技术领域
[0001] 本
发明黄瓜-酸黄瓜渐渗系抗蔓枯病IL14的筛选方法，通过不同浓度的批量处理，筛选出抗性表现良好的植株，属于
生物技术育种领域。
背景技术
[0002] 黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界十大蔬菜之一，主要分布于温带和亚热带地2
区。据联合国粮食与农业组织(FAO)统计，2010年中国黄瓜的栽培面积为988 680hm，总产量达到40 710 200t，是世界上最大的黄瓜生产和消费国。近年来，随着设施黄瓜的不断发展，黄瓜蔓枯病(Mycosphaerella melonis)成为继根结
线虫病后危害黄瓜生产的第二大病害。该病害在设施中遇高温高湿条件多发，黄瓜可减产20％左右，严重的将导致提前拉秧甚至绝收，这对黄瓜商品化生产造成严重影响(孙元超，2010；王培双和董勤成，2010)。
[0003] 目前，国内国外尚无专
门针对蔓枯病进行防治的有效措施，多数倾向于普通
化学防治，化学药剂不但成本相对较高且在高温高湿等蔓枯病发病较为严重地区防治效果较差，不能有效的控制蔓枯病病情的发展，长期喷施化学药剂导致的环境污染及病原菌本身产生的抗药性日益明显，化学药剂在实际生产过程中的局限性日益突出；
生物防治方面研究较少且应用推广有限。因此筛选具有高抗稳定品种进行推广应用，可从根本上有效控制病情的发生和蔓延。
[0004] 黄瓜遗传背景狭窄，变异率仅为3～8％(Staub et al.，1987)，抗病资源比较匮乏，自然条件下难以获得具有优良的抗病资源或突变体，因此黄瓜抗蔓枯病育种
进程一度陷于
瓶颈阶段。野生种或野生近缘种在长期进化过程中积累了抗逆遗传因子，为作物遗传改良提供了良好材料。通过远缘杂交转移近缘野生种中的优异抗性基因以拓展黄瓜遗传
基础，利用远缘杂交获得渐渗系是拓宽
植物遗传背景提高抗逆性的有效手段，渐渗系群体在挖掘、利用近缘种质资源，研究影响作物生长发育、产量、抗逆性等复杂性状上发挥着重要作用，是解决黄瓜抗病、抗逆性育种进程中的重要方法和手段。
[0005] 黄瓜野生种C.hystrix Chakr.(2n＝24)，是一个原产中国
云南甜瓜属的珍稀野生种，经过多年多次抗性鉴定，明确该野生种对蔓枯病上具有多种抗性，如抗蔓枯病、霜霉病、根结线虫病等多种病害(Chen J F，1997；Chen J F，2003；Chen JF，2004)。陈劲枫等(Chen J F，2000)成功实现了其与感病栽培品种‘北京截头’(C.sativus L.，2n＝14)的种间杂交获得F1，利用胚胎拯救及
体细胞无性系
染色体加倍技术合成了新的异源四倍体Cucumis.×hytivus。通过将该异源四倍体和栽培黄瓜‘北京截头’进行回交、自交，获得了一系列具有不同表型性状的渐渗育种材料。
[0006] 远缘杂交不仅是创造新物种及新材料的有效途径，同时其渐渗到栽培作物中的外源有益基因可提高作物的抗病抗逆性，通过接种鉴定渐渗系群体对黄瓜蔓枯病的抗性，可筛选出对蔓枯病高抗的株系，从而改善栽培作物中黄瓜的商品化生产的
质量，发明内容
[0007] 技术问题
[0008] 本发明是针对当前
现有技术的上述不足之处，提供一种抗蔓枯病黄瓜渐渗系材料的培育和筛选方法
[0009] 技术方案
[0010] 黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14的筛选方法，包含如下步骤：
[0011] (1)黄瓜种间渐渗系的获得：以野生种酸黄瓜为母本，栽培黄瓜‘北京截头’为父本杂交获得杂种F1，野生种酸黄瓜可比栽培黄瓜‘北京截头’提前2个月
