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一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂及其在糖肽富集中的应用

阅读：717发布：2021-08-01

专利汇可以提供一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂及其在糖肽富集中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明具体涉及一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，并将其应用于糖肽富集。首先制备粒径在8-15μm且表面含有多个环氧官能团的多孔环氧树脂微球，然后加入间苯二胺和间苯二甲醛，以乙酸为催化剂制备得到表面包覆一层微孔有机聚合物(MOP)的亲水性树脂，该亲水树脂制备条件简单，反应温和。最后以标准糖蛋白(IgG)酶解液为样品考察亲水性树脂对糖肽的富集性能，并进一步应用于鼠肝中糖蛋白质组学分析。，下面是一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂及其在糖肽富集中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂，所述的树脂以多孔环氧树脂微球为载体，在其表面包覆一层亲水性的微孔有机聚合物。
2.按照权利要求1所述的微孔聚合物包覆的亲水性树脂，其特征在于：所述的多孔环氧树脂微球为烯丙基缩水甘油醚和季戊四醇三丙烯酸酯为原料制备成的高分子微球，微球载体的粒径为8-15μm，比表面积为40-80m2/g，平均孔径为150-180nm，孔隙率为75-78％，水接触角大小为50-65°。
3.按照权利要求1所述的微孔聚合物包覆的亲水性树脂，其特征在于：MOP修饰的亲水
2
树脂，比表面积为100-135m/g，平均孔径为1-5nm，水接触角大小为24-30°。
4.按照权利要求1、2或3所述的微孔聚合物包覆的亲水性树脂，其特征在于：
微孔聚合物包覆的亲水性树脂结构示意式如下，
5.按照权利要求1、2或3所述的微孔聚合物包覆的亲水性树脂，其特征在于：
所述的微孔聚合物包覆的亲水性树脂采用种子溶胀聚合法制备多孔环氧树脂微球，然后在其表面包覆亲水性微孔有机聚合物(MOP)，
具体制备过程可按如下步骤操作：
(1)配制含有聚乙烯醇和非离子表面活性剂Triton X-100的水溶液，将烯丙基缩水甘油醚、季戊四醇三丙烯酸酯、引发剂和致孔剂的混合油相加入水溶液中，加热搅拌得到环氧树脂微球；
(2)采用“一锅法”制备，将间苯二胺和间苯二甲醛与环氧树脂微球混合，然后在二氧六环溶液中加热搅拌进行反应；间苯二胺用量为环氧树脂质量的5-10倍(优选8倍)；胺基化反应的温度为60-120℃(优选80℃)，反应时间为12-48小时(优选30小时)；间苯二胺的浓度为
0.5-10mg/mL(优选0.8)，间苯二甲醛与间苯二胺的摩尔比为0.4-1.5(优选1)；且所需催化剂乙酸的浓度为2-6mol/L(优选3mol/L)，机械搅拌速度为100-300r/min(优选140r/min)；
在反应过程中环氧树脂表面的环氧基团与间苯二胺反应得到氨基化的树脂，同时间苯二甲醛与其反应得到MOP修饰的亲水树脂，反应结束后，取出微孔聚合物包覆的亲水性树脂洗涤，干燥得产品。
6.一种权利要求1-5任一所述微孔有机聚合物包覆的亲水性树脂的应用，其特征在于：
所制备亲水树脂应用于蛋白质酶解液中的糖肽富集。
7.按照权利要求6所述微孔有机聚合物包覆的亲水性树脂的应用，其特征在于：微孔有机聚合物包覆的亲水性树脂利用亲水作用色谱机理富集蛋白酶解液中的糖肽。

说明书全文

一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂及其在糖肽富集中的应用

技术领域

[0001] 本发明具体涉及一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，该亲水树脂可用于生命健康领域的糖肽富集。

