，抽取RNA，反转录为cDNA进行RT-qPCR分析，并以根瘤中稳定表达的结瘤素基因MtN5作为正对照；
所述MtPAP2在苜蓿菌根中的时空表达的具体实现步骤为：收取不接种和接种AM真菌R.irregularis后第9天、15天、21天和28天的植株材料，收集到的根样均分两份，一份用于TB染色，统计分析AM真菌共生水平数据，另外一份抽取RNA，进行转录水平分析，并以参与丛枝形成的磷转运基因MtPT4作为对照；
所述MtPAP2在菌根共生中的时空表达的具体实现步骤为：将获得的阳性植株移至无菌沙土中，磷饥饿处理3-5天后接种AM真菌，分别在接菌14天和28天后收取根样。
7.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述启动子组织定位载体的构建，用于研究MtPAP2启动子在苜蓿根瘤和菌根共生中的时空表达定位，包括：将MtPAP2的启动子序列融合到GUS报告基因N端，经菌落PCR，酶切，测序比对正确，表明MtPAP2启动子组织表达定位载体构建成功。
8.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述MtPAP2基因超表达对的苜蓿根瘤研究方法包括MtPAP2基因超表达载体的构建、MtPAP2超表达在苜蓿根瘤中转录水平检测和MtPAP2基因超表达影响根瘤共生，所述MtPAP2基因沉默的研究方法包括MtPAP2基因沉默载体的构建、MtPAP2沉默后在根瘤中转录水平检测和MtPAP2基因沉默影响根瘤共生。
9.根据权利要求1所述的酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，其特征在于：所述MtPAP2基因超表达对的苜蓿菌根研究方法包括MtPAP2基因超表达载体的构建、MtPAP2超表达在苜蓿菌根中转录水平检测和MtPAP2基因超表达影响苜蓿菌根共生，所述MtPAP2基因沉默的研究方法包括MtPAP2基因沉默载体的构建、MtPAP2沉默后在苜蓿菌根中转录水平检测和MtPAP2基因沉默影响苜蓿菌根共生。

说明书全文

酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法

技术领域

[0001] 本发明涉及豆科植物研究技术领域，具体为酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法。

背景技术

[0002] 豆科植物与根瘤菌或AM真菌形成的共生体系对于农业可持续化发展具有重要意义。根瘤菌与豆科植物的生物固氮过程主要为植物提供生长所需的氮源，而AM真菌能够改
善植物体内的磷稳态；同时氮和磷是植物生长发育所必须的两种大量元素，而土壤中匮乏
的磷含量不仅影响豆科作物的生长，还对豆科植物的共生固氮产生不良影响。

[0003] 目前豆科植物PAP家族基因的研究多集中于协助植物应对磷胁迫和改善植物体的磷营养，但是对于该家族的蛋白在植物与微生物共生过程中的功能却是少有报道。紫色酸
性磷酸酶(purpleacidphosphatase，PAP)是酸性磷酸酶中最主要的一类，对于活化植物根
际周围的有机态磷及促进植物组织内有机磷的分解和循环利用发挥着重要作用。本研究选
择了在根瘤和菌根中高量表达的MtPAP2以及受低磷和根瘤诱导表达的MtPAP3为研究对象，
研究PAP蛋白在豆科植物与微生物共生中的功能和作用机理，期望能为阐明PAP蛋白在植物
生长发育中的调控机制提供依据；同时不受磷诱导的MtPAP2与受低磷胁迫诱导的MtPAP3表
达模式的不同，表明其在植物磷代谢过程中具有不同的功能，研究MtPAP2与MtPAP3在苜蓿
结瘤过程中的表达及功能，能更有助于理解植物内PAP家族成员间的相互作用，为植物响应低磷胁迫和协调机体自身磷稳态的分子机制提供新的看法和见解。

[0004] MtPAP2在接种根瘤菌或AM真菌(Rhizophagusirregularis)后，其在根或根瘤中的转录水平显著上升；此外，结合激光显微切割技术在植物与根瘤菌及AM真菌共生中应用的
转录组数据，结果显示MtPAP2在根瘤固氮区的转录水平明显高于根瘤其它部位；同时，该基因在含丛枝的皮层细胞中的转录水平最高；这些转录组数据暗示了MtPAP2在蒺藜苜蓿与根
瘤菌以及AM真菌共生中发挥着重要作用，即以MtPAP2基因作为最终的研究对象。

[0005] 基于此，本发明设计了酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，以解决上述提到的问题。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，所述的研究方法包括以下步骤：

[0008] 1)挑选蒺藜苜蓿种子，并进行表面灭菌、催芽和萌发；

[0009] 2)不同磷浓度条件下，对蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌和蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌分别进行盆栽试验；

[0010] 3)检测MtPAP2在苜蓿根瘤中的组织特异性表达和MtPAP2在苜蓿菌根中的组织特异性表达以及磷对MtPAP2基因表达的影响、磷对苜蓿根瘤的影响、磷对苜蓿菌根的影响；