播种，并对其进行40天以上的光周期处理，使两者花期相遇。杂种F1通过胚胎拯救结合体细胞无性系变异染色体加倍技术，获得可育的种间异源四倍体新种，命名为Cucumis hytivus，以异源四倍体新种Cucumis hytivus为母本，与栽培品种‘北京截头’通过系统回交和自交选育，获得86份携带有野生种染色体
片段的黄瓜种间渐渗系材料。
[0012] (2)黄瓜种间渐渗系抗蔓枯病接种初鉴定(春、秋两季)：制备孢子浓度为1×106个/mL的蔓枯病病原菌孢子悬浮液，利用
温室人工苗期接种鉴定方法喷施接种上述(1)中的86份黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料，接种7天后统计
叶片病级。接种鉴定两季材料，共筛选出表现稳定的中抗及以上的渐渗系材料27份。
[0013] (3)黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14筛选：制备孢子浓度为1×107个/mL的蔓枯病病原菌孢子悬浮液，利用温室人工苗期接种鉴定方法喷施接种上述(2)中的27份黄瓜-酸黄瓜渐渗系材料，接种7天后统计叶片病级。筛选出黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14。
[0014] 所述的黄瓜种间渐渗系抗蔓枯病接种鉴定具体步骤如下：
[0015] 1)接种前黄瓜材料的育苗和移苗步骤，具体方法如下：
[0016] 育苗：将各株系黄瓜种间渐渗系于55℃温
水中浸种3～5个小时，28℃恒温
培养箱中催芽，每隔10h冲洗
种子表面，更换浸种水，待种子胚根长至0.3～0.7cm时将种子播于装有灭菌营养土的穴盘中，置于
温度25℃、
相对湿度为80％的温室内。；
[0017] 移苗：待黄瓜
幼苗第一片真叶展平
时移苗至装有灭菌营养土的营养钵(口径12cm，底径10cm，高8cm)中，每钵1株。
[0018] 所述的灭菌营养土为草炭和蛭石1∶1混合，并经121℃灭菌所得。
[0019] 2)病原菌的获得与培养
[0020] 病原菌的获得取子实体突出表皮的黄瓜蔓枯病蔓1～2cm，
自来水冲洗2～3min，75％酒精表面消毒30s，无菌水清洗2～3min，用灭菌解剖针挑取单个子实体，置于盛有无菌水的灭菌培养皿中浸泡2min。将子实体放在含有利福平的
马铃薯
葡萄糖培养基(PDA)上进行培养(PH＝5)。培养皿放置在28℃下培养3d，通过多次分离培养，最终获得纯合培养(李英等，2007；Ellis and Holliday，1971)。
[0021] 病原菌的培养将经纯化培养的病原菌采用挑取菌丝或孢子的方式，接种于含有利福平、PH为5.0的PDA培养基中，暗培养4d后采用暗培养和间歇紫外灯处理(12h黑暗/12h紫外灯)相结合的方法诱导分生孢子产生，25℃保存。
[0022] 病原菌复壮：将经过纯化培养的病原菌接种于灭菌处理后的新鲜黄瓜表皮，4d后挑取黑色孢子接种于含有利福平的PDA培养基中(PH＝5.0)。
[0023] 3)病原菌孢子悬浮液配置
[0024] 加入5～10mL无菌水冲洗病原菌培养基表面，用L型玻璃棒轻轻刮培养基表层，获得的孢子悬浮液经四层纱布过滤，除去菌丝、琼脂等杂质的孢子粗提液作为母液。用乳酸调整孢子悬浮液的pH值至3.5～4.0，在
显微镜下使用血球计数板统计悬浮液的孢子浓度，-1 -1将接种孢子浓度配制至1×106mL ，接种前，加入2.5g·L 的明胶作为
表面活性剂。