背景技术

[0002] 蛋白质糖基化是重要的翻译后修饰之一，它在许多生物学过程中起着非常重要的调节作用(文献1.Yan et.al“Selective enrichment of glycopeptides/phosphopeptides using porous titania microspheres”《, Chemical Communications》,2010,46(30),5488-5490)。糖蛋白异常与人类的多种疾病密切相关，因此糖蛋白的检测和鉴定对疾病的诊断和治疗有重要的指导意义。目前，在糖蛋白和糖肽的分析中，质谱技术因其较高的灵敏度和分辨率(文献2.Dell et.al.“Glycoprotein structure determination by mass spectrometry”《, Science》,2001,291(5512):2351-2356)而被广泛应用。然而，实际样品中的糖肽信号通常较低，它们极易受到非糖肽的干扰。因此，在质谱分析前有必要对糖肽进行高选择性富集。目前，凝集素亲和色谱、硼酸化学、酰肼化学和亲水作用色谱等多种方法被广泛应用于生物样品中糖肽的富集。在这些方法中，亲水作用色谱(文献3“.Xiong et.al.Synthesis of branched PEG brushes hybrid hydrophilic magnetic nanoparticles for the selective enrichment of N-linked glycopeptides”,《Chemical Communications》,2012,48(65),8138-8140)具有富集过程简单、富集条件温和以及重现性较好的优点而受到普遍关注。最近，研究者们发展了多种类型的亲水固定相，如麦芽糖、两性硅胶或者聚合物、纤维素、琼脂糖和MOFs材料，并将它们应用于糖肽富集中。因此，设计新型亲水色谱固定相是糖肽富集研究的热点之一。近年来，多孔有机材料(POPs)(文献4.Zang et.al.“Functional porous organic polymers for heterogeneous catalysis”《,Chemical Society Reviews》,2012,41(6),2083-2094)因其制备简单、比表面积较大且聚合物分子链主要为密度较轻的元素C、N、O、B等组成以及化学和热稳定性较好受到了较为广泛的关注。而由纯有机构筑基元构建的有机多孔材料更是迅猛发展，此类材料包括超交联聚合物(HCP)、共轭微孔聚合(CMP)、微孔有机材料(MOP)、内在微孔聚合物(PIM)、共价有机骨架(COF)和多孔芳香骨架(PAF)等，它们通常通过溶剂热反应、聚合/浓缩或者金属介导偶联/加成反应制备。相比于传统的微孔材料：分子筛、活性碳、石墨和金属–有机配位聚合物(MOF)而言，它们可以在很大范围内通过改变有机分子的官能团和采用不同的合成手段对微孔聚合物的功能化进行调节。另外，绝大部分有机聚合物通常对空气、环境湿度或者更苛刻的环境有非常好的稳定性(文献5.Jiang et.al.“Synthetic control of the pore dimension and surface area in conjugated microporous polymer and copolymer networks”《, Journal of the American Chemical Society》,2008,130(24),
7710-7720)。目前，这些材料已经成功应用于催化、气体储存以及样品预处理等领域。MOP巨大的比表面积、高的孔隙率和优异的物理化学稳定性使其非常适合作为复杂样品中痕量目标物的分离富集介质。MOP可以通过分子筛分作用或微孔填充效应进行选择性的分离和富集与分子尺寸“大小一致”的目标分析物。功能化的MOP具有疏水、亲水以及磁性作用，可有效提高前处理过程的分离富集能力。本发明以环氧树脂为基质，采用一锅法在其表面包覆亲水微孔有机聚合物(MOP)，制备亲水树脂，并将其应用于标准糖蛋白酶解液和鼠肝蛋白质酶解液的糖蛋白质组学分析。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂及其制备，可采用亲水作用色谱将该树脂应用于蛋白酶解液中的糖肽富集。

[0004] 一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂，该微孔聚合物包覆的亲水性树脂结构示意如下，

[0005]

[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体包括如下内容：

[0007] 具有亲水作用的是制备过程简单、比表面积较大的微孔有机聚合物。

[0008] (1)多孔环氧树脂微球的制备

[0009] 配制含有聚乙烯醇和非离子表面活性剂Triton X-100的水溶液，将烯丙基缩水甘油醚(CAS:106-92-3)、季戊四醇三丙烯酸酯(CAS:3524-68-3)、引发剂和致孔剂的混合油相加入水溶液中，加热搅拌得到环氧树脂微球。