[0011] 4)利用时空表达、启动子组织定位、超表达、沉默方法研究苜蓿与根瘤菌、菌根真菌共生过程中的作用。

[0012] 优选的，所述步骤1)的具体步骤为：

[0013] (1)挑选大小均一的蒺藜苜蓿A17种子；

[0014] (2)用手术刀片或注射器针头在种子表面轻划一下，肉眼能看到轻微的划痕即可；

[0015] (3)将划好的种子倒置100mL无菌的三角瓶中，按照2％(V/V)比例加次氯酸钠至三角瓶中，轻微晃动3-5min，直至种皮表面出现褐色划痕；

[0016] (4)弃废液，无菌水冲洗7-10次，至三角瓶中液体由淡黄色变为无色，最后加入少量无菌水淹没种子，常温放置3h，至种子吸水至饱满状；

[0017] (5)弃废液，用无菌水冲洗5遍，然后将种子铺至水琼脂上，最后放置4℃黑暗处理48h；

[0018] (6)将含有种子的水琼脂平板倒置放置28℃恒温培养箱，黑暗处理10-12h，直至种子萌发出1cm长的胚根，可用于植物盆栽及苜蓿毛根转化。

[0019] 优选的，所述步骤2)中，不同磷浓度条件下，蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌盆栽试验具体步骤如下：

[0020] (1)取适量的河砂，用自来水冲洗干净，装入罐头瓶中，一半数量的瓶中倒入适量的无氮营养液(NFS)，另外一半的瓶中倒入适量的低磷(5μmol/LKH2PO4)无氮营养液(LP-
NFS)，牛皮纸封口包紧，121℃灭菌1h；

[0021] (2)把健壮、长势一致的苜蓿幼苗移栽到罐头瓶中，每瓶种植4颗幼苗，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；

[0022] (3)待幼苗第一片真叶长出后(约6-7天)，每颗幼苗接种1mLOD600＝0.5-1.0的Sinorhizobiummeliloti1021菌液；

[0023] (4)每隔3天分别更换瓶内的无氮营养液和低磷无氮营养液；

[0024] (5)在接种Sinorhizobiummeliloti102121天后，收取根样和根瘤样品，做好标记，放置-80℃保存，待用于基因表达分析。

[0025] 优选的，所述步骤2)中，不同磷浓度条件下，蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌盆栽试验具体步骤如下：

[0026] (1)取适量的河砂清洗干净，装入布袋，放入烘箱烘干；同时将试验田采集的土壤锤碎，过筛，与河砂按照1:3(V/V)的比例混匀组成砂土混合物基质，装入布袋，121℃灭菌
1h，间歇灭菌3次；直径10cm的盆钵用自来水冲洗干净，同样121℃灭菌1h，间歇灭菌3次；

[0027] (2)把健壮、长势一致的苜蓿幼苗移栽到盛有无菌砂的盆钵中，同时浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland营养液，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；

[0028] (3)待幼苗第一片真叶长出后，按照10％(V/V)的接种量称取适量AM真菌Rhizophagusirregularis接种剂与相应比例沙土混合物基质混合均匀；作为对照，另外一
组不接种AM真菌接种剂；将两组基质分别装入等数量的盆钵中，将幼苗移至其中，每盆种植
5颗，同时浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland营养液，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；

[0029] 4)前两周浇灌含有20μmol/LKH2PO4的1/2Hoagland低磷营养液，从第三周开始，植物盆栽等分三组，一组浇灌含有20μmol/LKH2PO4的1/2Hoagland低磷营养液，第二组浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland中磷营养液，第三组浇灌含有1mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland高磷营养液，其余时间浇灌无菌去离子水，保证植株正常生长所需水分；

[0030] 5)在不同磷浓度处理两周后，收取根样，做好标记，放置-80℃保存，待用于基因表达分析。

[0031] 优选的，所述磷对MtPAP2基因表达的影响研究方法包括以下步骤：收取经Hoagland(1mmol/LPi)和LP-Hoagland(5μmol/LPi)营养液处理21天的植物根样，抽取RNA，进行转录水平分析，以低磷胁迫根中诱导表达的磷转运基因MtPT1作为对照；磷对苜蓿根瘤的影响研究方法包括以下步骤：收取NFS(含1mmol/LPi)和LP-NFS(含5μmol/LPi)处理21天
后的根和根瘤，抽取RNA，反转录为cDNA进行转录水平分析；磷对苜蓿菌根的影响研究方法包括以下步骤：接种AM真菌后，先用1/2LP(20μmol/LPi)Hoagland营养液浇灌植物2周，再分别用1/2HP(1mmol/LPi)，1/2MP(0.2mmol/LPi)和1/2LP(20μmol/LPi)Hoagland营养液浇灌2周，最后将收集的根样均分两份，一份根样用于TB染色，另一份根样抽取RNA，反转录为cDNA进行转录水平分析。

[0032] 优选的，所述的时空表达包括MtPAP2在苜蓿根瘤中的时空表达、MtPAP2在苜蓿菌根中的时空表达和MtPAP2在菌根共生中的时空表达，

[0033] 所述MtPAP2在苜蓿根瘤中的时空表达的具体实现步骤为：收取不接种和接种苜蓿中华根瘤S.meliloti1021后第9天、15天、21天和28天的植株材料，抽取RNA，反转录为cDNA进行RT-qPCR分析，并以根瘤中稳定表达的结瘤素基因MtN5作为正对照；

[0034] 所述MtPAP2在苜蓿菌根中的时空表达的具体实现步骤为：收取不接种和接种AM真菌R.irregularis后第9天、15天、21天和28天的植株材料，收集到的根样均分两份，一份用于TB染色，统计分析AM真菌共生水平数据，另外一份抽取RNA，进行转录水平分析，并以参与丛枝形成的磷转运基因MtPT4作为对照；