[0025] 4)接种
[0026] 黄瓜
幼苗生长至3～4片真叶时进行人工喷雾接种，接种孢子悬浮液浓度为6 -1
1×10mL ，对照植株接种无菌水。接种后
覆盖棚膜3d，遮光密闭小棚，并保持棚内相对湿度
92％～95％，温度21～25℃。
[0027] 所述的接种步骤具体方法为待幼苗长到3～4片真叶时接种，使用
喷雾器全株喷6 -1
雾，控制喷施量至植株叶片上水滴欲滴，孢子悬浮液浓度为1×10mL ，接种后在密闭棚内放置
加湿器进行加湿处理以保证湿度，对照组接种液不加病原菌分生孢子。保持棚内相对湿度92％～95％，温度21～25℃，进行正常肥水管理。
[0028] 5)鉴定
[0029] 接种后7d后统计叶部病级，统计部位为从茎基部起4片真叶，参照Wehner和Zhang的方法统计病级，按照如下公式计算病情指数。
[0030] 病情指数(DI)＝∑(病级×该病级株数)/(最高病级×调查总株数)×100。参考方中达(1998)的方法。叶，茎部病指DI≤15为高抗(HR)；15＜DI≤45为抗(R)；
45＜DI≤75为感(S)；75＜DI为高感(HS)。
[0031] 叶部分级标准：0～9级：0)无症状；1～2)零星感染；3～4)少量小斑点；5～6)20～50％的叶片有小斑点；7～8)植株萎蔫并且斑点超过50％；9)植株死亡(Wehner&Shetty，2000)。
[0032] 黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14的筛选通过以下方法获得的：
[0033] (1)黄瓜-酸黄瓜渐渗系群体抗蔓枯病春秋两季初筛选：
[0034] 以黄瓜-酸黄瓜渐渗系群体(86份)、普通栽培黄瓜‘北京截头’(感病对照)为6
材料，采用温室苗期人工接种鉴定的方法进行接种，制备孢子悬浮液浓度为1×10个/mL。
接种后覆盖棚膜3d，遮光密闭，保证棚内相对湿度92％～95％，温度21～25℃。接种1周后统计叶部病级，统计部位为从茎基部起4片真叶。根据公式得出病情指数在中抗以上的材料，两季共筛出27份。
[0035] (2)黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14的筛选：
[0036] 以(1)中所得27份黄瓜-酸黄瓜渐渗系为材料，普通栽培黄瓜‘北京截头’为感7
病对照，同样采用温室苗期人工接种鉴定的方法进行接种，制备孢子悬浮液浓度为1×10个/mL，使具有抗性不同的株系接种后可产生明显的抗性等级差异，接种后覆盖棚膜3d，遮光密闭，保证棚内相对湿度92％～95％，温度21～25℃。接种1周后统计叶部病级，统计部位为从茎基部起4片真叶。筛选出具有高抗且抗性稳定的黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14。
[0037] 有益效果：
[0038] 本发明黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14的培育和筛选及其应用方法，与现有黄瓜栽培现状相比，具有如下优点和积极效果：
[0039] 黄瓜是一种重要的世界性蔬菜，由于其背景狭窄，多样性较低，传统育种无法满足抗病育种需求，本发明是利用种间杂交、多代回交及自交的方式将野生酸黄瓜中优异基因转育到86份渐渗系黄瓜中，通过转移野生种中有益抗性基因可提高普通栽培种的抗病抗逆性。本发明采用苗期温室人工接种鉴定的方法，在渐渗系群体中筛选出抗蔓枯病渐渗系IL14，为抗蔓枯病育种选育提供有益材料。通过接种鉴定筛选的黄瓜抗蔓枯病渐渗系材料IL14具有明显的应用前景，不仅解决了黄瓜背景狭窄问题，也为黄瓜抗蔓枯病缺乏稳定