[0010] (2)微孔聚合物包覆的亲水树脂的制备

[0011] 取步骤(1)中制备的干燥环氧树脂与两个带有不同官能团的间苯二胺和间苯二甲醛单体分散于40-80mL二氧六环中，氮气保护下，在80-120℃油浴中回流20-40h，环氧树脂和间苯二胺发生环氧开环反应，两单体之间发生胺醛缩合反应，反应结束后，取出微孔聚合物包覆的亲水性树脂用二氧六环，无水乙醇洗涤，然后置于40-80℃的真空干燥箱中干燥12-24h。制备得到的亲水性树脂可应用于富集糖肽。

[0012] (3)应用

[0013] 采用1-6mg材料富集IgG酶解液中的糖肽。具体过程如下，首先将30-100μg IgG蛋白质酶解液用100-300μL上样液稀释，加入该亲水性树脂后，室温震荡5-15min。离心，除去上清液。然后采用上样液清洗，以除去非糖肽和其他杂质。接着加入50-100μL洗脱液并室温震荡5-15min后，混合物离心，取上清液用MALDI-TOF/MS分析。另外，将上清液冷冻干燥后，加入PNGase F酶NH4HCO3溶液，一定温度下孵育10-20h，以除去糖基片段。最后去糖基化肽段采用MALDI-TOF/MS进行分析。运用该方法将该亲水性树脂进一步应用于鼠肝中糖蛋白质组学分析。

[0014] 本发明的有益效果

[0015] 1.本发明制备了一种微孔聚合物包覆的亲水树脂，制备得到的亲水树脂可以应用于糖肽的富集。

[0016] 2.本发明所制备得到的亲水树脂通过环氧开环反应，席夫碱反应共同完成，相对于需要昂贵的过渡金属催化的Sonogashira-Hagihara和Suzuki-Miyaura两种常用来制备微孔聚合物的交叉偶联反应，利用席夫碱反应制备微孔有机聚合物可避免使用大量金属偶联催化剂，所需反应单体廉价反应条件相对温和，制备过程简单可控且绿色灵活。

[0017] 3.本发明提供的微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，该亲水性树脂的合成中不仅无需昂贵的过渡金属作为催化剂或单体，且反应后亦不存在难以实现催化剂与微孔有机聚合物完全分离的难题，该聚合物的合成路线步骤少，制备成本低且具有实现工业化大批量生产的潜能。附图说明

[0018] 图1微孔聚合物包覆的亲水树脂的制备示意图。

[0019] 图2(a)mPDA，(b)IPA，(c)MOP，(d)原始MAR，(e)MAR@NH2，(f)MAR@MOP的傅里叶变换红外光谱图。

[0020] 图3四种不同材料的照片。原始MAR为白色，MAR@MOP为土黄色，MAR@MOP和MOP颜色相似但形貌差别较大。

[0021] 图4(a)原始MAR，(b)MAR@MOP的扫描电镜图。

[0022] 图5(a)原始MAR，(b)MAR@MOP的N2吸附/脱附等温线。

[0023] 图6(a)MOP(b)原始MAR和(c)MAR@MOP的水接触角。(a)(b)(c)水接触角大小分别为19.2°，58.8°和24°。

[0024] 图7IgG酶解液经富集前后的MALDI-TOF/MS质谱图。(a)富集前(b)经MAR@MOP富集后(c)富集肽段经PNGase F去糖基化后。

[0025] 表1(a)MOP(b)原始MAR和(c)MAR@MOP三种材料的比表面积及元素分析。

[0026] 表2亲水性树脂MAR@MOP从IgG酶解液中富集糖肽的分子量和糖链构成。

[0027] 表3MAR@MOP富集前后的LC-MS/MS数据。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] (1)采用种子溶胀法制备多孔环氧树脂微球，具体如下：