[0035] 所述MtPAP2在菌根共生中的时空表达的具体实现步骤为：将获得的阳性植株移至无菌沙土中，磷饥饿处理3-5天后接种AM真菌，分别在接菌14天和28天后收取根样。

[0036] 优选的，所述启动子组织定位载体的构建，用于研究MtPAP2启动子在苜蓿根瘤和菌根共生中的时空表达定位，包括：将MtPAP2的启动子序列融合到GUS报告基因N端，经菌落PCR，酶切，测序比对正确，表明MtPAP2启动子组织表达定位载体构建成功。

[0037] 优选的，所述MtPAP2基因超表达对的苜蓿根瘤研究方法包括MtPAP2基因超表达载体的构建、MtPAP2超表达在苜蓿根瘤中转录水平检测和MtPAP2基因超表达影响根瘤共生，
所述MtPAP2基因沉默的研究方法包括MtPAP2基因沉默载体的构建、MtPAP2沉默后在根瘤中
转录水平检测和MtPAP2基因沉默影响根瘤共生。

[0038] 优选的，所述MtPAP2基因超表达对的苜蓿菌根研究方法包括MtPAP2基因超表达载体的构建、MtPAP2超表达在苜蓿菌根中转录水平检测和MtPAP2基因超表达影响苜蓿菌根共
生，所述MtPAP2基因沉默的研究方法包括MtPAP2基因沉默载体的构建、MtPAP2沉默后在苜
蓿菌根中转录水平检测和MtPAP2基因沉默影响苜蓿菌根共生。

[0039] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0040] 1、MtPAP2在苜蓿的根茎叶中均有表达，其在叶中表达量最高；在接种根瘤菌或AM真菌后，该基因在根瘤或菌根中的表达量显著提高。磷诱导结果显示，MtPAP2在根中的表达并不受磷胁迫诱导，说明该蛋白不参与植物对低磷胁迫的应答。

[0041] 2、时空基因表达和启动子组织表达定位显示，MtPAP2受到根瘤菌和AM真菌的诱导表达，且主要在根瘤的分生区、侵染区、维管束组织和菌根中含丛枝以及相邻的皮层细胞中大量表达。

[0042] 3、MtPAP2基因超表达和沉默植株共生表型显示，MtPAP2的超量表达能显著提高根瘤数和固氮酶活，增加菌根的侵染率及丛枝丰度；MtPAP2基因的沉默能显著抑制根瘤的发
育和固氮酶活，菌根中丛枝的形成和发育也受到影响，从枝丰度显著下降，表明该蛋白在苜蓿与根瘤、菌根真菌的共生中具有重要作用，其可能通过调节根组织内磷的代谢和在组织
内的平衡分配进而调控植物与微生物的共生。
附图说明