抗原问题提供了可靠保障，将黄瓜-酸黄瓜渐渗系中优异的种质资源加以利用，这对于今后黄瓜抗蔓枯病育种研究中打破黄瓜遗传背景狭窄的瓶颈状态并发掘野生资源优异基因、研究抗蔓枯病遗传特性、精细
定位、基因的图位克隆及品种的遗传改良等具有广泛的应用前景。
[0040] 通过田间观察，黄瓜-酸黄瓜渐渗系IL14对蔓枯病具有稳定抗性，植株长势强，平均主节间长14.2cm，平均主蔓粗0.3cm，平均分枝数为4，叶片绿色，平均叶长22.5cm，平均叶宽23.1cm，平均叶柄长14.4cm，平均第一雌花节位在8节，平均单节雌花数为3，商品瓜为短棒状，浅绿色，瓜刺白色，数量中等，平均瓜长14.5cm，粗4.2cm，主侧蔓均可结瓜。因此，黄瓜-酸黄瓜渐渗系IL14可作为优良的抗病材料应用于黄瓜新品种育种实践。
附图说明
[0041] 图1：抗蔓枯病黄瓜渐渗系材料IL14的培育和筛选技术路线图；
[0042] 图2：蔓枯病病原菌菌丝及孢子；
[0043] 图3：待接种黄瓜幼苗；
[0044] 图4：接种后不同等级黄瓜叶片；
[0045] 图5：接种后不同等级黄瓜植株；
[0046] 图6：接种蔓枯病后抗、感植株的田间表现。
具体实施方式
[0047] 黄瓜蔓枯病是一种严重的世界性病害，对黄瓜的品质和产量造成很大影响。本发明以黄瓜-酸黄瓜渐渗系为材料，利用苗期温室人工接种方法对渐渗系材料进行抗性鉴定，经过两季接种鉴定，筛选出黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14。抗蔓枯病黄瓜渐渗系材料IL14的培育和筛选方法，包括：
[0048] 1、黄瓜-酸黄瓜渐渗系的获得
[0049] 黄瓜野生种C.hystrix Chakr.(2n＝24)是一个原产中国云南甜瓜属的珍稀野生种，为短日照植物，初期长势时间较长，‘北京截头’为普通栽培黄瓜，因此野生种酸黄瓜要比普通栽培黄瓜提前2个月播种，并对其进行40d以上的光周期处理，使得两者花期相遇。以野生种酸黄瓜为母本，栽培黄瓜‘北京截头’为父本杂交获得杂种F1，杂种F1通过胚胎拯救结合体细胞无性系变异染色体加倍技术，获得可育的种间异源四倍体新种，命名为Cucumis hytivus，以异源四倍体新种Cucumis hytivus为母本，与栽培品种‘北京截头’通过系统回交1～2代、自交5～7代选育，获得86份携带有野生种染色体片段的黄瓜种间渐渗系材料，其体细胞染色体鉴定结果表明黄瓜-酸黄瓜渐渗系群体与普通栽培黄瓜染色体数目相同，2n＝14。具体培育技术路线图见图1。
[0050] 2、黄瓜86份渐渗系抗蔓枯病接种鉴定
[0051] 1)病原菌采集：蔓枯病病原菌采自田间黄瓜自然发病(蔓枯病)病株病茎，用挑取单个子实体的接种法进行分离纯化，并由南京农业大学
园艺学院黄瓜课题组搜集保存。
[0052] 2)病原菌的培养：将经纯化培养的病原菌采用挑取菌丝或孢子的方式，接种于含有利福平、PH为5.0的PDA培养基中，暗培养4d后采用暗培养和间歇紫外灯处理(12h黑暗/12h紫外灯)相结合的方法诱导分生孢子产生，25℃保存，见图2。
[0053] 3)基质的配比和灭菌：将蛭石和草炭按1∶1比例混合均匀制得营养土，于121℃下高压灭菌。
[0054] 4)材料种植：
[0055] 育苗：将86份黄瓜种间杂交渐渗系材料、抗病对照野生种(C.hystrix)、感病对照‘北京截头’，每份材料10株，于55℃温水中浸种4个小时，置于28℃恒温培养箱中进行催芽，观察并冲洗种子表面，种子表面水分少时及时补充少量水分，待种子胚根长至0.5cm时将种子播于装有灭菌营养土的穴盘中。