[0030] A溶液：配制含聚乙烯醇为20g/L和非离子表面活性剂Triton X-100为20g/L的无水乙醇溶液1L。B溶液：配制3g/L偶氮二异丁腈的苯乙烯溶液16mL。氮气氛围下，将B溶液缓慢加入64mL A溶液中，得到的混合体系在室温下以220r.p.m.的机械搅拌速度下搅拌1小时，然后将温度升高至70℃，聚合反应12小时，得到的产物聚苯乙烯微球依次用无水乙醇和水洗涤三次后于60℃下真空干燥12小时后备用。配制含聚乙烯醇为10g/L和十二烷基硫酸钠为2.5g/L的水溶液1L作为种子溶胀聚合法制备环氧树脂反应体系的水相溶液。首先将0.45g聚苯乙烯微球加入到15mL水相溶液中超声分散形成悬浊液，另外向150mL水相溶液中依次加入7.20g烯丙基缩水甘油醚(CAS:106-92-3)、7.20g季戊四醇三丙烯酸酯(CAS:3524-
68-3)、144mg偶氮二异丁氰和14.40g 甲苯，氮气氛围下，加入已制备的聚苯乙烯微球悬浊液，得到的混合体系在室温下以240r.p.m.的机械搅拌速度搅拌0.5小时，然后将温度升高至60℃，聚合反应12小时，得到的产物环氧树脂依次用丙酮和乙醇洗涤三次后于60℃下真空干燥12小时。

[0031] (2)微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，具体为：

[0032] 取310mg环氧树脂、39mg间苯二胺、48mg间苯二甲醛分散于40mL二氧六环中，另加入8mL浓度为3mol/L的乙酸溶液作为催化剂，得到的混合体系在室温氮气保护下以140r.p.m.的机械搅拌速度搅拌1小时，然后在80℃搅拌反应30小时。反应结束，所得产物冷却至室温而后用二氧六环，无水乙醇各清洗3次，60℃真空干燥过夜，得到亲水树脂。

[0033] (3)产物表征

[0034] 在FT-IR谱中，3400,3326cm-1属于间苯二胺中NH2的伸缩振动，1600cm-1处的峰信号归属于NH2的弯曲振动(图2a)。在间苯二甲醛(图2b)的FT-IR谱中，2863cm-1处的峰信号对应-1于醛基上的C-H的伸缩振动,1694cm 属于C＝O的振动吸收峰。在MOP(图2c)的FT-IR谱中，特征峰1627cm-1以及3250cm-1和3500cm-1之间的宽峰分别对应于MOP中的(-C＝N-)和(-NH-，-OH)的伸缩振动，图2d,e,f中，因MOP的特征吸收峰被MAR全部覆盖，故谱图中的特征吸收峰几乎没有明显变化。

[0035] 扫描电镜观察MAR和MAR@MOP亲水树脂的相貌和尺寸，结果如图4a所示，MAR为单分散球型，微球直径分布约为10μm。高倍SEM图片显示微球有明显微米尺度的大孔结构(图4b,c)。通过压汞法测得MAR微球的平均孔径为177.1nm，孔隙率为77.05％，MAR微球的纳米尺寸的孔对蛋白质等大分子物质也具有一定的吸附能力因此不利于酶解液中糖肽的特异性富集。为了提高糖肽富集的特异性，选择微孔有机聚合物对其进行改性(图4d,e,f)，MAR微球表面修饰了MOP后尺寸和表面形态均没有发生明显变化，说明原始MAR具有较强的化学稳定性。但颜色由原来的白色变成了棕黄色(图3)，更有力的说明微孔有机聚合物MOP已经成功修饰在MAR微球表面，且MOP具有较小的平均孔径为1.5nm。

[0036] 氮气吸附-解吸法测得MAR和MAR@MOP比表面积，如图5所示.根据BET(Brunauer-Emmett-Teller)模型计算MAR和MAR@MOP的比表面积分别为57.77m2/g和131.3m2/g(表1)。