[0043] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附
图。

[0044] 图1为本发明MtN5和MtPAP2在未接种和接种根瘤菌S.meliloti1021植株根和根瘤中的转录水平图；

[0045] 图2为本发明AM真菌R.irregularis在共生不同阶段形态结构图；

[0046] 图3为本发明接种AM真菌9天、15天、21天及28天后的共生水平图；

[0047] 图4为本发明MtPT4和MtPAP2在接种和不接种AM真菌R.irregularis植株根中的转录水平图；

[0048] 图5为本发明低磷处理下MtPT1和MtPAP2在根中的转录水平图；

[0049] 图6为本发明低磷处理下MtPAP2在根和根瘤中的转录水平图；

[0050] 图7为本发明不同磷浓度处理对蒺藜苜蓿生长的影响图；

[0051] 图8为本发明不同磷浓度处理的蒺藜苜蓿根经TB染色的显微图；

[0052] 图9为本发明MtPAP2在不同磷浓度条件下接种和不接种AM真菌R.irregularis植株根中的转录水平图；

[0053] 图10为本发明MtPAP2-Pro:GUS载体示意图；

[0054] 图11为本发明MtPAP2启动子组织表达定位载体的构建图；

[0055] 图12为本发明MtPAP2在菌根共生中的时空表达图；

[0056] 图13为本发明MMtPAP2-Overexpression载体示意图；

[0057] 图14为本发明MtPAP2超表达载体的构建图；

[0058] 图15为本发明MtPAP2在超表达植株发根和根瘤中的转录水平图；

[0059] 图16为本发明MtPAP2超表达植株的结瘤表型图；

[0060] 图17为本发明MtPAP2超表达和对照植株共生表型测定图；

[0061] 图18为本发明MtPAP2-RNAi载体示意图；

[0062] 图19为本发明MtPAP2-RNAi干扰载体的构建图；

[0063] 图20为本发明MtPAP2沉默植株发根和接种S.meliloti 1021后根瘤中转录水平图；

[0064] 图21为本发明MtPAP2-RNAi植株的结瘤表型图；

[0065] 图22为本发明MtPAP2沉默和对照植株共生表型测定图；

[0066] 图23为本发明MtPAP2超表达和沉默植株根瘤石蜡切片图；

[0067] 图24为本发明MtPAP2超表达植株发根和菌根定殖根样中转录水平图；

[0068] 图25为本发明MtPAP2超表达植株与AM真菌的共生表型图；

[0069] 图26为本发明MtPAP2超表达植株TB染色根段显微图；

[0070] 图27为本发明MtPAP2-OE植株根段共生水平统计图；

[0071] 图28为本发明MtPAP2沉默植株发根和接种AM fungi后根中转录水平图；

[0072] 图29为本发明MtPAP2-RNAi干扰植株与AM真菌的共生表型图；

[0073] 图30为本发明MtPAP2RNAi干扰植株TB染色根段显微图；

[0074] 图31为本发明MtPAP2-RNAi干扰植株根段共生水平统计图。

具体实施方式

[0075] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它
实施例，都属于本发明保护的范围。

[0076] 实施例

[0077] 本发明提供一种技术方案：酸性磷酸酶在苜蓿根瘤和菌根共生中的功能研究方法，所述的研究方法包括以下步骤：

[0078] 1)挑选蒺藜苜蓿种子，并进行表面灭菌、催芽和萌发；

[0079] 2)不同磷浓度条件下，对蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌和蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌分别进行盆栽试验；

[0080] 3)检测MtPAP2在苜蓿根瘤中的组织特异性表达和MtPAP2在苜蓿菌根中的组织特异性表达以及磷对MtPAP2基因表达的影响、磷对苜蓿根瘤的影响、磷对苜蓿菌根的影响；

[0081] 4)利用时空表达、化学组织定位、超表达、沉默方法研究苜蓿与根瘤菌、菌根真菌共生过程中的作用。

[0082] 本实施例中，步骤1)的具体步骤为：

[0083] (1)挑选大小均一的蒺藜苜蓿A17种子；

[0084] (2)用手术刀片或注射器针头在种子表面轻划一下，肉眼能看到轻微的划痕即可；

[0085] (3)将划好的种子倒置100mL无菌的三角瓶中，按照2％(V/V)比例加次氯酸钠至三角瓶中，轻微晃动3-5min，直至种皮表面出现褐色划痕；

[0086] (4)弃废液，无菌水冲洗7-10次，至三角瓶中液体由淡黄色变为无色，最后加入少量无菌水淹没种子，常温放置3h，至种子吸水至饱满状；

[0087] (5)弃废液，用无菌水冲洗5遍，然后将种子铺至水琼脂上，最后放置4℃黑暗处理48h；

[0088] (6)将含有种子的水琼脂平板倒置放置28℃恒温培养箱，黑暗处理10-12h，直至种子萌发出1cm长的胚根，可用于植物盆栽及苜蓿毛根转化。本实施例中，步骤2)中，不同磷浓度条件下，蒺藜苜蓿接种苜蓿中华根瘤菌盆栽试验具体步骤如下：

[0089] (1)取适量的河砂，用自来水冲洗干净，装入罐头瓶中，一半数量的瓶中倒入适量的无氮营养液(NFS)，另外一半的瓶中倒入适量的低磷(5μmol/LKH2PO4)无氮营养液(LP-
NFS)，牛皮纸封口包紧，121℃灭菌1h；

[0090] (2)把健壮、长势一致的苜蓿幼苗移栽到罐头瓶中，每瓶种植4颗幼苗，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；

[0091] (3)待幼苗第一片真叶长出后(约6-7天)，每颗幼苗接种1mLOD600＝0.5-1.0的Sinorhizobiummeliloti1021菌液；

[0092] (4)每隔3天分别更换瓶内的无氮营养液和低磷无氮营养液；

[0093] (5)在接种Sinorhizobiummeliloti102121天后，收取根样和根瘤样品，做好标记，放置-80℃保存，待用于基因表达分析。

[0094] 不同磷浓度条件下，蒺藜苜蓿接种丛枝状菌根真菌盆栽试验具体步骤如下：

[0095] (1)取适量的河砂清洗干净，装入布袋，放入烘箱烘干；同时将试验田采集的土壤锤碎，过筛，与河砂按照1:3(V/V)的比例混匀组成砂土混合物基质，装入布袋，121℃灭菌
1h，间歇灭菌3次；直径10cm的盆钵用自来水冲洗干净，同样121℃灭菌1h，间歇灭菌3次；

[0096] (2)把健壮、长势一致的苜蓿幼苗移栽到盛有无菌砂的盆钵中，同时浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland营养液，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；

[0097] (3)待幼苗第一片真叶长出后，按照10％(V/V)的接种量称取适量AM真菌Rhizophagusirregularis接种剂与相应比例沙土混合物基质混合均匀；作为对照，另外一
组不接种AM真菌接种剂；将两组基质分别装入等数量的盆钵中，将幼苗移至其中，每盆种植
5颗，同时浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland营养液，完毕后盖上一层保鲜膜，减少水分蒸发，放置光照室；

[0098] 4)前两周浇灌含有20μmol/LKH2PO4的1/2Hoagland低磷营养液，从第三周开始，植物盆栽等分三组，一组浇灌含有20μmol/LKH2PO4的1/2Hoagland低磷营养液，第二组浇灌含有0.2mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland中磷营养液，第三组浇灌含有1mmol/LKH2PO4的1/2Hoagland高磷营养液，其余时间浇灌无菌去离子水，保证植株正常生长所需水分。