[0056] 移苗：待黄瓜幼苗第一片真叶展平即“两叶一心”时移苗至装有灭菌营养土的营养钵(口径12cm，底径10cm，高8cm)中，每钵1株。
[0057] 5)材料接种：
[0058] 病原菌孢子悬浮液配置：在病原菌培养皿上加入5～10mL无菌水来冲洗病原菌培养基表面，用L型玻璃棒轻轻刮培养基表层，获得的孢子悬浮液经四层纱布过滤，除去菌丝、琼脂等杂质的孢子粗提液作为母液。用乳酸调整孢子悬浮液的pH值至3.5～4.0，在6 -1
显微镜下使用血球计数板统计悬浮液的孢子浓度，将接种孢子浓度配制至1×10mL ，接种-1
前，加入2.5g·L 的明胶作为表面活性剂。
[0059] 接种：黄瓜幼苗生长至3～4片真叶时进行人工喷雾接种，见图3。接种孢子悬浮6 -1
液浓度为1×10mL ，对照植株接种无菌水。使用喷雾器全株喷雾，控制喷施量至植株叶片上水滴欲滴，接种后在密闭棚内放置加湿器进行加湿处理以保证湿度，对照组接种液不加病原菌分生孢子。接种后覆盖棚膜3d，遮光密闭小棚，保持棚内相对湿度92％～95％，温度
21～25℃，进行正常肥水管理。
[0060] 6)鉴定
[0061] 接种后7d后统计叶部病级，统计部位为从茎基部起4片真叶，参照Wehner和Zhang的方法统计病级，按照如下公式计算病情指数。
[0062] 病情指数(DI)＝∑(病级×该病级株数)/(最高病级×调查总株数)×100。参考方中达(1998)的方法。叶，茎部病指DI≤15为高抗(HR)；15＜DI≤45为抗(R)；
45＜DI≤75为感(S)；75＜DI为高感(HS)。
[0063] 叶部分级标准：0～9级：0)无症状；1～2)零星感染；3～4)少量小斑点；5～6)20～50％的叶片有小斑点；7～8)植株萎蔫并且斑点超过50％；9)植株死亡(Wehner&Shetty，2000)。
[0064] 7)按照上述接种鉴定方法进行统计，在春秋两季实验中共筛选出表现中抗及以上的渐渗系材料27份，见图4和图5。
[0065] 8)以筛选出的27份表现有抗性的材料进行第三季接种鉴定，以普通栽培黄瓜‘北京截头’为感病对照，同样采用温室苗期人工接种鉴定的方法进行接种，材料种植和菌种培7 -1
养方法同上。接种时将病原菌孢子悬浮液浓度上升至1×10个mL ，使具有抗性不同的株系接种后可产生明显的抗性等级差异，接种后覆盖棚膜3d，遮光密闭，保证棚内相对湿度
92％～95％，温度21～25℃。接种7天后统计叶部病级，统计部位为从茎基部起4片真叶。
筛选出具有高抗且抗性稳定的黄瓜-酸黄瓜抗蔓枯病渐渗系IL14，鉴定后发现编号为IL14的渐渗系材对蔓枯病表现出抗性，并在三季观察中抗性较为稳定，见图6。
[0066] 应用本发明获得的黄瓜抗蔓枯病渐渗系材料IL14，可以直接作为育种材料，该材料生长势强，平均主节间长14.2cm，平均主蔓粗0.3cm，平均分枝数为4，叶片绿色，平均叶长22.5cm，平均叶宽23.1cm，平均叶柄长14.4cm，平均第一雌花节位在8节，平均单节雌花数为3，商品瓜为短棒状，浅绿色，瓜刺白色，数量中等，平均瓜长14.5cm，粗4.2cm，主侧蔓均可结瓜。此抗病材料的获得可作为优良的抗病材料应用于黄瓜新品种育种实践，同时也为今后研究黄瓜抗病基因分子标记的定位、图谱的构建及克隆等奠定了坚实的基础。
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