[0037] 水接触角测试中，结果如图6所示，修饰前环氧大孔吸附树脂MAR的水接触角为58.8°，修饰MOP后水接触角降低到24°，这说明微孔有机聚合物已经成功修饰到MAR表面。证明MAR@MOP具有很好的亲水性能，是一种理想的亲水材料。

[0038] 元素分析(表1)中，MAR的氮元素含量＜0.3，说明原始微球MAR中几乎不含氮元素；与MAR相比，MAR@MOP中氮含量的增加(2.09％)说明微孔有机聚合物成功地被包覆到MAR上；
相对于MAR和MAR@MOP，MOP(11.6％)中较高氮含量更进一步说明MOP成功包覆到微球表面。

[0039] (4)蛋白质样品(IgG与鼠肝蛋白质)的酶解，具体为：

[0040] 首先将2mg 2种蛋白质、1mL变性缓冲液(含有8mol/L尿素和0.1mol/L碳酸氢铵)和20μL DTT(50mmol/L)加入到一个10mL离心管中，混合均匀后在60℃下孵育1h。然后加入
3.7mg IAA并在室温下避光孵育40min后，用0.1mol/L三乙铵碳酸氢盐缓冲剂(pH 8.2)稀释
8倍，并按照1:40(w/w)的比例加入胰蛋白酶，在37℃下酶解20h。酶解过后，采用TFA(10％)溶液将酶解液的pH值调为2.7。最后，用自制C18小柱对酶解液进行固相萃取，收集到的肽段经过冷冻干燥并在冰箱中保存以备用。

[0041] (5)采用亲水作用色谱法将该亲水性树脂应用于富集糖肽

[0042] 分别用2mg和5mg亲水性树脂富集IgG和鼠肝蛋白质酶解液中的糖肽。具体过程如下，首先将50μg IgG或200μg鼠肝蛋白质酶解液分别用200μL上样液(ACN/H2O/TFA，88/11.9/0.1，v/v/v)稀释，加入MAR@MOP后，室温震荡10min。离心，除去上清液。然后采用上样液(400μL×3次)清洗，以除去非糖肽和其他杂质。接着加入60μL洗脱液(ACN/H2O/TFA，30/
69.9/0.1，v/v/v)并室温震荡10min后，混合物离心，取上清液用MALDI-TOF/MS分析。另外，将上清液冷冻干燥后，加入60μL含1000UPNGase F酶的10mmol/L NH4HCO3溶液(pH＝8.0)，37℃下孵育12h，以除去糖基片段。最后去糖基化肽段采用MALDI-TOF/MS或者cLC-MS/MS进行分析。

[0043] 选用人血清免疫球蛋白酶解液为样品评价微孔聚合物包覆的亲水树脂对糖肽的富集性能。直接对IgG酶解液进行质谱分析时，质谱图以非糖肽峰为主，经过亲水性树脂富集后，非糖肽完全被除去，检测出17条糖肽，糖肽峰的信号强度得到明显加强，说明该材料在糖肽富集中具有较好的特异性。

[0044] 取鼠肝提取蛋白酶解液与微孔聚合物包覆的亲水树脂孵育、富集、洗脱、洗脱液冻干、糖苷酶去糖基化、nano LC-MS/MS分析。重复分析3次。富集前总共鉴定出属于516个糖蛋白上的879个N-糖基化位点。富集得到糖肽的糖型结构和氨基酸序列见表3。该结果表明微孔聚合物包覆的亲水树脂可用于高选择性分离富集、分析鉴定微量复杂生物样中低丰度糖肽，实现微量样品中糖蛋白质组学分析。

[0045] 表1

[0046]

[0047] a根据BET模型计算

[0048] 表2

[0049]

[0050] 表3

[0051]

[0052] a:鼠肝提取蛋白酶解液直接分析的N-糖基化位点数目、糖肽数目和糖蛋白数目[0053] b:鼠肝提取蛋白酶解液经MAR@MOP富集后的N-糖基化位点数目、糖肽数目和糖蛋白数目