[0099] 5)在不同磷浓度处理两周后，收取根样，做好标记，放置-80℃保存，待用于基因表达分析。

[0100] 本实施例中，磷对MtPAP2基因表达的影响研究方法包括以下步骤：收取经Hoagland(1mmol/LPi)和LP-Hoagland(5μmol/LPi)营养液处理21天的植物根样，抽取RNA，进行转录水平分析，以低磷胁迫根中诱导表达的磷转运基因MtPT1作为对照，如图5(A，C)所示，结果显示，MtPAP2在HP和LP处理后根中的相对表达量没有显著性差异，如图5(B，C)，表明该基因在根中的表达并不受到环境中磷浓度的影响，该蛋白并不参与植物对低磷胁迫的
应答反应，暗示其主要与植物组织内磷的代谢和分配相关；

[0101] 磷对苜蓿根瘤的影响研究方法包括以下步骤：收取NFS(含1mmol/LPi)和LP-NFS(含5μmol/LPi)处理21天后的根和根瘤，抽取RNA，反转录为cDNA进行转录水平分析；结果显示，MtPAP2在根瘤中的相对表达量均比根中高，且在LP-NFS处理后根瘤中的相对表达量最
高，此外MtPAP2在LP-NFS处理后根瘤中的相对表达量比NFS处理后根瘤中的高，但是LP处理却不改变该基因在根中的表达如图6；说明MtPAP2在接菌后根中的表达量并不受外界环境
中磷浓度的影响，然而该基因在根瘤中的表达量因根际环境中磷浓度的降低而升高；推测
在LP胁迫条件下，植物机体为维持根瘤中的磷稳态，过量表达MtPAP2来分解储藏于各组织
内的有机磷，为根瘤的形成和固氮提供磷元素。

[0102] 磷对苜蓿菌根的影响研究方法包括以下步骤：接种AM真菌后，先用1/2LP(20μmol/LPi)Hoagland营养液浇灌植物2周，再分别用1/2HP(1mmol/LPi)，1/2MP(0.2mmol/LPi)和1/2LP(20μmol/LPi)Hoagland营养液浇灌2周如图7，最后将收集的根样均分两份，一份根样用于TB染色如图8，另一份根样抽取RNA，反转录为cDNA进行转录水平分析；结果显示，在低磷及高磷处理时，MtPAP2的表达量分别在根及菌根中并无显著差异，进一步表明MtPAP2在根
及菌根中的表达并不受到外界磷浓度的改变的影响。而比较根和菌根中MtPAP2的表达，
MtPAP2在菌根中的表达量显著高于根中表达量，这一结果与之前在菌根中的检测结果一
致，如图9所示，

[0103] 本实施例中，时空表达包括MtPAP2在苜蓿根瘤中的时空表达和MtPAP2在苜蓿菌根中的时空表达，

[0104] MtPAP2在苜蓿根瘤中的时空表达的具体实现步骤为：收取不接种和接种苜蓿中华根瘤S.meliloti1021后第9天、15天、21天和28天的植株材料，抽取RNA，反转录为cDNA进行RT-qPCR分析，并以根瘤中稳定表达的结瘤素基因MtN5作为正对照；如图1(A)所示，结果显示MtPAP2在共生固氮各时期根瘤中的相对表达量均比根中高，且在接菌后第15天和第28天
根瘤中的相对表达量最高，是接菌实验组根中相对表达量的29.37倍；此外，MtPAP2在共生条件下各时期根中的相对表达量与非共生条件下没有显著性差异如图1(B)，表明MtPAP2在
非共生条件下根和茎中少量表达，但是接种根瘤菌后，该基因在根瘤发育的共生中期
(15dpi)和根瘤固氮的共生后期(28dpi)根瘤中的表达量明显增加，且显著高于其它各组织
中的表达量。其在共生各时期根瘤中的大量表达显示该蛋白可能参与结瘤共生过程中的磷
代谢。

[0105] MtPAP2在苜蓿菌根中的时空表达的具体实现步骤为：收取不接种和接种AM真菌R.irregularis后第9天、15天、21天和28天的植株材料，收集到的根样均分两份，一份用于TB染色，统计分析AM真菌共生水平数据，另外一份抽取RNA，进行转录水平分析，并以参与丛枝形成的磷转运基因MtPT4作为对照，如图4(A)，共生水平数据显示，随着菌根共生关系的建立，侵染率(F)，侵染强度(M)和丛枝丰度(A)依次增加，且共生中后期(21-28dpi)的侵染率(F)最高达到80.4％，侵染强度(M)达到最高达到61.3％，丛枝丰度(A)最高达到40.6％，如图3所示，表明此时AM真菌已经侵入大多数宿主植株根段，如图2所示，并形成大量丛枝结构。此时，菌根真菌可通过丛枝将根外菌丝吸收的磷转运到宿主植株，使得含有丛枝的细胞及相邻皮层细胞内磷大量累积。

[0106] RT-qPCR结果显示，在未接种AM真菌的对照组中，MtPAP2在各时期根中的表达量无显著性差异。在接种AM真菌后9d，其在根中表达量与未接种根中表达量并无显著差异，而在
15-28d根段中，该基因表达显著上升，在28d其表达量达到最高，是未接种AM真菌根中的28倍，如图4(B)。

[0107] 结合菌根共生水平结果，在接种后9d根中并无丛枝形成，此时菌根真菌与植物之间没有发生磷的转运。在接种后15d-21d，丛枝的形成及丛枝丰度的增加，表明菌根真菌与植物细胞间磷的转运效率的加强，磷在含有丛枝的细胞及相邻细胞内开始逐渐累积。因此
在接菌28d后，此时整个根段中的丛枝丰度(A)已经达到28.7％，尽管根中从枝丰度略有下
降，其表达量仍比15-21d表达量高约5.4倍，表明该蛋白与菌根真菌定殖共生的过程根组织内磷的平衡及分配有关。

[0108] MtPAP2在菌根共生中的时空表达的具体实现步骤为：将获得的阳性植株移至无菌沙土中，磷饥饿处理3-5天后接种AM真菌，分别在接菌14天和28天后收取根样。结果显示，非共生条件下，MtPAP2主要在根部中柱的维管束中表达(如图12A，D，M，P)；接种AM真菌后，MtPAP2不仅在共生前期(14dpi)和后期(28dpi)根部中柱维管束组织中表达，也在邻近根部
中柱维管束的皮层细胞中强烈表达(图12G，J，S，V)，且这些皮层细胞均含有丛枝或与含丛枝的皮层细胞毗邻(图12I，L，U，X)；这些时空表达定位的结果进一步验证了MtPAP2受到AM真菌诱导表达的结论，同时该基因的表达部位也显示该基因主要在磷累积的含丛枝及相邻
的皮层细胞内高量表达，暗示该蛋白可能通过释放含丛枝及相邻皮层细胞内大量累积的
磷，使其能通过磷转运蛋白的作用，转运到其他组织，进而调节菌根共生过程中根组织内磷的平衡。

[0109] 图12中，A-L为14dpi阳性转化植株观察；M-X为28dpi阳性转化植株观察；A-F，M-R为未接种植株观察；G-L，S-X为接种植株观察；D，E，J，K，P，Q，V和W图分别为A，B，G，H，M，N，S和T图局部放大；A，D，G，J，M，P，S和V图为明场拍摄，B，E，H，K，N，Q，T和W图为WGA488染色GFP荧光场拍摄；A，B，C，G，H，I，M，N，O，S，T，和U图中bar＝100μm，D，E，F，J，K，L，P，Q，R，V，W和X图中bar＝50μm。

[0110] 本实施例中，启动子组织定位载体的构建，用于研究MtPAP2启动子在苜蓿根瘤和菌根共生中的时空表达定位，包括：将MtPAP2的启动子序列融合到GUS报告基因N端，经菌落PCR，酶切，测序比对正确，表明MtPAP2启动子组织表达定位载体构建成功。如图10和11所示。其中，A:MtPAP2启动子克隆；B:转化子PCR验证；C:启动子组织表达定位载体酶切验证；

[0111] M:1kbladderA中1号泳道是从基因组DNA中扩增得到的MtPAP2启动子；B中2和3号泳道分别是阳性转化子PCR扩增得到的目的条带；C中4号泳道为启动子组织表达定位载体
经HindIII和BamHI双酶切后的条带，切下的条带为2157bp。

[0112] 本实施例中，MtPAP2基因超表达载体的构建：

[0113] 为了进一步探究MtPAP2在生物固氮与菌植互作中的功能，构建了超表达载体，如图13所示，经菌落PCR，酶切，测序比对正确，表明MtPAP2超表达载体构建成功，如图14所示，其中，A:MtPAP2编码区克隆；B:转化子PCR验证；C:超表达载体pUB-PAP2-OE酶切验证，M1:
DL2000Plus；M2:Marker12；M3:1kbladder

[0114] 1号泳道是从cDNA中扩增得到的MtPAP2编码区；B中2和3号泳道分别是阳性转化子PCR扩增得到的目的条带；C中4号泳道为超表达载体pUB-PAP2-OE经XbaI和AscI双酶切后的
条带，切下的条带为1204bp，符合预期，超表达载体载体构建成功。

[0115] MtPAP2超表达在苜蓿根瘤中转录水平检测：

[0116] 为了确定构建的超表达载体在苜蓿毛根和和根瘤中是否获得超表达，通过苜蓿毛根转化获得转基因植株，待植株发根长出10天后，收获根样，抽取RNA，反转录为cDNA，进行超表达效率检测；结果显示，超表达植株发根中MtPAP2的相对表达量是空载体对照组
(control)的8.6倍(n＝9，p<0.001)(如图14，A所示，)，表明MtPAP2基因获得基因超表达；对获得的阳性植株接种苜蓿中华根瘤菌S.meliloti1021，28天后收获根瘤样品，抽取RNA，反转录为cDNA，进行转录水平检测。结果显示，超表达植株根瘤中MtPAP2的相对表达量是空载体对照植株(control)的17.5倍(n＝9，p<0.001)(如图14，B所示，)，表明该批次植株可以用于后续共生表型鉴定。

[0117] MtPAP2基因超表达影响根瘤共生：

[0118] 对获得的超表达植株进行共生表型鉴定，结果表明，与空载体对照组(control)植株相比，MtPAP2超表达植株地上长势较好，地下根部较长且密集，根瘤大且数量较多，如图
16所示，为了量化MtPAP2超表达对共生固氮影响的程度，分别对两组植株的地上鲜重，固氮酶活，根瘤数以及根瘤鲜重等共生指标进行统计分析；结果显示，对照组植株(control)地上部分鲜重平均为0.09g/颗，而超表达植株平均为0.12g/颗(如图17，A)，与对照组相比，超表达植株地上鲜重有显著性增加(p<0.01，n＝18)；对照组植株固氮酶活平均为3.93μmolg-
1NDWh-1，超表达植株固氮酶活为7.98μmolg-1NDWh-1(如图17，B)，与对照组相比，超表达植株固氮酶活有显著性增加(p<0.01，n＝9)；对照组平均每颗植株上的根瘤数是17.5个，而超表达平均每颗植株上的根瘤数是30.72个(如图17，C)，与对照组相比，超表达植株的根瘤数有显著性增加(p<0.001，n＝9)；对照组植株(control)根瘤鲜重平均为0.004g/颗，而超表达植株平均为0.009g/颗(如图17，D)，与对照组相比，超表达植株根瘤鲜重有显著性增加(p<0.001，n＝9)。