[0054] 实施例2

[0055] (1)采用种子溶胀法制备多孔环氧树脂微球，具体步骤同实施例1步骤(1)[0056] (2)微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，具体步骤同实施例1步骤(2),不同之处为：投放的间苯二甲醛质量减少为38mg，即间苯二甲醛与间苯二胺的摩尔比为0.8。

[0057] (3)产物表征方法同实施例1的(3)。所得结果不同之处为比表面积大小为120m2/g，MAR@MOP的水接触角为27°。

[0058] (4)蛋白质样品的酶解以及(5)亲水性树脂应用于富集蛋白酶解液中糖肽同实施例1中的(4)和(5)。

[0059] 直接对IgG酶解液进行质谱分析时，质谱图以非糖肽峰为主，经过亲水性树脂富集后，非糖肽几乎完全被除去，检测出16条糖肽。

[0060] 实施例3

[0061] (1)采用种子溶胀法制备多孔环氧树脂微球，具体步骤同实施例1步骤(1)[0062] (2)微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，具体步骤同实施例1步骤(2),不同之处为：投放的间苯二甲醛质量减少为24mg，即间苯二甲醛与间苯二胺的摩尔比为0.5。

[0063] (3)产物表征方法同实施例1的(3)。所得结果不同之处为比表面积大小为100m2/g，MAR@MOP的水接触角为30°。

[0064] (4)蛋白质样品的酶解以及(5)亲水性树脂应用于富集蛋白酶解液中糖肽同实施例1中的步骤(4)和(5)。

[0065] 直接对IgG酶解液进行质谱分析时，质谱图以非糖肽峰为主，经过亲水性树脂富集后，非糖肽几乎完全被除去，检测出15个糖肽。

[0066] 实施例4

[0067] (1)采用种子溶胀法制备多孔环氧树脂微球，具体步骤同实施例1步骤(1)[0068] (2)微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，具体步骤同实施例1步骤(2),不同之处为：投放的间苯二甲醛质量减少为20mg，即间苯二甲醛与间苯二胺的摩尔比为0.4。

[0069] (3)产物表征，产物表征方法同实施例1的(3)。所得结果不同之处为比表面积大小2
为90m/g，MAR@MOP的水接触角为40°。

[0070] (4)蛋白质样品的酶解以及(5)亲水性树脂应用于富集蛋白酶解液中糖肽，同实施例1中的(4)和(5)。

[0071] 直接对IgG酶解液进行质谱分析时，质谱图以非糖肽峰为主，经过亲水性树脂富集后，非糖肽被除去，检测出5条糖肽，但信号强度较低。

[0072] 实施例5

[0073] (1)采用种子溶胀法制备多孔环氧树脂微球，具体步骤同实施例1步骤(1)[0074] (2)微孔聚合物包覆的亲水性树脂的制备，具体步骤同实施例1步骤(2),不同之处为：投放的间苯二甲醛质量增加为72mg，即间苯二甲醛与间苯二胺的摩尔比为1.5。

[0075] (3)产物表征，产物表征的方法同实施例1的(3)。所得结果不同之处为比表面积大小为200m2/g，MAR@MOP的水接触角为15°。

[0076] (4)蛋白质样品的酶解以及(5)亲水性树脂应用于富集蛋白酶解液中糖肽，同实施例1中的(4)和(5)。

[0077] 直接对IgG酶解液进行质谱分析时，质谱图以非糖肽峰为主，经过亲水性树脂富集后，检测出15条糖肽，因间苯二甲醛与间苯二胺的摩尔比(1.5)较大，MAR表面的MOP含量增多，因MOP含有大量的网状结构，非糖肽也易被保留，故以该实施例中的方法制备的材料不利于蛋白酶解液中糖肽的特异性富集。

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一种微孔聚合物包覆的亲水性树脂及其在糖肽富集中的应用

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