[0119] 综上所述，MtPAP2基因的大量表达，促进了根瘤的形成和发育，提高了固氮酶活，进而促进地上部分的生长。

[0120] MtPAP2基因沉默载体的构建：

[0121] 既然MtPAP2基因的超表达促进了根瘤发育和植株生长，那么沉默该基因的表达是否也会损害根瘤的发育或者抑制植株长势呢？为了进一步确定该基因在根瘤共生中发挥的
作用，构建了RNAi干扰载体(如图18)，经菌落PCR，酶切，测序比对正确，表明MtPAP2RNAi干扰载体构建成功(如图19)。其中，A:MtPAP2干扰片段克隆；B:转化子PCR验证；C:干扰载体p1301-PAP2-Ri酶切验证，M1:DL2000Plus；M2:Marker1；M3:1kbladder

[0122] 1和2号泳道是分别是从cDNA中扩增得到的干扰片段正义链和反义链；B中3和4号泳道及5和6号泳道分别是干扰片段正义链和反义链阳性转化子PCR扩增得到的目的条带；C
中7号泳道为干扰载体p1301-PAP2-Ri经SacI和PstI双酶切后的条带，切下的条带为742bp，符合预期，干扰载体载体构建成功。

[0123] MtPAP2沉默后在根瘤中转录水平检测：

[0124] 为了确定构建的RNAi干扰载体在苜蓿毛根和和根瘤中是否发挥作用，通过苜蓿毛根转化获得转基因植株，待植株发根长出10天后，收获根样，抽取RNA，反转录为cDNA，进行沉默效率检测；结果显示，沉默植株发根中MtPAP2的相对表达量是空载体对照植株
(control)的0.35倍(n＝9，p<0.001)(图20，A)；表明MtPAP2基因表达受到抑制；对获得的阳性植株接种苜蓿中华根瘤菌S.meliloti1021，21天后收获根瘤样品，抽取RNA，反转录为
cDNA，进行转录水平检测；结果显示，沉默植株根瘤中MtPAP2的相对表达量是空载体对照植株(control)的0.07倍(n＝9，p<0.001)(图20，B)；表明该批次植株可以用于后续共生表型鉴定。

[0125] MtPAP2基因沉默影响根瘤共生：

[0126] 对获得的沉默植株进行共生表型鉴定；结果表明，与空载体对照组(control)植株相比，MtPAP2沉默植株地上长势较小，地下根部较短，根瘤小且多数为颜色暗淡的坏死根瘤(图21，A-D)。

[0127] 为了量化MtPAP2沉默后对共生固氮影响的程度，分别对两组植株的地上鲜重，固氮酶活，根瘤数以及根瘤鲜重进行统计分析；结果显示，对照组植株(control)地上部分鲜重平均为0.061g/颗，而沉默植株平均为0.048g/颗，与对照组相比，沉默植株地上鲜重显著降低(p<0.05，n＝9)(图22，A)；对照组植株固氮酶活平均为3.93μmolg-1NDWh-1，沉默植株固氮酶活为2.48μmolg-1NDWh-1，与对照组相比，沉默植株固氮酶活显著降低(p<0.001，n＝
9)(图22，B)；对照组平均每颗植株上的根瘤数是17.8个，其中红瘤平均每颗16.5个，黄瘤平均每颗1.3个，沉默植株平均每颗植株上的根瘤数是16.8个，其中红瘤平均每颗10.6个，黄瘤平均每颗6.1个，与对照组相比，沉默植株根瘤总数目没有显著性差异，但是红瘤数目显著减少，坏死黄色根瘤数目显著增加(p>0.05，n＝9)(图22，C)；对照组植株(control)根瘤鲜重平均为0.003g/颗，而沉默植株平均为0.002g/颗，与对照组相比，沉默植株根瘤鲜重显著降低(p<0.05，n＝9)(图22，D)。

[0128] 综上所述，MtPAP2基因的沉默，造成共生固氮所需磷元素无法及时运送至根瘤，导致根瘤固氮酶活降低，影响植株地上长势。

[0129] 为进一步检测MtPAP2在根瘤形成和发育中的作用，在空载体对照组、超表达和沉默组中分别随机挑取9-12颗阳性根瘤，经FAA固定，石蜡包埋，纵切，甲苯胺蓝染色，置于体视显微镜观察。结果显示，与对照组植株相比，MtPAP2超表达植株根瘤形态发育良好，且根瘤分生区和侵染区中含菌细胞明显增加；而MtPAP2沉默植株根瘤发育异常，固氮区中含菌
细胞明显减少，共生体膜破裂且周质空间增大(图23，A-F)。其中，A:空载体对照植株21dpi根瘤纵切切片，B:超表达植株21dpi根瘤纵切切片，C:沉默植株21dpi根瘤纵切切片，D，E和F图分别为A，B和C图中固氮区的局部放大，图中mer表示分生区，infz表示侵染区，fixz表示固氮区。图中bar＝100μm。

[0130] 本实施例中，MtPAP2超表达在苜蓿菌根中转录水平检测：

[0131] 通过苜蓿毛根转化的方法获得转基因植株，待植株发根长出10天后，收获根样，抽取RNA，反转录为cDNA，进行超表达效率检测；结果显示，超表达植株发根中MtPAP2的相对表达量是空载体对照组(control)的8.6倍(n＝12，p<0.001)(图24，A)，表明MtPAP2基因获得超表达；对获得的阳性植株接种AM真菌，28天后收获根样，随机挑取部分根样用于TB染色，剩余的用于抽取RNA，反转录为cDNA，进行转录水平检测；结果显示，超表达植株根样中MtPAP2的相对表达量是空载体对照植株(control)的11.6倍(n＝12，p<0.001)(图24，B)，表明该批植株可以用于后续共生水平统计。

[0132] 对获得的超表达植株根段进行共生水平指标统计；结果表明，与空载体对照组(control)植株相比，MtPAP2超表达植株地上长势较好，如图25，

[0133] 为了量化MtPAP2超表达后对菌根共生的影响程度，分别统计两组植株TB染色后根样的侵染率、发育良好的丛枝、降解的丛枝、根内菌丝以及泡囊丰度(图26)，结果显示对照组植株侵染率为49.7％，而超表达株侵染率为68.4％，与对照组相比，超表达植物侵染率增加18.7％(p<0.05，n＝12)；对照组植株发育良好的丛枝丰度为27.6％，而超表达植株发育良好的丛枝丰度为42.7％，与对照组相比，超表达植株发育良好的丛枝丰度增加15.1％(p<
0.05，n＝12)；对照组植株降解的丛枝丰度为1.4％，而超表达植株降解的丛枝丰度为
1.9％，与对照组相比，超表达植物降解的丛枝丰度没有显著性差异(p>0.05，n＝12)；对照组植株根内菌丝丰度为18.5％，而超表达植株根内菌丝丰度为20.8％，与对照组相比，超表达植株根内菌丝丰度没有显著性差异(p>0.05，n＝12)；对照组植株泡囊丰度为2.3％，而沉默植株泡囊丰度为3.1％，与对照组相比，超表达植株泡囊丰度没有显著性差异(p>0.05，n＝12)(图27)。

[0134] 综上所述，MtPAP2基因的超表达，使得AM真菌的侵染率及从枝丰度都有提升，显示该蛋白在菌根真菌的共生及丛枝的形成和发育有重要作用。

[0135] MtPAP2沉默后在菌根中转录水平检测：

[0136] 通过苜蓿毛根转化的方法获得转基因植株，待植株发根长出10天后，收获根样，抽取RNA，反转录为cDNA，进行沉默效率检测；结果显示，沉默植株发根中MtPAP2的相对表达量是空载体对照组(control)的0.35倍(n＝12，p<0.001)(图28，A)，表明MtPAP2基因的表达受到抑制；对获得的阳性植株接种AM真菌，28天后收获根样，随机挑取部分根样用于TB染色，剩余的用于抽取RNA，反转录为cDNA，进行转录水平检测；结果显示，沉默株根样中MtPAP2的相对表达量是空载体对照植株(control)的0.21倍(n＝12，p<0.001)(图28，B)，表明该批植株可以用于后续共生水平统计。

[0137] 对获得的沉默植株根段进行共生水平指标统计；结果表明，与空载体对照组(control)植株相比，MtPAP2沉默植株地上长势较差(图29)。

[0138] 为了量化MtPAP2沉默后对菌根共生的影响程度，分别统计两组植株TB染色后根样的侵染率、发育良好的丛枝、降解的丛枝、根内菌丝以及泡囊丰度(图30，A-D)，其中，A:空载体植株28dpi染色根段C:RNAi干扰植株28dpi染色根段；C和D图分别为A和B图局部放大，图

[0139] 中fa表示发育良好的丛枝，da表示已经降解的丛枝，ih表示根内菌丝，v表示泡囊。Bar＝100μm

[0140] 结果显示对照组植株侵染率为70.6％，而沉默植株侵染率为52.1％，与对照组相比，沉默植物侵染率下降18.5％(p<0.05，n＝12)；对照组植株发育良好的丛枝丰度为
44.7％，而沉默植株发育良好的丛枝丰度为4.6％，与对照组相比，沉默植物发育良好的丛枝丰度下降40.1％(p<0.05，n＝12)；对照组植株降解的丛枝丰度为4.8％，而沉默植株降解的丛枝丰度为20.5％，与对照组相比，沉默植物降解的丛枝丰度上升15.7％(p<0.05，n＝
12)；对照组植株根内菌丝丰度为15.4％，而沉默植株根内菌丝丰度为16.2％，与对照组相比，沉默植物根内菌丝丰度没有显著性差异(p>0.05，n＝12)；对照组植株泡囊丰度为
5.6％，而沉默植株泡囊丰度为10.7％，与对照组相比，沉默植物泡囊丰度上升5.1％(p<
0.05，n＝12)(图31)。

[0141] 综上所述，MtPAP2基因表达的沉默，抑制了菌根真菌的侵染，尤其是丛枝结构的形成和发育，进一步证实MtPAP2对菌根真菌的共生及丛枝的形成和发育具有重要的作用。

[0142] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。
而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0143] 以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明
的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅
受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

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